CN110079497A - 一种脂肪干细胞的分离与培养方法 - Google Patents

一种脂肪干细胞的分离与培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110079497A
CN110079497A CN201910213693.5A CN201910213693A CN110079497A CN 110079497 A CN110079497 A CN 110079497A CN 201910213693 A CN201910213693 A CN 201910213693A CN 110079497 A CN110079497 A CN 110079497A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glu
lys
asn
tyr
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910213693.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110079497B (zh
Inventor
宋珂慧
胡振生
刘振中
庄秀萍
郭伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan Saier Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Jinan Saier Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan Saier Biological Technology Co ltd filed Critical Jinan Saier Biological Technology Co ltd
Priority to CN201910213693.5A priority Critical patent/CN110079497B/zh
Publication of CN110079497A publication Critical patent/CN110079497A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110079497B publication Critical patent/CN110079497B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本申请公开了一种脂肪干细胞的分离与培养方法。所述方法包括如下步骤：S1、收集脂肪组织；S2、在步骤S1得到的脂肪组织中加入胶原酶进行消化得到脂肪干细胞；S3、富集步骤S2得到脂肪干细胞；S4、对步骤S3得到的脂肪干细胞进行纯化和传代培养；其中，步骤S2中，所述胶原酶的氨基酸序列如Seq ID No.5所示；所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为40—60％；所述胶原酶在所述消化的体系中含量为0.20—0.30g/L；所述消化的时间为15—30min。本发明所述方法具有胶原酶用量少、脂肪干细胞分离效率高的优点，对脂肪干细胞的科学研究和大规模分离培养具有重要的价值。

Description

一种脂肪干细胞的分离与培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞的分离与培养方法。
背景技术
因先天性畸形、创伤及肿瘤切除术等多种原因所造成的软组织缺损以及日益增多的整形美容需求，软组织填充是目前整形美容外科采用的一种常见技术。自体移植脂肪作为理想的软组织填充材料，其生物相容性优于人工组织替代用品、异体及异种材料，没有免疫排斥现象，同时具有取材容易、操作简单、充盈外形好等优点。然而，自体脂肪移植存在着术后脂肪存活率低(25％－80％)的问题极大地限制了其在临床中的广泛应用。近年来，随着对脂肪移植后存活机制的逐步了解，人们采取脂肪来源干细胞帮助移植脂肪有更高的存活率。研究报道表明，脂肪组织含有的原始成体干细胞占比很高，每克脂肪多达5000个脂肪干细胞，而每毫升骨髓只有100-1000个干细胞。与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞的获得更加方便，它们可以在局部麻醉下使用脂肪抽吸技术轻松得到。目前，脂肪干细胞使用的主要限速步骤是其提取、分离的技术。
胶原酶消化法是脂肪干细胞分离的主流方法。该方法与组织块贴壁法、吸附柱法、直接离心法和机械振荡法等其它方法相比，具有干细胞产量高的优点，但胶原酶的使用也提高了成本。根据胶原酶的使用类型、浓度和消化时间的不同，胶原酶浓度从0.75g/L至2.5g/L不等，消化时间从0.5h至3h不等。
胶原酶(Collagenase)是一种蛋白酶，一种肽链内切酶，能够在生理pH和温度条件下特异性识别高频率出现于胶原蛋白中的Pro-X-Gly-Pro序列，并切割该序列中性氨基酸(X)和甘氨酸(Gly)之间的肽键，而不损伤其它蛋白质和组织，是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内，降解脂肪组织中的胶原纤维对提高脂肪干细胞的数量十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供脂肪干细胞的分离与培养方法。所述方法具有胶原酶用量少、脂肪干细胞分离效率高等优点，对脂肪干细胞的科学研究和大规模分离培养具有重要的价值。
为达到以上目的，本发明提供的技术方案如下：
一种脂肪干细胞的分离与培养方法，包括如下步骤：
S1、收集脂肪组织；
S2、在步骤S1得到的脂肪组织中加入胶原酶进行消化得到脂肪干细胞；
S3、富集步骤S2得到脂肪干细胞；
S4、对步骤S3得到的脂肪干细胞进行纯化和传代培养；
其中，步骤S2中，所述胶原酶的氨基酸序列如Seq ID No.5所示；所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为40—60％；所述胶原酶在所述消化的体系中含量为0.20—0.30g/L；所述消化的时间为15—30min。
优选的，步骤S2中，所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为50％；所述胶原酶的在所述消化的体系中含量为0.25g/L；所述消化的时间为20min。
优选的，步骤S2中，所述消化的体系使用生理盐水作为溶剂；所述消化的环境条件如下：温度为35—38℃，优选37℃；转速为50—200rpm，优选100rpm。
优选的，步骤S1中，所述脂肪组织来自负压法抽脂术，还包括对所述脂肪组织使用生理盐水洗涤后进行机械破碎的步骤。
优选的，步骤S3中，所述富集包括离心收集沉淀的步骤，所述离心的相对离心力为400—800g，时间为5—10min。
优选的，步骤S4中，进行所述纯化和传代培养前，包括对所述脂肪干细胞进行洗涤的步骤。
进一步的，步骤S4中，所述纯化的方法为流式细胞术、免疫磁珠分选法、密度梯度离心或细胞贴壁培养法；优选，细胞贴壁培养法。
优选的，所述细胞贴壁培养法和/或所述传代培养使用完全培养基进行；
优选的，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加8—20％(体积分数)胎牛血清、15—100ng/ml表皮生长因子、15—100ng/ml血管内皮生长因子、和3—50ng/ml人重组白细胞介素-3；更优选的，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加8—12％(体积分数)胎牛血清、15—25ng/ml表皮生长因子、15—25ng/ml血管内皮生长因子、和3—8ng/ml人重组白细胞介素-3；更优选的，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加10％(体积分数)胎牛血清、20ng/ml表皮生长因子、20ng/ml血管内皮生长因子、和5ng/ml人重组白细胞介素-3。
优选的，所述细胞贴壁培养法中所述脂肪干细胞的初始种植密度为0.5×105个/ml—1.5×105个/ml；更优选，1×105个/ml；
优选的，所述细胞贴壁培养法的培养条件为37℃、5％CO2条件下进行；
优选的，所述细胞贴壁培养法的培养时间为12—16天，培养至融合度为75—85％，更优选的，所述细胞贴壁培养法的培养时间为14天，培养至融合度为80％。
在上述方法中，所述脂肪干细胞具有定向分化为脂肪细胞、和/或骨细胞、和/或软骨细胞的能力；
和/或，所述脂肪干细胞表面高表达的表面标志物包括CD105、和/或CD73、和/或CD44、和/或CD90，低表达的表面标志物包括CD34和/或CD45。
本发明保护Seq ID No.5所示胶原酶在分离脂肪干细胞中的应用。
本发明的有益效果如下：
经试验证明，本发明方法分离培养得到的脂肪干细胞表面可高表达CD105、CD73、CD44、CD90等干细胞的表面标志物，低表达CD34和CD45；而且具有成脂、成骨、成软骨分化潜能。
本发明所述方法具有胶原酶用量少、脂肪干细胞分离效率高的优点，对脂肪干细胞的科学研究和大规模分离培养具有重要的价值。所述培养基添加多种因子，促进细胞快速增殖，保持细胞干性和生物学特性，细胞不宜分化。本发明方法使用的Seq ID No.5胶原酶比活力为1546.21U/mg，是现有的商品化的Ⅰ型胶原酶比活力的12.84倍，用于脂肪干细胞分离消化脂肪组织时，从成本和效率出发，胶原酶的最佳使用浓度为0.25g/L、消化时间为20min，获得的脂肪干细胞数量为2.29×106个/毫升，成活率为80.4％，效果明显好于商品化的Ⅰ型胶原酶，且上述胶原酶使用浓度和消化时间均低于现有技术。
附图说明
图1是脂肪干细胞生长融合度80％时的细胞状态。
图2是脂肪干细胞表面标志物的鉴定。
图3是脂肪干细胞诱导27天油红O染色(×100)。
图4是脂肪干细胞成骨诱导21天茜素红S染色结果(×100)。
图5是脂肪干细胞成软骨诱导21天阿利辛蓝染色结果(×100)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本申请发明人分离得到一种新的胶原酶，试验发现其比活力与现有的广泛使用的商业Ⅰ型胶原酶比活力相近，随后通过对该胶原酶进行定点突变，获得了两种胶原酶比活力显著提高的突变体，用于脂肪干细胞分离和培养效果很好。
实施例1、一种新的胶原酶获得及其表达、纯化和活性鉴定
一、胶原酶的获得
根据NCBI公开的胶原酶基因序列,设计一对引物(如Seq ID No.7和Seq ID No.8所示)，以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株ACCC10263(购自中国农业微生物菌种保藏管理中心)的基因组DNA为模板进行PCR扩增，电泳并回收约3.0kb左右的条带，经测序得到该胶原酶编码基因的核苷酸序列Seq ID No.1，其编码的胶原酶氨基酸序列为Seq IDNo.2。
二、工程菌的构建
将Seq ID No.1所示胶原酶编码基因连接到表达载体pET28a多克隆位点处，获得重组表达载体Z1。将该重组表达载体Z1转化大肠杆菌BL21(DE3)，经PCR和测序鉴定，获得表达Seq ID No.2所示胶原酶的工程菌J1。
三、胶原酶的诱导、表达和分离提纯
1、胶原酶的诱导表达及SDS-PAGE检测
使用LB平板培养工程菌J1，挑取阳性单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、120r/min条件下振荡培养14h。然后再用LB液体培养基扩大培养，至菌液OD600为0.6—0.8时向培养液中加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，在22℃、160r/min条件下振荡诱导培养16h。
将经上述诱导培养后的培养液低温离心收集菌体，弃上清，用50mL缓冲液Ⅰ(pH值为7.4，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：PBS 20mmol/L，NaCl 500mmol/L，PMSF 1mmol/L，及咪唑20mmol/L)重悬菌体沉淀。将重悬后的菌液在0℃冰水浴中用超声波破碎，400W功率间歇破碎90次，然后将菌液进行低温离心，收集上清液，将上清液用0.45μm膜过滤后的滤液于4℃条件下保存。将诱导前、诱导后的大肠杆菌菌液、诱导后菌体经超声破碎得到的上清液和沉淀同时进行SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE检测结果：对比诱导前、诱导后的大肠杆菌菌液的SDS-PAGE检测结果，诱导后的大肠杆菌菌液中含有大量Seq ID No.2所示胶原酶；
对比诱导后菌体经超声破碎得到的上清液和沉淀的SDS-PAGE检测结果，诱导后菌体经超声破碎得到的上清液中含有大量Seq ID No.2所示胶原酶。
2、胶原酶的纯化
使用AKTA蛋白纯化系统，首先用超纯水洗蛋白纯化柱，再使用5倍柱体积的缓冲液Ⅰ以1mL/min的流速平衡蛋白纯化柱。随后以0.1mL/min的流速将10mL步骤1中诱导后菌体经超声破碎得到的上清液(含有大量的Seq ID No.2所示胶原酶)加入到蛋白纯化柱。再用5倍柱体积的缓冲液Ⅰ以1mL/min的流速洗涤蛋白纯化柱。然后用缓冲液Ⅱ(pH值为7.4，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：PBS 20mmol/L，PMSF 1mmol/L及咪唑250mmol/L)洗脱蛋白并用紫外检测仪在280nm下监测蛋白的洗脱情况，并收集洗脱下来的蛋白。
取部分洗脱得到的蛋白进行SDS-PAGE检测，结果证明得到了一条与理论蛋白大小(110KD)相同的蛋白条带，且通过分析可知该蛋白占总蛋白的比例高达99％，试剂盒检测洗脱得到的蛋白溶液中蛋白浓度为0.133mg/mL。
四、胶原酶的活性检测
1、绘制标准曲线
用缓冲液Ⅲ(pH值为7.4，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：Tris-HCl 50mmol/L及CaCl2 0.36mmol/L)浓度不同的系列L-甘氨酸标准溶液，分别为：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/mL；
分别取200μL上述不同浓度的L-甘氨酸标准溶液，依次加入200μL乙酸钠-乙酸缓冲液(pH5.4，乙酸钠浓度为2mol/L)和400μL 2％(W/V)茚三酮溶液(含SnCl2 7.1mmol/L)；
沸水浴加热5min后迅速置于冰水中冷却，570nm处测定吸光度；
以吸光度值为Y轴纵坐标，L-甘氨酸浓度为X轴横坐标，得到标准曲线：Y＝1.201X，R2为0.99。
2、使用缓冲液Ⅲ配制牛跟腱来源的Ⅰ型胶原蛋白溶液，并于37℃恒温水浴预热5min左右。
3、胶原酶活性检测
取步骤三中的步骤2中洗脱得到的蛋白溶液5μL，37℃恒温水浴预热2min，加入95μL步骤2中所述的Ⅰ型胶原蛋白溶液(终浓度为5mg/mL)作为底物溶液，摇匀；37℃恒温水浴反应5h，依次加入0.1mol/L的HCl溶液100μL(作为终止液)、乙酸钠-乙酸缓冲液200μL和茚三酮溶液400μL沸水浴加热5min后迅速置于冰水中冷却，570nm处测定吸光度，代入方程Y＝1.201X(R2为0.99)中，得出蛋白溶液中游离氨基酸浓度，记为A1；
上述检测同时设对照：即在上述底物溶液和终止液对调，得出蛋白溶液中游离氨基酸浓度，记为A2；
按照如下公式计算胶原酶的比活力E(U/mg)：
E＝(A1-A2)×V1/(V2×P)；
上述公式中，
V1为胶原酶与胶原蛋白反应终止后的体积，即：蛋白溶液5μL、95μL底物溶液和100μL终止液之和，为200μL；
V2为反应体系中使用的胶原酶的体积，即5μL；
P为胶原酶所取溶液的蛋白浓度，即0.133mg/mL；
1个酶活单位U的定义为：每毫升胶原酶与牛跟腱来源的Ⅰ型胶原蛋白在37℃、pH7.4的条件下反应，5.0小时内每生成1μmol游离氨基酸即对应1个酶活单位U(1U)。
结果：步骤三中的步骤2中洗脱得到的蛋白溶液中蛋白的胶原酶酶活力为17.96U/mL，比活力为135.01U/mg；
该结果与商品化的Ⅰ型胶原酶(invitrogen，货号17100-017)按照步骤四的方法检测得到的胶原酶比活力120.44U/mg相近。
实施例2、突变体的获得及其表达、纯化和活性鉴定
一、突变体的获得
根据胶原酶的功能区域，设计若干与实施例1得到的胶原酶在氨基酸序列Seq IDNo.2特定位置上存在2—3个氨基酸替换的胶原酶突变体，其中四个突变体(A、B、C和D)的突变位点信息如下：
突变体A为在胶原酶Seq ID No.2序列的第254位将氨基酸d(Asp)替换为m(Met)，且在第255位将氨基酸r(Arg)替换为g(Gly)；该突变体A的氨基酸序列如Seq ID No.3所示，其编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.4所示；
突变体B为在胶原酶Seq ID No.2序列的第382位将氨基酸k(Lys)替换为l(Leu)，且在第383位将氨基酸e(Glu)替换为p(Pro)；
突变体C为在胶原酶Seq ID No.2序列的第579位将氨基酸w(Trp)替换为d(Asp)，且在第580位将氨基酸d(Asp)替换为s(Ser)；
突变体D为在胶原酶Seq ID No.2序列的第863位将氨基酸r(Arg)替换为g(Gly)，且在第864位将氨基酸p(Pro)替换为l(Leu)；该突变体D的氨基酸序列如Seq ID No.5所示，其编码基因的核苷酸序列如Seq ID No.6所示；
根据上述四个突变体(A、B、C和D)的突变位点信息，获得相应突变体编码基因的核苷酸序列，然后以含有Seq ID No.1所示DNA的载体为模板，通过PCR定点突变方式获得相应突变体编码基因的DNA分子，且经测序验证无误。
二、工程菌的构建
将突变体A、B、C和D的编码基因分别连接到表达载体pET28a多克隆位点处，分别获得重组表达载体Z2、Z3、Z4和Z5。将重组表达载体Z2、Z3、Z4和Z5分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经PCR和测序鉴定，获得分别表达突变体A、突变体B、突变体C和突变体D的工程菌J2、J3、J4和J5。
三、突变体的诱导、表达和分离提纯
按照实施例1步骤三的方法进行。
洗脱得到的蛋白(突变体A、突变体B、突变体C和突变体D)分别进行SDS-PAGE检测，结果证明各突变体与理论蛋白大小(110KD)相同，且通过分析可知各突变体分别占各自总蛋白的比例均高达99％，试剂盒检测洗脱得到的蛋白(突变体A、突变体B、突变体C和突变体D)溶液中蛋白浓度如表1所示。
四、突变体的胶原酶活性检测
按照实施例1步骤四的方法进行。结果如表1所示。
表1、各突变体的胶原酶活性检测
突变体 蛋白浓度(mg/mL) 胶原酶酶活力(U/mL) 比活力(U/mg)
A 0.147 185.90 1289.14
B 0.108 14.11 130.69
C 0.121 10.33 85.36
D 0.142 219.56 1546.21
表1的结果显示，突变体A的胶原酶比活力是实施例1中胶原酶和商品化的Ⅰ型胶原酶的9.55和10.7倍，突变体B的胶原酶比活力与实施例1中胶原酶和商品化的Ⅰ型胶原酶相近，突变体C的胶原酶比活力明显低于实施例1中胶原酶和商品化的Ⅰ型胶原酶。突变体D的胶原酶比活力是实施例1中胶原酶和商品化的Ⅰ型胶原酶的11.45和12.84倍，上述结果表明，突变体A和D作为胶原酶具有很好的市场应用价值。
实施例3、突变体A和D作为胶原酶在脂肪干细胞分离和培养中的应用
1、突变体A和D的加入量(浓度)对脂肪干细胞分离效果的影响
以实施例2制备得到的突变体A和D分别作为胶原酶，按照如下步骤分离脂肪干细胞，其中，消化时间相同，胶原酶的加入量(浓度)设不同处理,同时以商品化的Ⅰ型胶原酶(invitrogen，货号17100-017)为对照(CK1)：
(1)负压法抽脂术采集人脂肪组织，分装成100mL每份，将每份盛有脂肪组织容器表面消毒后，小心转入生物安全柜中，静置后使肿胀液与脂肪组织分层，并去除下方液体和上层油脂；
(2)加入等体积的生理盐水至脂肪组织，常温下振荡洗涤3min后静置5min，去除下方溶液和上层油脂；
(3)再次加入等体积的生理盐水，600g离心力离心7min，去除上层油脂；
(4)机械破碎脂肪组织，加入胶原酶，37℃恒温下以100r/min振荡处理(即消化)；以600g离心力离心7min，弃上清保留沉淀；
(5)向沉淀中加入50mL生理盐水重悬细胞，600g离心力离心7min，弃上清保留沉淀；
(6)将沉淀用生理盐水重悬，600g离心力离心7min，弃上清，保留沉淀，获得脂肪干细胞。
将不同处理得到的脂肪干细胞以细胞计数板进行计数，以台盼蓝染色法进行活细胞计数，每个处理设三个重复，结果取三个重复的平均值，如表2所示。
表2、突变体A/D作为胶原酶在不同浓度下获得脂肪干细胞数量对比
注：表2中的数量和活细胞数均为每毫升的负压法抽脂术采集得到的人脂肪组织中的个数。
表2的结果表明，相同使用浓度(0.80g/L)和相同消化时间(30min)下，以突变体A或D作为胶原酶分离得到的脂肪干细胞数量和成活率明显高于商品化的Ⅰ型胶原酶(invitrogen，货号17100-017)。综合考虑胶原酶的用量与分离数量，在消化时间为30min较短的时间内，以突变体A或D作为胶原酶分离脂肪干细胞的最佳使用浓度为0.25g/L，其使用量明显低于现有的其它胶原酶，且获得的脂肪干细胞数量和成活率也明显高于现有的商业化胶原酶。。
2、突变体的消化时间对脂肪干细胞分离效果的影响
以实施例2制备得到的突变体A和D分别作为胶原酶，按照步骤1中的步骤(1)—(6)分离脂肪干细胞，其中，胶原酶的加入量(浓度)相同，消化时间设不同处理，同时以商品化的Ⅰ型胶原酶(invitrogen，货号17100-017)为对照(CK2)。
将不同处理得到的脂肪干细胞以细胞计数板进行计数，以台盼蓝染色法进行活细胞计数，每个处理设三个重复，结果取三个重复的平均值，如表3所示。
表3、突变体A/D作为胶原酶在不同消化时间下获得脂肪干细胞数量对比
注：表3中的数量和活细胞数均为每毫升的负压法抽脂术采集得到的人脂肪组织。
表3的结果表明，相同使用浓度(0.25g/L)和相同消化时间(60min)下，以突变体A和D分别作为胶原酶分离得到的脂肪干细胞数量和成活率明显高于商品化的Ⅰ型胶原酶(invitrogen，货号17100-017)。综合考虑胶原酶的消化时间与分离数量，在使用浓度为0.25g/L较低的浓度下，以突变体A和D分别作为胶原酶分离脂肪干细胞的最佳消化时间为20min，其消化时间明显低于现有的其它胶原酶，且获得的脂肪干细胞数量和成活率也明显高于现有的商业化胶原酶。
3、脂肪干细胞的纯化和传代培养
将步骤1和2中各处理获得的细胞分别按照如下方法进行培养后收获细胞：
(1)完全培养基配制：以DMEM/F-12培养基为基液，添加10％(体积分数)胎牛血清、20ng/ml表皮生长因子、20ng/ml血管内皮生长因子、和5ng/ml人重组白细胞介素-3。
(2)使用步骤(1)中配制的完全培养基将步骤一中步骤(6)获得的细胞调整密度为1×105/ml，取5ml细胞悬液接种于25cm2培养瓶中，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养4d，观察细胞状态。
(3)小心取出细胞，吸弃2.5ml上层培养基，添加2.5ml步骤(1)中配制的完全培养基，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养3d。
(4)取出细胞，吸弃上层培养基，并添加5ml步骤(1)中完全培养基，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，每3d全换液1次。
(5)细胞培养至14d，融合度为80％左右进行细胞传代(图1)。
(6)吸弃上层培养基，使用生理盐水洗涤两遍培养瓶，加1ml胰酶消化1min，观察细胞状态，待细胞变圆变亮时加2ml完全培养基终止消化。
(7)轻轻拍打培养瓶使细胞悬浮，收集细胞，进行细胞计数。
(8)调整细胞密度为1×105/ml，取10ml细胞悬液接种于75cm2细胞培养瓶中，计为P1，待细胞融合度80％—90％时，进行传代，传代4—5代之后收获细胞。
4、脂肪干细胞的鉴定
将经过步骤3培养得到的细胞分别按照如下方法进行鉴定：
(1)取4—5代收获后的脂肪干细胞，离心。
(2)D-PBS重悬并调整细胞密度约为2.4×106/ml。
(3)取四支流式管，每管加入100μl细胞悬液。
(4)第一管加入Anti-human CD90FITC，Anti-human CD105APC，Anti-humanCD45PE-Cy7各5μl。
(5)第二管加入Anti-human CD44FITC，Anti-human CD73APC，Anti-humanCD34PE-Cy7各5μl。
(6)第三管为阴性对照，加入同型小鼠单克隆抗体FITC 0.6μl，同型小鼠单克隆抗体PE-Cy7 1.2μl，同型小鼠单克隆抗体APC 1.2μl，振荡混匀，室温避光孵育20min。
(7)染色结束后，每管加入2ml含1％NaN3的PBS，混匀。
(8)300g离心力离心5min，弃上清。
(9)弹散重悬细胞。每管加入500μl含0.1％多聚甲醛的PBS溶液，混匀固定。
(10)流式细胞仪检测。
结果：如图2所示，步骤1和2中各处理获得的细胞经培养和鉴定，均具有如下表型：CD105、CD73、CD44、CD90高表达；CD34和CD45低表达。
该结果说明，步骤1和2中各处理获得的细胞中含有大量的脂肪干细胞。
5、脂肪干细胞的成脂分化
将步骤3得到的细胞按照如下步骤进行成脂分化：
(1)将4—5代收获后的脂肪干细胞接种六孔板，每孔接种3×103个细胞，每2天换液一次。
(2)待细胞生长融合至80-90％，吸弃完全培养基(步骤3中的完全培养基)，每孔加入2ml成脂分化诱导培养基A(成脂分化诱导基础培养基A 175mL+FBS 20mL+青链霉素(penicillin-streptomyc)2mL+谷氨酰胺(Glutamine)2mL+胰岛素(Insulin)200L+IBMX200L+吲哚美辛(Rosiglitazone)200L+地塞米松(Dexamethasone)200L)诱导培养3天。
(3)吸出诱导培养基A，加入2ml成脂诱导分化培养基B(成脂分化诱导基础培养基B175mL+FBS 20mL，penicillin-streptomyc 2mL+Glutamine 2mL+Insulin 200L)，培养24小时。
(4)吸出成脂诱导分化培养基B，加入成脂诱导分化培养基A液2ml。
(5)重复步骤(3)和步骤(4)5次，诱导完成。
(6)吸出诱导培养基，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定30min，油红O染色30min，镜检、拍照。
结果如图3所示，该结果表明步骤3得到细胞具有成脂分化能力。
6、脂肪干细胞的成骨分化
将步骤3得到的细胞按照如下步骤进行成骨分化：
(1)将4—5代收获后的脂肪干细胞接种六孔板，每孔接种2×104个细胞，每2天换液一次。
(2)待细胞生长融合至80-90％，吸弃完全培养基(步骤3中的完全培养基)，每孔加入2ml成骨诱导培养基(成骨分化诱导基础培养基175ml+FBS 20mL+penicillin-streptomyc 2mL+Glutamine 2mL+抗坏血酸(Ascorbate)400μL+β-甘油磷酸钠(Glycerophosphate)2mL+Dexamethasone 20μL)，每3天换液一次。
(3)常规诱导21后天弃培养基，PBS清洗2次，加入2ml 4％中性甲醛固定30min，茜素红染色5分钟，镜检、拍照。
结果如图4所示，该结果表明步骤3得到的细胞具有成骨分化能力。
7、脂肪干细胞的成软骨分化
将步骤3得到细胞按照如下步骤进行成软骨分化：
(1)取4—5代收获后的脂肪干细胞，软骨诱导基础培养液重悬细胞调整密度至7.5×105/ml。
(2)150g离心5min，弃上清。
(3)软骨诱导完全培养液(即配即用)重悬细胞，调整细胞密度5.0×105/ml。
(4)取500ul细胞悬液(即2.5×105个细胞)转入15ml离心管中，150g离心5min。
(5)离心后不可摇动或吹打细胞团，小心地将离心管盖拧松，以便于气体交换。放入37℃、5％CO2的培养箱中孵育。(注意：24小时内不要摇动细胞团)
(6)每2～3d加入新鲜的软骨分化诱导液，每管0.5ml，换液后轻弹细胞团使其能脱壁漂浮，拧松管盖，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续诱导。
(7)诱导14～21天后，细胞团直径可增至约2mm，进行石蜡切片(一般厚度为4～8um)，脱蜡后做阿利辛蓝染色。
(8)阿利辛蓝染色液浸染30分钟，终止染色、镜检、拍照。
结果如图5所示，该结果表明步骤3得到的细胞具有成软骨分化能力。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 济南赛尔生物科技股份有限公司
<120> 一种脂肪干细胞的分离与培养方法
<130> JH-CNP190044
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2895
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaacaaaa aatcgaaaat taacaaagtg atgctgtcga tttcgacgat ggcgctgtcg 60
ctgggggcgc tgcaagcgcc ggcgtcggcg gaagaaaaag tgccgtacaa cgtgctgaaa 120
acgaaaccgg tggggattga aaaaccggtg gacgaaattg ggcacgtgtc gaaagcggaa 180
gaaacgctgt cgttccaaga acggctgaaa gtgggggact tctcgcaacg gccggcgtcg 240
attccgaaca aagcggcggt gaaacaagtg aaagaatcgt actcgatggc ggacctgaac 300
aaaatgaacg accaagaact ggtggaaacg ctggggtgca ttaaatggca ccaaattacg 360
aacgaagaca cgaaagacct gttccaattc gcgttctaca aagacaaagg gaaaatgcaa 420
gtgattattg acgaactgtc ggcgacgcac ttccggcggg ggacggacga ctcgaaaggg 480
gaagtgctgc ggtcgattca aacgttcacg gcgttctacc tggcgttcta caacaacgaa 540
ctgtcggaac tgaacgaacg gtcgttccaa gacaaatgcc tgccggcgct gaaatcgatt 600
gcgaaaaacc cgaacttcaa actggggacg gcggaacaag acacggtggt gtcggcgtac 660
gggaaactga tttcgaacgc gtcgtcggac gtggaaacgg tgcaatacgc gtcgaacatt 720
ctgaaacaat acaacgacaa cttcaacacg tacgtgaacg atcggatgaa agggcaagcg 780
atttacgaca ttatgcaaga cattgggatt gactaccaat cgtacctgat tgaagcgcgg 840
aaagaagcga acgaaacgat gtggtacggg aaagtggacg ggttcattaa cgaaattaac 900
aacaacggga tttacttcgc gtcgcggttc gaaaacaaat ggctggtgct gaacgaacgg 960
attgcgctgg tgacgccggg gaaattccac tcgaacccga acaaagggct ggaagtggtg 1020
acgcaagcgt cggaaccgat gcacatgtac ccgcggctgt acttcgtggc ggtggaacaa 1080
attacgacga actacaacgg gaaagactac tcggggaaca cggtggacct ggaaaaaatt 1140
cggaaagaag ggaaagaaca atacctgccg aaaacgtaca cgttcgacga cgggtcgatt 1200
gtgttcaaaa cgggggacaa agtgtcggaa gaaaaaatta aacggctgta ctgggcggcg 1260
aaagaagtga aagcgcaata ctaccacatt cggaacgtgg tggacaaagc gctggaaccg 1320
aacgcggacg acattctgac gattgtgatt aacctgaaac cgctggaccc gaaatcgccg 1380
cggcaactgt acgggtacga aacgaacggg aacattgaaa cggaatacac ggggacgtac 1440
cggacgccgg aacaattctt cacgtacgaa tcgatttact cgctggaaga actgttccgg 1500
cacgaattca cgcacgggcg gctgtacctg tacgaagtgc cggggctgtt cgggcggggg 1560
gacatgtacc aaaacgaacg gctgacgtgg ttccaagaag ggaacgcgga attcttcgcg 1620
gggtcgacgc ggacgaacaa cgtggtgccg cggaaatcga ttatttcggg gctgtcgtcg 1680
gacccggcgt cgcggtacac ggcggaacgg acgctgttcg cgaaatacgg gtcgtgggac 1740
ttctacaact actcgttcgc gctgcaatcg tacctgtaca cgcaccaatt cgaaacgttc 1800
gacaaaattc aagacctgat tcgggcgaac gacgtgtacc gggaatacaa ctcgccggaa 1860
gaataccaac tgaacaaaaa ctacgacgcg gaataccaag aatacatgca acaactgatt 1920
aacgtgccgg cggtggcgga cgactacctg gcggacaacc aagacaaata cgaacacgcg 1980
ccgaaatcgc tgacggcggt ggaaaaagaa atgacggaaa cgctgccgat gaaagacgcg 2040
aaaatgacga aacactcgtc gcaattcttc aacacgttca cgctggaagg gacgtacacg 2100
gggtcggtga cgaaagggga atcggaagac tggaacgcga tgtcgaaaaa agtgaacgaa 2160
gtgctggaac aactggcgca aaaagaatgg tcggggtaca aaacggtgac ggcgtacttc 2220
gtgaacaaag aagggattca attcaaatcg ttcgaatacg acgtggtgtt ccacgggatt 2280
gcgaaagacg acggggaaaa caaagcgccg acggtgaaca ttaacgggcc gtacaacggg 2340
ctggtgtacc gggtgaactc gtcgaacgaa gacgggtcga aagacgaaga cgggaaaatt 2400
gtgtcgtacc tgtgggactt cggggacggg cggacgtcga cggaagtgaa cccggtgcac 2460
gtgtacgaac gggaagggtc gtacaaagtg gcgctgattg tgaaagacga caaagggaaa 2520
gaatcgaaat cggaaacgac ggtgacggtg aaagacgggt cgctgacgga atcggaaccg 2580
aacaaccggc cggaagaagc gaaccggatt gggctgaaca cgacgattaa agggtcgctg 2640
attggggggg accacacgga cgtgtacacg ttcaacgtgg cgtcggcgaa agacattgac 2700
atttcggtgc tgaacgaata cgggattggg atgacgtggg tgctgcacca cgaatcggac 2760
atgcaaaact acgcggcgta cgggcaagcg aacgggaacc acattgaagc gaacttcaac 2820
gcgaaaccgg gggaatacta cctgtacgtg tacaaatacg acaacgggga cgggacgtac 2880
aaactgtcgg tgtaa 2895
<210> 2
<211> 964
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asn Lys Lys Ser Lys Ile Asn Lys Val Met Leu Ser Ile Ser Thr
1 5 10 15
Met Ala Leu Ser Leu Gly Ala Leu Gln Ala Pro Ala Ser Ala Glu Glu
20 25 30
Lys Val Pro Tyr Asn Val Leu Lys Thr Lys Pro Val Gly Ile Glu Lys
35 40 45
Pro Val Asp Glu Ile Gly His Val Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Ser
50 55 60
Phe Gln Glu Arg Leu Lys Val Gly Asp Phe Ser Gln Arg Pro Ala Ser
65 70 75 80
Ile Pro Asn Lys Ala Ala Val Lys Gln Val Lys Glu Ser Tyr Ser Met
85 90 95
Ala Asp Leu Asn Lys Met Asn Asp Gln Glu Leu Val Glu Thr Leu Gly
100 105 110
Cys Ile Lys Trp His Gln Ile Thr Asn Glu Asp Thr Lys Asp Leu Phe
115 120 125
Gln Phe Ala Phe Tyr Lys Asp Lys Gly Lys Met Gln Val Ile Ile Asp
130 135 140
Glu Leu Ser Ala Thr His Phe Arg Arg Gly Thr Asp Asp Ser Lys Gly
145 150 155 160
Glu Val Leu Arg Ser Ile Gln Thr Phe Thr Ala Phe Tyr Leu Ala Phe
165 170 175
Tyr Asn Asn Glu Leu Ser Glu Leu Asn Glu Arg Ser Phe Gln Asp Lys
180 185 190
Cys Leu Pro Ala Leu Lys Ser Ile Ala Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu
195 200 205
Gly Thr Ala Glu Gln Asp Thr Val Val Ser Ala Tyr Gly Lys Leu Ile
210 215 220
Ser Asn Ala Ser Ser Asp Val Glu Thr Val Gln Tyr Ala Ser Asn Ile
225 230 235 240
Leu Lys Gln Tyr Asn Asp Asn Phe Asn Thr Tyr Val Asn Asp Arg Met
245 250 255
Lys Gly Gln Ala Ile Tyr Asp Ile Met Gln Asp Ile Gly Ile Asp Tyr
260 265 270
Gln Ser Tyr Leu Ile Glu Ala Arg Lys Glu Ala Asn Glu Thr Met Trp
275 280 285
Tyr Gly Lys Val Asp Gly Phe Ile Asn Glu Ile Asn Asn Asn Gly Ile
290 295 300
Tyr Phe Ala Ser Arg Phe Glu Asn Lys Trp Leu Val Leu Asn Glu Arg
305 310 315 320
Ile Ala Leu Val Thr Pro Gly Lys Phe His Ser Asn Pro Asn Lys Gly
325 330 335
Leu Glu Val Val Thr Gln Ala Ser Glu Pro Met His Met Tyr Pro Arg
340 345 350
Leu Tyr Phe Val Ala Val Glu Gln Ile Thr Thr Asn Tyr Asn Gly Lys
355 360 365
Asp Tyr Ser Gly Asn Thr Val Asp Leu Glu Lys Ile Arg Lys Glu Gly
370 375 380
Lys Glu Gln Tyr Leu Pro Lys Thr Tyr Thr Phe Asp Asp Gly Ser Ile
385 390 395 400
Val Phe Lys Thr Gly Asp Lys Val Ser Glu Glu Lys Ile Lys Arg Leu
405 410 415
Tyr Trp Ala Ala Lys Glu Val Lys Ala Gln Tyr Tyr His Ile Arg Asn
420 425 430
Val Val Asp Lys Ala Leu Glu Pro Asn Ala Asp Asp Ile Leu Thr Ile
435 440 445
Val Ile Asn Leu Lys Pro Leu Asp Pro Lys Ser Pro Arg Gln Leu Tyr
450 455 460
Gly Tyr Glu Thr Asn Gly Asn Ile Glu Thr Glu Tyr Thr Gly Thr Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Glu Gln Phe Phe Thr Tyr Glu Ser Ile Tyr Ser Leu Glu
485 490 495
Glu Leu Phe Arg His Glu Phe Thr His Gly Arg Leu Tyr Leu Tyr Glu
500 505 510
Val Pro Gly Leu Phe Gly Arg Gly Asp Met Tyr Gln Asn Glu Arg Leu
515 520 525
Thr Trp Phe Gln Glu Gly Asn Ala Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr Arg
530 535 540
Thr Asn Asn Val Val Pro Arg Lys Ser Ile Ile Ser Gly Leu Ser Ser
545 550 555 560
Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Thr Ala Glu Arg Thr Leu Phe Ala Lys Tyr
565 570 575
Gly Ser Trp Asp Phe Tyr Asn Tyr Ser Phe Ala Leu Gln Ser Tyr Leu
580 585 590
Tyr Thr His Gln Phe Glu Thr Phe Asp Lys Ile Gln Asp Leu Ile Arg
595 600 605
Ala Asn Asp Val Tyr Arg Glu Tyr Asn Ser Pro Glu Glu Tyr Gln Leu
610 615 620
Asn Lys Asn Tyr Asp Ala Glu Tyr Gln Glu Tyr Met Gln Gln Leu Ile
625 630 635 640
Asn Val Pro Ala Val Ala Asp Asp Tyr Leu Ala Asp Asn Gln Asp Lys
645 650 655
Tyr Glu His Ala Pro Lys Ser Leu Thr Ala Val Glu Lys Glu Met Thr
660 665 670
Glu Thr Leu Pro Met Lys Asp Ala Lys Met Thr Lys His Ser Ser Gln
675 680 685
Phe Phe Asn Thr Phe Thr Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Gly Ser Val Thr
690 695 700
Lys Gly Glu Ser Glu Asp Trp Asn Ala Met Ser Lys Lys Val Asn Glu
705 710 715 720
Val Leu Glu Gln Leu Ala Gln Lys Glu Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Val
725 730 735
Thr Ala Tyr Phe Val Asn Lys Glu Gly Ile Gln Phe Lys Ser Phe Glu
740 745 750
Tyr Asp Val Val Phe His Gly Ile Ala Lys Asp Asp Gly Glu Asn Lys
755 760 765
Ala Pro Thr Val Asn Ile Asn Gly Pro Tyr Asn Gly Leu Val Tyr Arg
770 775 780
Val Asn Ser Ser Asn Glu Asp Gly Ser Lys Asp Glu Asp Gly Lys Ile
785 790 795 800
Val Ser Tyr Leu Trp Asp Phe Gly Asp Gly Arg Thr Ser Thr Glu Val
805 810 815
Asn Pro Val His Val Tyr Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Lys Val Ala Leu
820 825 830
Ile Val Lys Asp Asp Lys Gly Lys Glu Ser Lys Ser Glu Thr Thr Val
835 840 845
Thr Val Lys Asp Gly Ser Leu Thr Glu Ser Glu Pro Asn Asn Arg Pro
850 855 860
Glu Glu Ala Asn Arg Ile Gly Leu Asn Thr Thr Ile Lys Gly Ser Leu
865 870 875 880
Ile Gly Gly Asp His Thr Asp Val Tyr Thr Phe Asn Val Ala Ser Ala
885 890 895
Lys Asp Ile Asp Ile Ser Val Leu Asn Glu Tyr Gly Ile Gly Met Thr
900 905 910
Trp Val Leu His His Glu Ser Asp Met Gln Asn Tyr Ala Ala Tyr Gly
915 920 925
Gln Ala Asn Gly Asn His Ile Glu Ala Asn Phe Asn Ala Lys Pro Gly
930 935 940
Glu Tyr Tyr Leu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asp Asn Gly Asp Gly Thr Tyr
945 950 955 960
Lys Leu Ser Val
964
<210> 3
<211> 964
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Asn Lys Lys Ser Lys Ile Asn Lys Val Met Leu Ser Ile Ser Thr
1 5 10 15
Met Ala Leu Ser Leu Gly Ala Leu Gln Ala Pro Ala Ser Ala Glu Glu
20 25 30
Lys Val Pro Tyr Asn Val Leu Lys Thr Lys Pro Val Gly Ile Glu Lys
35 40 45
Pro Val Asp Glu Ile Gly His Val Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Ser
50 55 60
Phe Gln Glu Arg Leu Lys Val Gly Asp Phe Ser Gln Arg Pro Ala Ser
65 70 75 80
Ile Pro Asn Lys Ala Ala Val Lys Gln Val Lys Glu Ser Tyr Ser Met
85 90 95
Ala Asp Leu Asn Lys Met Asn Asp Gln Glu Leu Val Glu Thr Leu Gly
100 105 110
Cys Ile Lys Trp His Gln Ile Thr Asn Glu Asp Thr Lys Asp Leu Phe
115 120 125
Gln Phe Ala Phe Tyr Lys Asp Lys Gly Lys Met Gln Val Ile Ile Asp
130 135 140
Glu Leu Ser Ala Thr His Phe Arg Arg Gly Thr Asp Asp Ser Lys Gly
145 150 155 160
Glu Val Leu Arg Ser Ile Gln Thr Phe Thr Ala Phe Tyr Leu Ala Phe
165 170 175
Tyr Asn Asn Glu Leu Ser Glu Leu Asn Glu Arg Ser Phe Gln Asp Lys
180 185 190
Cys Leu Pro Ala Leu Lys Ser Ile Ala Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu
195 200 205
Gly Thr Ala Glu Gln Asp Thr Val Val Ser Ala Tyr Gly Lys Leu Ile
210 215 220
Ser Asn Ala Ser Ser Asp Val Glu Thr Val Gln Tyr Ala Ser Asn Ile
225 230 235 240
Leu Lys Gln Tyr Asn Asp Asn Phe Asn Thr Tyr Val Asn Met Gly Met
245 250 255
Lys Gly Gln Ala Ile Tyr Asp Ile Met Gln Asp Ile Gly Ile Asp Tyr
260 265 270
Gln Ser Tyr Leu Ile Glu Ala Arg Lys Glu Ala Asn Glu Thr Met Trp
275 280 285
Tyr Gly Lys Val Asp Gly Phe Ile Asn Glu Ile Asn Asn Asn Gly Ile
290 295 300
Tyr Phe Ala Ser Arg Phe Glu Asn Lys Trp Leu Val Leu Asn Glu Arg
305 310 315 320
Ile Ala Leu Val Thr Pro Gly Lys Phe His Ser Asn Pro Asn Lys Gly
325 330 335
Leu Glu Val Val Thr Gln Ala Ser Glu Pro Met His Met Tyr Pro Arg
340 345 350
Leu Tyr Phe Val Ala Val Glu Gln Ile Thr Thr Asn Tyr Asn Gly Lys
355 360 365
Asp Tyr Ser Gly Asn Thr Val Asp Leu Glu Lys Ile Arg Lys Glu Gly
370 375 380
Lys Glu Gln Tyr Leu Pro Lys Thr Tyr Thr Phe Asp Asp Gly Ser Ile
385 390 395 400
Val Phe Lys Thr Gly Asp Lys Val Ser Glu Glu Lys Ile Lys Arg Leu
405 410 415
Tyr Trp Ala Ala Lys Glu Val Lys Ala Gln Tyr Tyr His Ile Arg Asn
420 425 430
Val Val Asp Lys Ala Leu Glu Pro Asn Ala Asp Asp Ile Leu Thr Ile
435 440 445
Val Ile Asn Leu Lys Pro Leu Asp Pro Lys Ser Pro Arg Gln Leu Tyr
450 455 460
Gly Tyr Glu Thr Asn Gly Asn Ile Glu Thr Glu Tyr Thr Gly Thr Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Glu Gln Phe Phe Thr Tyr Glu Ser Ile Tyr Ser Leu Glu
485 490 495
Glu Leu Phe Arg His Glu Phe Thr His Gly Arg Leu Tyr Leu Tyr Glu
500 505 510
Val Pro Gly Leu Phe Gly Arg Gly Asp Met Tyr Gln Asn Glu Arg Leu
515 520 525
Thr Trp Phe Gln Glu Gly Asn Ala Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr Arg
530 535 540
Thr Asn Asn Val Val Pro Arg Lys Ser Ile Ile Ser Gly Leu Ser Ser
545 550 555 560
Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Thr Ala Glu Arg Thr Leu Phe Ala Lys Tyr
565 570 575
Gly Ser Trp Asp Phe Tyr Asn Tyr Ser Phe Ala Leu Gln Ser Tyr Leu
580 585 590
Tyr Thr His Gln Phe Glu Thr Phe Asp Lys Ile Gln Asp Leu Ile Arg
595 600 605
Ala Asn Asp Val Tyr Arg Glu Tyr Asn Ser Pro Glu Glu Tyr Gln Leu
610 615 620
Asn Lys Asn Tyr Asp Ala Glu Tyr Gln Glu Tyr Met Gln Gln Leu Ile
625 630 635 640
Asn Val Pro Ala Val Ala Asp Asp Tyr Leu Ala Asp Asn Gln Asp Lys
645 650 655
Tyr Glu His Ala Pro Lys Ser Leu Thr Ala Val Glu Lys Glu Met Thr
660 665 670
Glu Thr Leu Pro Met Lys Asp Ala Lys Met Thr Lys His Ser Ser Gln
675 680 685
Phe Phe Asn Thr Phe Thr Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Gly Ser Val Thr
690 695 700
Lys Gly Glu Ser Glu Asp Trp Asn Ala Met Ser Lys Lys Val Asn Glu
705 710 715 720
Val Leu Glu Gln Leu Ala Gln Lys Glu Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Val
725 730 735
Thr Ala Tyr Phe Val Asn Lys Glu Gly Ile Gln Phe Lys Ser Phe Glu
740 745 750
Tyr Asp Val Val Phe His Gly Ile Ala Lys Asp Asp Gly Glu Asn Lys
755 760 765
Ala Pro Thr Val Asn Ile Asn Gly Pro Tyr Asn Gly Leu Val Tyr Arg
770 775 780
Val Asn Ser Ser Asn Glu Asp Gly Ser Lys Asp Glu Asp Gly Lys Ile
785 790 795 800
Val Ser Tyr Leu Trp Asp Phe Gly Asp Gly Arg Thr Ser Thr Glu Val
805 810 815
Asn Pro Val His Val Tyr Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Lys Val Ala Leu
820 825 830
Ile Val Lys Asp Asp Lys Gly Lys Glu Ser Lys Ser Glu Thr Thr Val
835 840 845
Thr Val Lys Asp Gly Ser Leu Thr Glu Ser Glu Pro Asn Asn Arg Pro
850 855 860
Glu Glu Ala Asn Arg Ile Gly Leu Asn Thr Thr Ile Lys Gly Ser Leu
865 870 875 880
Ile Gly Gly Asp His Thr Asp Val Tyr Thr Phe Asn Val Ala Ser Ala
885 890 895
Lys Asp Ile Asp Ile Ser Val Leu Asn Glu Tyr Gly Ile Gly Met Thr
900 905 910
Trp Val Leu His His Glu Ser Asp Met Gln Asn Tyr Ala Ala Tyr Gly
915 920 925
Gln Ala Asn Gly Asn His Ile Glu Ala Asn Phe Asn Ala Lys Pro Gly
930 935 940
Glu Tyr Tyr Leu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asp Asn Gly Asp Gly Thr Tyr
945 950 955 960
Lys Leu Ser Val
964
<210> 4
<211> 2895
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaacaaaa aatcgaaaat taacaaagtg atgctgtcga tttcgacgat ggcgctgtcg 60
ctgggggcgc tgcaagcgcc ggcgtcggcg gaagaaaaag tgccgtacaa cgtgctgaaa 120
acgaaaccgg tggggattga aaaaccggtg gacgaaattg ggcacgtgtc gaaagcggaa 180
gaaacgctgt cgttccaaga acggctgaaa gtgggggact tctcgcaacg gccggcgtcg 240
attccgaaca aagcggcggt gaaacaagtg aaagaatcgt actcgatggc ggacctgaac 300
aaaatgaacg accaagaact ggtggaaacg ctggggtgca ttaaatggca ccaaattacg 360
aacgaagaca cgaaagacct gttccaattc gcgttctaca aagacaaagg gaaaatgcaa 420
gtgattattg acgaactgtc ggcgacgcac ttccggcggg ggacggacga ctcgaaaggg 480
gaagtgctgc ggtcgattca aacgttcacg gcgttctacc tggcgttcta caacaacgaa 540
ctgtcggaac tgaacgaacg gtcgttccaa gacaaatgcc tgccggcgct gaaatcgatt 600
gcgaaaaacc cgaacttcaa actggggacg gcggaacaag acacggtggt gtcggcgtac 660
gggaaactga tttcgaacgc gtcgtcggac gtggaaacgg tgcaatacgc gtcgaacatt 720
ctgaaacaat acaacgacaa cttcaacacg tacgtgaaca tggggatgaa agggcaagcg 780
atttacgaca ttatgcaaga cattgggatt gactaccaat cgtacctgat tgaagcgcgg 840
aaagaagcga acgaaacgat gtggtacggg aaagtggacg ggttcattaa cgaaattaac 900
aacaacggga tttacttcgc gtcgcggttc gaaaacaaat ggctggtgct gaacgaacgg 960
attgcgctgg tgacgccggg gaaattccac tcgaacccga acaaagggct ggaagtggtg 1020
acgcaagcgt cggaaccgat gcacatgtac ccgcggctgt acttcgtggc ggtggaacaa 1080
attacgacga actacaacgg gaaagactac tcggggaaca cggtggacct ggaaaaaatt 1140
cggaaagaag ggaaagaaca atacctgccg aaaacgtaca cgttcgacga cgggtcgatt 1200
gtgttcaaaa cgggggacaa agtgtcggaa gaaaaaatta aacggctgta ctgggcggcg 1260
aaagaagtga aagcgcaata ctaccacatt cggaacgtgg tggacaaagc gctggaaccg 1320
aacgcggacg acattctgac gattgtgatt aacctgaaac cgctggaccc gaaatcgccg 1380
cggcaactgt acgggtacga aacgaacggg aacattgaaa cggaatacac ggggacgtac 1440
cggacgccgg aacaattctt cacgtacgaa tcgatttact cgctggaaga actgttccgg 1500
cacgaattca cgcacgggcg gctgtacctg tacgaagtgc cggggctgtt cgggcggggg 1560
gacatgtacc aaaacgaacg gctgacgtgg ttccaagaag ggaacgcgga attcttcgcg 1620
gggtcgacgc ggacgaacaa cgtggtgccg cggaaatcga ttatttcggg gctgtcgtcg 1680
gacccggcgt cgcggtacac ggcggaacgg acgctgttcg cgaaatacgg gtcgtgggac 1740
ttctacaact actcgttcgc gctgcaatcg tacctgtaca cgcaccaatt cgaaacgttc 1800
gacaaaattc aagacctgat tcgggcgaac gacgtgtacc gggaatacaa ctcgccggaa 1860
gaataccaac tgaacaaaaa ctacgacgcg gaataccaag aatacatgca acaactgatt 1920
aacgtgccgg cggtggcgga cgactacctg gcggacaacc aagacaaata cgaacacgcg 1980
ccgaaatcgc tgacggcggt ggaaaaagaa atgacggaaa cgctgccgat gaaagacgcg 2040
aaaatgacga aacactcgtc gcaattcttc aacacgttca cgctggaagg gacgtacacg 2100
gggtcggtga cgaaagggga atcggaagac tggaacgcga tgtcgaaaaa agtgaacgaa 2160
gtgctggaac aactggcgca aaaagaatgg tcggggtaca aaacggtgac ggcgtacttc 2220
gtgaacaaag aagggattca attcaaatcg ttcgaatacg acgtggtgtt ccacgggatt 2280
gcgaaagacg acggggaaaa caaagcgccg acggtgaaca ttaacgggcc gtacaacggg 2340
ctggtgtacc gggtgaactc gtcgaacgaa gacgggtcga aagacgaaga cgggaaaatt 2400
gtgtcgtacc tgtgggactt cggggacggg cggacgtcga cggaagtgaa cccggtgcac 2460
gtgtacgaac gggaagggtc gtacaaagtg gcgctgattg tgaaagacga caaagggaaa 2520
gaatcgaaat cggaaacgac ggtgacggtg aaagacgggt cgctgacgga atcggaaccg 2580
aacaaccggc cggaagaagc gaaccggatt gggctgaaca cgacgattaa agggtcgctg 2640
attggggggg accacacgga cgtgtacacg ttcaacgtgg cgtcggcgaa agacattgac 2700
atttcggtgc tgaacgaata cgggattggg atgacgtggg tgctgcacca cgaatcggac 2760
atgcaaaact acgcggcgta cgggcaagcg aacgggaacc acattgaagc gaacttcaac 2820
gcgaaaccgg gggaatacta cctgtacgtg tacaaatacg acaacgggga cgggacgtac 2880
aaactgtcgg tgtaa 2895
<210> 5
<211> 964
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Asn Lys Lys Ser Lys Ile Asn Lys Val Met Leu Ser Ile Ser Thr
1 5 10 15
Met Ala Leu Ser Leu Gly Ala Leu Gln Ala Pro Ala Ser Ala Glu Glu
20 25 30
Lys Val Pro Tyr Asn Val Leu Lys Thr Lys Pro Val Gly Ile Glu Lys
35 40 45
Pro Val Asp Glu Ile Gly His Val Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Ser
50 55 60
Phe Gln Glu Arg Leu Lys Val Gly Asp Phe Ser Gln Arg Pro Ala Ser
65 70 75 80
Ile Pro Asn Lys Ala Ala Val Lys Gln Val Lys Glu Ser Tyr Ser Met
85 90 95
Ala Asp Leu Asn Lys Met Asn Asp Gln Glu Leu Val Glu Thr Leu Gly
100 105 110
Cys Ile Lys Trp His Gln Ile Thr Asn Glu Asp Thr Lys Asp Leu Phe
115 120 125
Gln Phe Ala Phe Tyr Lys Asp Lys Gly Lys Met Gln Val Ile Ile Asp
130 135 140
Glu Leu Ser Ala Thr His Phe Arg Arg Gly Thr Asp Asp Ser Lys Gly
145 150 155 160
Glu Val Leu Arg Ser Ile Gln Thr Phe Thr Ala Phe Tyr Leu Ala Phe
165 170 175
Tyr Asn Asn Glu Leu Ser Glu Leu Asn Glu Arg Ser Phe Gln Asp Lys
180 185 190
Cys Leu Pro Ala Leu Lys Ser Ile Ala Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu
195 200 205
Gly Thr Ala Glu Gln Asp Thr Val Val Ser Ala Tyr Gly Lys Leu Ile
210 215 220
Ser Asn Ala Ser Ser Asp Val Glu Thr Val Gln Tyr Ala Ser Asn Ile
225 230 235 240
Leu Lys Gln Tyr Asn Asp Asn Phe Asn Thr Tyr Val Asn Asp Arg Met
245 250 255
Lys Gly Gln Ala Ile Tyr Asp Ile Met Gln Asp Ile Gly Ile Asp Tyr
260 265 270
Gln Ser Tyr Leu Ile Glu Ala Arg Lys Glu Ala Asn Glu Thr Met Trp
275 280 285
Tyr Gly Lys Val Asp Gly Phe Ile Asn Glu Ile Asn Asn Asn Gly Ile
290 295 300
Tyr Phe Ala Ser Arg Phe Glu Asn Lys Trp Leu Val Leu Asn Glu Arg
305 310 315 320
Ile Ala Leu Val Thr Pro Gly Lys Phe His Ser Asn Pro Asn Lys Gly
325 330 335
Leu Glu Val Val Thr Gln Ala Ser Glu Pro Met His Met Tyr Pro Arg
340 345 350
Leu Tyr Phe Val Ala Val Glu Gln Ile Thr Thr Asn Tyr Asn Gly Lys
355 360 365
Asp Tyr Ser Gly Asn Thr Val Asp Leu Glu Lys Ile Arg Lys Glu Gly
370 375 380
Lys Glu Gln Tyr Leu Pro Lys Thr Tyr Thr Phe Asp Asp Gly Ser Ile
385 390 395 400
Val Phe Lys Thr Gly Asp Lys Val Ser Glu Glu Lys Ile Lys Arg Leu
405 410 415
Tyr Trp Ala Ala Lys Glu Val Lys Ala Gln Tyr Tyr His Ile Arg Asn
420 425 430
Val Val Asp Lys Ala Leu Glu Pro Asn Ala Asp Asp Ile Leu Thr Ile
435 440 445
Val Ile Asn Leu Lys Pro Leu Asp Pro Lys Ser Pro Arg Gln Leu Tyr
450 455 460
Gly Tyr Glu Thr Asn Gly Asn Ile Glu Thr Glu Tyr Thr Gly Thr Tyr
465 470 475 480
Arg Thr Pro Glu Gln Phe Phe Thr Tyr Glu Ser Ile Tyr Ser Leu Glu
485 490 495
Glu Leu Phe Arg His Glu Phe Thr His Gly Arg Leu Tyr Leu Tyr Glu
500 505 510
Val Pro Gly Leu Phe Gly Arg Gly Asp Met Tyr Gln Asn Glu Arg Leu
515 520 525
Thr Trp Phe Gln Glu Gly Asn Ala Glu Phe Phe Ala Gly Ser Thr Arg
530 535 540
Thr Asn Asn Val Val Pro Arg Lys Ser Ile Ile Ser Gly Leu Ser Ser
545 550 555 560
Asp Pro Ala Ser Arg Tyr Thr Ala Glu Arg Thr Leu Phe Ala Lys Tyr
565 570 575
Gly Ser Trp Asp Phe Tyr Asn Tyr Ser Phe Ala Leu Gln Ser Tyr Leu
580 585 590
Tyr Thr His Gln Phe Glu Thr Phe Asp Lys Ile Gln Asp Leu Ile Arg
595 600 605
Ala Asn Asp Val Tyr Arg Glu Tyr Asn Ser Pro Glu Glu Tyr Gln Leu
610 615 620
Asn Lys Asn Tyr Asp Ala Glu Tyr Gln Glu Tyr Met Gln Gln Leu Ile
625 630 635 640
Asn Val Pro Ala Val Ala Asp Asp Tyr Leu Ala Asp Asn Gln Asp Lys
645 650 655
Tyr Glu His Ala Pro Lys Ser Leu Thr Ala Val Glu Lys Glu Met Thr
660 665 670
Glu Thr Leu Pro Met Lys Asp Ala Lys Met Thr Lys His Ser Ser Gln
675 680 685
Phe Phe Asn Thr Phe Thr Leu Glu Gly Thr Tyr Thr Gly Ser Val Thr
690 695 700
Lys Gly Glu Ser Glu Asp Trp Asn Ala Met Ser Lys Lys Val Asn Glu
705 710 715 720
Val Leu Glu Gln Leu Ala Gln Lys Glu Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Val
725 730 735
Thr Ala Tyr Phe Val Asn Lys Glu Gly Ile Gln Phe Lys Ser Phe Glu
740 745 750
Tyr Asp Val Val Phe His Gly Ile Ala Lys Asp Asp Gly Glu Asn Lys
755 760 765
Ala Pro Thr Val Asn Ile Asn Gly Pro Tyr Asn Gly Leu Val Tyr Arg
770 775 780
Val Asn Ser Ser Asn Glu Asp Gly Ser Lys Asp Glu Asp Gly Lys Ile
785 790 795 800
Val Ser Tyr Leu Trp Asp Phe Gly Asp Gly Arg Thr Ser Thr Glu Val
805 810 815
Asn Pro Val His Val Tyr Glu Arg Glu Gly Ser Tyr Lys Val Ala Leu
820 825 830
Ile Val Lys Asp Asp Lys Gly Lys Glu Ser Lys Ser Glu Thr Thr Val
835 840 845
Thr Val Lys Asp Gly Ser Leu Thr Glu Ser Glu Pro Asn Asn Gly Leu
850 855 860
Glu Glu Ala Asn Arg Ile Gly Leu Asn Thr Thr Ile Lys Gly Ser Leu
865 870 875 880
Ile Gly Gly Asp His Thr Asp Val Tyr Thr Phe Asn Val Ala Ser Ala
885 890 895
Lys Asp Ile Asp Ile Ser Val Leu Asn Glu Tyr Gly Ile Gly Met Thr
900 905 910
Trp Val Leu His His Glu Ser Asp Met Gln Asn Tyr Ala Ala Tyr Gly
915 920 925
Gln Ala Asn Gly Asn His Ile Glu Ala Asn Phe Asn Ala Lys Pro Gly
930 935 940
Glu Tyr Tyr Leu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asp Asn Gly Asp Gly Thr Tyr
945 950 955 960
Lys Leu Ser Val
964
<210> 6
<211> 2895
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaacaaaa aatcgaaaat taacaaagtg atgctgtcga tttcgacgat ggcgctgtcg 60
ctgggggcgc tgcaagcgcc ggcgtcggcg gaagaaaaag tgccgtacaa cgtgctgaaa 120
acgaaaccgg tggggattga aaaaccggtg gacgaaattg ggcacgtgtc gaaagcggaa 180
gaaacgctgt cgttccaaga acggctgaaa gtgggggact tctcgcaacg gccggcgtcg 240
attccgaaca aagcggcggt gaaacaagtg aaagaatcgt actcgatggc ggacctgaac 300
aaaatgaacg accaagaact ggtggaaacg ctggggtgca ttaaatggca ccaaattacg 360
aacgaagaca cgaaagacct gttccaattc gcgttctaca aagacaaagg gaaaatgcaa 420
gtgattattg acgaactgtc ggcgacgcac ttccggcggg ggacggacga ctcgaaaggg 480
gaagtgctgc ggtcgattca aacgttcacg gcgttctacc tggcgttcta caacaacgaa 540
ctgtcggaac tgaacgaacg gtcgttccaa gacaaatgcc tgccggcgct gaaatcgatt 600
gcgaaaaacc cgaacttcaa actggggacg gcggaacaag acacggtggt gtcggcgtac 660
gggaaactga tttcgaacgc gtcgtcggac gtggaaacgg tgcaatacgc gtcgaacatt 720
ctgaaacaat acaacgacaa cttcaacacg tacgtgaacg atcggatgaa agggcaagcg 780
atttacgaca ttatgcaaga cattgggatt gactaccaat cgtacctgat tgaagcgcgg 840
aaagaagcga acgaaacgat gtggtacggg aaagtggacg ggttcattaa cgaaattaac 900
aacaacggga tttacttcgc gtcgcggttc gaaaacaaat ggctggtgct gaacgaacgg 960
attgcgctgg tgacgccggg gaaattccac tcgaacccga acaaagggct ggaagtggtg 1020
acgcaagcgt cggaaccgat gcacatgtac ccgcggctgt acttcgtggc ggtggaacaa 1080
attacgacga actacaacgg gaaagactac tcggggaaca cggtggacct ggaaaaaatt 1140
cggaaagaag ggaaagaaca atacctgccg aaaacgtaca cgttcgacga cgggtcgatt 1200
gtgttcaaaa cgggggacaa agtgtcggaa gaaaaaatta aacggctgta ctgggcggcg 1260
aaagaagtga aagcgcaata ctaccacatt cggaacgtgg tggacaaagc gctggaaccg 1320
aacgcggacg acattctgac gattgtgatt aacctgaaac cgctggaccc gaaatcgccg 1380
cggcaactgt acgggtacga aacgaacggg aacattgaaa cggaatacac ggggacgtac 1440
cggacgccgg aacaattctt cacgtacgaa tcgatttact cgctggaaga actgttccgg 1500
cacgaattca cgcacgggcg gctgtacctg tacgaagtgc cggggctgtt cgggcggggg 1560
gacatgtacc aaaacgaacg gctgacgtgg ttccaagaag ggaacgcgga attcttcgcg 1620
gggtcgacgc ggacgaacaa cgtggtgccg cggaaatcga ttatttcggg gctgtcgtcg 1680
gacccggcgt cgcggtacac ggcggaacgg acgctgttcg cgaaatacgg gtcgtgggac 1740
ttctacaact actcgttcgc gctgcaatcg tacctgtaca cgcaccaatt cgaaacgttc 1800
gacaaaattc aagacctgat tcgggcgaac gacgtgtacc gggaatacaa ctcgccggaa 1860
gaataccaac tgaacaaaaa ctacgacgcg gaataccaag aatacatgca acaactgatt 1920
aacgtgccgg cggtggcgga cgactacctg gcggacaacc aagacaaata cgaacacgcg 1980
ccgaaatcgc tgacggcggt ggaaaaagaa atgacggaaa cgctgccgat gaaagacgcg 2040
aaaatgacga aacactcgtc gcaattcttc aacacgttca cgctggaagg gacgtacacg 2100
gggtcggtga cgaaagggga atcggaagac tggaacgcga tgtcgaaaaa agtgaacgaa 2160
gtgctggaac aactggcgca aaaagaatgg tcggggtaca aaacggtgac ggcgtacttc 2220
gtgaacaaag aagggattca attcaaatcg ttcgaatacg acgtggtgtt ccacgggatt 2280
gcgaaagacg acggggaaaa caaagcgccg acggtgaaca ttaacgggcc gtacaacggg 2340
ctggtgtacc gggtgaactc gtcgaacgaa gacgggtcga aagacgaaga cgggaaaatt 2400
gtgtcgtacc tgtgggactt cggggacggg cggacgtcga cggaagtgaa cccggtgcac 2460
gtgtacgaac gggaagggtc gtacaaagtg gcgctgattg tgaaagacga caaagggaaa 2520
gaatcgaaat cggaaacgac ggtgacggtg aaagacgggt cgctgacgga atcggaaccg 2580
aacaacgggc tggaagaagc gaaccggatt gggctgaaca cgacgattaa agggtcgctg 2640
attggggggg accacacgga cgtgtacacg ttcaacgtgg cgtcggcgaa agacattgac 2700
atttcggtgc tgaacgaata cgggattggg atgacgtggg tgctgcacca cgaatcggac 2760
atgcaaaact acgcggcgta cgggcaagcg aacgggaacc acattgaagc gaacttcaac 2820
gcgaaaccgg gggaatacta cctgtacgtg tacaaatacg acaacgggga cgggacgtac 2880
aaactgtcgg tgtaa 2895
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgaacaaaa aatcgaaaat t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttacaccgac agtttgtacg t 21

Claims (10)

1.一种脂肪干细胞的分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集脂肪组织；
S2、在步骤S1得到的脂肪组织中加入胶原酶进行消化得到脂肪干细胞；
S3、富集步骤S2得到脂肪干细胞；
S4、对步骤S3得到的脂肪干细胞进行纯化和传代培养；
其中，步骤S2中，所述胶原酶的氨基酸序列如Seq ID No.5所示；所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为40—60％；所述胶原酶在所述消化的体系中含量为0.20—0.30g/L；所述消化的时间为15—30min。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为50％；所述胶原酶的在所述消化的体系中含量为0.25g/L；所述消化的时间为20min。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述消化的体系使用生理盐水作为溶剂；所述消化的环境条件如下：温度为35—38℃，优选37℃；转速为50—200rpm，优选100rpm。
4.如权利要求1—3中任一所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述脂肪组织来自负压法抽脂术，还包括对所述脂肪组织使用生理盐水洗涤后进行机械破碎的步骤。
5.如权利要求1—4中任一所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述富集包括离心收集沉淀的步骤，所述离心的相对离心力为400—800g，时间为5—10min。
6.如权利要求1—5中任一所述的方法，其特征在于，步骤S4中，进行所述纯化和传代培养前，包括对所述脂肪干细胞进行洗涤的步骤。
7.如权利要求1—6中任一所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述纯化的方法为流式细胞术、免疫磁珠分选法、密度梯度离心或细胞贴壁培养法；优选，细胞贴壁培养法。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述细胞贴壁培养法和/或所述传代培养使用完全培养基进行，
优选的，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加8—20％(体积分数)胎牛血清、15—100ng/ml表皮生长因子、15—100ng/ml血管内皮生长因子、和3—50ng/ml人重组白细胞介素-3；更优选的，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加8—12％(体积分数)胎牛血清、15—25ng/ml表皮生长因子、15—25ng/ml血管内皮生长因子、和3—8ng/ml人重组白细胞介素-3；更优选的，所述完全培养基为以DMEM/F-12培养基为基液，添加10％(体积分数)胎牛血清、20ng/ml表皮生长因子、20ng/ml血管内皮生长因子、和5ng/ml人重组白细胞介素-3。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述细胞贴壁培养法中所述脂肪干细胞的初始种植密度为0.5×105个/ml—1.5×105个/ml；优选，1×105个/ml；
所述细胞贴壁培养法的培养条件为37℃、5％CO2条件下进行；
所述细胞贴壁培养法的培养时间为12—16天，培养至融合度为75—85％。
10.Seq ID No.5所示的胶原酶在分离脂肪干细胞中的应用。
CN201910213693.5A 2019-03-20 2019-03-20 一种脂肪干细胞的分离与培养方法 Active CN110079497B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910213693.5A CN110079497B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种脂肪干细胞的分离与培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910213693.5A CN110079497B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种脂肪干细胞的分离与培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110079497A true CN110079497A (zh) 2019-08-02
CN110079497B CN110079497B (zh) 2022-05-13

Family

ID=67413382

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910213693.5A Active CN110079497B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种脂肪干细胞的分离与培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110079497B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111484973A (zh) * 2020-06-04 2020-08-04 广州同康生物科技有限公司 一种脂肪干细胞的纯化方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101880649A (zh) * 2009-05-05 2010-11-10 中国福利会国际和平妇幼保健院 一种干细胞培养方法
CN101984049A (zh) * 2010-12-09 2011-03-09 协和干细胞基因工程有限公司 从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法
CN102391987A (zh) * 2011-11-17 2012-03-28 安徽农业大学 用于分离小鼠脂肪干细胞的消化液
CN102851243A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 北京市农林科学院 一株多粘类芽孢杆菌及其应用
CN104673745A (zh) * 2015-02-05 2015-06-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法
CN104789520A (zh) * 2015-03-10 2015-07-22 协和干细胞基因工程有限公司 利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法及获得的组织工程胰岛
CN105193847A (zh) * 2015-09-15 2015-12-30 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂及其制备方法和医用敷料
CN107828725A (zh) * 2017-12-15 2018-03-23 北京焕生汇生物技术研究院 一种脂肪干细胞分离和体外培养的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101880649A (zh) * 2009-05-05 2010-11-10 中国福利会国际和平妇幼保健院 一种干细胞培养方法
CN101984049A (zh) * 2010-12-09 2011-03-09 协和干细胞基因工程有限公司 从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法
CN102391987A (zh) * 2011-11-17 2012-03-28 安徽农业大学 用于分离小鼠脂肪干细胞的消化液
CN102851243A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 北京市农林科学院 一株多粘类芽孢杆菌及其应用
CN104673745A (zh) * 2015-02-05 2015-06-03 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种猪脂肪干细胞的分离培养方法
CN104789520A (zh) * 2015-03-10 2015-07-22 协和干细胞基因工程有限公司 利用脂肪间充质干细胞构建组织工程胰岛的方法及获得的组织工程胰岛
CN105193847A (zh) * 2015-09-15 2015-12-30 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种含有脂肪干细胞的凝胶制剂及其制备方法和医用敷料
CN107828725A (zh) * 2017-12-15 2018-03-23 北京焕生汇生物技术研究院 一种脂肪干细胞分离和体外培养的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张卫泽等: "人脂肪间充质干细胞的分离培养及其遗传稳定性", 《中国组织工程研究与临床康复》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111484973A (zh) * 2020-06-04 2020-08-04 广州同康生物科技有限公司 一种脂肪干细胞的纯化方法
CN111484973B (zh) * 2020-06-04 2021-08-27 铜仁市泛特尔生物技术有限公司 一种脂肪干细胞的纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110079497B (zh) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100489248B1 (ko) 제대혈 유래 간엽줄기세포ㆍ전구세포의 분리배양방법 및간엽조직으로의 분화유도방법
CN107475190B (zh) 一种脂肪svf细胞临床级高效制备和冻存的方法及其用途
WO1998020731A9 (en) Msc-megakaryocyte precursor composition and method of isolating mscs associated with isolated megakaryocytes by isolating megakaryocytes
JP2001510330A (ja) ＭＳＣ―メガカリオサイト前駆体組成物およびメガカリオサイト分離による分離メガカリオサイトと会合するＭＳＣ▲下ｓ▼の分離方法
NO169497B (no) Fremgangsmaate for fremstilling av en serumavhengig human cellelinje
CN103525752B (zh) 一种山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化方法
CN109837239A (zh) 一种人脂肪干细胞原代培养及无血清多向诱导分化方法
CN101831403B (zh) 体外扩增人脐带胎盘间充质干细胞的方法
CN107418930A (zh) 一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法
CN101821383A (zh) 一种用于人成体原始间充质干细胞体外规模化培养的培养基、方法及获得的原始间充质干细胞及其应用
CN104651305A (zh) 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法
Hassan et al. Isolation of umbilical cord mesenchymal stem cells using human blood derivatives accompanied with explant method
CN109897815B (zh) 一种无需包被的脂肪内皮祖细胞的高效分离和培养方法
CN110846273A (zh) 一种脂肪组织来源的间充质干细胞培养及三系分化诱导方法
CN109797136A (zh) 一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法
CN110079497A (zh) 一种脂肪干细胞的分离与培养方法
CN109837241A (zh) 脂肪干细胞的分离与培养方法
CN111690686B (zh) 一种miRNA高表达在促进脐带间充质干细胞体外增殖和成骨分化方面的应用
CN113322231A (zh) 一种间充质干细胞的分离和培养方法及制剂
CN108486039A (zh) 小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
CN108753709A (zh) 一种无血清培养基及其制备与细胞培养方法
CN102140440A (zh) 用骨髓组织块分离及培养禽类骨髓间充质干细胞的方法
CN102041243A (zh) 一种快速分离骨髓间充质干细胞的试剂盒及方法
CN111172104A (zh) 一种脐血间充质干细胞的分离培养方法
CN105624115B (zh) 一种诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞的培养基及其诱导方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant