CN102391987A - 用于分离小鼠脂肪干细胞的消化液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于分离小鼠脂肪干细胞的消化液。所述消化液的组成成分为10％的胎牛血清，0.09％的胶原酶I，余量为DMEM/F12。本发明的成分简单，来源方便，成本低；能够有效的从小鼠的脂肪组织中分离出脂肪干细胞；能够很好的维持细胞的活性，为细胞的后期培养和进一步的科学研究奠定了基础。
Description
[技术领域]
本发明涉及动物干细胞的分离技术领域，尤其涉及一种用于分离小鼠脂肪干细胞的消化液。
[背景技术]
脂肪干细胞具有多向分化的潜能，在体外可定向分化为脂肪、成骨、软骨、肝脏、心肌细胞等，在人源方面，相比于骨髓干细胞，其具有取材容易、获取量大、减少取材时供体痛苦的优点，因此在再生医学上具有重要的意义。
小鼠作为一个重要的模式动物，在基础研究方面有着广泛的应用，但是小鼠脂肪干细胞的体外培养却一直是个难题，体现在从分离到培养的各个方面，小鼠脂肪干细胞的分离一般采用酶消化法，作为分离培养的初始阶段，若没有采用合适的消化体系，往往导致细胞后期培养的诸多问题。
目前也有一些已报道的消化液，较简单有用含1％牛血清白蛋白(BSA)的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)溶解，胶原酶终浓度为0.075％或0.1％，较复杂的配方有0.1％胶原酶，1-2％BSA、200nM腺苷酸、50mg/ml的葡萄糖。
上述消化液的不足之处在于：前者经实验发现，在相同条件下，前者原代后传代4天即已充分老化无法维持。后者消化液对其可实践性没有做详细探究，但其成分相对复杂，并且其中腺苷酸的价格高昂，提高了消化液的成本。
[发明内容]
本发明要解决的技术问题是提供一种成分简单，效果明显的消化液，能够高效的分离出小鼠的脂肪干细胞，使有利于其后期的长期培养。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种用于分离小鼠脂肪干细胞的消化液，所述消化液的组成成分为10％的胎牛血清(FBS)，0.09％的胶原酶I，余量为DMEM/F12。
通过针对现有方案中含1％BSA的DPBS消化液存在的问题以及添加葡萄糖和腺苷酸进入消化液必要性的综合考虑，我们认为，前者的主要问题在于将近一个小时的消化过程中，仅仅添加BSA不能很好的维持细胞在此过程中的营养需求以及维持其活性。因此后期的培养过程中细胞在第一代便出现老化，很可能与前期的损伤有关。
为此选用基础培养基，同时添加一定量的FBS来溶解胶原酶以提供细胞在长时间消化过程中的营养消耗，并维持细胞的活性。在此体系中胶原酶以及FBS的浓度对细胞的分离率以及细胞的活性有着重要的影响，FBS的浓度过高或胶原酶浓度过低会影响细胞的分离率，反之则会影响细胞的活性，在代数低的时候也许体现不是很明显，随着代数的增加则会明显的体现出来。
本发明的有益效果是：
1.消化液成分简单，来源方便、成本低；
2.能够有效的从小鼠的脂肪组织中分离出脂肪干细胞；
3.能够很好的维持细胞的活性，为细胞的后期培养和进一步的科学研究奠定了基础。
[具体实施方式]
本实施例按各组成成分的不同配比设计了下述三个实验组，每组取同样量的脂肪组织，分别用以下三种不同配比的消化液进行消化。
三种消化液的具体成分如下(10ml体系)；
(1)消化液一
| 成分 | 比例 | 添加量 |
| 胎牛血清 | 0 | 0 |
| 胶原酶I | 0.1％ | 0.01g |
| DMEM/F12 | 10ml |
(2)消化液二
| 成分 | 比例 | 添加量 |
| 胎牛血清 | 10％ | 1ml |
| 胶原酶I | 0.09％ | 0.009g |
| DMEM/F12 | 9ml |
(3)消化液三
| 成分 | 比例 | 添加量 |
| 胎牛血清 | 20％ | 2ml |
| 胶原酶I | 0.08％ | 0.008g |
| DMEM/F12 | 8ml |
通过实验发现，同样的组织量，用消化液一和消化液二消化，48h后贴壁细胞占底面积将近40％，而消化液三得到的细胞5％不到。用同样的培养液(其组成成分：胎牛血清20％，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，DMEM/F12补足到100％)培养，消化液三得到的细胞且6天后细胞即已死亡，原代无法维持。消化液一、二得到的细胞原代具有良好的状态并可继续传代。
由于消化液三的分离效率过低，不利于后期的应用，后期仅对消化液一和消化液二所消化的细胞传代能力做了进一步的探索。分别将经消化液一和消化液二消化后得到的细胞，用完全培养基(其组成成分：胎牛血清20％，青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml，维生素C 50μg/ml，DMEM/F12补足到100％)培养并连续传代，消化液一得到的细胞传至17代便严重老化无法继续传代，随后死亡，而用消化液二得到的此代的细胞仍有较快的增速度，细胞传至30代，仍然具有良好的形态，并可继续传代。
用消化液二消化得到的细胞，流式细胞仪检测间充质来源细胞的表面抗原CD44表达率为99.75％、CD105为68.77％，干细胞表面抗原Sca-1为99.01％，与现有的报道基本相符，同时我们也检测了杂细胞表面标记的表达率，其中造血干细胞表面抗原CD45为0.25％，内皮细胞表面抗原CD31为0.79％，成纤维细胞表面抗原HLA-DR为0.24％，杂细胞的比例非常低，细胞相纯度较高。
成脂与成骨诱导的结果表明，其在体外能够很好的分化为成熟的脂肪细胞和成骨细胞，而对照组未分化，说明消化液二在小鼠脂肪干细胞分离培养的初始阶段起了很好的作用，有利于后期培养维持脂肪干细胞的相关特性。
Claims (1)
1.一种用于分离小鼠脂肪干细胞的消化液，其特征在于，所述消化液的组成成分为10％的胎牛血清，0.09％的胶原酶I，余量为DMEM/F12。
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| CN2011103661110A CN102391987A (zh) | 2011-11-17 | 2011-11-17 | 用于分离小鼠脂肪干细胞的消化液 |
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| CN (1) | CN102391987A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667187A (zh) * | 2012-09-12 | 2014-03-26 | 贵州神奇集团控股有限公司 | 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法 |
| CN110079497A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-08-02 | 济南赛尔生物科技股份有限公司 | 一种脂肪干细胞的分离与培养方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101845416A (zh) * | 2010-03-27 | 2010-09-29 | 戴景兴 | 老年性痴呆治疗用脂肪源干细胞 |
| CN102140437A (zh) * | 2011-01-07 | 2011-08-03 | 西北农林科技大学 | 一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法 |
| CN102146358A (zh) * | 2011-01-17 | 2011-08-10 | 西北农林科技大学 | 山羊黄体细胞系的建立方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101845416A (zh) * | 2010-03-27 | 2010-09-29 | 戴景兴 | 老年性痴呆治疗用脂肪源干细胞 |
| CN102140437A (zh) * | 2011-01-07 | 2011-08-03 | 西北农林科技大学 | 一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法 |
| CN102146358A (zh) * | 2011-01-17 | 2011-08-10 | 西北农林科技大学 | 山羊黄体细胞系的建立方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| CHEN CHAO 等: "Cultur e of r abbit osteoblasts digested by collagenase in DMEM containing fetal bovine serum", 《中国临床康复》 * |
| 张艳芳 等: "猪肌内前体脂肪细胞的体外培养", 《农业生物技术学报》 * |
| 杨旭芳 等: "高度同源性人脂肪间充质干细胞体外分离培养条件的优化", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
| 郑金旭 等: "构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型", 《中国组织工程研究与临床康复》 * |
| 郭悦劼 等: "大鼠脑动脉平滑肌细胞的体外培养与鉴定", 《中风与神经疾病杂志》 * |
| 陈超 等: "含胎牛血清胶原酶消化法培养兔成骨细胞", 《中国矫形外科杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667187A (zh) * | 2012-09-12 | 2014-03-26 | 贵州神奇集团控股有限公司 | 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法 |
| CN110079497A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-08-02 | 济南赛尔生物科技股份有限公司 | 一种脂肪干细胞的分离与培养方法 |
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