CN102140437A - 一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法 - Google Patents

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宋子仪
张国华
赵丽丽
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Abstract

本发明公开了一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法，包括以下步骤：a.猪成熟脂肪细胞的分离；b.天花板培养法去分化猪成熟脂肪细胞；c.去分化脂肪细胞的传代培养。本发明提供的方法能够廉价、快速而高效的获得大量去分化的脂肪细胞，所使用的培养基价格低廉，去分化的代价较低，可以大范围的推广使用。

Description

一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法。
背景技术
脂肪组织成熟脂肪细胞去分化为前体脂肪细胞，是近年来发展起来的一种获得纯净、同质的前体脂肪细胞的方法。前体脂肪细胞在研究与肥胖相关疾病的致病机理及治疗方法等方面是一个理想的体外模型，而猪是目前研究人类肥胖、糖尿病及其并发症等疾病的最佳模式动物，因此，从猪的脂肪组织获得成熟脂肪细胞并去分化为前体脂肪细胞具有极其重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法。
一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法，包括以下步骤：
a.猪成熟脂肪细胞的分离
无菌条件下采集1-30日龄仔猪颈、背部皮下脂肪组织，把剪下的脂肪组织放在玻璃皿中，用含有双抗的PBS缓冲液清洗2次。然后将脂肪组织转入到另一个干净的玻璃皿中，并用眼科手术剪将脂肪组织剪成约1mm3的小块，之后将脂肪组织碎块转入一个体积为30ml的小玻璃瓶中，向小玻璃瓶中加入10-15ml 1％Ⅰ型胶原酶消化液，盖好盖子后将瓶口用封口膜封好后带出细胞间，在37℃水浴锅中振荡消化；
消化完后用酒精棉球将玻璃瓶擦拭干净并带入细胞间，在无菌操作台上加入等体积的DMEM/F12完全培养基，中和胶原酶的消化反应，然后将细胞消化液经两层200目不锈钢细胞筛网过滤到100mL烧杯中，过滤完后将滤液转入到10mL离心管中；在低速离心机中，以800-900r/min离心3-5min，小心取出10mL离心管，离心管中最上层可见的白色的细胞团即为成熟脂肪细胞；
用枪将白色的细胞团小心吸至一新的10ml离心管，之后加入5ml左右的PBS，并用枪反复吹打，之后800r/min离心3-5min；重复3次，直至得到的细胞悬液纯白色为止；
b.天花板培养法去分化猪成熟脂肪细胞
将分离的成熟脂肪细胞接种入25cm2的培养瓶中，然后在瓶内装满含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基；盖紧瓶盖，轻轻摇匀，然后颠倒，静置于37℃，5％的CO2和95％的空气的培养箱中；
培养至第八天时，倒掉培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞3次，然后正置培养瓶，加入6-8ml含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基，之后每四天更换一次培养基，大约12天便可达到融合；
c.去分化脂肪细胞的传代培养
待细胞达到90％-95％融合后，倒掉培养基，用PBS清洗两次，然后加入2ml温育过的含0.02％EDTA的0.25％的胰酶消化液，孵育片刻，显微镜下观察到95％-99％的细胞均变圆，然后加入含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基1-2ml终止消化，然后用弯头吸管吹打瓶底，将细胞全部吹落下来，之后1500rpm离心5min，弃掉上清，在离心管中加入含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基900μl，，然后1∶3传代；大约2-3天细胞长满后，便又可进行传代。
所述的培养方法，剪碎的脂肪组织在37℃水浴锅中振荡消化的时间是45-60min。
所述的培养方法，成熟脂肪细胞接种密度为1-2.5×104cells/cm2。
所述的培养方法，成熟脂肪细胞去分化时，培养基用含四季青胎牛血清体积百分比为15～25％的DMEM/F12生长培养基；培养瓶正置以后用含hyclone胎牛血清体积百分比为15～25％的DMEM/F12生长培养基。
所述的培养方法，传代培养用含hyclone血清体积百分比为15～25％的DMEM/F12生长培养基。
本发明提供的方法能够廉价、迅速而高效的获得大量去分化的脂肪细胞，所使用的培养基价格低廉，去分化的代价较低可以大范围的推广使用。
附图说明
图1.天花板培养法流程图；
图2.培养1d后的细胞照片；
图3.培养2d后的细胞照片；
图4.培养3d后的细胞照片；
图5.培养4d后的细胞照片；
图6.培养5d后的细胞照片；
图7.培养6d后的细胞照片；
图8.培养7d后的细胞照片；
图9.培养8d后的细胞照片；
图10.培养9d后的细胞照片；
图11.培养10d后的细胞照片；
图12.培养11d后的细胞照片；
图13.培养12d后的细胞照片；
图14.胰酶消化完的细胞状态；
图15.1∶3传代培养刚接种的细胞照片；
图16.传代培养第一代的细胞；
图17.传代培养第二代的细胞；
图18.传代培养第三代的细胞。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法。包括以下操作步骤：
a.猪成熟脂肪细胞的分离
无菌条件下采集1-30日龄仔猪颈、背部皮下脂肪组织，把剪下的脂肪组织放在玻璃皿中，用含有双抗的PBS缓冲液清洗2次。然后将脂肪组织转入到另一个干净的玻璃皿中，并用眼科手术剪将脂肪组织剪成约1mm3的小块，之后将脂肪组织碎块转入到一个30ml的小玻璃瓶中，向小玻璃瓶中加入10-15ml 1％Ⅰ型胶原酶消化液，盖好盖子后将瓶口用封口膜封好后带出细胞间，在37℃水浴锅中振荡消化45-60min(具体时间与猪的年龄和组织块大小有关系)。
消化完后用酒精棉球将玻璃瓶擦拭干净并带入细胞间，在无菌操作台上加入等体积的DMEM/F12完全培养基，中和胶原酶的消化反应，然后将细胞消化液经两层200目不锈钢细胞筛过滤到100mL烧杯中，过滤完后将滤液转入到10mL离心管中。在低速离心机中，以800-900r/min离心3-5min，小心取出10mL离心管，离心管中最上层可见的白色的细胞团即为成熟脂肪细胞。
然后，用枪将白色的细胞团小心吸至一新的10ml离心管，之后加入5ml左右的PBS，并用枪反复吹打，之后800r/min离心3-5min。如此重复3次，直至得到的细胞悬液纯白色为止。
b.天花板培养法去分化猪成熟脂肪细胞
将分离的成熟脂肪细胞(大约1-2.5×104cells/cm2)加入25cm2的培养瓶中，然后在瓶内装满含20％血清(四季青胎牛血清)的DMEM/F12生长培养基。盖紧瓶盖，轻轻摇匀，然后颠倒，静置于37℃，5％的CO2和95％的空气的培养箱中。
12h时成熟脂肪细胞已经贴在了培养瓶的内表面，并可观察到多室的成熟脂肪细胞，说明成熟脂肪细胞已经开始去分化。大约4天后，就可见无脂滴的成纤维细胞；到第六天时，成纤维细胞大量增多，多室脂肪细胞脂滴逐渐减少；第七天时，倒掉培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞3次，然后正置培养瓶，加入6-8ml含20％血清(hyclone公司)的DMEM/F12生长培养基，之后每四天更换一次培养基，大约12天便可达到融合。
c.去分化脂肪细胞的传代培养
细胞有90％细胞融合后，倒掉培养基，用PBS清洗两次，然后加入2ml含0.02％EDTA的0.25％的胰酶消化液，孵育片刻，显微镜下观察到95-99％的细胞均变圆，轻轻的吸掉胰酶，然后加入含20％血清(hyclone公司)的DMEM/F12生长培养基1-2ml，用弯头吸管吹打瓶底，将细胞全部吹落下来，然后按1∶3传代。大约2-3天细胞长满后，便又可传代。
第一次之后的传代，采用更简便的方法，不需要传代。即显微镜下观察到95％-99％的细胞均变圆后，轻轻的吸掉胰酶，然后加入含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基900μl，用弯头吸管吹打瓶底，将细胞全部吹落下来，之后1∶3传代，每个皿中加300μl；大约2-3天细胞长满后，便又可进行传代。
采用本发明的方法，第一天细胞就开始大量的去分化，从单室大脂滴细胞变成多室的小脂滴细胞，并且在12天时就可以传代培养。这种去分化的速度，在国内外都处于领先地位。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.一种猪成熟脂肪细胞快速去分化为前体脂肪细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.猪成熟脂肪细胞的分离
无菌条件下采集1-30日龄仔猪颈、背部皮下脂肪组织，把剪下的脂肪组织放在玻璃皿中，用含有双抗的PBS缓冲液清洗2次。然后将脂肪组织转入到另一个干净的玻璃皿中，并用眼科手术剪将脂肪组织剪成约1mm3的小块，之后将脂肪组织碎块转入一个体积为30ml的小玻璃瓶中，向小玻璃瓶中加入10-15ml 1％Ⅰ型胶原酶消化液，盖好盖子后将瓶口用封口膜封好后带出细胞间，在37℃水浴锅中振荡消化；
消化时间到了后用酒精棉球将玻璃瓶擦拭干净并带入细胞间，在无菌操作台上加入等体积的DMEM/F12完全培养基，中和胶原酶的消化反应，然后将细胞消化液经两层200目不锈钢细胞筛网过滤到100mL烧杯中，过滤完后将滤液转入到10mL离心管中；在低速离心机中，以800-900r/min离心3-5min，小心取出10mL离心管，离心管中最上层可见的白色的细胞团即为成熟脂肪细胞；
用枪将白色的细胞团小心吸至一新的10ml离心管，之后加入5ml左右的PBS并用枪反复吹打，以纯化成熟脂肪细胞，之后800r/min离心3-5min；重复3次，直至得到的细胞悬液纯白色为止；
b.天花板培养法去分化猪成熟脂肪细胞
将分离的成熟脂肪细胞接种入25cm2的培养瓶中，然后在瓶内灌满含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基；盖紧瓶盖，轻轻摇匀，然后颠倒，静置于37℃，5％的CO2和95％的空气的培养箱中；
培养至第七天时，倒掉培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞3次，然后正置培养瓶，加入6-8ml含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基，之后每四天更换一次培养基，大约12天便可达到融合；
c.去分化脂肪细胞的传代培养
待细胞达到90％-95％融合后，倒掉培养基，用PBS清洗两次，然后加入2ml温育过的含0.02％EDTA的0.25％的胰酶消化液，孵育片刻，显微镜下观察到95％-99％的细胞均变圆，然后加入含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基1-2ml终止消化，然后用弯头吸管吹打瓶底，将细胞全部吹落下来，之后1500r/min离心5min，弃掉上清，在离心管中加入含15％～25％胎牛血清的DMEM/F12生长培养基900μl，然后1∶3传代；大约2-3天细胞长满后，便又可进行传代。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，剪碎的脂肪组织在37℃水浴锅中振荡消化的时间是45-60min。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，成熟脂肪细胞接种密度为1-2.5×104cells/cm2。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，成熟脂肪细胞去分化时，培养基用含四季青胎牛血清体积百分比为15％～25％的DMEM/F12生长培养基；培养瓶正置以后用含hyclone胎牛血清体积百分比为15％～25％的DMEM/F12生长培养基。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，传代培养用含hyclone血清体积百分比为15％～25％的DMEM/F12生长培养基。
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