CN104818244B - 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 - Google Patents
一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104818244B CN104818244B CN201510263291.8A CN201510263291A CN104818244B CN 104818244 B CN104818244 B CN 104818244B CN 201510263291 A CN201510263291 A CN 201510263291A CN 104818244 B CN104818244 B CN 104818244B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- epithelial cells
- amniotic epithelial
- culture
- amniotic
- amnion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Abstract
一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，它涉及一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法。本发明是要解决现有方法分离、培养的羊膜上皮细胞的纯度低的问题，方法为：一、羊膜组织分离和消毒；二、羊膜上皮细胞分离；三、羊膜上皮细胞纯化培养，得到高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，即完成。本发明羊膜组织制成羊膜贴片后可以保证羊膜上皮面平整，同时羊膜背面粘液与结缔组织与硝酸纤维膜紧密贴合，促进胰酶消化效率和细胞与组织的分离，短时间消化即可收集全部羊膜上皮细胞，避免了细胞贴壁率的降低，短时间培养后进行两次胰酶消化，获得了高纯度羊膜上皮细胞。本发明应用于基础研究和临床移植领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法。
背景技术
围产期废弃的羊膜组织是重要的再生医学种子细胞来源之一，其来源广泛、易于获取且无伦理道德争议，是近年的研究热点。羊膜中可分离出羊膜上皮细胞(humanamniotic epithelial cell,hAEC)和羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymalstem cell,hAMSC)，两种干细胞均具有含量丰富、免疫原性低、无致瘤性等特点是未来临床治疗的主要干细胞资源，其中羊膜上皮细胞具有更多的“干性”，更为接近胚胎干细胞的性质，因此成为再生医学领域研究热点。
羊膜上皮细胞在受精后第8天由外胚层发育而来，衬于羊膜内表面，大部分为单层立方和柱状细胞，参与羊水形成和传递，还可合成、分泌和形成基底膜细胞外间质成分。研究显示，羊膜上皮细胞同样具有一定三胚层分化潜能，表达多种与胚胎干细胞相关的表面标志：SSEA3/4、TRA1-60/81、Nanog、Oct4、Sox2等，可在体外特定的诱导条件下可分化成肝细胞、心肌样细胞、神经细胞、成骨及软骨细胞，而且免疫原性低，具有抗炎作用。羊膜上皮细胞还分泌生理水平的与损伤修复有关的细胞因子，如血小板源性生长因子、血管内皮细胞生长因子、血管生成因子、转化生长因子β2、金属蛋白酶组织抑制剂1和金属蛋白酶组织抑制剂2。这些细胞因子能够促进种细胞增殖，减少炎症反应，调节损伤修复的许多关键步骤。临床前研究显示人羊膜上皮细胞在治疗神经组织退化疾病、心肌组织损伤、糖尿病等疾病模型中有显著作用，证明在组织修复领域羊膜上皮细胞具有重要的医疗价值。
目前常规羊膜上皮细胞的分离方法采用0.25％胰酶一次或多次消化法，由于羊膜间充质干细胞的胰酶消化效率比羊膜上皮细胞更高，往往会对羊膜上皮细胞造成污染，导致纯度下降。同时羊膜组织极薄，而且柔软、黏连，不易操作，装在离心管或无菌瓶中进行胰酶消化常常折叠、堆积在一起，细胞消化后也很难摆脱羊膜组织，导致羊膜组织中细胞的过度留存。同时羊膜背面有粘液、血渍和多余的结缔组织等物质会影响胰酶消化效率，降低羊膜上皮细胞的产出，但消化时间(目前比较普遍的多次胰酶消化法总消化时间在30-50min左右)的过度延长又会导致细胞贴壁率下降、增殖分化能力降低，表面抗原标记丢失。专利CN201410050051(人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法)和CN201310650384(一种从人羊膜中制取干细胞的方法)中采用胰酶分步消化，想达到提高羊膜上皮细胞纯度的目的，但事实表明消化后羊膜组织往往堆积悬浮于溶液中黏附、包裹住大量的羊膜上皮细胞，因此需要用生理盐水或D-Hanl’s平衡液多次反复冲洗，这样造成了羊膜间充质干细胞的大量溢出，降低了羊膜上皮细胞纯度。CN201410050051(人胎盘亚全能干细胞及其干细胞库构建方法)在羊膜剥离后采用载玻片去除羊膜背面血管、结缔组织，碾压作用会直接破坏羊膜上皮细胞，且长时间操作导致羊膜上皮细胞活性降低。
发明内容
本发明是要解决现有方法分离、培养的羊膜上皮细胞的纯度低的问题，提供了一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法。
本发明一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，是按以下步骤完成的：
一、羊膜组织分离和消毒：将羊膜自胎盘上剥离，然后用生理盐水冲洗2～3遍，再在含有1％～3％头孢哌酮的生理盐水中浸泡3～10min；
二、羊膜上皮细胞分离：将羊膜裁剪成50～150cm2的块状，然后将裁剪后的羊膜的上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向培养皿A中加入3～10mL生理盐水，再将羊膜的上皮面朝下贴置在培养皿A中，静置2～3min，获得羊膜贴片；将羊膜贴片置于培养皿B中，加入10～30ml质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA消化15～20min，然后封口膜封口后将培养皿放入恒温摇床中消化，得到消化液，再加入2～5ml胎牛血清终止酶反应，然后去除羊膜贴片上团聚、黏连的羊膜上皮细胞，再将羊膜贴片转移至装有生理盐水的培养皿C中，清洗贴壁的羊膜上皮细胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，经100目细胞筛过滤，获得羊膜上皮细胞单细胞悬液；
三、羊膜上皮细胞纯化培养：将步骤二获得的羊膜上皮细胞单细胞悬液在4℃、1500rpm的条件离心5～15min，弃上清，然后加入含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基重悬细胞，混匀后按0.9～1.1×105/cm2的接种量接种于培养瓶中，再置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，细胞融合率达到85％后，弃除非贴壁细胞，并用生理盐水冲洗2次，然后加入质量浓度为0.05％的胰酶-EDTA消化，37℃消化2～5min，弃除消化液，再用生理盐水冲洗1～2次，然后加入质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA，在37℃条件下消化3～6min，再加入FBS终止酶反应，收集消化液，将消化液在4℃、1500rpm旋转震荡的条件下离心5～15min，弃上清，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞，得到高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，即完成。
本发明的有益效果有：
(一)羊膜组织制成羊膜贴片后可以保证羊膜上皮面平整，同时羊膜背面粘液与结缔组织与硝酸纤维膜紧密贴合，促进胰酶消化效率和细胞与组织的分离，短时间消化即可收集全部羊膜上皮细胞，避免了细胞贴壁率的降低。
(二)羊膜上皮细胞附着于羊膜表面基底膜外侧，可以优先与组织分离，羊膜背面与硝酸纤维膜贴合阻碍了羊膜组织中间质细胞的流出，操作中羊膜组织不需要大幅度搅动也可使羊膜上皮细胞与羊膜组织充分分离，进一步降低了羊膜间充质干细胞的污染。
(三)短时间培养后使用0.05％胰酶，37℃消化2-5min可使羊膜间充质干细胞完全分离，此时羊膜上皮细胞尚保持平展贴壁状态，纯化后，加入0.25％胰酶，37℃消化3-6min即可获得高纯度羊膜上皮细胞。
附图说明
图1为试验1制备的p1代羊膜上皮细胞形态的显微镜图；
图2为试验1制备的P1代羊膜间充质干细胞形态的显微镜图；
图3为试验1对照组p1代羊膜上皮细胞形态的显微镜图；
图4为试验1制备的p1代羊膜上皮细胞中Cytokeratin19免疫荧光表达图(×100)；
图5为试验1制备的p1代羊膜上皮细胞中DAPI免疫荧光表达图(×100)；
图6为试验1制备的p1代羊膜上皮细胞Cytokeratin19和DAPI免疫荧光表达整合图(×100)；
图7为试验1制备的p1代羊膜上皮细胞中Cytokeratin19免疫荧光表达图(×200)；
图8为试验1制备的p1代羊膜上皮细胞中DAPI免疫荧光表达图(×200)；
图9为试验1制备的p1代羊膜上皮细胞Cytokeratin19和DAPI免疫荧光表达整合图(×200)。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，是按以下步骤完成的：
一、羊膜组织分离和消毒：将羊膜自胎盘上剥离，然后用生理盐水冲洗2～3遍，再在含有1％～3％头孢哌酮的生理盐水中浸泡3～10min；
二、羊膜上皮细胞分离：将羊膜裁剪成50～150cm2的块状，然后将裁剪后的羊膜的上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向培养皿A中加入3～10mL生理盐水，再将羊膜的上皮面朝下贴置在培养皿A中，静置2～3min，获得羊膜贴片；将羊膜贴片置于培养皿B中，加入10～30ml质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA消化15～20min，然后封口膜封口后将培养皿放入恒温摇床中消化，得到消化液，再加入2～5ml胎牛血清终止酶反应，然后去除羊膜贴片上团聚、黏连的羊膜上皮细胞，再将羊膜贴片转移至装有生理盐水的培养皿C中，清洗贴壁的羊膜上皮细胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，经100目细胞筛过滤，获得羊膜上皮细胞单细胞悬液；
三、羊膜上皮细胞纯化培养：将步骤二获得的羊膜上皮细胞单细胞悬液在4℃、1500rpm的条件离心5～15min，弃上清，然后加入含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基重悬细胞，混匀后按0.9～1.1×105/cm2的接种量接种于培养瓶中，再置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，细胞融合率达到85％后，弃除非贴壁细胞，并用生理盐水冲洗2次，然后加入质量浓度为0.05％的胰酶-EDTA消化，37℃消化2～5min，弃除消化液，再用生理盐水冲洗1～2次，然后加入质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA，在37℃条件下消化3～6min，再加入FBS终止酶反应，收集消化液，将消化液在4℃、1500rpm旋转震荡的条件下离心5～15min，弃上清，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞，得到高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，即完成。
本实施方式的有益效果有：
(一)羊膜组织制成羊膜贴片后可以保证羊膜上皮面平整，同时羊膜背面粘液与结缔组织与硝酸纤维膜紧密贴合，促进胰酶消化效率和细胞与组织的分离，短时间消化即可收集全部羊膜上皮细胞，避免了细胞贴壁率的降低。
(二)羊膜上皮细胞附着于羊膜表面基底膜外侧，可以优先与组织分离，羊膜背面与硝酸纤维膜贴合阻碍了羊膜组织中间质细胞的流出，操作中羊膜组织不需要大幅度搅动也可使羊膜上皮细胞与羊膜组织充分分离，进一步降低了羊膜间充质干细胞的污染。
(三)短时间培养后使用0.05％胰酶，37℃消化2～5min可使羊膜间充质干细胞完全分离，此时羊膜上皮细胞尚保持平展贴壁状态，纯化后，加入0.25％胰酶，37℃消化3-6min即可获得高纯度羊膜上皮细胞。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一所述的剥离方式为钝性剥离。其他步骤和参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述的培养皿A、培养皿B和培养皿C为直径是9～15cm的培养皿。其他步骤和参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二所述的消化是在37℃，60～120rpm的条件下，消化15～20min。其他步骤和参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中用平头镊子、玻璃棒或细胞刮匙去除羊膜贴片上团聚、黏连的羊膜上皮细胞。其他步骤和参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三所述的按1.0×105/cm2的接种量接种于培养瓶中。其他步骤和参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三所述的含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基中表皮生长因子的终浓度为10ng/ml。其他步骤和参数与具体实施方式一至六之一相同。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
试验1、本试验一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，是按以下步骤完成的：
一、羊膜组织分离和消毒：将羊膜自胎盘上剥离，然后用生理盐水冲洗2～3遍，再在含有2％头孢哌酮的生理盐水中浸泡8min；
二、羊膜上皮细胞分离：将羊膜裁剪成60cm2的块状，然后将裁剪后的羊膜的上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向培养皿A中加入5mL生理盐水，再将羊膜的上皮面朝下贴置在培养皿A中，静置3min，获得羊膜贴片；将羊膜贴片置于培养皿B中，加入20ml质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA消化15min，然后封口膜封口后将培养皿放入恒温摇床中消化，得到消化液，再加入3ml胎牛血清终止酶反应，然后去除羊膜贴片上团聚、黏连的羊膜上皮细胞，再将羊膜贴片转移至装有生理盐水的培养皿C中，清洗贴壁的羊膜上皮细胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，经100目细胞筛过滤，获得羊膜上皮细胞单细胞悬液；
三、羊膜上皮细胞纯化培养：将步骤二获得的羊膜上皮细胞单细胞悬液在4℃、1500rpm的条件离心10min，弃上清，然后加入含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基重悬细胞，混匀后按0.9～1.1×105/cm2的接种量接种于培养瓶中，再置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，细胞融合率达到85％后，弃除非贴壁细胞，并用生理盐水冲洗2次，然后加入质量浓度为0.05％的胰酶-EDTA消化，37℃消化3min，弃除消化液，再用生理盐水冲洗1～2次，然后加入质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA，在37℃条件下消化5min，再加入FBS终止酶反应，收集消化液，将消化液在4℃、1500rpm旋转震荡的条件下离心10min，弃上清，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞，得到高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，即完成。
本试验对照试验未纯化P1代羊膜上皮细胞，将收集的羊膜上皮细胞单细胞悬液在4℃、1500rpm的条件离心10min，弃上清，然后加入含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基重悬细胞，混匀后按1.0×105/cm2的接种量接种于培养瓶中，再置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，细胞贴壁率达到85％后，弃除非贴壁细胞，并用生理盐水冲洗2次，然后加入0.25％的胰酶-EDTA，在37℃条件下消化3-6min，再加入FBS终止酶反应，收集消化液，将消化液在4℃、1500rpm的条件下离心10min，弃上清，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞，得到P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，然后进行接种获得未纯化P1代羊膜上皮细胞，即完成。
对本试验制备的高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液进行传代培养，用倒置相差显微镜观察p1～p3代羊膜上皮细胞，发现P1-P3代形态均维持鹅卵石状，无成纤维样细胞混杂。p1代羊膜上皮细胞形态如图1所示。从p1代羊膜上皮细胞中提取P1代羊膜间充质干细胞，用显微镜观察，结果如图2所示，从图2可以看出羊膜上皮细胞呈鹅卵石状，羊膜间充质干细胞类似于成纤维样细胞，形态差异明显。对照组未经过纯化培养的p1代羊膜上皮细胞如图3所示，羊膜上皮细胞中混杂有成纤维样细胞，表明未经纯化培养过程的羊膜上皮细胞会存在有羊膜间充质干细胞污染现象。
对本试验制备的P0代羊膜上皮细胞进行流式检测，检测结果显示如表1所示，由表1可知，羊膜上皮细胞中SSEA-4的表达率纯化后均明显提高，而羊膜间充质干细胞无SSEA-4表达，表明经过纯化培养有效去除了羊膜间充质干细胞的污染。
表1流式检测结果表
| 纯化后羊膜上皮细胞 | 未纯化羊膜上皮细胞 | 羊膜间充质干细胞 | |
| CD29 | 99.66％ | 99.62％ | 99.70％ |
| CD73 | 99.77％ | 99.35％ | 99.52％ |
| CD105 | 84.85％ | 55.24％ | 99.63％ |
| SSEA-4 | 55.66％ | 47.57％ | 0.11％ |
对将本试验制备的高纯度P0代羊膜上皮细胞进行接种，得到p1代的羊膜上皮细胞，取p1代的羊膜上皮细胞进行免疫荧光检测，图4为在显微镜倍数为100的条件下p1代羊膜上皮细胞中Cytokeratin19免疫荧光表达图；图5为在显微镜倍数为100的条件下p1代羊膜上皮细胞中DAPI免疫荧光表达图；图6为在显微镜倍数为100的条件下p1代羊膜上皮细胞Cytokeratin19和DAPI免疫荧光表达整合图；图7为在显微镜倍数为200的条件下p1代羊膜上皮细胞中Cytokeratin19免疫荧光表达图；图8为在显微镜倍数为200的条件下p1代羊膜上皮细胞中DAPI免疫荧光表达图；图9为在显微镜倍数为200的条件下p1代羊膜上皮细胞Cytokeratin19和DAPI免疫荧光表达整合图。从图4～图9可知，P1代细胞均特异性表达Cytokeratin19，表明经过纯化培养获得了高纯度羊膜上皮细胞，无羊膜间充质干细胞污染。
本试验的羊膜组织制成羊膜贴片后可以保证羊膜上皮面平整，同时羊膜背面粘液与结缔组织与硝酸纤维膜紧密贴合，促进胰酶消化效率和细胞与组织的分离，短时间消化即可收集全部羊膜上皮细胞，避免了细胞贴壁率的降低；其次本试验羊膜上皮细胞附着于羊膜表面基底膜外侧，可以优先与组织分离，羊膜背面与硝酸纤维膜贴合阻碍了羊膜组织中间质细胞的流出，操作中羊膜组织不需要大幅度搅动也可使羊膜上皮细胞与羊膜组织充分分离，进一步降低了羊膜间充质干细胞的污染。最后本试验短时间培养后使用0.05％胰酶，37℃消化2-5min可使羊膜间充质干细胞完全分离，此时羊膜上皮细胞尚保持平展贴壁状态，纯化后，加入0.25％胰酶，37℃消化3-6min获得了高纯度羊膜上皮细胞。
Claims (6)
1.一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其特征在于该方法是按以下步骤完成的：
一、羊膜组织分离和消毒：将羊膜自胎盘上剥离，然后用生理盐水冲洗2～3遍，再在含有1％～3％头孢哌酮的生理盐水中浸泡3～10min；
二、羊膜上皮细胞分离：将羊膜裁剪成50～150cm2的块状，然后将裁剪后羊膜的上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向培养皿A中加入3～10mL生理盐水，再将羊膜的上皮面朝下贴置在培养皿A中，静置2～3min，获得羊膜贴片；将羊膜贴片置于培养皿B中，加入10～30ml质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA消化15～20min，然后封口膜封口后将培养皿放入恒温摇床中消化，得到消化液，再加入2～5ml胎牛血清终止酶反应，然后去除羊膜贴片上团聚、黏连的羊膜上皮细胞，再将羊膜贴片转移至装有生理盐水的培养皿C中，清洗贴壁的羊膜上皮细胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，经100目细胞筛过滤，获得羊膜上皮细胞单细胞悬液；
三、羊膜上皮细胞纯化培养：将步骤二获得的羊膜上皮细胞单细胞悬液在4℃、1500rpm的条件离心5～15min，弃上清，然后加入含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基重悬细胞，混匀后按0.9～1.1×105/cm2的接种量接种于培养瓶中，再置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，细胞融合率达到85％后，弃除非贴壁细胞，并用生理盐水冲洗2次，然后加入质量浓度为0.05％的胰酶-EDTA消化，37℃消化2～5min，弃除消化液，再用生理盐水冲洗1～2次，然后加入质量浓度为0.25％的胰酶-EDTA，在37℃条件下消化3～6min，再加入FBS终止酶反应，收集消化液，将消化液在4℃、1500rpm旋转震荡的条件下离心5～15min，弃上清，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞，得到高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，即完成，其中步骤二所述的消化是在37℃，60～120rpm的条件下，消化15～20min。
2.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其特征在于步骤一所述的剥离方式为钝性剥离。
3.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其特征在于步骤二所述的培养皿A、培养皿B和培养皿C为直径是9～15cm的培养皿。
4.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其特征在于步骤二中用平头镊子、玻璃棒或细胞刮匙去除羊膜贴片上团聚、黏连的羊膜上皮细胞。
5.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其特征在于步骤三按1.0×105/cm2的接种量接种于培养瓶中。
6.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其特征在于步骤三所述的含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基中表皮生长因子的终浓度为10ng/ml。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510263291.8A CN104818244B (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510263291.8A CN104818244B (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104818244A CN104818244A (zh) | 2015-08-05 |
| CN104818244B true CN104818244B (zh) | 2017-12-29 |
Family
ID=53728725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510263291.8A Active CN104818244B (zh) | 2015-05-21 | 2015-05-21 | 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104818244B (zh) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520676B (zh) * | 2016-12-09 | 2019-07-26 | 博雅干细胞科技有限公司 | 从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用 |
| CN106834218B (zh) * | 2017-01-06 | 2021-03-02 | 沈阳艾米奥生物工程技术研发中心有限公司 | 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法 |
| CN106834217B (zh) * | 2017-04-18 | 2021-07-09 | 遵义医学院附属医院 | 一种促进人羊膜上皮细胞体外扩增的方法及应用 |
| CN109528772A (zh) * | 2017-09-22 | 2019-03-29 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | 人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用 |
| CN109182260A (zh) * | 2018-09-11 | 2019-01-11 | 邵勇 | 一种体外培养胎膜间充质干细胞的方法 |
| WO2020096004A1 (ja) * | 2018-11-08 | 2020-05-14 | インテグリカルチャー株式会社 | 動物細胞増殖促進剤、動物細胞培養用培地及び動物細胞培養装置 |
| CN114480251A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-13 | 浙江金时代生物技术有限公司 | 羊膜上皮细胞培养方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103007349A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-04-03 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法 |
| CN103352026A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-10-16 | 黑龙江天晴干细胞有限公司 | 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法 |
| CN203329089U (zh) * | 2012-12-13 | 2013-12-11 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备装置 |
-
2015
- 2015-05-21 CN CN201510263291.8A patent/CN104818244B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103007349A (zh) * | 2012-12-13 | 2013-04-03 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备方法 |
| CN203329089U (zh) * | 2012-12-13 | 2013-12-11 | 吉林省拓华生物科技有限公司 | 负载干细胞的大面积羊膜贴片的制备装置 |
| CN103352026A (zh) * | 2013-07-24 | 2013-10-16 | 黑龙江天晴干细胞有限公司 | 人脐带血富血小板裂解液培养自体脐带间充质干细胞方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 人羊膜上皮细胞分泌神经营养因子诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化：可能性验证;张晓明 等;《中国组织工程研究与临床康复》;20100205;第14卷(第6期);全文 * |
| 羊膜上皮细胞条件培养液对大鼠骨髓基质细胞神经分化的影响;王丹妮 等;《解剖学报》;20080630;第39卷(第3期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104818244A (zh) | 2015-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104818244B (zh) | 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法 | |
| CN106754674B (zh) | 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用 | |
| CN103667182B (zh) | 一种骨髓间充质干细胞在体外向成骨细胞分化的诱导方法及诱导培养基 | |
| CN109880797A (zh) | 一种制备人脐带间充质干细胞外泌体的方法 | |
| CN107022521A (zh) | 壁蜕膜组织冻存、复苏及分离培养间充质干细胞的方法 | |
| CN105713871A (zh) | 一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN105420179A (zh) | 一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法 | |
| CN102676452A (zh) | 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用 | |
| CN105238750B (zh) | 一种复苏脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN104762257B (zh) | 一种从脐带制备间充质干细胞的方法 | |
| CN105970300A (zh) | 一种采用血清替代物建立人脐带间充质干细胞库的方法 | |
| CN104450611A (zh) | 一种人羊膜间充质干细胞原代分离及培养方法 | |
| CN109280635B (zh) | 一种子宫内膜干细胞分离方法 | |
| CN105200007B (zh) | 从胎盘胎儿面绒毛膜中提取亚全能干细胞的方法 | |
| CN101984049A (zh) | 从脂肪组织中分离间充质干细胞的方法 | |
| CN104762259A (zh) | 一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方法 | |
| CN109735490A (zh) | 一种脂肪干细胞提取方法 | |
| CN105647857A (zh) | 山羊骨骼肌卫星细胞的分离纯化方法 | |
| CN107114357A (zh) | 一种牙周膜干细胞的冻存液及其冻存方法 | |
| CN108315297A (zh) | 一种从脂肪组织中分离、纯化脂肪干细胞的方法 | |
| WO2019015584A1 (zh) | 一种人牙髓干细胞培养基及人牙髓干细胞的制备方法 | |
| CN104862274A (zh) | 高效分离脐带间充质干细胞的方法 | |
| CN105434468A (zh) | 一种皮肤细胞损伤修复试剂的制备方法 | |
| CN104480062A (zh) | 一种人乳腺组织不同细胞组分的分离与培养方法 | |
| CN104651305A (zh) | 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: The innovation of science and technology city top two high tech Industrial Development Zone, Heilongjiang province Harbin City Road 150028 No. 199 Applicant after: Sunny stem cell Limited by Share Ltd Address before: 602 room 1, unit 24, Songshan Road, Nangang concentration zone, Harbin Development Zone, Heilongjiang 150090, China Applicant before: HEILONGJIANG TIANQING STEM CELL CO., LTD. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |