CN109528772A - 人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用 - Google Patents

人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用 Download PDF

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郭英
孙俊艳
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Abstract

本发明涉及人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用。本发明将人羊膜上皮细胞分泌因子经浓缩后通过腹腔注射注入化疗损伤小鼠体内，发现可明显增加损伤卵巢中的卵泡数量、促进卵泡发育相关基因表达并促进血管新生，表明人羊膜上皮细胞不仅可直接转分化为颗粒细胞参与修复卵巢功能的过程，同时其旁分泌途径在此过程中也发挥着重要作用，人羊膜上皮细胞分泌因子可用于制备修复卵巢功能的药物。

Description

人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用。
背景技术
人羊膜上皮细胞(human Amniotic Epithelial Cells，hAECs)来自于分娩后的“医疗废弃物”胎盘，具有来源丰富、容易获得、无创伤性、不易引起伦理及法律争议并具有低免疫源性等特点。因其独特的生物学特性，为损伤组织的功能修复及再生医学的发展开辟了新的研究途径。越来越多的研究显示，人羊膜上皮细胞的移植治疗对多种组织损伤及疾病模型具有良好的治疗修复作用。
《苏州大学》，2013，29(5)，刊出的论文“人羊膜上皮细胞移植治疗创伤性脊髓损伤的移植免疫研究”，对人羊膜上皮细胞与研究较多的骨髓间充质干细胞移植后移植免疫情况作对比，揭示了人羊膜上皮细胞移植治疗创伤性脊髓损伤在移植免疫方面的优势，具体地，用SD大鼠建立了创伤性脊髓损伤动物模型，将人羊膜上皮细胞植入各分组大鼠的横断部位，对大鼠后肢运动功能恢复情况进行评分和记录，利用免疫组织化学法观察损伤段脊髓，用ELISA法测定大鼠血清IL-2和IL-10OD值，观察二者变化，结果表明细胞移植治疗脊髓损伤效果明显，人羊膜上皮细胞较大鼠骨髓间充质细胞的免疫源性为弱，人羊膜上皮细胞作为一种特殊的“干细胞”用于治疗脊髓损伤具有显著优势。专利文献CN104666346A，公开日2015.06.03，公开了一种羊膜上皮细胞在制备治疗不孕不育症药物中的用途。在实施例中，将人羊膜上皮细胞移植入化疗药物诱导的卵巢早衰(Premature Ovarian Failure andInsufficiency，POF/POI)小鼠体内，通过卵巢功能学、组织形态学及分子生物学相结合的方法，研究其在化疗药物引起卵巢功能损伤后的修复作用，首次报道分别通过尾静脉注射、腹腔注射两种方式将hAECs移植入POF/POI小鼠体内后，能有效抑制化疗药物引起的卵巢功能损伤，主要表现为：抑制化疗药物诱导的颗粒细胞凋亡，明显增加成熟卵泡数量并改善小鼠的生育能力。又通过使用携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)标记的慢病毒对植入的hAECs进行示踪观察，发现在化疗药物诱导的POF/POI小鼠体内，部分植入的hAECs迁移至损伤卵巢并转分化为颗粒细胞参与卵泡发育。通过以上实验证实了人羊膜上皮细胞能够有效治疗或者改善由于卵巢功能衰退所导致的不孕不育症，显著提高了卵巢功能衰退导致的不孕不育症患者体内卵泡的生成。
然而，目前还未见使用人羊膜上皮细胞分泌因子制备修复卵巢功能的药物的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人羊膜上皮细胞分泌因子的用途。
本发明的另一的目的是，提供一种人羊膜上皮细胞分泌因子。
本发明的再一的目的是，提供一种人羊膜上皮细胞分泌因子的制备方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面是人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用。
优选地，所述的人羊膜上皮细胞分泌因子是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1-2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)14-18小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
更优选地，所述的人羊膜上皮细胞分泌因子是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1.5min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)15小时后，缓慢地将培养基吸出，在2000g条件下离心30min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
作为本发明的一个实例，所述的修复卵巢功能是指修复化疗损伤卵巢的功能。
另一方面是人羊膜上皮细胞分泌因子在制备治疗不孕不育症的药物中的应用。
优选地，所述的人羊膜上皮细胞分泌因子是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1-2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)14-18小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
更优选地，所述的人羊膜上皮细胞分泌因子是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1.5min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)15小时后，缓慢地将培养基吸出，在2000g条件下离心30min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
作为本发明的一个实例，所述的不孕不育症是由化疗损伤引起的。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种人羊膜上皮细胞分泌因子，其是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1-2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)14-18小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种人羊膜上皮细胞分泌因子的制备方法，包括以下步骤：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1-2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)14-18小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
本发明优点在于：
1、本发明将人羊膜上皮细胞分泌因子经浓缩后通过腹腔注射注入化疗损伤小鼠体内，可明显增加损伤卵巢中的卵泡数量、促进卵泡发育相关基因表达并促进血管新生。这些结果表明，人羊膜上皮细胞不仅可直接转分化为颗粒细胞参与修复卵巢功能的过程，同时其旁分泌途径在此过程中也发挥着重要作用，人羊膜上皮细胞分泌因子可用于修复卵巢功能。
2、本发明优化了人羊膜上皮细胞分泌因子的制备方法，发现在其制备过程中，胰酶消化时间、培养基、培养时间等对其卵巢功能修复能力存在一定的影响，本发明提供了合适的人羊膜上皮细胞分泌因子的制备方法，该制备方法能够显著保留细胞活性，以促进重要细胞因子的分泌，发挥更显著的卵巢修复作用。
附图说明
图1.hAECs及hAECs-CM原位注射对化疗损伤后卵泡及相关基因表达的影响。(A)hAECs及hAECs-CM注射1个月后，卵巢切片的苏木素－伊红染色；(B)hAECs及hAECs-CM注射1个月后，损伤卵巢组织内卵泡发育相关基因表达qRT-PCR的分析。在A-a，c，e，g，i，k，m，o，q和s中比例尺为200μm；在A-b，d，f，h，j，l，n，p，r和t中比例尺为100μm。
图2.hAECs及hAECs-CM注射后对损伤卵巢中各级卵泡发育的影响。(A)hAECs及hAECs-CM注射2个月后，卵巢切片的苏木素－伊红染色；(B)hAECs及hAECs-CM注射2个月后，不同组别中原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡及成熟卵泡计数分析。在A中，比例尺代表200μm。
图3.人羊膜上皮细胞分泌因子中细胞因子的芯片分析。
图4.hAECs旁分泌途径对化疗药物诱导颗粒细胞凋亡的影响。(A)人卵泡液来源颗粒细胞与人羊膜上皮细胞共培养体系；(B-C)CCK8检测不同处理组中颗粒细胞的活性；(D)流式细胞术检测不同处理组中Annexin V+/PI+的细胞比例；(E-F)Western Blot检测不同处理组中caspase3的蛋白表达情况。在B中，比例尺代表200μm。
图5.人羊膜上皮细胞分泌的细胞因子对颗粒细胞中smad信号通路的影响。(A)在人羊膜上皮细胞与化疗药物处理的颗粒细胞共培养24小时后，Elisa方法检测颗粒细胞培养基中TGF-beta 1的含量；(B-F)Western Blot方法检测不同处理组颗粒细胞中p-smad2，p-smad3蛋白的表达情况。
图6.人羊膜上皮细胞旁分泌途径对血管新生的影响。(A-B)在人羊膜上皮细胞及其分泌因子注射后1个月，在卵巢切片上进行CD34免疫组织化学染色及阳性细胞的统计学分析；(C-E)人脐静脉内皮细胞与人羊膜上皮细胞共培养观察血管形成情况。在A-(a-d)中，比例尺为200μm；在A-(e-h)中，比例尺为100μm；在C中，比例尺为200μm。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下实施例1-6的试剂和材料来源为：0.25％胰酶(1665788，Gibco公司)，胎牛血清(10091148，ThermoFisher公司)，DMEM/F12(1:1)培养基(1710137，Gibco公司)，0.2μm的滤器(Millipore公司)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药公司)，白消胺(Sigma公司)。
实施例1人羊膜上皮细胞分泌因子的制备(一)
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化1.5min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2次后更换无血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养。
5、15小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在2000g条件下离心30min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
实施例2人羊膜上皮细胞分泌因子的制备(二)
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞3min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤3次后更换无血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养。
5、14小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在1500g条件下离心40min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
实施例3人羊膜上皮细胞分泌因子的制备(三)
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化3min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2次后更换无血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养。
5、18小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在2500g条件下离心20min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
实施例4人羊膜上皮细胞分泌因子的制备(四)
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化1.5min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤3次后更换无血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养。
5、16小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在2000g条件下离心20min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
实施例5人羊膜上皮细胞分泌因子的制备(五)
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤3次后更换无血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养。
5、16小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在2000g条件下离心20min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
实施例6人羊膜上皮细胞分泌因子修复卵巢功能的研究
1.人羊膜上皮细胞分泌因子具有修复损伤卵巢功能的作用
订购8周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠，通过单次腹腔注射环磷酰胺(120mg/kg)联合白消胺(30mg/kg)构建卵巢早衰小鼠动物模型。将2×104人羊膜上皮细胞(hAECs)重悬于20μl的PBS中，及按照实施例1的方法将同等细胞量来源的分泌因子(hAECs-CM)浓缩至20μl，通过微玻璃针在显微镜下分别多点注入化疗药物注射后小鼠的单侧卵巢内(同时以同等剂量的PBS及DMED/F12作为对照组)。在注射后1个月，收集小鼠双侧卵巢组织进行4％多聚甲醛固定过夜后，进行石蜡包埋及制备切片，并进行苏木素-伊红染色。结果显示，在注射hAECs及hAECs-CM的损伤卵巢组织切片中均可见健康的成熟卵泡，同时qRT-PCR结果显示hAECs-CM明显上调卵泡发育相关基因AMH，MVH，BMP15及HAS2的表达，而同只小鼠的对侧卵巢严重纤维化、无成熟卵泡可见(图1)。
2.人羊膜上皮细胞分泌因子增加次级卵泡及成熟卵泡的数量
在hAECs及hAECs-CM注射后2个月，根据发育不同时期卵泡形态学特点对各级卵泡进行计数分析，结果显示在人羊膜上皮细胞及其分泌因子注射组中次级卵泡及成熟卵泡的数量均高于PBS注射的对照组。在PBS对照组中仍存在大量初级卵泡，且在数量上与hAECs及hAECs-CM治疗组相比较无明显差异。这些结果表明在化疗损伤的卵巢组织中初级卵泡不能发育成熟，而人羊膜上皮细胞可能通过旁分泌途径调控卵泡发育成熟的过程(图2)。
3.人羊膜上皮细胞分泌因子中细胞因子成分分析
将按照实施例1的方法制备的人羊膜上皮细胞分泌因子进行浓缩。通过蛋白芯片对人羊膜上皮细胞分泌因子中的细胞因子进行检测，结果发现在其分泌因子中富含有109种细胞因子。通过生物信息学方法对其功能进行如下分类，这些细胞因子在调控细胞周期，血管新生，免疫调节及细胞程序性死亡的过程中发挥重要作用。其中TGF-beta1/2/3，GDF5/9/11及BMP15细胞因子都有较高水平的表达(图3)。
4.人羊膜上皮细胞通过旁分泌途径抑制化疗药物诱导的颗粒细胞凋亡
在离体细胞实验中，通过向培养基中添加化疗药物(环磷酰胺)24小时后，可诱导卵泡液来源的颗粒细胞发生大量凋亡。将颗粒细胞与人羊膜上皮细胞进行共培养24小时后，结果显示人羊膜上皮细胞可通过旁分泌途径明显抑制化疗药物诱导的颗粒细胞活性的降低及凋亡的发生(图4)。
5.人羊膜上皮细胞通过旁分泌途径激活颗粒细胞中smad信号通路
蛋白芯片结果显示，在人羊膜上皮细胞分泌因子中含有大量调控卵泡发育的细胞因子如TGF-beta1/2/3，GDF5/9/11及BMP15等。通过离体细胞实验，对人羊膜上皮细胞分泌的细胞因子功能进行进一步验证。将人羊膜上皮细胞与化疗药物处理的颗粒细胞共培养24小时后，在颗粒细胞培养基中TGF-beta 1的含量明显高于化疗处理对照组。同时，在共培养组的颗粒细胞中p-smad2及p-smad3的蛋白表达明显高对照组(图5)。这些结果显示，人羊膜上皮细胞通过旁分泌途径，分泌大量具有生物学活性的细胞因子激活颗粒细胞中smad信号通路，进而影响颗粒细胞功能。
6.人羊膜上皮细胞旁分泌途径具有促进血管新生的作用
生物信息学结果显示，人羊膜上皮细胞分泌因子中的细胞因子不仅可以参与细胞程序性死亡的过程，同时对血管新生也具有一定的作用。有研究指出，化疗药物的使用可导致卵巢中血管功能下降，影响血管新生，进而影响卵泡发育及成熟。在hAECs及hAECs-CM注射后1个月，免疫组织化学结果显示，在正常小鼠卵巢组织中含有大量CD34阳性细胞，而在化疗处理组卵巢组织严重萎缩CD34的阳性细胞显著减少。而hAECs及hAECs-CM的显微注射治疗显著增加了损伤卵巢组织中的CD34阳性细胞数量。同时，通过将人羊膜上皮细胞与人脐静脉内皮细胞共培养后发现，人羊膜上皮细胞可通过旁分泌途径增加血管管腔形成并增加血管长度(图6)。
实施例7人羊膜上皮细胞分泌因子制备条件的研究
进一步研究人羊膜上皮细胞分泌因子制备条件对其卵巢修复能力的影响。设置大量的实验组，其中包含实施例2-5及下列实验组：
实验组①：
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化1.5min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2次后更换含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养。
5、15小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在2000g条件下离心30min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
实验组②：
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞3min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤3次后更换含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养。
5、14小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在1500g条件下离心40min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
实验组③：
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化1.5min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、15小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在2000g条件下离心30min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
实验组④：
1、经本院伦理委员会批准、研究对象知情同意后，于无菌条件下获取足月健康产妇新鲜的羊膜组织。
2、将羊膜组织经0.25％胰酶消化3min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，接种于100mm细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。
3、当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2min并重悬于含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于100mm细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养。同时，收集部分人羊膜上皮细胞进行RNA抽提，通过Real-time PCR检测标志物的表达(Cytokeratin 19、Sox2、Oct-4及NANOG)对其进行鉴定。
4、待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2次后更换无血清的DMEM/F12(1:1)培养基培养。
5、20小时后，使用10ml的移液管缓慢地将培养基吸出并放入新的50ml离心管中，在2500g条件下离心20min去除残余细胞及细胞碎片。使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
按照实施例6的方法研究各实验组制备的人羊膜上皮细胞分泌因子对卵巢功能的修复作用。结果表明，实施例2-5及上述实验组①-④的人羊膜上皮细胞分泌因子均具有修复损伤卵巢功能的作用，能够增加次级卵泡及成熟卵泡的数量，分析其中的细胞因子成分，结果表明一些重要的细胞因子也都有较高水平的表达。
其中，各组处理的卵泡发育相关基因AMH，MVH，BMP15及HAS2的相对表达量统计结果见表1。各组人羊膜上皮细胞分泌因子中细胞因子相对表达水平统计结果见表2。分析结果发现，实验组①-④处理的小鼠AMH，MVH，BMP15及HAS2的相对表达量均低于实施例2-5(P<0.05)，实验组①-④人羊膜上皮细胞分泌因子中的TGF-beta1，GDF5/9/11的相对表达量也均低于实施例2-5(P<0.05)，表明人羊膜上皮细胞分泌因子的制备步骤及其参数对其修复卵巢的能力存在一定的影响。
表1各组处理的卵泡发育相关基因AMH，MVH，BMP15及HAS2的相对表达量
AMH MVH BMP15 HAS2
实施例2 0.28 0.44 0.07 0.64
实施例3 0.25 0.42 0.07 0.65
实施例4 0.28 0.43 0.06 0.61
实施例5 0.24 0.41 0.06 0.62
实验组① 0.09 0.24 0.02 0.30
实验组② 0.11 0.29 0.04 0.26
实验组③ 0.12 0.25 0.03 0.31
实验组④ 0.10 0.23 0.02 0.22
表2各组人羊膜上皮细胞分泌因子中细胞因子相对表达水平
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的人羊膜上皮细胞分泌因子是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1-2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)14-18小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的人羊膜上皮细胞分泌因子是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1.5min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)15小时后，缓慢地将培养基吸出，在2000g条件下离心30min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的修复卵巢功能是指修复化疗损伤卵巢的功能。
5.人羊膜上皮细胞分泌因子在制备治疗不孕不育症的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的人羊膜上皮细胞分泌因子是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1-2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)14-18小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的人羊膜上皮细胞分泌因子是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1.5min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)15小时后，缓慢地将培养基吸出，在2000g条件下离心30min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
8.根据权利要求5-7任一所述的应用，其特征在于，所述的不孕不育症是由化疗损伤引起的。
9.一种人羊膜上皮细胞分泌因子，其特征在于，是通过以下方法制备的：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1-2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)14-18小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
10.一种人羊膜上皮细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将足月健康产妇新鲜的羊膜组织经0.25％胰酶消化1-2min分离出人羊膜上皮细胞，重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，接种于细胞培养皿中后置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
b)当细胞融合度达到70％-80％时，使用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min并重悬于含有胎牛血清的DMEM/F12培养基中，重新调整细胞密度为1×105后接种于细胞培养皿中，放置于含有5％CO2的37℃细胞培养箱中进行培养；
c)待细胞密度再次达到70％-80％时，吸出含血清的完全培养基，用PBS缓慢洗涤2-3次后更换无血清的DMEM/F12培养基培养；
d)14-18小时后，缓慢地将培养基吸出，在1500-2500g条件下离心20-40min，使用0.2μm的滤器将获得的培养基进行再次过滤即可获得人羊膜上皮细胞分泌因子。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110251534A (zh) * 2019-06-21 2019-09-20 中国福利会国际和平妇幼保健院 羊膜上皮细胞在预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤中的应用
CN112933215A (zh) * 2021-03-10 2021-06-11 华中科技大学同济医学院附属同济医院 Sirt1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用
WO2022204904A1 (zh) * 2021-03-29 2022-10-06 浙江大学 人羊膜上皮细胞在制备用于治疗和/或改善宫腔粘连疾病的药物中的用途

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104818244A (zh) * 2015-05-21 2015-08-05 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法
CN104873956A (zh) * 2005-09-27 2015-09-02 组织技术公司 羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法
CN105663168A (zh) * 2016-01-27 2016-06-15 深圳爱生再生医学科技有限公司 用于修复卵巢功能的细胞制剂
CN106520676A (zh) * 2016-12-09 2017-03-22 博雅干细胞科技有限公司 从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104873956A (zh) * 2005-09-27 2015-09-02 组织技术公司 羊膜制品和纯化的组合物及其使用方法
CN104818244A (zh) * 2015-05-21 2015-08-05 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法
CN105663168A (zh) * 2016-01-27 2016-06-15 深圳爱生再生医学科技有限公司 用于修复卵巢功能的细胞制剂
CN106520676A (zh) * 2016-12-09 2017-03-22 博雅干细胞科技有限公司 从人胎盘羊膜制备人羊膜上皮细胞的方法及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEZHONG YANG ET AL.: ""The Relative Contribu tion of Paracine Effect versus Direct Differe ntiation on Adipose-Deriv ed Stem Cell Transplantation Mediated Cardiac Repair"", 《PLOS ONE》 *
QIUWAN ZHANG ET AL.: ""Paracrine effects of human amniotic epithelial cells protect against chemotherapy-induced ovarian damage"", 《STEM CELL RESEARCH & THERAPY》 *
XIAOFEN YAO ET AL.: ""The Paracrine Effect of Transplanted Human Amniotic Epithelial Cells on Ovarian Function Improvement in a Mouse Model of ChemotherapyInduced Primary Ovarian Insufficiency"", 《STEM CELLS INTERNATIONAL》 *
YUELIN ZHANG ET AL.: ""Potent Paracrine Effcts of human induced Pluripotent Stem Cell derived Mesenchymal Stem Cells Attenuate Doxorubicin-induced Cardiomyopathy"", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
刘小勇 等: ""人羊膜上皮细胞的原代及传代培养"", 《广东医学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110251534A (zh) * 2019-06-21 2019-09-20 中国福利会国际和平妇幼保健院 羊膜上皮细胞在预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤中的应用
CN112933215A (zh) * 2021-03-10 2021-06-11 华中科技大学同济医学院附属同济医院 Sirt1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用
WO2022204904A1 (zh) * 2021-03-29 2022-10-06 浙江大学 人羊膜上皮细胞在制备用于治疗和/或改善宫腔粘连疾病的药物中的用途

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