KR20140048064A

KR20140048064A - 신경퇴행성 질환 및/또는 장애의 치료 및/또는 역전 방법

Info

Publication number: KR20140048064A
Application number: KR1020137004632A
Authority: KR
Inventors: 칼 케이. 조헤; 웨이-쳉 시우; 신-종 린; 시아오-정 왕
Original assignee: 뉴럴스템, 인크.; 웨이-쳉 시우; 신-종 린; 시아오-정 왕
Priority date: 2010-07-28
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2014-04-23
Also published as: MY168084A; CN103237553A; JP2013532690A; KR101765980B1; CA2806904C; ES2571991T3; AU2011282642A1; JP6077996B2; JP2015214589A; SG187226A1; AU2011282642B2; IL224416A; EP2598154A1; EP2598154B1; ZA201300954B; MX341316B; NZ623207A; CA2806904A1; US9540611B2; NZ607195A

Abstract

본 개시내용은 척수 조직으로부터 수득한 신경 줄기 세포 (NSC)를 이용하여 신경계 질환/장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 NSC 집단을 이용하여 뇌의 신경계 질환/장애를 치료하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 외인성 배양 및 증대된 NSC를 뇌로 도입하는 것을 포함할 수 있고, NSC는 신경계 질환/장애와 관련된 증상을 완화시키기에 충분한 방식으로 생체 내에서 뇌 조직으로 통합될 수 있는 뉴런으로 분화한다.

Description

신경퇴행성 질환 및/또는 장애의 치료 및/또는 역전 방법{METHODS FOR TREATING AND/OR REVERSING NEURODEGENERATIVE DISEASES AND/OR DISORDERS}

뇌졸중은 불충분한 혈류로 인한 국소 지역에서의 뇌 세포의 급사이다. 뇌졸중은 혈류가 뇌의 일부분에 차단될 때 발생한다. 산소 및 영양소를 공급하고 노폐물을 제거하는 혈액이 없다면, 뇌 세포는 빠르게 죽기 시작한다. 영향을 받는 뇌의 영역에 따라, 뇌졸중은 마비, 언어 장애, 기억 및 추론 능력 상실, 혼수상태 또는 사망을 야기할 수 있다.

<본 발명의 개요>

본 개시내용은 뇌에서의 뉴런 세포 손실 (예를 들어, 대뇌 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 뇌성 마비 또는 외상성 뇌 손상에 의해 야기된 세포 사멸)과 관련된 신경계 질환 또는 장애의 치료 및/또는 역전 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 뇌졸중 또는 기타 뇌 손상으로 인한 증상을 치료하는 데 유용할 수 있다.

또한, 본 개시내용은 증대된 신경 줄기 세포 집단을 수득하여 치료 유효량의 증대된 신경 줄기 세포 집단을 대상체의 뇌의 하나 이상의 영역에 도입함으로써, 예를 들어 뇌졸중 또는 기타 뇌 손상으로 인한 증상의 치료를 포함한 뇌에서의 뉴런 세포 손실과 관련된 질환 또는 장애의 치료 방법을 제공하며, 여기서 신경 줄기 세포 집단은 생체 내에서 대상체의 뇌로 통합되는 뉴런으로 분화한다. 본 발명의 이론에 얽매이길 원치는 않지만, 통합된 뉴런은 그 후 죽은 뉴런을 대체하고/거나, 숙주 뉴런을 재생시키고/거나, 공여자 뉴런을 포함한 손상된 뉴런 연결을 회복시키기 위해 숙주 회로망(host circuitry)의 가소성을 유도함으로써 손상된 조직의 복구를 촉진한다.

일부 실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 집단을 도입하는 것은 치료 유효량의 적어도 일부를 대상체의 뇌의 하나 내지 다수의 영역으로 주입하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 증대시키는 것은 혈청의 부재 하에 신경 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 증대시키는 것은 하나 이상의 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 성장 인자는 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 증대된 줄기 세포 집단의 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 90％ 이상은 대상체의 뇌 조직에서 뉴런을 생성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 치료 유효량의 증대된 줄기 세포 집단을 도입하는 것은 치료 유효량의 적어도 일부를 대상체의 뇌 조직의 다수의 영역으로 주입하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 뇌의 영역은 운동 경로, 즉, 근육 수축을 통제하는 뇌, 뇌간 및 척수로의 및 이들로부터의 전기 신호를 전도하는 신경 섬유를 포함한다. 이러한 영역은 운동 피질, 선조체, 내포(internal capsule), 시상, 중뇌, 뇌간 및 소뇌를 포함한다. 뇌졸중 또는 외상으로 인해, 이러한 경로 내의 별개의 영역 또는 영역들이 손상될 수 있고, 이는 마비, 경직, 강직 및 기타 운동 기능장애의 증상을 야기한다.

또 다른 실시양태에서, 척수-유래 인간 신경 줄기 세포의 현탁액을 영향을 받은 영역 내, 근처 또는 주위로 주입한다. 주입된 세포는 뉴런 및 신경교세포로 분화하여 영향을 받은 영역으로 통합되어 운동 경로의 복구를 촉진함으로써, 운동 회복 및/또는 운동 기능장애의 완화를 가져온다.

일부 실시양태에서, 대상체는 심근경색 또는 뇌졸중과 같은 대뇌 허혈을 야기하는 사건을 겪었다.

본 개시내용은 또한, 인간의 척수 조직으로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포를 단리하는 단계; 시험관 내에서 상기 신경 줄기 세포를 증대시켜 증대된 집단 형성하는 단계; 증대된 집단의 농축시키는 단계; 및 치료 유효량의 상기 증대된 집단을 대상체 뇌의 하나 이상의 영역에 도입을 포함하는 단계를 포함하는, 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 증대된 신경 줄기 세포 집단은, 예를 들어 인간의 사후 태아 척수 조직을 포함한 척수 조직으로부터 유래한다.

일부 실시양태에서, 사후 태아의 수태령(gestational age)은 약 5 내지 약 20주이다.

이들 및 기타 본 발명의 실시양태는 이하 본원에서 더욱 상세하게 설명된다.

상술한 본 발명의 개요 뿐만 아니라 본 개시내용의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 인간 척수 유래의 신경 줄기 세포 (HSSC)의 이식이 대뇌 허혈 후의 신경학적 거동을 개선시켰음을 나타낸다. 신경학적 거동 측정 프로토콜을 이용하여 HSSC-이식된 래트 (n = 10) 및 완충액 주입된 대조군 래트 (n = 10)에서의 MCA 결찰(ligation) 전후의 신경학적 기능을 평가하였다. HSSC 래트는 바디 스윙(body swing) 시험에서 대조군 래트에 비해 상당히 감소된 몸체 비대칭을 나타내었다 (패널 A). 운동 활성(locomotor activity)을 모든 동물에서 대뇌 허혈 전후에 조사하였다. 수직 활동, 수직 운동 시간 및 수직 운동 횟수는 대조군 래트에 비해 HSSC 이식을 받은 래트에서 대뇌 허혈 후 상당한 증가를 나타내었다 (패널 B-D). 또한, 각각의 두 처리 후의 모든 실험 래트의 앞다리 강도를 조사하여 악력(grip strength)의 측정을 수행하였다 (패널 E). 결과는 대조군에서보다 HSSC 군에서 더 높은 비율의 악력을 나타내었다.
도 2a-b는 허혈성 래트 뇌에 삽입된 외인성 이식된 HSSC의 면역조직화학적 (IHC) 분석으로부터 얻은 화상을 나타낸다. HSSC-처리된 허혈성 래트 뇌의 경계영역(penumbra)을 인간 특이적 핵 항체 (HuNu) (도 2a) 및 뉴런 특이적 에놀라아제 (NSE) (도 2b)에 대한 항체로 면역염색하였다.

개시된 방법은 뇌에서의 뉴런 세포 손실과 관련된 신경계 질환 또는 장애의 치료에 관한 것이다. 인간 척수 줄기 세포주 (HSSC)가 뇌의 주변 경색부로 이식되는 경우, 이는 생존할 수 있고 손상된 조직에서 일제히 뉴런으로 분화할 수 있다는 것이 본 발명에 와서야 발견되었다. 특히, 분화된 뉴런은 주변 뇌 조직으로 통합되어 (즉, 다른 뉴런과의 상호연결성을 확립하여) 운동 결핍을 역전시켰다. 따라서, 본 개시내용의 방법을 이용하여, 예를 들어 뇌의 질환을 포함한 신경퇴행성 질환을 치료 (역전 포함)할 수 있다. 특히, 본 개시내용의 방법을 이용하여, 대뇌 허혈로부터 발생한 임의의 운동 증상 (예를 들어, 부전마비, 마비, 경직 또는 강직)을 치료할 수 있다. 운동 증후군은 급성, 아급성 또는 만성 단계의 질환 (예를 들어, 만성 뇌졸중)일 수 있다.

본 개시내용은, 증대된 신경 줄기 세포 집단 (예를 들어, 인간 척수 줄기 세포주)을 수득하여 치료 유효량의 증대된 신경 줄기 세포 집단을 대상체의 뇌의 하나 내지 다수의 영역에 도입함으로써, 뇌 (예를 들어, 대뇌 반구, 대뇌 피질, 피질하 운동 피질, 선조체, 내포, 시상, 시상하부, 해마, 중뇌, 뇌간 및 소뇌와 같은 뇌 조직)의 뉴런 세포 손실 (예를 들어, 세포 사멸)과 관련된 신경계 또는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 치료 및/또는 역전 방법을 제공하며, 여기서 뉴런 줄기 세포 집단은 생체 내에서 대상체의 뇌로 통합되는 뉴런으로 분화할 수 있다.

본 개시내용은 또한, 포유동물로부터 하나 이상의 신경 줄기 세포 (예를 들어, 인간 척수 줄기 세포주)를 단리하고; 시험관 내에서 상기 신경 줄기 세포를 증대된 집단으로 증대시키고; 증대된 집단을 농축시키고; 치료 유효량의 상기 증대된 집단을 대상체 뇌 (예를 들어, 대뇌 반구, 대뇌 피질, 피질하 운동 피질, 선조체, 내포, 시상, 시상하부, 해마, 중뇌, 뇌간 및 소뇌와 같은 뇌 조직)의 하나 이상의 영역에 도입하여, 대뇌 허혈과 관련된 부전마비, 마비, 경직, 강직 또는 근육 과다활동 병태의 치료 및/또는 역전을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 및/또는 역전하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 증대된 집단의 20％ 이상이 대상체 뇌에서 뉴런을 생성할 수 있다.

개시된 방법은 NSC를 사용하여 신경퇴행성 병태를 완화시키는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "NSC"는 또한 신경 또는 뉴런 전구체(progenitor) 또는 신경상피 전구체를 지칭할 수 있다. NSC는 CNS의 3가지 주요 세포 유형인 뉴런, 성상교세포 및 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 각각으로 분화하는 능력에 따라 기능적으로 정의될 수 있다.

일부 실시양태에서, 질환, 장애 또는 병태를 "치료하는 것" 또는 이들의 "치료"는 적어도 부분적으로 (1) 질환, 장애 또는 병태를 예방하는 것, 즉, 질환, 장애 또는 병태의 임상적 증상이, 질환, 장애 또는 병태에 노출되거나 또는 이에 취약하지만, 아직 질환, 장애 또는 병태의 증상을 경험하거나 보이지 않은 포유동물에서 발생하지 않도록 하는 것; (2) 질환, 장애 또는 병태를 억제하는 것, 즉, 질환, 장애 또는 병태, 또는 이들의 임상적 증상의 발생을 막거나 감소시키는 것; 또는 (3) 질환, 장애 또는 병태를 경감시키는 것, 즉, 질환, 장애 또는 병태, 또는 이들의 임상적 증상의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 사용되는 "유효량"은 대상체에 치료 효과를 부여하기 위해 요구되는 활성 조성물의 양을 지칭한다. 본원에 사용되는 "치료 유효량"은 치료되어야 할 질환, 장애 또는 병태의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬, 투여되는 작용제 또는 화합물의 충분한 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 목적하는 변화이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 치료 용도에 대한 "유효량"은 지나친 부작용 없이 질환 증상에서 임상적으로 상당한 감소를 제공하기 위해 요구되는, 본원에 개시된 바와 같은 화합물을 포함하는 조성물의 양이다. 일부 실시양태에서, 임의의 개개인의 경우에서의 적절한 "유효량"은 용량 증가 연구(dose escalation study)와 같은 기술을 이용하여 측정된다. 용어 "치료 유효량"은 예를 들어 예방 유효량을 포함한다. 다른 실시양태에서, 화학식 A 또는 화학식 Ⅰ의 화합물과 같이 본원에 개시된 화합물의 "유효량"은 지나친 부작용 없이 목적하는 약리학적 효과 또는 치료학적 개선을 달성하는 데 효과적인 양이다. 다른 실시양태에서, "유효량" 또는 "치료 유효량"은 대사, 연령, 체중, 대상체의 일반적 상태, 치료되어야 할 병태, 치료되어야 할 병태의 중증도, 및 처방한 의사의 판단의 차이로 인해 대상체 마다 다른 것으로 이해된다.

한 실시양태에서, NSC는, 각각의 세포가 뉴런, 성상교세포 또는 올리고덴드로사이트로 분화하는 능력을 갖는 다능성(multipotential)이다. 또 다른 실시양태에서, NSC는, 각각의 세포가 CNS의 3가지 세포 유형 중 2가지로 분화하는 능력을 갖는 이능성이다. 또 다른 실시양태에서, NSC는 시험관 내에서 뉴런 및 성상교세포 둘 다를 생성하는 적어도 이능성 세포를 포함하며, 생체 내에서 뉴런을 생성하는 적어도 단능성 세포를 포함한다.

성장 조건은 하나 또는 또 다른 세포 유형을 향한 세포의 분화 방향에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 세포가 단일 계통으로 위탁되지 않았음을 나타낸다. 뉴런 분화에 유리한 배양 조건에서, 특히 인간 CNS로부터의 세포는 주로 뉴런 및 성상교세포에 대해 이능성이고, 올리고덴드로사이트로의 분화는 최소이다. 따라서, 개시된 방법의 분화된 세포 배양은 뉴런 및 성상교세포를 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 뉴런 대 성상교세포의 비율은 약 20:80 내지 약 80:20, 예를 들어 약 50:50이다.

개시된 방법의 한 실시양태에서, 대상체로 이식될 세포는 뇌 조직으로부터 유래한다. 또 다른 실시양태에서, NSC는 약 5 내지 약 20주 사이의 수태령의 인간 태아 뇌 조직으로부터 단리된다. 단리가능한 신경 줄기 세포 집단의 비율은 공여자의 연령에 따라 다를 수 있다는 것을 알아야 한다. 세포 집단의 증대 용량 또한 공여자의 연령에 따라 다를 수 있다. 이러한 NSC의 지역적 및 시간적 특수성은 NSC가 블랭크(blank) 세포 또는 세포의 단일 집단으로서가 아닌 운명-제한된 전구체로서 행동한다는 것을 나타낸다.

예를 들어, 복측 중뇌의 NSC는 동일한 수태 단계의 척수로부터 수득한 NSC와 구별된다. 특히, 복측 중뇌로부터의 NSC는 티로신-히드록실라제-발현 도파민성 뉴런만을 독점적으로 생성하는 반면에, 척수로부터의 NSC는 아세틸콜린-생성 콜린성 뉴런만을 독점적으로 생성한다. 그러나, 2가지 세포 유형 모두 보다 흔한 글루타메이트- 및 GABA-생성 뉴런을 자발적으로 생성한다. 따라서, 한 실시양태에서, 개시된 방법은 복측 중뇌로부터 NSC를 수득하여, 적어도 부분적으로, 티로신-히드록실라제-발현 도파민성 뉴런의 이식으로 완화 또는 약화되는 병태를 치료하는 것을 포함한다.

NSC는 또한 출생-후 및 성인 조직으로부터 단리될 수 있다. 출생-후 및 성인 조직으로부터 유래한 NSC는, 뉴런 및 신경교세포로의 분화하는 능력 뿐만 아니라 성장 및 분화 특성과 관련하여 정량적으로 동등하다. 그러나, 다양한 출생-후 및 성인 CNS로부터의 NSC의 시험관 내 단리 효율은 보다 풍부한 NSC 집단을 포함하는 태아 조직으로부터의 NSC의 단리보다 훨씬 더 낮을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 태아-유래 NSC를 사용하는 것과 같이, 개시된 방법은 신생아 및 성인 공급원으로부터 유래한 NSC의 약 30％ 이상이 시험관 내에서 뉴런으로 분화하는 것을 가능하게 한다. 따라서, 출생-후 및 성인 조직은 태아-유래 NSC의 경우에서 상술한 바와 같이 사용될 수 있다.

다양한 뉴런의 아형이 배양물에서 증대된 배아 줄기 세포의 조작으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 개시된 방법에 기초하여, 특정 뉴런의 아형을 다른 무관한 또는 원치않는 세포로부터 단리 및 정제하여, 필요에 따라, 결과를 개선할 수 있고, 동일한 신경퇴행성 병태의 치료에 사용할 수 있다.

개시된 방법에서 NSC는 자가이식으로서 동일한 대상체 내에서 한 부위로부터 유래되어 또 다른 부위로 이식될 수 있다. 또한, 개시된 방법에서 NSC는 동계이식으로서 유전적으로 동일한 공여자로부터 유래되어 이식될 수 있다. 또한, 개시된 방법에서 NSC는 동종이식으로서 동일한 종의 유전적으로 비동일한 구성원으로부터 유래되어 이식될 수 있다. 다르게는, NSC는 이종이식으로서 비-인간 기원으로부터 유래되어 이식될 수 있다. 강력한 면역억제제의 개발로, 돼지 기원의 신경 전구체와 같이, 비-인간 신경 전구체의 동종이식물 및 이종이식물이 인간 대상체로 이식될 수 있다.

샘플 조직은 임의의 표준 방법으로 해리될 수 있다. 한 실시양태에서, 조직을 피펫 및 2가 양이온-무함유 완충액 (예를 들어, 염수)를 사용하여 적당한 기계적 분쇄로 해리시켜, 해리된 세포의 현탁액을 형성한다. 과도한 국소 세포 밀도를 피하기 위해서, 대부분 단일 세포를 수득하기 위한 충분한 해리가 요구된다.

NSC의 성공적인 상업적 이용을 위해서, 수많은 연이은 계대배양을 통해 안정한 증대 및 분화 능력을 갖는 왕성하고 일관된 배양을 유지하는 것이 바람직하다. 상술한 바와 같이, 배양 방법을 최적화하여, 이들의 별개의 전구체 특성을 유지하면서, CNS 발생의 다양한 영역 및 시기로부터의 NSC의 개별 세포주의 장기간 안정한 증대를 달성할 수 있다. 한 실시양태에서, 줄기 세포는 U.S. 7,691,629, U.S. 5,753,506, U.S. 6,040,180 또는 U.S. 7,544,511에 제시된 방법에 따라 배양될 수 있으며, 이들의 전문은 본원에 참고로 포함된다.

한 실시양태에서, 개시된 방법의 NSC는 이식을 위해 미리-분화된 세포를 포함할 수 있다. 세포의 최대 수율 및 절차의 간단함을 위해서, 주로 비분화된 세포의 집단을 포함하는 전면성장 배양물을 이식을 위해 수거한다. 그러나, 또한, 자발적으로 분화하기 시작하는 세포의 소수 집단이 증가된 세포 밀도로 인해 존재할 수 있다는 것을 알아야 한다.

한 실시양태에서, NSC는 상술한 임상적으로 사용가능한 동결(hibernation) 또는 얼린 용액과 같은 용액으로 농축된다. 한 실시양태에서, NSC는 세포 투여를 위한 세포 밀도와 동일하거나 상이할 수 있는 적절한 세포 밀도로 농축된다. 한 실시양태에서, 투여를 위한 세포 밀도는 주입 부위, 주입 부위의 신경퇴행성 상태, 이로운 효과를 위해 필요한 최소 용량, 및 독성 부작용 고려사항과 같은 요인에 따라 마이크로리터당 약 1,000개 세포 내지 마이크로리터당 약 1,000,000개 세포로 다양할 수 있다. 한 실시양태에서, 개시된 방법은 마이크로리터당 약 5,000개 내지 약 50,000개 세포의 세포 밀도로 NSC를 주입하는 것을 포함한다.

치료 영역으로의 전달을 위해 증대된 NSC를 현탁시키는 매질의 부피는 본원에서 주입 부피로 지칭될 수 있다. 주입 부피는 주입 부위 및 조직의 퇴행성 상태에 따라 달라진다. 보다 구체적으로, 주입 부피의 하한은 높은 세포 밀도의 점성 현탁액의 실질적인 액체 취급 뿐만 아니라 군집하는 세포 경향에 의해 결정될 수 있다. 주입 부피의 상한은 숙주 조직의 손상을 피하는 데 필요한 주입 부피에 의해 가해지는 압축력의 한계 뿐만 아니라 실질적인 수술 시간에 의해 결정될 수 있다.

공지된 방법을 이용하는 공여 세포의 낮은 세포 생존으로 인해, 효과적인 치료를 시도하기 위해서 상대적으로 작은 영역으로의 다량의 세포 전달이 필요하게 되었다. 그러나, 주입 부피는 숙주 조직에 가해진 정수압(hydrostatic pressure)이고, 큰 주입 부피와 관련된 연장된 주입 시간은 수술 위험을 악화시킨다. 추가적으로, 공여 세포의 과주입은 숙주 실질 조직의 압축 및 연이은 손상을 초래한다. 부피 제약을 보상하기 위한 시도로, 공지된 방법은 주입을 위한 높은 세포 밀도 현탁액의 제조를 요구한다. 그러나, 높은 세포 밀도는 이식된 세포의 조밀한 군집을 촉진하고 세포 이동 또는 확산을 억제하여, 제한된 영역을 넘어서는 효과적인 치료를 방해하고 숙주 조직으로의 완전한 통합을 위태롭게 한다.

대조적으로, 개시된 방법에 의해 제조된 세포의 생체 내 개선된 생존의 결과로서 주입 당 보다 적은 수의 세포가 요구된다. 사실상, 개시된 방법을 이용하여 주입된 세포 수의 최대 3 내지 4배가 주입 시점으로부터 6개월 후에 존재하는 것으로 나타났고, 이는 상당한 양적 생존을 입증한다. 또한, 양적 생존 덕분에 목적하는 세포 용량의 재현가능한 투여가 달성될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, NSC는 마이크로리터 당 약 1,000개 내지 약 200,000개 세포의 밀도로 농축된다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로리터 당 약 5,000개 내지 약 50,000개의 NSC가 효과적인 이식을 위해 사용되었다. 또 다른 실시양태에서, 마이크로리터 당 약 10,000개 내지 30,000개의 NSC가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, NSC는 주입 부위 당 약 100 마이크로리터 미만의 주입 부피로 현탁되어 치료 영역으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 다수 주입이 이루어질 수 있는 인간 대상체의 신경퇴행성 병태의 치료에서, 주입 부위 당 0.1 및 약 100 마이크로리터의 주입 부피가 이용될 수 있다.

목적하는 영역으로 세포를 주입하기 위한 임의의 적합한 장치가 개시된 방법에서 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 실질적으로 일정한 유속으로 장시간에 걸쳐 마이크로리터 미만의 부피를 전달할 수 있는 주사기가 사용된다. 세포는 바늘 또는 유연한 관 또는 임의의 다른 적합한 전달 장치를 통해 장치 내로 로딩될 수 있다.

한 실시양태에서, 신경퇴행성 병태의 치료를 위한 목적하는 주입 부위는 뇌의 하나 이상의 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 대뇌 피질, 대뇌 반구, 시상, 시상하부, 중뇌, 소뇌, 뇌교 또는 연수와 같은 뇌의 하나 이상의 특정한 부분 또는 영역으로 이식된다.

또 다른 실시양태에서, 세포는 뇌의 약 5 내지 약 50개의 부위에 주입된다. 한 실시양태에서, 세포는 뇌의 약 10 내지 약 30개의 부위에 주입된다. 부위 중 2개 이상이 대략 100 마이크로미터 내지 약 5000 마이크로미터의 거리로 떨어져 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 주입 부위 사이의 거리는 약 400 마이크로미터 내지 약 600 마이크로미터이다. 주입 부위 사이의 거리는, 뇌 조직 도처에 실질적으로 연속하고 근접한 공여 세포 존재를 유발하는 지와 래트 또는 돼지와 같은 동물 모델에서 약 2 내지 3개월 생존을 달성하는 것으로 입증된 평균 주입 부피에 기초하여 결정될 수 있다. 인간에서의 주입의 실제 수는 동물 모델에서의 결과로부터 추정될 수 있다.

개시된 방법의 NSC는 생체 내에서 다수의 뉴런을 생성할 수 있다. NSC가 이식 전에 명백히 미리-분화되지 않은 경우, NSC는 분화 전에 생체 내에서 2 내지 4 이하의 세포 분열로 증식하여, 효과적인 공여 세포의 수를 추가로 증가시킬 수 있다. 분화시 뉴런은 특정 신경전달물질을 분비한다. 또한, 뉴런은 성장 인자, 효소 및 다른 단백질, 또는 다양한 병태에 이로운 물질들을 생체 내에서 이식 주변의 환경에 분비한다. 따라서, 생체 내에서 다수의 뉴런을 생성하는 이식된 세포의 능력으로 인해서, 및 신경퇴행성 병태가 뉴런-유래 요소를 포함하는 요소의 손실에 의해 야기될 수 있거나 또는 요소의 손실을 야기할 수 있으므로, 다양한 병태가 개시된 방법에 의해 치료될 수 있다. 따라서, 성장 인자, 효소 및 다른 단백질과 같은 이러한 뉴런-유래 요소의 부족으로 인해 CNS 조직의 퇴화를 겪고 있는 대상체가 개시된 방법에 의해 효과적으로 치료될 수 있다.

개시된 방법은 또한 대뇌 허혈로 발생한 부전마비, 마비, 경직, 강직 또는 임의의 다른 운동, 언어 또는 인지 증상을 치료하는 데 적용될 수 있다. 대뇌 허혈은 뇌에서의 뇌졸중 사건의 결과로서 또는 뇌로의 혈액 순환이 상당한 기간 동안 중단되는 심근경색으로부터 발생할 수 있다. 따라서, 상술한 척수 허혈과 유사하다. 일부 뇌졸중 대상체는 중추 기원의 발작 뿐만 아니라, 기억 상실, 마비 또는 부전마비와 같은 다른 결손을 발생시킨다. 또한, 대뇌 허혈로부터의 이러한 결손은 해마 및/또는 다른 뇌 영역의 억제개재뉴런의 선택적 손실로 인한 것일 수도 있다. 따라서, 개시된 방법은 부전마비, 마비, 경직 또는 다른 운동, 언어 및 인지 증상을 겪고 있는 뇌졸중 대상체를 치료하는 데 적용될 수 있다.

추가적 설명 없이, 당해 분야의 통상의 기술자는 상기 설명 및 하기 예시적인 실시예를 이용하여 본 개시내용의 작용제를 제조하고 이용하며, 청구된 방법을 실시할 수 있는 것으로 이해된다. 하기 실시예는 본 개시내용의 실시를 용이하게 하기 위해 제공되며, 어떤 식으로도 본 개시내용의 나머지를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

<실시예>

실시예 1: 인간 척수 신경 줄기/전구체 세포의 증대

대략 7 내지 8.5주의 수태령의 하나 이상의 공여자로부터 척수를 수득하였다. 척수의 단일 인접 조직을 기계적 분쇄를 이용하여 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺-무함유 인산염 완충 염수에서 해리시켰다. 이어서, 수득한 세포 현탁액을 폴리-L-오르니틴 또는 폴리-D-리신 및 인간 피브로넥틴 또는 다른 세포외 기질 단백질로 미리 코팅된 조직 배양 플레이트에 시딩하였다. 이어서, 조직 배양-처리된 플레이트 또는 플라스크를 100 ㎍/ml의 폴리-D-리신과 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 이를 물로 3회 세척하고, 건조시켰다. 이어서, 이를 25 mg/ml와 함께 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 때때로, 실온에서 1시간 동안 10 mg/ml의 피브로넥틴을 사용하였다. 때때로, 37℃에서 18시간 동안 1 mg/ml의 피브로넥틴을 사용하였다. N2 (DMEM/F12 + 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 푸트레신 및 프로게스테론)로 이루어진 배양 배지를 1개의 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)로 보충하였다. 한 실시양태에서, 0.1 ng/ml 내지 100 ng/ml의 범위를 이용할 수 있었다. 한 실시양태에서, 최적으로는 10 ng/ml의 bFGF를 이용하였다.

수득한 최초 배양물은 유사분열 후 뉴런 및 증식성 NSC의 단층으로 이루어져 있었다. 후속적으로, 배양한 지 대략 5 내지 약 20일 후에, 네스틴-양성 분열 NSC가 비-분열 뉴런 또는 느린-분열 신경교세포에 비해 배양물에서 우세하였다. 이러한 배양 조건 하에, NSC는 증대에 있어서 선택적으로 유리하였다. 증대된 NSC 집단을 트립신의 사용과 같은 가벼운 효소 처리로 계대배양하였다. 이어서, 세포를 혈청을 함유하지 않거나 혈청을 실질적으로 함유하지 않는 배지에서 배양하였다. 저농도의 혈청은 세포에 의해 허용될 수 있지만, 혈청은 NSC의 신경교세포 분화를 촉진하는 수많은 사이토킨, 예컨대 LIF 및 CNTF를 함유하므로, 세포를 혈청에 노출시키는 것을 피하는 것이 최선이다. 따라서, 계대배양 동안, 혈청보다는 특정 효소 억제제, 예컨대 트립신 억제제를 첨가하여 효소 사용을 중지하였다. 각각의 계대배양에서, 수거된 세포의 수를 계수하고, 추가 증대를 위해 분획을 다시 시딩하였다. 상기 방법을 이용하여, 인간 NSC를 그의 성장 및 분화 특성을 유지하면서 10¹⁸배 넘게 집단으로 증대시킬 수 있었다. 증대 기간 동안, 거의 대부분의 세포가 유사분열 신경상피세포의 생체 내 마커인 네스틴을 발현하였고, 분화된 뉴런 및 신경교세포의 항원, 예컨대 유형 3-베타 튜불린 및 GFAP는 부재하였다. 상기 세포는 또한 위탁 뉴런 전구체의 가능한 마커인 PSA-NCAM, 올리고덴드로사이트의 마커인 O4 및 GalC, 방사성 신경교세포의 마커인 RC2에 대한 면역염색에 음성을 나타내었다. 따라서, 면역염색으로 측정시, NSC는 연장된 증대 기간에 걸쳐 그의 항원 프로파일의 발현을 안정하게 유지하였다.

실시예 2: 인간 척수 신경 줄기 전구체 세포의 분화

NSC의 증대 기간 중 임의의 시점에 배양물 내 미토겐, 예컨대 bFGF를 회수하여 배양물을 분화시킬 수 있었다. NSC의 분화는 미토겐의 제거 후 약 1 내지 3일 내에 일어났고, 특이한 이종 세포 형태가 나타났다. 분화 후 대략 제4일 내지 제7일에, 뉴런-특이적 항원, 예컨대 MAP2c, tau 및 유형 III 베타-튜불린이 면역염색에 의해 시각화될 수 있었다. 대략 제12일 내지 제14일에, 하위세포 단백질 수송의 명확한 분극화와 함께 배양물 전반에 걸쳐 축삭의 연장 및 다발형성 과정이 명백히 나타났다. 대략 제28일에, 시냅스 단백질, 예컨대 시냅신 및 시냅토피신이 축삭 말단으로 국소화되었고, 이는 얼룩 반점으로 나타났다. 추가의 성상교세포의 영양세포층을 제공하여 뉴런의 장기 성숙을 더욱 촉진시킬 수 있었다. 인간 척수 NSC의 분화로 뉴런 및 신경교세포의 혼합 배양물이 생성되었고, 여기서 뉴런은 뉴런-특이적 항원, 예컨대 tau, MAP2ab 및 유형 3 베타 튜불린을 강하게 발현하면서 배양물의 대락 50％를 차지하였다. 추가로, 배양물은 수 cm로 신장하는 긴 다발형의 축삭 케이블을 자발적으로 생성하였다. 뉴런의 상당 비율이 배양물에 또한 존재하는 콜린성 운동 뉴런과 함께 GABA성 뉴런이었다. 배양물 내 상당한 GABA 뉴런의 존재로 인해, 특정 회로망에서의 감소된 GABA 생성으로 인한 다양한 신경계 병태를 치료하기 위한 인간 척수 NSC의 유용성이 예측되었다. 이와 유사하게, 콜린성 뉴런의 존재는 인간 척수 NSC가 운동 뉴런으로 분화할 수 있음을 입증하고, 이로써 운동 뉴런의 점진적 감소로 인한 다양한 운동 뉴런 질환을 치료하기 위한 이들의 유용성이 예측되었다. 치료를 위해, NSC를 추가의 표현형-향상 조건의 존재 또는 부재 하에 증대시키고, 수거하여 신경 결핍 영역으로 주입할 수 있다.

실시예 3: 척수 유래의 신경 줄기 세포의 뇌로의 이식

신경 줄기 세포를 시험관내 증대된 포유동물로부터 단리한 후, 신경퇴행성 질환 및/또는 장애로 고통받는 대상체의 하나 이상의 영역 (예를 들어, 대상체의 뇌)에 도입 (예를 들어, 이식)할 수 있다.

예시적인 신경퇴행성 장애의 치료 방법에서, 제0일에 선행 기재된 변형된 방법 (문헌 [Chen et al., 1986; Shyu et al. 2004] 참조)으로 성인 수컷 스프라그-다우레이(Sprague-Dawley) 래트 (체중 250-300 g)에서 3-혈관 결찰을 수행하여 대뇌 허혈 (예를 들어, 뇌졸중)을 유도하였다. 요컨대, 래트를 클로랄 수화물 (0.4 g/kg, ip)로 마취시키고, 양측 CCA를 비외상성 동맥 클립으로 클램핑하였다. 이어서, 수술 현미경을 이용하여 2 x 2 mm 크기로 두부를 천공하고, 관골을 인상골에 연결시켰다. 이어서, 우측 MCA를 10-O 나일론 봉합사로 결찰하였다. 마취된 래트에서 피질 혈류를 레이저 도플러 유량계 (PF-5010, 페리플럭스 시스템(Periflux system), 페리메드 아베(Perimed AB), 스웨덴 스톡홀름 소재)를 이용하여 연속 측정하였다. 이어서, 우측 전두두정 영역에서 천두술 (1-mm 직경)을 수행하여 광검출기를 위치시켰다. 이어서, 프로브 (직경 0.45 mm)를 피질에 정위 방식으로 위치시켰다 (정수리점에서 1.3 mm 후방, 2.8 mm 측방, 및 경질막에서 1.0 mm 하방). 결찰시킨 지 90분 후, MCA 상의 봉합사 및 CCA 상의 동맥 클립을 제거하여 재관류시켰다. 래트가 마취 상태로 있는 동안, 그의 중심 체온을 서미스터 프로브로 모니터링하고, 마취 기간 동안 가열 패드를 이용하여 37℃로 유지시켰다. 마취로부터 회복된 후, 가열 램프를 이용하여 체온을 37℃로 유지시켰다.

이어서, 3-혈관 결찰된 래트를 2개의 군으로 나누었다. 제1군 ("이식군")에 NSI-566RSC 세포 (인간 척수 줄기 세포주 "HSSC"주; 임상 로트, 뉴럴스템, 인크.(Neuralstem, Inc.), 미국 소재)를 수여하고, 제2군 ("대조군")에 비히클-대조군을 수여하였다. NSI-566RSC 줄기 세포주는 태아 척수 조직으로부터 유래하였다. cGMP 임상 로트 (계대배양 12)로부터의 줄기 세포를 본 연구에서 사용하였다. 수술 당일에, 하나의 저온보존된 세포 바이알을 뉴럴스템의 프로토콜에 따라 해동하고, 세척하고, 농축시켰다. 본 연구에서, 모든 동물에게 FK506 (또는 프로그라프) 1 mg/kg을 매일 1회 복강내 주사로 수여하여 이들의 면역계를 억제하였다.

NSI-566RSC 세포 또는 대조군 비히클을 제7일에 이식군 및 대조군에게 각각 투여하였다. 이식군의 래트에게 5 ㎕의 현탁액 중 대략 2 x 10⁵개 NSI-566RSC 세포를 30-가우스 해밀턴(Hamilton) 주사기를 통해 경질막에서 3.0 내지 5.0 mm 아래의 3군데 피질하 영역에 정위 방식으로 주사하였다. 이들 부위에 대한 대략적인 좌표는 정수리점에서 1.0 내지 2.0 mm 전방 및 중간선에서 3.5 내지 4.0 mm 측방, 정수리점에서 0.5 내지 1.5 mm 후방 및 중간선에서 4.0 내지 4.5 mm 측방, 및 정수리점에서 3.0 내지 4.0 mm 후방 및 중간선에서 4.5 내지 5.0 mm 측방이었다. 각각의 주사 후 5분 동안 바늘을 제자리에 유지시키고, 하나의 골랍을 두골 결손 부위에 도포하여 주사 용액의 누출을 방지하였다. 비히클-대조군의 실험 래트는 세포 없이 현탁 완충액만을 이용하여 정위 방식으로 처리하였다.

신경 거동 평가를 대뇌 허혈 3일 전, 및 치료 후 제1일, 제7일, 제14일, 제21일 및 제28일에 수행하였다. 본 시험은 (a) 몸체 비대칭, (b) 운동 활성 및 (c) 악력을 측정하였다. 사전-처리 스코어를 기록하여 대뇌 허혈 후 얻어진 스코어를 표준화하였다. 몸체 비대칭의 경우, 선행 기재된 바와 같이 (문헌 [Borlongan et al., 1998]), 상승된 바디 스윙 시험 (EBST)을 이용하여 MCA 결찰 후의 몸체 비대칭을 평가하였고, 이는 정량적으로 평가되었다. 초기에, 동물을, 그의 꼬리로 매달린 몸체를 이용하여 수평 운동에 대해 시험하였다. 선행 기재된 바와 같이 (문헌 [Chang et al., 2003]), 허혈 부분 반대로의 초기 헤드 스윙의 빈도를 20회의 연속 시험에서 계수하고, 표준화하였다 (도 1, 패널 A). 운동 활성의 경우, 각각의 실험 래트의 거동 기록을 위해 약 2시간 동안 래트에게 버사맥스 애니멀 액티비티 모티터링(VersaMax Animal Activity monitoring) (아큐스캔 인스트루먼츠, 인크.(Accuscan Instruments, Inc.), 미국 오하이오주 콜럼버스 소재)을 수행하였다. 버사맥스 애니멀 액티비티 모니터는 87 cm 간격으로 16개의 수평 및 8개의 수직 적외선 센서를 포함하였다. 수직 센서는 챔버 바닥으로부터 10 cm 떨어져 위치하였다. 챔버 내 래트의 운동으로 인해 차단된 광선의 수로 운동 활성을 계수하였다. 제조업자의 메뉴 선택사항에 규정된 하기 3가지 수직 파라미터를 야간에 2시간에 걸쳐 계산하였다: (i) 수직 활동, (ii) 수직 시간 및 (iii) 수직 운동 횟수 (도 1, 패널 B-D). 악력의 경우, 선행 기재된 바를 변형하여 (문헌 [(Dunnett et al., 1998]), 악력계 (TSE-시스템즈(TSE-Systems), 독일 소재)를 이용하여 래트를 분석하였다. 요컨대, 각각의 앞다리의 악력비를 따로 측정하고, 허혈 반대 부분으로의 20회의 잡아당김의 평균 강도와 허혈 부분으로의 20회의 잡아당김의 평균 강도 사이의 비로 계산하였다. 또한, 치료후 및 치료전 악력의 비를 계산하고, 사전-치료 값의 백분율로서 변화를 나타내었다 (도 1, 패널 E). 전반적으로, 세포-처리군과 대조군에서의 거동 변화의 측정시 조사원들은 맹검된 상태였다.

래트에 3-혈관 결찰을 수행한 지 대략 27일 후, 래트를 클로랄 수화물 (0.4 g/kg, ip)로 마취하고, 이들의 뇌를 염수를 이용한 심장 관류, 및 이어서 관류, 및 4％ 파라포름알데히드 중의 침지로 고정시킨 후, 꺼내어 30％ 수크로스에 포매하였다. 일련의 인접한 20-㎛-두께의 절편을 각각의 뇌로부터 관상면으로 자르고, H&E로 염색하고, 광현미경 (니콘(Nikon), E600, 일본 소재)으로 관찰하였다. 이어서, 인간 이식된 세포를 다양한 인간-특이적 항체 (HuNu, 시냅토피신, hNSE, hNF 등)로 확인하였다 (도 2a-2b 참조). BrdU 면역염색을 위해, 먼저 각각의 절편을 65℃에서 2시간 동안 2X 표준 염수 시트레이트의 50％에서 인큐베이션하고, 이어서 37℃에서 30분 동안 2 N HCl에서 인큐베이션하여 DNA를 변성시키고, 마지막으로 pH 8.5의 0.1 M 붕산에서 세정하였다. 이어서, 상기 절편을 트리스 완충액으로 세정하고, 1％ H₂O₂로 처리하여 내인성 퍼옥시다제를 차단하였다. 이어서, 표지된 스트렙타비딘-바이오틴 (LSAB) 방법 (DAKO LASB-2 키트, 퍼옥시다제, DAKO, 미국 소재)을 이용하여 면역염색 절차를 수행하였다. 이어서, 염수-코팅된 슬라이드 상의 뇌 조직을 탈파라핀화 및 재수화 후에 750 W의 마이크로웨이브 오븐 내 비등하는 시트레이트 완충액 (pH 6, 켐메이트(ChemMate), DAKO, 미국 소재)에 5분 동안 2회 위치시켰다. 이어서, 조직을 적절히 희석된 BrdU에 대한 1차 항체 (핵 확인을 위한 것, 1:400 희석, 시그마(Sigma), 미국 소재)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 0.1％ 트윈(Tween)-20을 함유하는 트리스-완충 염수 (TBS-T)로 세척한 후, 표본을 바이오티닐화된 항-토끼 및 항-마우스 (1:200, R&D 시스템즈(R&D Systems), 미국 소재) 이뮤노글로불린 및 퍼옥시다제-표지된 스트렙타비딘과 함께 10 내지 30분 동안 순차적으로 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 지 10분 후, 새로 제조된 기질-발색체 용액 (3％ 3-아미노-9-에틸카르바졸 및 과산화수소 함유)으로 염색을 수행하였다. 마지막으로, 슬라이드를 헤마톡실린으로 가볍게 대비염색하고, 물로 세척한 후 탑재하였다. 1차 항체를 생략한 것을 제외하고는 동일한 뇌 조직 표본의 제법으로 음성 대조군 절편을 염색하였다. BrdU 면역반응 세포의 정량을 컴퓨터 화상 분석 시스템 (이미징 리서치(Imaging Research), 캐나다 소재)을 통해 60X 대물 렌즈 (칼 자이스(Carl Zeiss) LSM510, 독일 소재)를 이용하여 디지털 방식으로 계수하였다.

또한, 외인성 이식된 NPC 및 내인성 귀소 줄기 세포와 함께 위치하는 세포 유형-특이적 마커 (BrdU 면역반응)를 레이저-스캐닝 공초점 현미경에 의한 면역형광 동일위치 분석으로 확인할 수 있었다. 면역형광 동일위치 연구에서, 각각의 관상면을 Cy3 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch), 미국 펜실베니아주 소재, 1:500) 염색과 함께, 세포-특이적 항체, 예를 들어 신경교 섬유 산성 단백질 (성상교세포의 경우 GFAP, 1:400, 시그마, 미국 소재), 폰-빌레브란트(Von-Willebrand) 인자 (내피 세포의 경우 vWF, 1:400, 시그마, 미국 소재), 뉴런 핵 항원 (뉴런 핵의 경우 Neu-N, 1:200, 켐아이콘(Chemicon), 캐나다 소재), 네스틴 (뉴런 수상돌기의 경우, 1:200, 켐아이콘, 캐나다 소재), 미세관-관련 단백질 2 (뉴런 수상돌기의 경우 MAP-2, 1:200, BM, 독일 소재), 케모카인으로부터의 간질 세포-유래 인자 1 (SDF-1, 1:200) 및 CXC 수용체 유형 4 (CXCR4, 1:200), 및 PrP^C (1:300, M20, 산타 크루즈(Santa Cruz))로 처리하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, NSI-566RSC 세포로 처리된 동물은 바디 스윙, 수직 운동, 수직 활동, 수직 운동 시간 및 악력에서 대조군 비히클로 처리된 동물에 비해 개선을 나타내었다.

실시양태를 포함한 상기 기재된 본 발명의 주제의 측면은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 측면 또는 실시양태와 조합하여 이점이 있을 수 있다. 상기 기재에 제한 없이, 본원 주제의 한 측면에 따라, 인간의 척수 조직으로부터 하나 이상의 줄기 세포를 수득하는 단계; 하나 이상의 줄기 세포를 증대시켜 증대된 줄기 세포 집단을 형성하는 단계; 및 치료 유효량의 증대된 줄기 세포 집단을 대상체의 뇌의 하나 이상의 영역에 도입하는 단계를 포함하는, 뇌에서의 뉴런 세포 손실과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 증대된 줄기 세포 집단은 생체 내에서 대상체의 뇌로 통합되는 뉴런으로 분화된다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 질환 또는 장애는 대뇌 허혈, 출혈 및 외상에 기인한다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 질환 또는 장애는 마비, 언어 장애, 기억 또는 추론 능력 상실을 포함한다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 질환 또는 장애는 운동 기능장애 또는 인지 결핍을 포함한다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 인간은 약 5 내지 약 20주의 수태령을 갖는다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 증대시키는 것은 혈청의 부재 하에 신경 줄기 세포를 배양하는 것을 포함한다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 증대시키는 것은 하나 이상의 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함한다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 성장 인자는 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 증대된 줄기 세포 집단의 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 90％ 이상은 대상체의 뇌 조직에서 뉴런을 생성할 수 있다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 증대된 줄기 세포 집단의 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 90％ 이상은 시험관 내에서 뉴런으로 분화할 수 있다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 치료 유효량의 증대된 줄기 세포 집단을 도입하는 것은 치료 유효량의 적어도 일부를 대상체의 뇌 조직의 다수의 영역으로 주입하는 것을 포함한다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 영역은 대뇌 반구, 대뇌 피질, 피질하 운동 피질, 선조체, 내포, 시상, 시상하부, 해마, 중뇌, 뇌간 및 소뇌를 포함한다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 대상체는 대뇌 허혈을 야기하는 사건을 경험하였다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 사건은 뇌졸중이다.

상기 기재에 제한 없이, 본원 주제의 또 다른 측면에 따라, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 인간의 척수 조직으로부터 단리하는 단계; 시험관 내에서 상기 신경 줄기 세포를 증대시켜 증대된 집단을 형성하는 단계; 증대된 집단을 농축시키는 단계; 및 치료 유효량의 상기 증대된 집단을 대상체 뇌의 하나 이상의 영역에 도입하는 단계를 포함하는, 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서의 뇌졸중의 치료 방법이 제공된다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 척수는 약 5 내지 약 20주의 수태령으로부터 얻어진다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 증대된 집단의 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 90％ 이상은 대상체의 뇌 조직에서 뉴런을 생성할 수 있다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 치료 유효량의 증대된 집단을 도입하는 것은 치료 유효량의 적어도 일부를 수여자 뇌의 하나 내지 다수의 영역으로 주입하는 것을 포함한다.

이전 또는 이후의 측면 중 임의의 것과 함께 사용 또는 조합될 수 있는 또 다른 측면에 따라, 수여자 뇌의 영역은 대뇌 반구, 대뇌 피질, 피질하 운동 피질, 선조체, 내포, 시상, 시상하부, 해마, 중뇌, 뇌간 및 소뇌를 포함한다.

본 개시내용은 다양한 특정 물질, 절차 및 실시예에 대한 참고로서 본원에 기재 및 예시되지만, 본 개시내용은 이러한 목적을 위해 선택된 물질 및 절차의 특정 조합으로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 이러한 세부사항의 수많은 변형이 포함될 수 있음을 당업자는 알 것이다. 명세서 및 실시예는 단지 예로서 고려되며, 본 개시내용의 진정한 범주 및 취지는 하기 특허청구범위에 의해 명시된다. 본 출원에서 언급되는 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Claims

a) 인간의 척수 조직으로부터 하나 이상의 줄기 세포를 수득하는 단계;
b) 하나 이상의 줄기 세포를 증대시켜 증대된 줄기 세포 집단을 형성하는 단계; 및
c) 치료 유효량의 증대된 줄기 세포 집단을 대상체의 뇌의 하나 이상의 영역에 도입하는 단계
를 포함하는, 뇌에서의 뉴런 세포 손실과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 증대된 줄기 세포 집단이 생체 내에서 대상체의 뇌로 통합되는 뉴런으로 분화되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 질환 또는 장애가 대뇌 허혈, 출혈 및 외상에 기인하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 질환 또는 장애가 마비, 언어 장애, 기억 또는 추론 능력 상실을 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 질환 또는 장애가 운동 기능장애 또는 인지 결핍을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 인간이 약 5 내지 약 20주의 수태령(gestational age)을 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 증대시키는 것이 혈청의 부재 하에 신경 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 증대시키는 것이 하나 이상의 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 성장 인자가 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 증대된 줄기 세포 집단의 30％ 이상이 대상체의 뇌 조직에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 증대된 줄기 세포 집단의 50％ 이상이 시험관 내에서 뉴런으로 분화할 수 있는 것인 방법.
제1항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 줄기 세포 집단을 도입하는 것이 치료 유효량의 적어도 일부를 대상체의 뇌 조직의 다수의 영역으로 주입하는 것을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 영역이 대뇌 반구, 대뇌 피질, 피질하 운동 피질, 선조체, 내포, 시상, 시상하부, 해마, 중뇌, 뇌간 및 소뇌를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 대상체가 대뇌 허혈을 야기하는 사건을 경험한 대상체인 방법.
제14항에 있어서, 사건이 뇌졸중인 방법.
a) 하나 이상의 신경 줄기 세포를 인간의 척수 조직으로부터 단리하는 단계;
b) 시험관 내에서 상기 신경 줄기 세포를 증대시켜 증대된 집단을 형성하는 단계;
c) 증대된 집단을 농축시키는 단계; 및
d) 치료 유효량의 상기 증대된 집단을 대상체 뇌의 하나 이상의 영역에 도입하는 단계
를 포함하는, 뇌졸중의 치료를 필요로 하는 대상체에서 뇌졸중을 치료하는 방법.
제16항에 있어서, 증대된 집단의 20％ 이상이 대상체의 뇌 조직에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제16항에 있어서, 척수가 약 5 내지 약 20주의 수태령으로부터 얻어지는 것인 방법.
제16항에 있어서, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 증대시키는 것이 혈청의 부재 하에 신경 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 하나 이상의 신경 줄기 세포를 증대시키는 것이 하나 이상의 신경 줄기 세포를 하나 이상의 성장 인자에 노출시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제20항에 있어서, 성장 인자가 bFGF, EGF, TGF-알파, aFGF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 증대된 집단의 30％ 이상이 대상체의 뇌 조직에서 뉴런을 생성할 수 있는 것인 방법.
제16항에 있어서, 치료 유효량의 증대된 집단을 도입하는 것이 치료 유효량의 적어도 일부를 수여자 뇌의 하나 내지 다수의 영역으로 주입하는 것을 포함하는 것인 방법.
제23항에 있어서, 수여자 뇌의 영역이 대뇌 반구, 대뇌 피질, 피질하 운동 피질, 선조체, 내포, 시상, 시상하부, 해마, 중뇌, 뇌간 및 소뇌를 포함하는 것인 방법.