CN110251534A - 羊膜上皮细胞在预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤中的应用 - Google Patents
羊膜上皮细胞在预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110251534A CN110251534A CN201910544486.8A CN201910544486A CN110251534A CN 110251534 A CN110251534 A CN 110251534A CN 201910544486 A CN201910544486 A CN 201910544486A CN 110251534 A CN110251534 A CN 110251534A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- asherman
- haecs
- syndrom
- endometrium
- mouse
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000028685 Asherman syndrome Diseases 0.000 title claims abstract description 95
- 230000002357 endometrial effect Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 210000003425 amniotic epithelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 16
- 230000006735 deficit Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 claims abstract description 80
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 claims abstract description 69
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 46
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 20
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 18
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 23
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 claims description 20
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 claims description 20
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 16
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 15
- 101001052506 Homo sapiens Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A Proteins 0.000 claims description 13
- 102100024178 Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3A Human genes 0.000 claims description 13
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 11
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 claims description 11
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 claims description 11
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 claims description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 8
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 claims description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 7
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000568 mesometrium Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 2
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 2
- 210000004993 mammalian placenta Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 34
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 8
- 230000035558 fertility Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000009681 mesenchymal cell proliferation Effects 0.000 abstract description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 70
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 40
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 102100020814 Sequestosome-1 Human genes 0.000 description 23
- 101800001821 Precursor of protein E3/E2 Proteins 0.000 description 21
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 21
- 101800002664 p62 Proteins 0.000 description 21
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 20
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 18
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 18
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 16
- 238000011160 research Methods 0.000 description 15
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 14
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 12
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 10
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 10
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 10
- 208000002777 Gynatresia Diseases 0.000 description 9
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 8
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 230000001072 progestational effect Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 8
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 8
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 7
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 7
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 7
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 6
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 6
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 6
- 101100372758 Danio rerio vegfaa gene Proteins 0.000 description 5
- DNXHEGUUPJUMQT-CBZIJGRNSA-N Estrone Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 DNXHEGUUPJUMQT-CBZIJGRNSA-N 0.000 description 5
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 5
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 5
- 101150030763 Vegfa gene Proteins 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 5
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 5
- 210000002570 interstitial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 5
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 239000002346 layers by function Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000003821 menstrual periods Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 108010082399 Autophagy-Related Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102100021251 Beclin-1 Human genes 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 101000894649 Homo sapiens Beclin-1 Proteins 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 3
- 210000004957 autophagosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000016117 decidualization Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 3
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 description 3
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 3
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- DNXHEGUUPJUMQT-UHFFFAOYSA-N (+)-estrone Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 DNXHEGUUPJUMQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N (16alpha,17betaOH)-Estra-1,3,5(10)-triene-3,16,17-triol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(C(O)C4)O)C4C3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010092776 Autophagy-Related Protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 102000016614 Autophagy-Related Protein 5 Human genes 0.000 description 2
- 108091060290 Chromatid Proteins 0.000 description 2
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 description 2
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 description 2
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 2
- 102100033296 Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 1 Human genes 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- 101000887051 Homo sapiens Ubiquitin-like-conjugating enzyme ATG3 Proteins 0.000 description 2
- -1 Imide ester Chemical class 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039930 Ubiquitin-like-conjugating enzyme ATG3 Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- TXUZVZSFRXZGTL-QPLCGJKRSA-N afimoxifene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=C(O)C=C1 TXUZVZSFRXZGTL-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000181 anti-adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 210000004756 chromatid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N estriol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H]([C@H](O)C4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 PROQIPRRNZUXQM-ZXXIGWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960003399 estrone Drugs 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- BGOFCVIGEYGEOF-UJPOAAIJSA-N helicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1C=O BGOFCVIGEYGEOF-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 2
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 210000005077 saccule Anatomy 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- KCTJOEASAHXBBW-UHFFFAOYSA-N 3-methylamphetamine Chemical compound CC(N)CC1=CC=CC(C)=C1 KCTJOEASAHXBBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein succinimidyl ester Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O VDABVNMGKGUPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100020689 Autophagy-related protein 13 Human genes 0.000 description 1
- 102100026324 Beclin 1-associated autophagy-related key regulator Human genes 0.000 description 1
- 108090000524 Beclin-1 Proteins 0.000 description 1
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 208000036086 Chromosome Duplication Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100451497 Dictyostelium discoideum hspB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101150064205 ESR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 229940122880 Estrogen receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 102100029951 Estrogen receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 206010016880 Folate deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000010188 Folic Acid Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000005915 GABA Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010005551 GABA Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100035695 Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein Human genes 0.000 description 1
- 101710106570 Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 1 Proteins 0.000 description 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101150022862 HSC70 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000008899 Habitual abortion Diseases 0.000 description 1
- 101000785138 Homo sapiens Autophagy-related protein 13 Proteins 0.000 description 1
- 101000766227 Homo sapiens Beclin 1-associated autophagy-related key regulator Proteins 0.000 description 1
- 101001010910 Homo sapiens Estrogen receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101001001372 Homo sapiens Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 101000926844 Homo sapiens Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000644537 Homo sapiens Sequestosome-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 description 1
- 102000014944 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010064171 Lysosome-Associated Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000037093 Menstruation Disturbances Diseases 0.000 description 1
- 101100345706 Mus musculus Map1lc3b gene Proteins 0.000 description 1
- 101000808007 Mus musculus Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 208000000450 Pelvic Pain Diseases 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical class C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006399 Premature Obstetric Labor Diseases 0.000 description 1
- 206010036600 Premature labour Diseases 0.000 description 1
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108700026518 Sequestosome-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 208000033040 Somatoform disorder pregnancy Diseases 0.000 description 1
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 1
- 206010072810 Vascular wall hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003098 androgen Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012822 autophagy inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000005886 chromosome breakage Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011262 co‐therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003785 decidua Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 101150007515 esr2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960001348 estriol Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000002219 extraembryonic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003667 hormone antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000002657 hormone replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000008069 intimal proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000006674 lysosomal degradation Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000011599 ovarian follicle development Effects 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009963 pathologic angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 208000026440 premature labor Diseases 0.000 description 1
- 208000016685 primary ovarian failure Diseases 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000035752 proliferative phase Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000333 selective estrogen receptor modulator Substances 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 210000003684 theca cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 230000001550 time effect Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000000685 uterine artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000013948 uterine smooth muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/50—Placenta; Placental stem cells; Amniotic fluid; Amnion; Amniotic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及羊膜上皮细胞在制备预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤的药物中的应用，以人羊膜上皮细胞为例，其能修复小鼠宫腔粘连模型中的子宫内膜形态，促进子宫内膜血管生成与间质细胞增殖，改善小鼠宫腔损伤后的生育能力，调节小鼠宫腔粘连模型中子宫内膜间质细胞自噬并体外激活人子宫内膜间质细胞自噬。本发明首次报道了hAECs对宫腔粘连及子宫内膜损伤的修复作用，其为hAECs对于临床上宫腔粘连及子宫内膜损伤的预防和治疗的应用提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及于生物医药技术领域，尤其涉及羊膜上皮细胞在制备预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤的药物中的应用。
背景技术
由于多种原因导致子宫内膜受损，使得子宫腔或宫颈管粘连，部分或全部闭塞，即为宫腔粘连，病人常出现月经减少、停经、盆腔疼痛、反复流产等症状，又称为Asherman综合征。一般认为，孕期或非孕期子宫的各种人工创伤，如流产刮宫术、剖宫产、子宫肌瘤切除术等损伤子宫基底层，则有可能导致宫腔粘连，这是十分常见的宫腔粘连病因；而诸如结核等感染造成子宫内膜的慢性炎症，也会导致粘连产生；一些先天苗勒氏管畸形，如纵膈子宫等，发生宫腔粘连的概率也会上升。研究表明，在创伤、感染以及自身遗传易感因素的相互作用下，子宫内膜修复能力与血管化能力降低，最终形成粘连。宫腔粘连的病理特征表现为正常的内膜基质被纤维化的组织替代，正常的腺体被无功能的上皮细胞取代；功能层基底层分界不清，功能层对激素刺激的反应变差；内膜组织中血管减少；宫腔中出现纤维化粘连。
Asherman综合征在一般妇女人群中的发生率约为1.5％，重复流产导致多次刮宫后，其发病率可达39％。因此，Asherman综合征给病人带来极大痛苦。目前，在临床上，宫腔镜下粘连松解术是治疗Asherman综合征的金标准。Deans等对154名女性进行的一项回顾性研究发现，对于希望怀孕的因Asherman综合征行宫腔镜下粘连松解术的患者，术后怀孕率可达79.0％；术后活产率可达63.7％。但研究人员也发现，由于子宫环境已经出现异常的生化代谢和血管化不良，Asherman综合征患者妊娠时很容易出现早产、胎盘发育异常等问题。在患有宫腔粘连的女性中，有三分之二曾经有过流产史。在宫腔侵入性操作后预防粘连产生的方法主要有放置宫内节育器(intrauterine device，IUD)、使用雌激素促进内膜生长和放置球囊导尿管等，但IUD、球囊导尿管的放置会增加感染风险。透明质酸可以减少重度IUA的几率但是不能完全阻止粘连产生。目前各种治疗方法仍缺乏大样本随机试验，也缺乏远期对生育功能影响的评价。也没有确切证据表明任何方法可以有效预防宫腔镜手术后的IUA。因此，如果在刮宫等危险因素发生后，使用有效的方法预防粘连发生，减少IUA发生的风险，将有益于病人的生殖健康。
由于干细胞有良好的组织修复潜能，来源丰富，目前，越来越多的研究着眼于使用各种干细胞预防宫腔粘连。Kilic等人使用三氯乙酸损伤大鼠子宫内膜，再用鼠源间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)腹腔注射修复，并使用口服雌激素配合治疗，发现MSC可以减少子宫的纤维化面积，增加血管生成、细胞增殖相关因子的表达。Zhang等人分别通过针尖机械损伤和注射脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)诱发炎症反应两种方法在小鼠体内建立了IUA模型，然后在小鼠子宫原位注射鼠源诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells，iPSCs)。在两种模型中，iPSCs均可以修复内膜形态，减轻炎症反应，并且使小鼠的妊娠率和平均胚胎数量明显上升。Gan等人在机械损伤的大鼠IUA模型中，肌层注射人羊膜间充质细胞(human amniotic mesenchymal stromal cells，hAMSCs)，起到了良好的修复作用。采用月经血来源的间质细胞(menstrual blood-derived stromalcells，menSCs)治疗Asherman综合征已经有了初步的临床依据。研究人员收集了7名宫腔镜诊断的重度Asherman综合征患者自身来源的menSCs，在两周内进行自体移植，并使用激素替代治疗以促进内膜修复。5名患者的子宫内膜厚度在治疗后达到了可以接受冷冻胚胎移植(frozen embryo transfer,FET)的水平。在三年的随访期内3名患者通过FET或自然受孕的方式成功怀孕。骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived stem cells，BMDSCs)移植在动物实验和临床研究中均获得了良好效果。鼠源和人源的BMDSCs均可被募集到小鼠子宫中，修复宫腔粘连，最终改善生育结局。在Santamaria等人的前瞻性临床研究中，11名Asherman综合征患者接受了自体BMDSCs的移植。在治疗后的3个月内，患者的平均内膜厚度、月经量、月经期长度明显增加。
人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells，hAECs)来源于胎盘，作为一种围产期干细胞，既拥有胚胎干细胞的多向分化潜能，又具有成体干细胞的免疫调节能力，因此，hAECs是再生医学领域重要的种子细胞。在前期研究中，针对人羊膜上皮细胞(hACEs)对卵巢和生育力的修复作用进行了一系列研究，包括：使用环磷酰胺与白消安联合化疗的方法，在小鼠体内模拟卵巢早衰；2个月后，化疗小鼠的卵巢中已经无法产生卵泡，而在尾静脉注射移植hAECs的小鼠中，各个阶段的卵泡都有发育，通过GFP标记发现，hAECs在小鼠卵巢中定植，并分化成为颗粒细胞；另外，hAECs可以明显抑制肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)介导的化疗后颗粒细胞凋亡。除此之外，仅对化疗后的小鼠腹腔注射hAECs的培养液上清，也可以增加卵泡数目，挽救生育能力。同时，卵巢的血管化能力也得到了提升。并验证旁分泌也是hAECs发挥卵巢功能的重要的修复作用方式。细胞因子芯片表明，hAECs上清中含有多种与凋亡、血管化、细胞周期、免疫相关的细胞因子。
但目前并未有任何文献报道hAECs在修复宫腔粘连及子宫内膜损伤中的应用。
发明内容
针对上述问题，本发明研究hAECs是否能在宫腔粘连及子宫内膜损伤的修复中起作用，并探索其中可能涉及到的分子机制，进一步验证了羊膜上皮细胞对于预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤的用途。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
本发明提供羊膜上皮细胞在制备预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤的药物中的应用。
进一步地，所述羊膜上皮细胞来源于哺乳动物胎盘羊膜组织。
进一步地，所述羊膜上皮细胞为人羊膜上皮细胞。
进一步地，所述人羊膜上皮细胞对宫腔损伤造成的内膜变薄、腺体数量减少、纤维化面积增加具有逆转作用。
进一步地，所述人羊膜上皮细胞能增加LC3的表达，降低p62的表达，表明所述人羊膜上皮细胞可以改善损伤的子宫内膜中的自噬。
进一步地，所述人羊膜上皮细胞能升高LC3-II/LC3-I比例，降低p62含量，表明所述人羊膜上皮细胞通过旁分泌起到激活人子宫内膜间充质干细胞自噬的作用。
进一步地，所述人羊膜上皮细胞能增加血管内皮生长因子的表达，并增加微血管密度，表明所述人羊膜上皮细胞对损伤的子宫内膜有明显的促血管作用。
进一步地，所述人羊膜上皮细胞能增加增殖细胞核抗原的表达，表明所述人羊膜上皮细胞促进子宫内膜间质细胞增殖；所述人羊膜上皮细胞还能增加雌激素受体的表达。
进一步地，所述药物为包括人羊膜上皮细胞与促血管药物和/或雌激素的联合使用药物。
进一步地，所述药物采用宫腔内注射、子宫肌层原位注射、腹腔注射或静脉注射。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明使用小鼠作为研究对象，采用机械损伤的方式，建立宫腔粘连的模型，并通过宫腔内注射及腹腔注射的方式移植hAECs。通过研究发现，宫腔粘连的小鼠其子宫出现了不同程度的阻塞、粘连，出现大量纤维化组织，并伴有子宫内膜变薄，腺体、微血管减少的表现。而hAECs的治疗改善了子宫内膜形态的不良改变，促进血管生成，以及促进细胞增殖。生育实验表明，hAECs对子宫内膜受损小鼠的生育结局有显著的改善。另外还发现，宫腔粘连的子宫内膜间质细胞中自噬水平降低，而hAECs治疗可以使自噬恢复到接近正常的水平。体外研究也证明，hAECs可通过旁分泌起到激活人子宫内膜间充质干细胞(humanendometrial mesenchymal stem cells，hEnSCs)自噬的作用。本发明的研究证明，hAECs对小鼠的宫腔粘连及子宫内膜损伤有一定的修复作用，这一结果为hAECs对于临床上宫腔粘连及子宫内膜损伤的预防和治疗的应用提供了理论依据。
附图说明
图1为本发明一实施例中人羊膜上皮细胞(hAECs)的形态及特性的示意图；其中，A.体外培养hAECs的细胞形态，此时hAECs密度接近100％，呈铺路石样，表现为上皮细胞的形态(标尺50μm)；B.hAECs细胞特性的鉴定：a、在hAECs中SSEA4(干细胞标志物)为阳性，b、上皮细胞标志物CD324为阳性，c、间质标志物CD146为阴性，d、免疫原性标志物HLA-DR为阴性；C.免疫荧光显示，在hAECs中，CK18(上皮标志物)为阳性；D.免疫荧光显示，在hAECs中，TRA-1-60(干细胞标志物)为阳性(标尺100μm)；
图2为本发明一实施例中采用hAECs修复小鼠宫腔粘连模型的子宫内膜形态示意图；其中，A.子宫内膜横切面的H&E染色显示：a、正常小鼠子宫内膜层形态完整，腺体分布其中，宫腔面有连续排列的内膜上皮细胞，界限清晰；b、宫腔粘连产生后，宫腔出现闭塞、粘连，内膜层腺体数量减少，子宫内膜变薄；c、使用hAECs治疗后，宫腔粘连减少，腺体数量增多，子宫内膜厚度增加(标尺200μm)；B.masson染色在10倍(a、b、c)、20倍(d、e、f)、40倍(g、h、i)显微镜下视野所示的形态，细胞间淡蓝色的部分为胶原纤维(管腔内为粘液)，反映了子宫内膜的纤维化程度；宫腔粘连导致大片纤维化产生，如黑色箭头指向所示；hAECs处理后，纤维化面积减少(a、b、c标尺200μm；d、e、f标尺100μm；g、h、i标尺25μm)；C.各组小鼠子宫内膜腺体数量的统计，计数每个子宫横断面的腺体个数；D.各组小鼠子宫内膜厚度的统计，计算每个子宫横断面平均内膜厚度；E.各组小鼠子宫内膜纤维化面积的统计，用纤维化面积与内膜总面积作比(n＝6；p<0.05，*；p<0.01，**；p<0.001，***；NS，差异不显著)；
图3为本发明一实施例中hAECs迁移至损伤的小鼠子宫的示意图；其中，A.CFSE荧光标记处理的hAECs均可发出绿色荧光(标尺100μm)；B.CFSE标记的hAECs迁移至损伤的小鼠子宫中，移植CFSE标记的hAECs的宫腔粘连模型小鼠，其子宫中可见绿色荧光(如橙色箭头所示)，放大后可见绿色荧光的位置为细胞质部分，符合CFSE在细胞中的分布，而未移植CFSE标记的hAECs的宫腔粘连模型小鼠的子宫中，未发现绿色荧光(标尺200μm，放大后标尺25μm)；
图4为本发明一实施例中hAECs促进子宫内膜血管生成与间质细胞增殖的第一示意图；其中，A.20倍和40倍显微镜下子宫内膜vWF免疫组化染色结果，显示了子宫内膜的微血管密度；紫色箭头所指为vWF阳性的微小血管，可见内膜受到损伤后微血管密度下降，而hAECs促进了微血管的产生；B.20倍和40倍显微镜下子宫内膜间质VEGF免疫组化染色结果，正常情况下以及宫腔粘连时VEGF表达较少，使用hAECs治疗后，子宫内膜VEGF表达明显增加；C.20倍和40倍显微镜下子宫内膜间质PCNA免疫组化染色结果，内膜收到损伤后，PCNA阳性的细胞比例减少；hAECs组PCNA阳性细胞比例升高，可达正常水平(上方图像标尺100μm，下方图像标尺50μm)；
图5为本发明一实施例中hAECs促进子宫内膜血管生成与间质细胞增殖的的第二示意图；其中，A.20倍和40倍显微镜下子宫内膜间质ER免疫组化染色结果，hAECs组相对IUA组，ER阳性的细胞比例增多；B.20倍和40倍显微镜下子宫内膜间质PR免疫组化染色结果(上方图像标尺100μm，下方图像标尺50μm)；C.对照组、IUA组、hAECs组子宫内膜中VEGF表达情况的统计，统计每40倍视野下，VEGF阳性的细胞个数；D.各组别MVD的统计，计算每40倍视野下(统计选择的视野不包含子宫内膜以外的部分)由vWF阳性的内皮细胞围成的微小血管的数量；E.各组别PCNA表达情况的统计，在40倍视野下计数PCNA阳性的细胞占所有细胞的比例；F.各组别ER表达情况的统计，在40倍视野下计数ER阳性的细胞占所有细胞的比例；G.各组别PR表达情况的统计，在40倍视野下计数PR阳性的细胞占所有细胞的比例(p<0.05，*；p<0.01，**；p<0.001，***；NS，差异不显著)；
图6为本发明一实施例中hAECs改善小鼠宫腔损伤后的生育能力的示意图；其中，A.孕9天时各组小鼠孕子宫的形态，可见正常情况下胚胎数目较多，胚胎大小均一，形态规整；内膜收到损伤后，胚胎数目显著减少，且两侧子宫不对称，胚胎大小不一，形态有异；经hAECs治疗，可增加胚胎数量，且胚胎形态整齐；B.各组小鼠胚胎数量的统计，可见正常小鼠每胎胚胎数量平均为11.33(±3.204)个，IUA组胚胎数量显著减少仅有0.67(±1.211)个，hAECs组平均每胎胚胎数量为5.17(±4.535)个，虽未达到正常小鼠水平，但较IUA组有显著提高(n＝6；p<0.05，*；p<0.01，**；p<0.001，***；NS，差异不显著)；C.对照组、IUA组、hAECs组每只小鼠胚胎数量的具体数据，并统计了怀孕率，宫腔粘连使得怀孕比例显著降低，而hAECs治疗后怀孕比例上升；
图7为本发明一实施例中hAECs调节小鼠宫腔粘连模型中子宫内膜间质细胞自噬的示意图；其中，A.20倍和40倍显微镜下子宫内膜间质细胞LC3免疫组化染色结果，可见IUA组小鼠子宫内膜LC3阳性间质细胞相比正常小鼠减少，hAECs组LC3阳性子宫内膜间质细胞相对IUA组增多；B.20倍和40倍显微镜下子宫内膜间质细胞p62免疫组化染色结果，可见IUA组小鼠子宫内膜p62阳性间质细胞相比正常小鼠增多，hAECs组p62阳性子宫内膜间质细胞相对IUA组减少(上方图像标尺100μm，下方图像标尺50μm)；C.各组别LC3表达情况的统计，在40倍视野下计数ER阳性的细胞占所有细胞的比例；D.各组别p62表达情况的统计，在40倍视野下计数ER阳性的细胞占所有细胞的比例(p<0.05，*；p<0.01，**；p<0.001，***；NS，差异不显著)；
图8为本发明一实施例中hAECs在体外激活人子宫内膜间质细胞自噬；其中，A.hAECs与hEnSCs非接触共培养模式图，上层transwell小室中为hAECs，下层孔中为hEnSCs；B.处理并培养24小时后，三组细胞的形态：过氧化氢损伤组细胞皱缩，形态明显改变，hAECs共培养组细胞较为饱满，形态改变较小；C.对照组细胞与过氧化氢处理2小时后的细胞，培养24小时后CCK-8试验检测细胞活力，过氧化氢组细胞活力明显下降；D.过氧化氢损伤后，hEnSCs中LC3-II/LC3-I比例下降，p62含量上升，说明经过过氧化氢损伤，hEnSCs的自噬受到了抑制；使用hAECs共培养后，LC3-II/LC3-I比例升高，p62含量下降，显示与hAECs共培养后，hEnSCs受损的自噬得到了恢复；PCNA的表达变化不明显；VEGF在过氧化氢处理后略有增加；ER在过氧化氢损伤后表达下降，hAECs共培养处理后增加；PR表达变化不明显；E.统计LC3蛋白印迹的灰度值，将LC3-II的灰度值与的LC3-I的灰度值作比，其比例反映了自噬水平的变化，并以对照组为标准，将各组相对LC3-II/LC3-I比值标准化，将重复实验的数据进行统计并作图F、G、H、I、J统计p62、VEGF、PCNA、ER、PR蛋白印迹的灰度值，与相应的β-tublin灰度值作比，计算在细胞中的相对含量，并以对照组的含量为标准，将各组蛋白表达量标准化，将重复实验的数据进行统计并作图(n＝3；p<0.05，*；p<0.01，**；p<0.001，***；NS，差异不显著)。
具体实施方式
本发明涉及羊膜上皮细胞在制备预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤的药物中的应用。上述羊膜上皮细胞为任一合适的哺乳动物羊膜上皮细胞，下述实施例以人羊膜上皮细胞为例进行相应的研究。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例验证了羊膜上皮细胞hAECs修复小鼠宫腔粘连模型中的子宫内膜形态。
hAECs从羊膜中分离获得，体外培养hAECs细胞形态如图1的A部分所示，细胞形态为铺路石状，呈上皮细胞特征。使用流式细胞学的方法对hAECs的特性进行研究。其结果显示：hAECs表面的干细胞标志物SSEA4显示为阳性，上皮细胞标志物CD324为阳性，而间质细胞标志物CD146和人类白细胞抗原HLA-DR均为阴性(图1的B部分)。免疫荧光显示，在hAECs中，上皮细胞标志CK18和干细胞标志TRA-1-60均为阳性(图1的C部分和D部分)。
为了更好地模拟刮宫等宫腔侵入性操作对子宫内膜的伤害，使用注射器针尖机械损伤小鼠子宫内膜的方法建立宫腔粘连模型。子宫内膜损伤由同一人操作，以减少不同术者习惯造成的差异
参考文献中报道过的方式(Kilic S,Yuksel B,Pinarli F,Albayrak A,BoztokB,Delibasi T.Effect of stem cell application on Asherman syndrome,anexperimental rat model.J Assist Reprod Genet 2014,31:975-982)，治疗组小鼠受到宫腔机械损伤后，于手术当天和术后连续三天接受了每次106hAECs的腹腔注射；宫腔粘连组小鼠予以等体积PBS；对照组小鼠不进行手术。于术后第9天取子宫标本，石蜡包埋后进行研究。小鼠子宫H&E染色显示，与正常小鼠的子宫相比，宫腔粘连的小鼠子宫宫腔出现不同程度的粘连、闭塞，失去其连续、完整的形态；子宫内膜显著变薄，腺体数量明显减少。而经过hAECs治疗的小鼠，其宫腔形态得以恢复，子宫内膜增厚，腺体数量较宫腔粘连的小鼠显著增加(图2的A部分、C部分、D部分)。
子宫内膜出现大量纤维化组织，是宫腔粘连的标志之一。使用Masson染色方法处理小鼠子宫内膜切片，其中胶原纤维被染为淡蓝色。图2的B部分显示了10倍、20倍、40倍镜下的子宫内膜Masson染色结果，可见宫腔粘连后，子宫内膜中胶原纤维明显增多(图2的E部分，n＝6)，甚至出现大量纤维化团块(如箭头处所示)。经hAECs治疗后，Masson染色示纤维化面积减少，有统计学差异(图2的B部分、E部分)。由此可见，本实施例中采用的机械损伤方法可以成功地模拟出宫腔粘连的改变，而hAECs能够在一定程度上治疗机械损伤引起的宫腔粘连，产生形态学的改善。
本实施例还验证了hAECs能否向损伤的子宫迁移，以便在一定时间段中持续发挥作用，将荧光标记的hAECs移植到宫腔粘连模型小鼠体内，通过荧光信息追踪hAECs的转归。使用细胞示踪荧光探针标记hAECs，胞浆内产生可发绿色荧光的羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester,CFSE)。如图3的A部分所示，CFSE的标记效率可达100％。小鼠子宫的冰冻切片荧光图像显示，在受损的子宫组织中，能够检测到绿色荧光标记的细胞(图3的B分布橙色箭头所示)。而作为阴性对照的宫腔粘连模型小鼠子宫内则未发现有绿色荧光的细胞(图3的B部分)。由上述细胞追踪实验显示，经腹腔注射的hAECs可以迁移到损伤的小鼠子宫，这也是干细胞趋炎性的体现，由此可见腹腔注射是一种适宜的hAECs移植方式。
实施例2
本实施例为验证hAECs能够促进子宫内膜血管生成与间质细胞增殖。
根据发生宫腔粘连后的子宫形态，欧洲妇科内镜协会对宫腔粘连的分类标准为：I度宫腔粘连，子宫腔内有多处纤细粘连带，不累及子宫角和输卵管开口；II度宫腔粘连，子宫腔内可见致密的纤维粘连，两侧子宫角以及输卵管开口不闭锁；III度宫腔粘连，部分宫腔以及其中一侧子宫角闭锁；IV度宫腔粘连，纤维粘连使得部分宫腔以及双侧子宫角闭锁；Va度宫腔粘连宫腔极度变形，Vb度宫腔粘连宫腔完全消失。结合症状，美国生殖协会建立了宫腔粘连严重程度评分，根据宫腔粘连范围、粘连类型、月经情况，每项计0-4分不等，最终1-4分为轻度宫腔粘连，为I级；得分5-8分为中度宫腔粘连，为II级；得分9-12分为重度宫腔粘连，为III级。一般认为，宫腔粘连可能阻塞通向子宫腔的输卵管口；粘连会减少适宜胚胎种植的容受性子宫内膜的面积；由于物理空间受限，以及血液供应受损，宫腔粘连也会阻碍正常种植后胚胎的发育。
多个研究显示，遭遇宫腔粘连的患者，即使在手术治疗之后，较正常人也更容易发生不孕和妊娠并发症。例如，子宫内膜层过薄会使受孕率大大降低，而宫腔粘连的患者子宫内膜很难达到理想厚度。另外，宫腔粘连后子宫内膜含氧量降低，持续缺氧可能影响子宫内膜容受性，影响胚胎种植。这说明，单单通过手术的方式物理解除粘连可能并不能完全恢复宫腔粘连患者的生育功能，想要进一步改善生育结局，还需要改善子宫内膜的整体环境，从血供、细胞因子、氧应激等多方面入手，使子宫内膜尽可能接近健康状态。因此，本实施例分析了hAECs移植前后多种可能与子宫内膜修复相关的分子指标。
PCNA在保证DNA精确复制中起着十分重要的作用。在真核细胞的细胞周期中，基因的复制发生在DNA合成期(synthesis，S)。在这一时期，有很多其他的重要事件，包括染色体的复制，着丝粒和端粒结构的维持；另外，染色体复制的产物，姐妹染色单体必须在复制后紧密地连接在一起。尽管真核细胞中复制效率与准确度极高，但DNA损伤等障碍可能导致复制失败，甚至出现染色体断裂。这些情况可能影响基因组的功能和完整性。因此，DNA复制过程中伴有诸多保险措施，通过修复DNA损伤、设置细胞周期停滞检查点等方式确保正常复制的延续。PCNA就是重要的DNA复制调控者。其作用包括组织正常的DNA复制、修复DNA损伤、重塑染色质、粘合姐妹染色单体。Niklaus等人研究了育龄期妇女的子宫内膜的mRNA情况和免疫组织化学染色情况，发现无论在腺体、管腔还是内膜间质中，PCNA的含量在增殖期较高，而在分泌期表达下降。
子宫动脉的诸多分支穿过浆膜，进入子宫肌层，形成弓形动脉；弓形动脉在基底层形成基底动脉滋养深层子宫内膜。更多的小动脉进入功能层形成螺旋动脉。螺旋动脉随月经周期发生变化。血管的重塑是内膜修复的重要因素。作为一种血管因子，VEGF对于正常的血管生成和病理性的血管新生都起着十分关键的作用。VEGF的作用靶点基本严格限制于内皮细胞，可以调节内皮细胞功能，并能增加血管的渗透性。子宫内膜中，VEGF等血管因子的表达与缺氧相关，其在月经周期变化中，与血管生成、组织重建修复、血管稳定成熟有关。VEGF在人子宫内膜的上皮、基质和内皮细胞中均有表达。在整个月经周期中，VEGF-A在月经期和增殖早期表达最多。在组织中，VEGF合成与功能的调节很可能与自噬相关。在一项对神经胶质瘤的研究中，研究人员对105位病人的病理切片进行了免疫组织化学染色，发现BECN1与VEGF呈正相关关系。在神经胶质瘤细胞系，U87MG细胞中，沉默Beclin-1基因之后，由缺氧导致的VEGF合成减少。Chen等人研究了重度宫腔粘连患者，行宫腔镜下粘连松解术与人工激素替代疗法结合治疗前后的情况，发现经过治疗后，患者子宫内膜的VEGF表达和微血管密度明显上升。而且，手术加激素治疗后恢复较好的患者，相比对治疗反应较差的患者，VEGF和微血管的含量更加丰富。这说明子宫内膜的血管生成水平对于损伤后的修复非常重要。
育龄期的妇女，其月经周期受到由下丘脑-垂体轴调节，由卵巢周期性分泌的雌激素和孕激素的调控。在激素的调控下，生殖器官发生周期性变化，为排卵、受精卵着床等作出准备。月经周期分为四个主要阶段：月经期，增殖期(也被称为卵泡期)，排卵期以及分泌期(也被称为黄体期)。不同的妇女月经周期长度有很大差异，但一般在二十一天到三十五天不等，平均为二十八天。在月经期起始时，卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)刺激卵泡膜和颗粒细胞产生卵泡，分泌雌二醇。在下丘脑-垂体轴的控制下，通过FSH和黄体生成素(luteinizing hormone，LH)的调控，雌激素含量在增殖期逐渐上升，于排卵前达到高峰。在此过程中内膜增殖变厚。在排卵之后，进入分泌期，黄体成为主要的雌激素和孕激素的来源。上皮细胞有丝分裂活性降低，腺体的分泌增加。子宫内膜间质细胞分化、膨大，可形成蜕膜成纤维细胞。分泌期内膜含有大量的自然杀伤细胞。在分泌中期，孕激素水平到达最高峰，而雌激素水平也到达第二个较之前低的小高峰。而如果此时没有受精，则黄体退化，结果导致雌激素和孕激素水平下降，此时子宫内膜脱落，月经开始。正常的子宫内膜修复为无瘢痕修复，从月经第二天出血即开始，月经第五天在雌激素作用下开始大量细胞增殖。Okada等人发现，17-β雌二醇(17β-estradiol，E2)可以增加人子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells，ESCs)中VEGF的mRNA水平。E2和选择性雌激素受体激动剂(selective ER modulators，SERMs)他莫昔芬的活性代谢物4-羟基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen，OHT)可以显著增加ESC的VEGF分泌。Cai等人使用机械损伤的方法在雌兔中建立宫腔粘连模型，发现肌注雌激素可以降低宫腔粘连程度，增加子宫内膜腺体与微血管数量，减少纤维化面积，并且可以增加胚胎种植窗中αvβ3整合素的表达，增加假妊娠期间子宫内膜表面的胞饮突数量，即大大提高了子宫内膜的容受性。雌激素联合防粘连膜的使用，也比单独使用防粘连膜起到了更好的效果。理论上，行宫腔粘连松解术前后，雌激素的使用都能获得收益。手术前使用时，雌激素可以最大限度地促进子宫内膜生长增厚，将子宫内膜调整到适合手术的增生期状态，增加手术施行空间。另外，由于腹部超声引导经常用于宫腔镜的指导，当使用雌激素使内膜增厚时，也更利于超声的观察。术后，由于宫腔经历过剥离创伤，雌激素有利于刺激子宫内膜恢复。
孕激素的基本作用是维持妊娠。孕激素可以促进LH的释放，使子宫内膜从增殖期状态转向分泌期，并且与雌二醇协同维持子宫内膜的完整性。在妊娠期间，孕激素通过抑制子宫肌层收缩，维持子宫静止。
雌激素受体(estrogen receptors，ERs)是重要的细胞内转录因子，其活性受到体内天然的雌激素以及合成的非激素类拮抗剂和激动剂配体的调控。雌酮(oestrone，E1)、E2和雌三醇(oestriol，E3)是三种最主要的内源性激素，其中E2是占最主要作用、生物活性最高的一种。ER主要有两种亚型，ERα由第6号染色体上的ESR1基因编辑,ERβ由第14号染色体上ESR2基因编辑。两种亚型的雌激素受体都在各种不同的组织和细胞中广泛表达。在子宫组织中主要分布的受体类型是ERα。ERα对乳腺、子宫的功能以及代谢、骨骼的稳态有深远的作用。孕激素受体是类固醇激素受体家族中的一员，也起到转录因子的作用。PR主要有两种亚型，PR-A和PR-B。PR-A相比PR-B缺少N端起始的184个氨基酸。典型的细胞核PR，在孕激素的作用下，可以在胚胎时期在乳房中产生促有丝分裂作用。在青春期，PR被重新激活，对乳房的发育起到刺激作用。但与乳房中的作用不同，PR在生殖道和卵巢中倾向于发挥抑制性的功能。PR也可以受到ERα的调控。Mehamed研究了月经周期中子宫内雌激素受体和孕激素受体的分布。在正常人群中，无论在子宫内膜还是子宫肌层，整个月经周期中都有大量的ERα阳性受体。但在分泌期，功能层的表达明显下调。在增殖期和分泌早期，功能层和基底层都有大量PR表达，但分泌中期和分泌晚期，PR大量减少。而肌层中的PR含量基本保持不变。
本实施例使用免疫组织化学染色的方法，检测了与子宫内膜血管生成、细胞增殖相关的几种分子。血管性血友病因子(von Willebrand Factor，vWF)是特异性的血管内皮细胞标志物，通过计数单位面积内vWF标记的微血管数量，可以进一步计算微血管密度(microvascular density，MVD)。由染色结果显示，宫腔粘连小鼠的子宫内膜MVD较对照组下降，而使用hAECs治疗后，MVD明显增加，其结果均有显著差异(图4的A部分，图5的C部分，紫色箭头指示的为微小血管)。血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，对血管形成有促进作用。实验结果发现，使用hAECs治疗后，小鼠子宫内膜中的VEGF表达相比对照组与宫腔粘连组均有增加，有统计学差异(图4的B部分，图5的D部分)。这说明，hAECs对损伤的子宫内膜有明显的促血管作用，有助于子宫内膜形态和功能的恢复。由上述结果可知，hAECs使小鼠子宫内膜的VEGF表达和MVD水平上升，说明hAECs对子宫内膜的血管再生有促进作用，有利于子宫内膜损伤后的修复。这也说明，hAECs移植有可能与促血管药物治疗结合，起到更好地效果促血管药物。
增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)存在于正常增殖细胞中，与细胞DNA的合成相关，对于细胞增殖的启动有重要作用，是一种反映细胞增殖情况的良好指标。实验结果发现，在宫腔粘连小鼠的子宫内膜间质细胞中，PCNA表达降低；而使用hAECs治疗处理后，PCNA的表达上升，可恢复至正常水平(图4的C部分，图5的E部分)。由上述结果可知，hAECs显著提高了小鼠子宫内膜中PCNA的表达，这意味着hAECs可以促进子宫内膜间质细胞增殖，有利于子宫内膜形态的修复。
本实施例还检测了与子宫内膜周期性变化中起重要作用的两种激素，雌激素和孕激素息息相关的的两种受体，雌激素受体(estrogen receptor，ER)和孕激素受体(progesterone receptor，PR)的表达(图5的A部分，图5的B部分)。检测结果发现，宫腔粘连模型中ER和PR表达基本不变；hAECs处理后，ER的表达相对于发生宫腔粘连时上升(图5的F部分，图5的G部分)。由上述结果可知，移植hAECs后，损伤的小鼠子宫内膜内雌激素受体阳性率上升，雌激素受体的增加意味着对雌激素更好的反应性，有利于子宫内膜的修复。这也说明，hAECs移植有可能与雌激素治疗结合，起到更好地效果。
实施例3
本实施例验证hAECs能够改善小鼠宫腔损伤后的生育能力。
本实施例将建模后的雌鼠与验证过生育能力的正常雄鼠交配，交配成功后，于孕9天观察孕子宫形态与胚胎数目。在2个动情周期的时间内，三个不同组别的雌鼠(n＝6)均可与雄鼠成功交配，检查到阴道栓。
图6的A部分展示了部分小鼠孕9天的孕子宫形态。正常小鼠的胚胎数目一般可达十余个，双侧子宫较为对称，胚胎大小均一，排列紧密。宫腔损伤的小鼠胚胎数目均不大于3个，且大小不均匀，形态不规整。宫腔损伤后经过hAECs治疗的小鼠，胚胎数目显著增加(图6的B部分)，形态有所改善。
图6的C部分统计了对照组、IUA组和hAECs治疗组每只小鼠的胚胎数目情况。可见对照组小鼠全部怀孕，平均每胎有11.33(±3.204)个胎鼠。而IUA组6只小鼠怀孕率仅有33.3％；hAECs治疗组怀孕率较IUA组上升，达到66.7％。经过统计，IUA组平均胚胎数目最少，为0.67(±1.211)个；而hAECs治疗组虽然胚胎数目减少，但较IUA组有明显提高(5.17(±4.535)个)(图6的B部分，n＝6)。
实施例4
本实施例验证了hAECs能够调节小鼠宫腔粘连模型中子宫内膜间质细胞自噬。
自噬是细胞中存在的一种降解过程，当面对环境应激时，自噬可以迅速被激活，也可以很快回归原有水平。自噬可以降解衰老损坏的细胞元件，同时也可以在营养来源缺乏时，通过这一途径提供能量。哺乳动物中存在三种形式的自噬：(1)大自噬(本文中“自噬”专指大自噬)，来源于内质网的膜包裹细胞质内老旧的细胞器等，形成自噬小体，在自噬小体与溶酶体融合后，内部包裹的细胞元件则被降解；(2)分子伴侣介导的自噬(chapterone-mediated autophagy，CMA)：细胞质内的分子伴侣hsc70与溶酶体相关膜蛋白2A(lysosome-associated protein type 2A，LAMP-2A)结合，将蛋白转运至溶酶体内，使其降解；(3)小自噬，溶酶体直接包裹胞质内的成分，将其降解[30]。根据对酵母菌基因组的研究，共有41种自噬相关基因(autophagy-related genes，ATG)。微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，MAPLC3/LC3)LC3是Atg8在哺乳动物中的同源产物。LC3前体先在细胞质中转化为可溶解形式LC3-I，之后被修饰成为LC3-II，在自噬体膜发挥功能。在酵母菌中，自噬被激活后，Atg8可以增加10倍以上。但在哺乳动物中，自噬激活有可能表现为LC3-II与LC3-I的比例升高，也可能因为溶酶体降解速度过快，表现为LC3-II减少[32]。自噬与炎症、凋亡、细胞增殖、分化、代谢等生理病理过程息息相关。例如，对蛋白的降解与神经退行性疾病，心脏疾病有关；对线粒体的降解与DNA损伤、肿瘤发生、神经疾病有关；对病原体的降解与感染性疾病、免疫调节紊乱有关。作为一种有多个结构域的适配器蛋白，p62(sequestosome-1，SQSTM1)参与多种细胞信号通路，与骨骼重塑、肥胖、肿瘤等生理病理过程都存在重要联系。在自噬过程中，p62装配和运输泛素化、错误折叠、累积的蛋白以及功能损坏的细胞器，与Atg8/LC3结合，从而通过自噬将废旧元件降解清除。在自噬缺陷的小鼠体内，出现了p62的积聚，这也证明了p62与自噬的关联。在研究自噬流的过程中，p62的积聚常常被视为自噬的降解过程受阻[35]。
自噬在子宫内膜的正常功能维持中起很大作用。Choi等人收集了因良性妇科疾病行子宫切除术的绝经前非孕期妇女的子宫内膜标本，发现随着月经周期的推进，LC3-II的含量逐渐增加，在分泌晚期达到最高峰。作者还发现，自噬可能与凋亡过程共同参与内膜的形态重塑过程。Tseng收集了28名月经正常的行子宫内膜活检术的病人的内膜样本，并进行了RNA芯片分析，发现两种与自噬相关的基因，γ氨基丁酸受体相关蛋白样1(γ-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 1，GABARAPL1)和3，在分泌中期表达最多，分泌晚期减少。作者认为自噬的变化可能与月经周期变化中的血管形成有关。自噬在孕期子宫中也起着重要作用。Choi发现在孕鼠子宫中，自噬水平在孕1天和孕2天达到最高，在着床前后趋于平稳。子宫中的自噬可能是降解糖原提供能量的一种机制。Rhee发现，无论在小鼠模型还是病人样本中，子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中自噬都被激活。而饮食引起的肥胖对蜕膜化的损伤，可能与其对自噬的抑制有关。Chen研究了叶酸缺乏对早孕期小鼠子宫内膜蜕膜化的损害作用，发现其机制与自噬损伤引起的凋亡增加有关[40]。与健康妇女相比，多囊卵巢综合征患者的子宫内膜组织中，自噬相关基因如ATG3、ATG5、ATG13、ATG14、BECN1、GABARAP的mRNA明显减少。而使用了二甲双胍，一种常用的改善多囊卵巢综合征患者高雄激素、糖代谢、月经周期与妊娠预后的药物后，患者内膜中ATG3等基因的mRNA水平上调。Xu等人研究了温度敏感的肝素修饰的帕洛沙姆水凝胶与角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)联合对大鼠宫腔粘连的修复作用。对各组大鼠模型的蛋白western blot分析和组织的免疫组织化学染色均显示，在IUA模型中，LC3-II的含量减少，p62表达增加；而用水凝胶联合KGF治疗之后，LC3-II含量增加，p62表达减少。这说明在受到损伤之后，子宫内膜的自噬受到了破坏，而修复治疗的过程包含了对自噬水平的挽救。
自噬是细胞面临应激时的重要反应机制，在月经周期中，自噬对子宫内膜的周期性变化也有重要的调节作用。本实施例在小鼠的子宫内膜组织中研究了自噬相关的分子，LC3和p62。研究结果发现，在宫腔粘连的小鼠子宫内膜间质细胞中，LC3水平显著降低，但予以hAECs移植的宫腔粘连模型小鼠子宫内膜间质细胞中，LC3相比IUA组显著升高，与正常水平接近，无显著差异(图7的A部分，图7的C部分)。p62在宫腔粘连模型小鼠的子宫内膜间质细胞中显著增加，而hAECs移植后p62的表达显著降低，达到对照组的水平，与对照组无显著差异(图7的B部分，图7的D部分)。由此可见，hAECs可以使宫腔粘连时被损伤的自噬恢复。
实施例5
本实施例验证了hAECs能够体外激活人子宫内膜间质细胞自噬。
在之前的研究中发现(Yao X,Guo Y,Wang Q,Xu M,Zhang Q,Li T,Lai D.TheParacrine Effect of Transplanted Human Amniotic Epithelial Cells on OvarianFunction Improvement in a Mouse Model of Chemotherapy-Induced Primary OvarianInsufficiency.Stem Cells Int 2016,2016:4148923)，通过腹腔注射移植hAECs的方法，修复了化疗诱导的卵巢功能减退小鼠模型的卵巢损伤，并验证了hAECs可以通过旁分泌作用修复化疗对卵巢的损伤。
在之前的研究中，收集了用无血清DMEM/F12培养基培养hAECs的条件培养基，并进行浓缩，与经过相同处理的对照培养基(未进行细胞培养)作对比，进行了细胞因子芯片研究。通过细胞因子芯片分析，hAECs的条件培养基中含有大量的细胞因子，其中有包括白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)在内的可能促进自噬的细胞因子。经文献报道，IL-2是一种可以激活细胞自噬的细胞因子。例如，在小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和原代肺成纤维细胞中，IL-2的应用可以增加LC3-II的表达，促进自噬；而提前使用抑制自噬早期步骤的自噬抑制剂3-甲基苯丙胺(3-methylamphetamine，3MA)预处理MEFs和原代肺成纤维细胞后，IL-2无法再起到增加LC3-II表达的作用。而IL-2的促自噬作用，与ATG5和BECN1有关。Liang等人为C57BL/6小鼠腹腔注射重组IL-2蛋白，小鼠的肝内自噬水平大量上调，LC3-II/LC3-I上升明显。Transwell非接触性共培养的结果也证明hAECs可以通过旁分泌作用促进hEnSCs的自噬。因此，移植hAECs后的促自噬作用可能与其旁分泌作用有关。
为了进一步验证hAECs的旁分泌效应对子宫内膜间质细胞的自噬激活作用，使用人子宫内膜间充质干细胞(human endometrial mesenchymal stem cells，hEnSCs)于体外模拟子宫内膜间质细胞对于hAECs旁分泌的反应。hEnSCs具有间质细胞的特征，其形态与特性已于之前发表的论著中加以描述。
按照文献中报道的方法(Xu HL,Xu J,Zhang SS,Zhu QY,Jin BH,ZhuGe DL,ShenBX,et al.Temperature-sensitive heparin-modified poloxamer hydrogel withaffinity to KGF facilitate the morphologic and functional recovery of theinjured rat uterus.Drug Deliv 2017,24:867-881)，使用过氧化氢处理hEnSCs，以模拟宫腔粘连发生时子宫内膜产生的变化。使用transwell小室将hAECs与hEnSCs非接触共培养，24小时后裂解获得蛋白后进行蛋白印迹分析(图8的A部分)。过氧化氢处理后hEnSCs细胞活力下降，形态改变(图8的B部分，图8的C部分)。如图8的B部分所示，相比对照组细胞，经过氧化氢处理的hEnSCs形态发生了明显改变，细胞皱缩，不易贴壁；经过hAECs处理的细胞，细胞形态比过氧化氢处理组接近正常，细胞较为饱满。实验结果发现，经过过氧化氢处理后，hEnSCs的LC3-II/LC3-I比例下降，p62含量上升，说明hEnSCs中自噬过程受阻，与动物体内宫腔粘连时的分子变化类似。而过氧化氢损伤后与hAECs共培养的hEnSCs，其LC3-II/LC3-I比例相对升高，p62含量下降，说明共培养后，hEnSCs中自噬被激活(图8的D部分)。在体外实验中同样研究了小鼠子宫免疫组织化学实验中检测的子宫内膜修复相关分子。其中，PCNA的表达没有明显改变(图8的D部分，图8的G部分)。VEGF在过氧化氢损伤和hAECs处理后均相对于对照组升高(图8的D部分，图8的H部分)。另外，过氧化氢损伤后，hEnSCs中ER表达下降，而经过hAECs处理后ER水平上升；PR水平无明显改变(图8的D部分、I部分、J部分)。
通过实施例4和5的结果可知，宫腔粘连发生后小鼠的子宫内膜自噬水平降低，而使用hAECs修复后，自噬水平上升。体外实验中，hAECs的共培养使得hEnSCs中受过氧化氢损伤的自噬被激活。因此，自噬有可能是研究子宫内膜粘连、修复过程的重要靶点。
由上述实施例可知，本发明采用机械损伤的方式，在雌性小鼠中成功地建立了宫腔粘连模型。宫腔粘连发生后，小鼠的子宫腔内出现粘连阻塞，子宫内膜变薄，腺体、血管减少，出现大量内膜组织纤维化，生育能力下降，而且出现了自噬水平的下降。使用腹腔注射的方法为子宫受到损伤的小鼠移植hAECs，可以有效地改善子宫内膜的形态，促进细胞增殖、血管新生有关的因子表达，增加小鼠的受孕率、胚胎数量及形态，hAECs还可以调节小鼠子宫内膜的自噬。
本发明首次报道了hAECs对宫腔粘连的修复作用。hAECs来源于羊膜组织，来源丰富，并且可以在体外大量扩增，是一种较易获得的生物材料。由于hAECs从胎膜中获得，可以避免很多胚胎干细胞研究与应用中面临的伦理问题。另外，hAECs的免疫原性较低，作为一种人体来源的细胞，理论上具有较小的危险性。因此，hAECs是非常理想的干细胞种子。鉴于hAECs在小鼠宫腔粘连治疗中收获的较好效果，hAECs具有宫腔粘连临床治疗的潜能。
基于本发明上述的研究，后续还可进一步研究临床上确定hAECs移植的治疗周期，并研究自噬在宫腔粘连的进展中受到损害的原因，正常的自噬稳态在子宫内膜的修复中所起的作用等等；鉴于hAECs可能的促血管生成、调节雌激素受体等作用，也可以探究hAECs联合促血管药物、雌激素共同治疗宫腔粘连的效果效果；也可以尝试不同的hAECs移植方式，例如直接通过宫腔内注射移植hAECs，也可以使用子宫肌层原位注射的方式进行hAECs移植等等。
总之，经过本发明的相关研究表明：人羊膜上皮细胞对小鼠的宫腔粘连有改善作用，并可以改善生育结局；宫腔粘连发生后，子宫内膜的自噬受到抑制，人羊膜上皮细胞可能通过旁分泌的方式修复受损的自噬。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.羊膜上皮细胞在制备预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羊膜上皮细胞来源于哺乳动物胎盘羊膜组织。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羊膜上皮细胞为人羊膜上皮细胞。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞对宫腔损伤造成的内膜变薄、腺体数量减少、纤维化面积增加具有逆转作用。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞能增加LC3的表达，降低p62的表达，表明所述人羊膜上皮细胞可以改善损伤的子宫内膜中的自噬。
6.根据权利要求5所述的的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞能升高LC3-II/LC3-I比例，降低p62含量，表明所述人羊膜上皮细胞通过旁分泌起到激活人子宫内膜间充质干细胞自噬的作用。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞能增加血管内皮生长因子的表达，并增加微血管密度，表明所述人羊膜上皮细胞对损伤的子宫内膜有明显的促血管作用。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述人羊膜上皮细胞能增加增殖细胞核抗原的表达，表明所述人羊膜上皮细胞促进子宫内膜间质细胞增殖；所述人羊膜上皮细胞还能增加雌激素受体的表达。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为包括人羊膜上皮细胞与促血管药物和/或雌激素的联合使用药物。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物采用宫腔内注射、子宫肌层原位注射、腹腔注射或静脉注射。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910544486.8A CN110251534A (zh) | 2019-06-21 | 2019-06-21 | 羊膜上皮细胞在预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910544486.8A CN110251534A (zh) | 2019-06-21 | 2019-06-21 | 羊膜上皮细胞在预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110251534A true CN110251534A (zh) | 2019-09-20 |
Family
ID=67920388
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910544486.8A Pending CN110251534A (zh) | 2019-06-21 | 2019-06-21 | 羊膜上皮细胞在预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110251534A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113563607A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-10-29 | 广州达康基因技术有限公司 | 一种用于治疗或预防宫腔粘连的3d打印水凝胶及其制备方法 |
| CN114796278A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-07-29 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 脂肪活性蛋白在制备治疗宫腔粘连药物中的应用 |
| WO2022204904A1 (zh) * | 2021-03-29 | 2022-10-06 | 浙江大学 | 人羊膜上皮细胞在制备用于治疗和/或改善宫腔粘连疾病的药物中的用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004046388A1 (en) * | 2002-11-18 | 2004-06-03 | Murdoch Childrens Research Institute | Genotyping of deafness by oligonucleotide microarray analysis |
| CN109528772A (zh) * | 2017-09-22 | 2019-03-29 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | 人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用 |
-
2019
- 2019-06-21 CN CN201910544486.8A patent/CN110251534A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004046388A1 (en) * | 2002-11-18 | 2004-06-03 | Murdoch Childrens Research Institute | Genotyping of deafness by oligonucleotide microarray analysis |
| CN109528772A (zh) * | 2017-09-22 | 2019-03-29 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | 人羊膜上皮细胞分泌因子在制备修复卵巢功能的药物中的应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BONING LI ET AL.: "Human amniotic epithelial cells improve fertility in an intrauterine adhesion mouse model", 《STEM CELL RESEARCH & THERAPY》 * |
| SHANGHAI ICELL BIOTECHNOLOGY CO.ET AL.: "Human Amniotic Epithelial Stem Cell in Treatment of Refractory Severe Intrauterine Adhesion, ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03381807", 《CLINICALTRIALS.GOV》 * |
| TOSHIO MIKI: "Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells", 《AM J REPROD IMMUNOL》 * |
| XUECHAI BAI ET AL.: "Therapeutic Effect of Human Amniotic Epithelial Cells in Rat Models of Intrauterine Adhesions", 《CELL TRANSPLANTATION》 * |
| 许凤: "不同剂量雌激素在宫腔粘连形成中的效果比较", 《临床合理用药》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022204904A1 (zh) * | 2021-03-29 | 2022-10-06 | 浙江大学 | 人羊膜上皮细胞在制备用于治疗和/或改善宫腔粘连疾病的药物中的用途 |
| CN113563607A (zh) * | 2021-07-01 | 2021-10-29 | 广州达康基因技术有限公司 | 一种用于治疗或预防宫腔粘连的3d打印水凝胶及其制备方法 |
| CN114796278A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-07-29 | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 | 脂肪活性蛋白在制备治疗宫腔粘连药物中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Human amniotic epithelial cells improve fertility in an intrauterine adhesion mouse model | |
| Carlson | Human Embryology and Developmental Biology-Inkling Enhanced E-Book | |
| Zhao et al. | Exosomes derived from adipose mesenchymal stem cells restore functional endometrium in a rat model of intrauterine adhesions | |
| Carlson | Human Embryology and Developmental Biology: with STUDENT CONSULT Online Access | |
| Coughlan et al. | Recurrent implantation failure: definition and management | |
| Edwards | IVF, IVM, natural cycle IVF, minimal stimulation IVF–time for a rethink | |
| Ozkan et al. | Preliminary results of the first human uterus transplantation from a multiorgan donor | |
| Uduwela et al. | Endometrial-myometrial interface: relationship to adenomyosis and changes in pregnancy | |
| Costello et al. | The effect of adenomyosis on in vitro fertilisation and intra-cytoplasmic sperm injection treatment outcome | |
| CN110251534A (zh) | 羊膜上皮细胞在预防或修复宫腔粘连和/或子宫内膜损伤中的应用 | |
| Jurisicova et al. | Recombinant human leukemia inhibitory factor does not enhance in vitro human blastocyst formation | |
| Modi et al. | Physiology of embryo-endometrial cross talk | |
| JPH08507530A (ja) | トランスフォーミング成長因子βによる受胎能調節 | |
| CN112870228A (zh) | 一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用 | |
| Zhou et al. | Germ cell development in neonatal mouse testes in vitro requires Müllerian inhibiting substance | |
| Khan et al. | Embryology, Week 1 | |
| Rageh et al. | PRP in recurrent implantation failure, hope or hype? A prospective randomized controlled study | |
| ES2268765T3 (es) | Tratamiento y diagnostico de infertilidad usando tgfbeta o activina. | |
| Trounson | In vitro fertilization | |
| Yu et al. | Growth hormone intrauterine perfusion combined with replacement cycle in the treatment of non-response thin endometrium: report of 5 cases | |
| Norenstedt et al. | Reduced developmental potential in oocytes from women with endometriosis | |
| Jiang et al. | Comparison of frozen embryo transfer outcomes between uterine infusion of granulocyte colony-stimulating factor and growth hormone application in patients with thin endometrium: A retrospective study | |
| Liu et al. | Therapeutic restoration of female reproductive and endocrine dysfunction using stem cells | |
| Allahbadia et al. | Intrauterine insemination | |
| CN111135193A (zh) | 一种应用干细胞恢复子宫内膜的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190920 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |