CN113563607A - 一种用于治疗或预防宫腔粘连的3d打印水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种用于治疗或预防宫腔粘连的3d打印水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，包括如下步骤：将甲基丙烯酸化明胶、甲基丙烯酸化胶原蛋白和光引发剂加入去离子水中，混合均匀，制得打印墨水；用3DS Max软件设计模型，将模型导入3D打印机控制软件；将打印墨水和人羊膜间充质干细胞转移至3D打印机的挤出筒内，打印制得水凝胶初品，然后用蓝光照射固化所述水凝胶初品，得到用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶。本发明的3D打印水凝胶具有优异的生物相容性和原位交联能力，机械性能、溶胀性能和降解性可控，细胞包封效率高，可将hAMSC负载于水凝胶内部，并实现hAMSC的可控释放，在体外连续释放7天以上，利用hAMSC有效治疗或预防宫腔粘连。

Description

一种用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶及其制备方法。
背景技术
宫腔粘连(IUA)被称为Asherman综合征，是指由于人工流产，刮宫等因素引起的子宫内膜基底层损伤，导致子宫腔和子宫颈管的局部或完全粘连。IUA的临床表现主要为月经量少、反复流产和闭经等，严重损害女性的生殖健康。
随着宫腔镜技术的发展，宫腔镜电切除术具有微创、安全和有效的治疗优点，已成为治疗IUA的优先选择。但是，术后伤口渗出、感染等问题导致继发IUA的复发率仍然很高。因此，在进行宫腔镜电切除术后，加强子宫内膜修复和防止再粘连仍是目前IUA治疗的重点。
目前，干细胞疗法已成为治疗组织损伤和纤维化的新方法，作为促进子宫内膜修复和再生的新有效方法而受到了广泛关注。研究表明，骨髓来源的造血干细胞(BMDSCs)移植可以改善IUA模型小鼠的生育能力，可以修复受损的子宫内膜。BMDSCs可以在体内分化为子宫内膜组织。人类经血来源的间充质干细胞(hEnSCs)可以修复受损的子宫内膜，诱导血管生成并增强子宫内膜受损小鼠的生育能力。脂肪来源的干细胞(ADSCs)可以促进子宫内膜细胞和肌肉细胞的再生以及血管生成，通过将细胞移植到局部切除的子宫中而获得更好的妊娠结局。人脐带来源的间充质干细胞(hUC-MSC)可能通过抑制过度纤维化和炎症并增强子宫内膜细胞增殖和血管重塑而在大鼠慢性子宫内膜损伤中发挥治疗作用。其中具有显著可塑性的人羊膜间充质干细胞(hAMSC)是一种具有自我复制和多向分化潜能的成年干细胞。hAMSC分泌的细胞因子具有抗炎、抗纤维化、促进血管生成和促进细胞生长的作用，有望成为治疗子宫粘连的新方法。研究表明，hAMSC可以促进大鼠子宫内膜的修复，证明了hAMSC移植可以改善IUA。然而，如何有效地将hAMSC移植入子宫腔，保持其细胞活性并促进子宫内膜修复成为尚待解决的难题。
近年来，各种不同的物理薄膜(电纺纤维薄膜、水凝胶和海绵)已被用作屏障，以最大程度地减少粘附形成的复杂过程。然而，传统的组织工程膜仍存在许多不足之处，如：细胞植入率低，膜与组织缺损之间的匹配度低，多种细胞的定位不准确等。3D打印技术可以精确地控制底部形成单元在时间和空间上的材料，还可以根据组织缺损部位进行个性化制造，以实现更好的组织修复。此外，基于交联聚合物的3D打印水凝胶具有出色的生物学和物理特性，例如：出色的生物相容性，高细胞包封效率，原位交联能力，以及可控制的机械、溶胀和降解特性。然而，现有的3D打印水凝胶大多使用紫外线引发交联，然而紫外交联会导致细胞增殖率和细胞活力降低。同时，虽然基于壳聚糖、明胶和透明质酸等天然材料的水凝胶已被用于防止粘附，但由于其较差的机械性能和快速降解，尚无法获得令人满意的治疗效果。另外，胶原蛋白是细胞外基质(ECM)的主要成分，然而，纯胶原蛋白水凝胶的结构单一、性能简单和机械性能较差，进而限制了其应用。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶及其制备方法。
为达到其目的，本发明所采用的技术方案为：
一种用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备打印墨水：将甲基丙烯酸化明胶、甲基丙烯酸化胶原蛋白和光引发剂加入去离子水中，混合均匀，制得打印墨水，保存待用；
(2)设计与载入3D模型：用3DS Max软件设计模型，将所述模型导入3D打印机控制软件；
(3)3D打印制备：将步骤(1)得到的打印墨水和人羊膜间充质干细胞转移至3D打印机的挤出筒内，打印制得水凝胶初品，然后用蓝光照射固化所述水凝胶初品，得到用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶。
胶原蛋白和明胶均属于细胞外基质(ECM)衍生物聚合物，具有良好的生物相容性，但由于胶原蛋白和明胶自身存在结构单一、机械性能较差等缺陷，无法直接用于干细胞，3D打印的成型性也较差。而本发明对胶原蛋白和明胶分别进行甲基丙烯酸化改性后，再将两者的改性材料进行复合制备预防宫腔粘连的水凝胶基质。如此，可使胶原蛋白和明胶具有光敏性，能在蓝光作用下进行原位快速交联，还提高了其3D打印的成型速度，以及机械性能，使其同时具备良好的生物学特性和可调节的物理特性，为细胞的增殖和扩散提供了有利条件。此外，通过3D打印技术将甲基丙烯酸化明胶与甲基丙烯酸化胶原蛋白进行复合制备成水凝胶，可精确地控制水凝胶底部形成单元在时间和空间上的材料，还可根据组织缺损部位进行个性化制造，以实现更好的组织修复，并获得具有多孔3D结构的水凝胶，将人羊膜间充质干细胞(hAMSC)负载于水凝胶内部，并实现hAMSC的可控释放。而且，本发明的水凝胶兼具了甲基丙烯酸化明胶和胶原蛋白的优点，同时可弥补两者自身的不足。本发明使用蓝光引发交联反应，实现了在温和条件下制备结构稳定的3D打印水凝胶，不会导致细胞增殖率和细胞活力的降低，克服了紫外线交联的不足。
优选地，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法为：将明胶溶于去离子水中，得到明胶溶液，向明胶溶液中滴入甲基丙烯酸酐，搅拌反应，反应完成后，透析除杂，冷冻干燥，即得所述甲基丙烯酸化明胶。
优选地，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法中，以去离子水的体积计，所述明胶溶液的浓度为10％g/mL，所述甲基丙烯酸酐的浓度为3％～12％，反应时间为4～12h。
优选地，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法中，透析截留的分子量为12～14kDa。
优选地，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的制备方法为：将胶原蛋白溶于去离子水中，得到胶原蛋白溶液，向胶原蛋白溶液中滴入甲基丙烯酸酐，搅拌反应，并使反应体系的pH值保持在8～9，反应完成后，透析除杂，冷冻干燥，即得所述甲基丙烯酸化胶原蛋白。
优选地，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的制备方法中，以去离子水的体积计，所述胶原蛋白溶液的浓度为2％g/mL，所述甲基丙烯酸酐的浓度为0.6％～2.4％，反应时间为8～24h。
优选地，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的制备方法中，透析截留的分子量为12～14kDa。
优选地，所述打印墨水中，按去离子水的体积计，所述甲基丙烯酸化明胶的浓度为5％～10％g/mL，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的浓度为0.5％～1.5％g/mL，所述光引发剂的浓度为0.01％～0.5％g/mL。经试验研究发现，甲基丙烯酸化明胶、甲基丙烯酸化胶原蛋白和光引发剂在打印墨水中的浓度会对打印墨水的3D打印效果产生影响，浓度太低会导致无法打印成型，浓度太高会导致打印过程中墨水无法挤出，从而无法顺利进行3D打印。而采用本发明上述的浓度，具有较好的3D打印效果，打印成型性好，且打印过程中墨水容易挤出。
优选地，所述打印墨水中，按去离子水的体积计，所述甲基丙烯酸化明胶的浓度为8％g/mL，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的浓度为1.0％g/mL，所述光引发剂的浓度为0.1％g/mL。采用上述浓度时，打印墨水的成型性和挤出性均较好。
优选地，所述步骤(3)的3D打印条件为：纤维直径为100～300μm，打印速度为900～1200mm/min，基板的温度为2～8℃，喷嘴温度为20～30℃。采用该打印条件，可使制得的3D打印水凝胶有效地固化成型，并具有精细的内部结构及良好的生物相容性。
优选地，所述步骤(3)的3D打印条件为：纤维直径为210μm，打印速度为1080mm/min，基板的温度为4℃，喷嘴温度为26℃。采用该打印条件，3D打印效果最好。
优选地，所述步骤(3)的固化条件为：使用405nm蓝光照射3～20s。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明的3D打印水凝胶具有优异的生物相容性和原位交联能力，机械性能、溶胀性能和降解性可控，细胞包封效率高，可将人羊膜间充质干细胞(hAMSC)负载于水凝胶内部，并实现hAMSC的可控释放，在体外连续释放7天以上，克服了现有技术移植干细胞所存在的存活率低和保留期短的问题，利用hAMSC的抗炎、抗纤维化、促进血管生成和促进细胞生长的作用，有效治疗或预防宫腔粘连。
附图说明
图1为Gel和实施例1所制备的GelMA的核磁氢谱图；
图2为Col和实施例2所制备的ColMA的核磁氢谱图；
图3为实施例4所制备3D打印水凝胶的宏观和微观图；
图4为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5制备水凝胶的溶胀率测试结果；
图5为对比例5、实施例3、实施例4和实施例5所制备水凝胶的细胞存活率统计图；
图6为对比例6和实施例4所制备水凝胶负载hAMSC后在7天内的累积递送曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中所用方法，如无特别指明，均为本领域的常规方法(例如，将hAMSC接种于水凝胶上时，采用常规方法接种即可)。实施例中使用的挤出型生物3D打印机为EFL-BP-8600 3D打印机。
实施例1
甲基丙烯酸化明胶(GelMA)的制备：将10g明胶溶解在50℃的100mL去离子水中，制成明胶溶液。然后将6mL甲基丙烯酸酐逐滴添加到明胶溶液中，搅拌反应6h。在透析袋(截留分子量：12～14kDa)中用蒸馏水透析3～5日，以除去杂质和未反应的甲基丙烯酸酐。最后冷冻干燥，-80℃下避光保存待用。
实施例2
甲基丙烯酸化胶原蛋白(ColMA)的制备：将2g胶原蛋白溶于37℃的100mL去离子水中，制成胶原蛋白溶液。然后将1.2mL的甲基丙烯酸酐滴加到胶原蛋白溶液中，搅拌反应12h，并使用浓度为5mol/L的NaOH将反应体系的pH值保持在8～9。在透析袋(截留分子量：12～14kDa)中用蒸馏水透析3～5日，然后将最终的透析产品冷冻干燥，-20℃下避光保存待用。
实施例3
一种3D打印水凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)制备打印墨水：将实施例1制备的甲基丙烯酸化明胶、实施例2制备的甲基丙烯酸化胶原蛋白和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，制得打印墨水，保存待用；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化明胶的添加量为5％g/mL，甲基丙烯酸化胶原蛋白的添加量为0.5％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.01％g/mL；
(2)设计与载入3D模型：用3DS Max软件设计模型，将模型导入3D打印机控制软件，模型为一个逐层的点阵结构，规格为16mm×16mm×2层；
(3)3D打印制备：将步骤(1)制得的打印墨水转移至挤出型生物3D打印机的挤出筒内，设定纤维直径为100μm，打印速度为20mm/s，基板的温度为4℃，喷嘴温度为20℃，打印制得水凝胶初品，然后用蓝光照射10s固定初始形状，得到3D打印水凝胶成品。
实施例4
一种3D打印水凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)制备打印墨水：将实施例1制备的甲基丙烯酸化明胶、实施例2制备的甲基丙烯酸化胶原蛋白和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，制得打印墨水，保存待用；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化明胶的添加量为8％g/mL，甲基丙烯酸化胶原蛋白的添加量为1.0％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.1％g/mL；
(2)设计与载入3D模型：用3DS Max软件设计模型，将模型导入3D打印机控制软件，模型为一个逐层的点阵结构，规格为16mm×16mm×2层；
(3)3D打印制备：将步骤(1)制得的打印墨水转移至挤出型生物3D打印机的挤出筒内，设定纤维直径为100μm，打印速度为20mm/s，基板的温度为4℃，喷嘴温度为20℃，打印制得水凝胶初品，然后用蓝光照射10s固定初始形状，得到3D打印水凝胶成品。
实施例5
一种3D打印水凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)制备打印墨水：将实施例1制备的甲基丙烯酸化明胶、实施例2制备的甲基丙烯酸化胶原蛋白和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，制得打印墨水，保存待用；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化明胶的添加量为10％g/mL，甲基丙烯酸化胶原蛋白的添加量为1.5％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.5％g/mL；
(2)设计与载入3D模型：用3DS Max软件设计模型，将模型导入3D打印机控制软件，模型为一个逐层的点阵结构，规格为16mm×16mm×2层；
(3)3D打印制备：将步骤(1)制得的打印墨水转移至挤出型生物3D打印机的挤出筒内，设定纤维直径为100μm，打印速度为20mm/s，基板的温度为4℃，喷嘴温度为20℃，打印制得水凝胶初品，然后用蓝光照射10s固定初始形状，得到3D打印水凝胶成品。
对比例1
一种GelMA水凝胶的制备方法，步骤如下：将实施例1制备的甲基丙烯酸化明胶和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，蓝光照10s，制得所述GelMA水凝胶；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化明胶的添加量为8％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.1％g/mL。
对比例2
一种ColMA水凝胶的制备方法，步骤如下：将实施例1制备的甲基丙烯酸化胶原蛋白和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，蓝光照10s，制得所述ColMA水凝胶；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化胶原蛋白的添加量为1％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.1％g/mL。
对比例3
一种复合水凝胶的制备方法，步骤如下：将实施例1制备的甲基丙烯酸化明胶、实施例2制备的甲基丙烯酸化胶原蛋白和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，蓝光照10s，制得所述复合水凝胶，记为GelMA/0.5％ColMA水凝胶；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化明胶的添加量为8％g/mL，甲基丙烯酸化胶原蛋白的添加量为0.5％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.1％g/mL。
对比例4
一种复合水凝胶的制备方法，步骤如下：将实施例1制备的甲基丙烯酸化明胶、实施例2制备的甲基丙烯酸化胶原蛋白和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，蓝光照10s，制得所述复合水凝胶，记为GelMA/1％ColMA水凝胶；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化明胶的添加量为8％g/mL，甲基丙烯酸化胶原蛋白的添加量为1.0％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.1％g/mL。
对比例5
一种复合水凝胶的制备方法，步骤如下：将实施例1制备的甲基丙烯酸化明胶、实施例2制备的甲基丙烯酸化胶原蛋白和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，蓝光照10s，制得所述复合水凝胶，记为GelMA/1.5％ColMA水凝胶；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化明胶的添加量为8％g/mL，甲基丙烯酸化胶原蛋白的添加量为1.5％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.1％g/mL。
对比例6
一种3D打印GelMA水凝胶的制备方法，步骤如下：
(1)制备打印墨水：将实施例1制备的甲基丙烯酸化明胶和LAP光引发剂加入去离子水中，混合均匀，制得打印墨水，保存待用；其中，按去离子水的体积计，甲基丙烯酸化明胶的添加量为8％g/mL，LAP光引发剂的添加量为0.1％g/mL；
(2)设计与载入3D模型：用3DS Max软件设计模型，将模型导入3D打印机控制软件，模型为一个逐层的点阵结构，规格为16mm×16mm×2层；
(3)3D打印制备：将步骤(1)制得的打印墨水转移至挤出型生物3D打印机的挤出筒内，设定纤维直径为100μm，打印速度为20mm/s，基板的温度为4℃，喷嘴温度为20℃，打印制得水凝胶初品，然后用蓝光照射10s固定初始形状，得到3D打印GelMA水凝胶。
效果验证：
一、核磁检测
将未经改性处理的明胶(Gel)、实施例1制备的GelMA、未经改性处理的胶原蛋白(Col)、以及实施例2制备的ColMA用核磁共振光谱仪进行1H-NMR谱图测定。
测定结果如图1和图2所示，其中，图1为Gel和GelMA的核磁氢谱图，图2为Col和ColMA的核磁氢谱图。
从图1和图2可以看出，与未改性的Gel和Col相比，GelMA和ColMA的1H NMR光谱在5.4ppm和5.89ppm处有两个峰，代表甲基丙烯酰基的氢吸收峰，证实了甲基丙烯酸基团已成功接枝到明胶和胶原蛋白的分子骨架上。根据甲基丙烯酸酯质子的积分面积与GelMA和ColMA的甲基氢的比例，可以计算出GelMA和ColMA的接枝率分别为59.6％和36.7％。
二、外观检测
图3为实施例4所制备3D打印水凝胶的宏观和微观图。从图3可看出，本发明制备的3D打印水凝胶具有良好的结构保真度，并且在被蓝光照射10s后可以稳定地交联，表现出较好的机械性能：能支撑自身重量，而且卷曲不会断裂。
三、水凝胶的溶胀性能测试
使用常规的重量分析法测量水凝胶的溶胀能力。称重测试水凝胶以记录其初始湿重(W0)，然后分别浸入37℃的PBS中。24h后，将样品表面的PBS轻轻吸干，然后称重肿胀的湿物质(Wt)。根据以下公式计算水凝胶的溶胀度：
Figure BDA0003143177640000101
通过重量分析法评价各水凝胶的溶胀率。PBS中水凝胶的溶胀现象实际上是由于PBS中的水分子扩散到水凝胶的聚合物中，然后通过水分子与水凝胶分子链之间的相互作用，分子链段逐渐延伸并在水凝胶中增加，最后从宏观上显示了聚合物体积和质量的增加。如图4所示，对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5制备的水凝胶的溶胀率分别为25.2％，26.1％，22.9％，20.9％和19.0％。可以看出，随着ColMA浓度的增加，水凝胶的溶胀率逐渐降低。这是由于ColMA的存在使得水凝胶的交联度比纯GelMA水凝胶的交联度高，导致孔隙率降低。然而，低的溶胀率(一般为＜22％)更有利于防止材料过度溶胀而引起器官损伤，因此，本发明以对比例4和对比例5的浓度作为ColMA的优选浓度。
四、压缩模量
压缩测试方法：将水凝胶样品制备成圆柱体(直径11mm，高度8mm)，并通过Universal Testing Machine(ELF3200；美国Bose)进行测量。十字头速度设定为0.05mm/s。由应力-应变曲线中60％的应变计算出压缩模量。
防止宫腔粘连的理想材料应具备合适的压缩强度(压缩强度＞30kPa)和弹性，以保证其在使用过程中不易断裂，能保持完整性。表1为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4和对比例5所制备的水凝胶的压缩强度。从表1可看出，随着水凝胶中ColMA浓度的增加，水凝胶的压缩强度呈现逐渐增高趋势，当ColMA的浓度达到1％g/mL时，水凝胶的压缩强度最高，之后，随着ColMA浓度的继续增加，水凝胶的压缩强度反而呈现下降趋势，因此，本发明以1％g/mL作为ColMA的最佳浓度。综合上述溶胀率测试结果，ColMA的浓度为1％g/mL时，水凝胶的综合性能最优。
表1
Figure BDA0003143177640000102
Figure BDA0003143177640000111
五、水凝胶的细胞生物相容性测试
人羊膜间充质干细胞(hAMSC)在10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素(100单位/mL)、链霉素(100μg/mL)和新鲜Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养。细胞在175cm2组织培养瓶中繁殖，并在37℃的5％CO2中孵育。每隔一天换一次培养基，并每隔4～7天用0.25％胰蛋白酶和1％EDTA传代细胞。将密度为2×104细胞/mL的hAMSCs细胞悬浮液添加到灭菌的3D打印水凝胶(24孔板的每个孔中有一个水凝胶)的表面。将接种了细胞的水凝胶在37℃下于5％CO2中孵育，并每隔一天换一次培养基。培养1天、3天和7天后，然后将样品用PBS洗涤3次。根据制造商的说明，使用胞计数试剂盒8(CCK-8)评估细胞增殖能力。
为了验证水凝胶的生物相容性，我们将干细胞接种于对比例6(GelMA)和实施例3～5制备的水凝胶上。为了进一步观察水凝胶加入ColMA后细胞在水凝胶上的活性，通过CCK-8实验进行了测试。结果如图5所示，接种在对比例6和实施例3(5％GelMA/0.5％ColMA)、实施例4(8％GelMA/1.0％ColMA)和实施例5(10％GelMA/1.5％ColMA)制备的水凝胶上的干细胞在整个7d培养期间均保持高增殖率，表明细胞可以粘附并在水凝胶上增殖。这主要是因为明胶本身可以促进细胞黏附和增殖。在第7天，实施例3～5的水凝胶的OD值明显高于对比例6，表明添加ColMA与GelMA复合可以更好地支持细胞增殖和生长。其中，实施例4的OD值最高，说明实施例4所制备的水凝胶更利于支持细胞增殖和生长。
六、3D打印水凝胶的体外细胞递送特性
首先，对包含hAMSC(1×107细胞/mL)的对比例6(GelMA)和实施例4(GelMA/1.0％ColMA)的打印墨水进行3D打印(打印方法参照实施例4)，制备水凝胶。然后将水凝胶置于24孔板中，并将1.5mL含10％FBS的DMEM添加到每个孔中。在各个时间点，通过Countess II FL自动细胞计数器(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)测量释放的细胞在水凝胶中的数目。
hAMSC具有修复子宫内膜的能力，可预防术后腹膜粘连。因此，我们选择了hAMSC来测试水凝胶的细胞传递能力。测试细胞7天，并监测细胞释放。如图6所示，hAMSC的释放曲线显示出累积增加的趋势，且实施例4组的效果更优，这表明本发明制备的水凝胶可以为组织修复提供稳定的细胞供应。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备打印墨水：将甲基丙烯酸化明胶、甲基丙烯酸化胶原蛋白和光引发剂加入去离子水中，混合均匀，制得打印墨水，保存待用；
(2)设计与载入3D模型：用3DS Max软件设计模型，将所述模型导入3D打印机控制软件；
(3)3D打印制备：将步骤(1)得到的打印墨水和人羊膜间充质干细胞转移至3D打印机的挤出筒内，打印制得水凝胶初品，然后用蓝光照射固化所述水凝胶初品，得到用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶。
2.如权利要求1所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，所述打印墨水中，按去离子水的体积计，所述甲基丙烯酸化明胶的浓度为5％～10％g/mL，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的浓度为0.5％～1.5％g/mL，所述光引发剂的浓度为0.01％～0.5％g/mL。
3.如权利要求2所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，所述打印墨水中，按去离子水的体积计，所述甲基丙烯酸化明胶的浓度为8％g/mL，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的浓度为1.0％g/mL，所述光引发剂的浓度为0.1％g/mL。
4.如权利要求1所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的3D打印条件为：纤维直径为100～300μm，打印速度为900～1200mm/min，基板的温度为2～8℃，喷嘴温度为20～30℃。
5.如权利要求1所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的固化条件为：使用405nm蓝光照射3～20s。
6.如权利要求1所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法为：将明胶溶于去离子水中，得到明胶溶液，向明胶溶液中滴入甲基丙烯酸酐，搅拌反应，反应完成后，透析除杂，冷冻干燥，即得所述甲基丙烯酸化明胶。
7.如权利要求6所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化明胶的制备方法中，以去离子水的体积计，所述明胶溶液的浓度为10％g/mL，所述甲基丙烯酸酐的浓度为3％～12％，反应时间为4～12h。
8.如权利要求1所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的制备方法为：将胶原蛋白溶于去离子水中，得到胶原蛋白溶液，向胶原蛋白溶液中滴入甲基丙烯酸酐，搅拌反应，并使反应体系的pH值保持在8～9，反应完成后，透析除杂，冷冻干燥，即得所述甲基丙烯酸化胶原蛋白。
9.如权利要求8所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸化胶原蛋白的制备方法中，以去离子水的体积计，所述胶原蛋白溶液的浓度为2％g/mL，所述甲基丙烯酸酐的浓度为0.6％～2.4％，反应时间为8～24h。
10.一种用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶，其特征在于，由如权利要求1～9任一项所述的用于治疗或预防宫腔粘连的3D打印水凝胶的制备方法制得。
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