CN113181427A - 体内原位生物制造方法及其在体内组织修补中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及体内原位生物制造方法及其在体内组织修补中的应用。本发明提供的体内原位生物制造方法是将光敏修补材料通过仪器输送到体内待修复组织处，作为生物打印支架以铆钉的形式固定在组织待修复部位，通过增加机械力实现生物打印支架与待修复组织的良好贴附，解决了体内组织修复中，由于待修复组织位于体内深层、表面潮湿而不易于组织贴附等问题。本发明的新型光敏修补材料广泛地适用于体内组织的原位修复，在体内原位快速固化的以水凝胶铆钉的形式与待修复组织铆接，强黏附于组织，通过水凝胶中的聚丙烯酸酯与待修复组织进行共价交联，实现对损伤部位的牢固修复和长效封堵，具有良好的临床应用前景。

Description

体内原位生物制造方法及其在体内组织修补中的应用

技术领域

本发明涉及体内生物制造与生物修复技术领域，具体涉及体内原位生物制造方法及其在体内组织修补中的应用，还涉及一种用于体内原位组织的医疗设备。

背景技术

原位生物制造指的是生物墨水在临床环境中被直接作用在活体的缺陷部位，以创建或修复活体组织或器官的过程，其作用位点是人体中需要修复的再生的解剖学位置。原位生物制造最普遍的作用形式是生物三维打印，基于计算机辅助的增材制造技术，将生物墨水层层递送至组织缺陷处，精确控制生物材料、细胞和生长因子等在三维结构中的分布和组合，实现对缺损组织的修复或再生。目前，利用原位生物打印机开展组织修复得到了众多的关注，该技术也在皮肤，软骨修复中得到了一定的突破和进展。专利CN110123487A提供了一种皮肤原位打印系统，整体系统包括参数处理设定装置、皮肤原位打印设备、创伤面扫描诊断装置以及呼吸起伏测定装置，能够根据患者的呼吸起伏对患者的创伤面进行精确的原位打印。该皮肤原位打印系统虽然能够实现原位修复，但其构型为龙门结构，尺寸较大并且结构复杂，且仅具有3个自由度，无法适应于表面特征复杂的皮肤缺陷修复，能够开展的原位修复较为有限。

中国专利申请CN110101448A提供了一种基于微创手术的水凝胶输送装置，利用该装置实现对软骨损伤的原位打印。该装置包括外壳及安装在外壳内部旋转换向结构和同轴喷头，还在喷头四周集成了固化光源，能够实现对光固化水凝胶的原位打印。该装置虽然能够在一定程度上实现对向体内组织的延申，但其整体结构较为简单，仅能实现对水凝胶的定点递送，距离原位制造的概念还有一定距离，能够开展的原位制造修复也比较局限。中国专利CN10302436A披露的是一个体外制造血管支架的方案，缺乏了体内制造的研究和应用，本质上也是体外制造-移植的流程，距离体内原位生物制造还有很长的距离。这是因为递送和原位制造是两个不同的概念，递送仅仅是能够将水凝胶转移到目标位置，一方面其精度受限制，另一方面其自由度也受到限制。而制造是一个更高维度的工作，不仅需要将水凝胶以一定精度递送至指定部位，还需要在指定部位进行一些精密的操作，比如微穿刺，以及在指定部位周围沿X、Y、Z三轴方向的小幅运动，实现在体内进行高精度封堵水凝胶补片的制造。可见目前主流的修补方式集中在体外制造-体内移植。

研究现有技术可以发现，现有的原位生物制造主要针对人体的浅表组织，如皮肤、关节软骨等。限制原位生物制造向体内延申的主要因素有两方面，一方面是现有原位生物制造设备体积较大，在不进行大伤口的外科手术下，无法适用于体内组织的修复；另一方面，原位生物制造的进一步发展也受限于材料的创新，体内的修复环境不同于体外损伤，是一个较为复杂的环境，如组织表面潮湿、pH值非中性等。适用于体外的原位生物制造材料在体内往往无法发挥其良好功效，如组织粘附性差、酸性环境中成形效果差等。这两方面因素使得现有的原位生物制造仅针对浅表组织，而少有对体内原位生物制造的研究，因此对于体内原位生物制造进行研究以实现良好的体内组织的修复非常必要和迫切。

胎膜早破是指羊膜囊中的胎膜在未满37周前发生破裂的现象，其发生率占全部早产的30％。胎膜早破的发生率约为2.7％～7％，影响百万计的新生儿。胎膜早破发生后，羊水与外界环境连通，并沿胎膜损伤处流出，该过程中可能引起的严重不良的围生期结局不容忽视，主要包括绒毛膜羊膜炎、胎盘早剥、脐带脱垂、宫内感染、胎儿窘迫、流产以及胎死宫内等；由于胎膜早破引起的羊水过少和早产，使早产儿发育未成熟，生存率极低，且多伴有严重神经系统损伤，对产科和新生儿科医生产生极大挑战，给社会与家庭带来巨大的疾病与经济负担。由于胎膜无血管分布，因此胎膜破口的自然修复能力极其有限，若不加以干预，一般无法实现对该疾病的治疗。

胎膜修补所处的体内环境极为特殊，修补发生的场所在羊膜囊内，羊膜囊内的环境较为特殊，其内充满羊水，需要修补材料在羊水的液体环境中成形，对修补材料提出了较高的要求；另外羊膜囊内存在生命体：胎儿。胎儿在羊膜囊内具有基础的运动和呼吸，吞咽等生理活动；流动的液体环境可能会对胎膜，以及胎膜上的封堵材料起到冲击作用，无法在液体环境中良好成形或者成形后的材料与胎膜的粘附性差，封堵效果差，以及游离在羊水中的修补材料对胎儿造成不利影响，这也是现有的修复材料无法用于胎膜封堵的原因之一。

基于胎膜内的特殊环境，对胎膜修补材料的基本要求是：(1)该材料可以发生溶胶-凝胶的变化，在输送时为溶胶，便于递送至待修补区域，受到特定响应后变成凝胶，可以起到对损伤部位的修补作用；(2)该溶胶-凝胶变化可以发生在液体环境中，上述特定响应可以在液体环境中发挥作用。(3)该溶胶-凝胶变化在液体环境中和在正常环境中没有显著差异。(4)受到响应得到的凝胶需要具有良好的生物相容性，组织粘附性和力学性能。生物相容性需要材料没有生物毒性，支持细胞生长增殖，对胎儿无害；组织粘附性需要材料具有一定的粘性，并且与胎膜内表面能够形成一定的分子间作用力，保证材料与待修复部位的良好贴附，在液体的冲刷下而不脱落；力学性能需要材料具有合适的弹性模量和泊松比，能够承受胎膜内压不破坏。

现有的胎膜修补方案主要有采用血液制品(血小板、凝血酶、纤维蛋白原等)注入羊膜腔，血小板激活凝血酶，进而将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，形成胶冻状物质，对胎膜破口处起到封堵作用。但该技术存在一定的不确定性，形成的胶冻状物质随机沉淀，无法对破孔起到针对性的封堵。US Patient，6,350,463在上述基础上研发了一种胎膜修补胶，其组分依然是纤维蛋白原和凝血酶，该修补胶通过双筒胎儿镜输送到待修补区域，在胎膜破孔处交联固化，实现对胎膜的封堵。但这项技术存在一定不确定性，研究文献利用该产品在临床上开展胎膜早破修补实验，失败率近50％，一方面纤维蛋白原和凝血酶为异源性物质，具有引发免疫反应、传播疾病的风险，另一方面该凝胶与组织黏附性交叉，无法长时间对破口进行封堵，综合治疗效果较差。

CN107400661A本专利中选用材料单纯为GelMA，其浓度为10％，光引发剂为I2959，激发光为紫外光，光照时间为5min。这些条件均无法使修补材料在羊膜囊内良好成形。CN107349470B选用的光引发剂同样也是I2959，GelMA的浓度为5％，紫外光照功率为10mW，光照时间为5min，这样的条件下修补材料也无法在羊膜囊内成形。

也有研究人员利用明胶海绵塞封堵胎膜上的破孔，明胶海绵塞具有多孔海绵结构，嵌在胎膜破孔处能够吸收体液，增大体积，并锁定在胎膜上。但这种方式主要应用于医源性破孔的封堵，如羊水穿刺造成破孔的封堵，暂时无法应用于胎膜的自然破孔修补。随着仿生材料的发展，有学者研发出一些能在液体环境中成形的材料，希望通过这种材料实现在液体环境中对胎膜损伤的封堵，然而该材料的组织黏附性差，容易与胎膜脱落，并且生物相容性也有待进一步考证。

相较于胎膜的特殊环境，体内其他组织所处的环境相对常规。大多数处于一个干燥的环境，仅待修复的组织器官表面被粘膜覆盖，具有潮湿的特性。因此，如果一种修补方法和修补材料适用于对胎膜进行良好封堵的情况下，必然适用于对体内其他组织的原位修复，且将对其他体内组织具有同样的修复效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种体内原位生物制造方法，以及基于该方法的用于体内原位修复的医疗设备。

本发明针对现有原位生物制造方法的局限性，利用可适用于体内复杂环境，特别是胎膜所在的特殊环境，进行体内组织修复的新型生物材料，通过微型可经人体自然腔道或微创进入人体并开展原位生物制造的制造设备进入人体，实现对体内组织缺损的原位生物制造及修复。在本方法的应用实例——胎膜早破的修复中，本发明利用一种新型光敏修补材料实现对胎膜的修复，光敏修补材料在内窥镜和材料递送装置的辅助下被递送至胎膜破孔处，并在破孔处受光照凝胶固化，实现对胎膜破孔的封堵，并实现与组织的良好贴附；另外通过工艺创新，如修补胎膜破孔采用铆钉方式以机械力的形式进一步增强了水凝胶与胎膜的贴附效果，获得长期高效的胎膜封堵效果，能够有效治疗胎膜早破这一临床问题。

羊膜囊内的环境较为特殊，其内①充满羊水，需要修补材料在羊水的液体环境中成形，并且使修补材料在液体环境中与胎膜内表面实现良好贴附，对修补材料提出了较高的要求；②羊水的主要成分为生理盐水+偏酸性环境+蛋白质小分子+糖+尿素+皮肤角质层等，是一个较为浑浊的环境，不利于材料的固化成形；③羊膜囊内存在生命体：胎儿。胎儿在羊膜囊内具有基础的运动和呼吸，吞咽等生理活动；④流动的液体环境可能会对胎膜，以及胎膜上的封堵材料起到冲击作用。针对羊膜囊内的特殊环境，发明人进行了大量的研究和实践，根据上述要求①和②，需要封堵材料在羊膜内能够快速有效固化，并且能够与胎膜实现稳固连接，可用的方案是选用甲基丙烯酸苷基团取代度高的GelMA(MA作为光敏交联基团，取代度越高，分子间的结合越快，越强)，提高GelMA浓度或提高光引发剂浓度，使得材料可以在液体环境中尽可能在短的时间内固化成形，抵抗液体的稀释；另外在材料体系中引入聚丙烯酸酯，通过聚丙烯酸酯与胎膜内表面广泛分布的伯氨基发生化学反应，形成稳定的共价交联，实现与胎膜的稳固连接。另外，还将水凝胶在待修复区域原位制造成铆钉形状，将水凝胶补丁铆定在子宫内膜上，以机械力的形式进一步提高与胎膜的连接稳定性。

与光敏材料修补生物组织的文献都显示，一般选用MA取代度为50％左右的GelMA，GelMA浓度均小于10％，光引发剂浓度约为0.5％，成形时间都是以分钟为单位，如5min。然而发明人经过实验发现，这些现有技术给出的参数下的修补材料无法在液体环境中特别是羊膜囊内做到良好成形。一方面是因为修补材料完全固化需要的时间过长，材料粘度过低，在进入液体环境中后很快被稀释，从而无法良好成形甚至无法成形，另一方面是由于羊水中的固态物质使羊水浑浊，影响光照，进而阻碍水凝胶材料的成形固化。而聚丙烯酸酯多被用于涂料制作和胶水的工业制备中，在生物材料用水凝胶中少被使用，通过发明人的实验发现，本发明研发的新型体内修补材料水凝胶能够在传统的光敏修补材料基础上显著提高水凝胶补片与待修复组织的界面韧性。

发明人在临床实践中还发现，在光敏修复材料体系中，需要根据待修补的组织选择光敏修补材料体系中不同组分的浓度。根据上述第③要求，光敏修补材料需要具有一定的生物降解性，通过实验发明人发现，光敏修补材料随交联程度的增大而不易被降解，如果修补材料(水凝胶补丁)在羊水冲击下脱落游离在羊水环境中，具有极大被胎儿误食的可能，因此需要水凝胶补丁能在被误食后尽快降解，从而避免在胎儿体内产生不良影响造成的风险。

根据上述第④要求，需要水凝胶补丁与胎膜表面具有良好的粘附性，以防止水凝胶补丁从胎膜内表面脱落。需要明确的是，胎膜本身是具有弹性的，具备一定的可变形能力，由于孕妇运动或者其他原因，胎膜可能会发生弹性形变，这更需要水凝胶补丁需具有随胎膜一起发生弹性形变的能力(举例：如果正常情况下胎膜破孔直径为1mm，水凝胶补丁直径为2mm，当胎膜发生弹性形变，破孔被撑开使直径从1mm变化到2mm，如果水凝胶不随之变大，那么就很有可能造成封堵的失效)。

将水凝胶补丁抽象成一个扁圆柱，其受压力一般为轴向的静水压力，当胎膜发生扩张，由于水凝胶扁圆柱和胎膜的黏附力是一定的，那么扁圆柱能否沿着径向方向随着胎膜一起扩张，其实衡量的是水凝胶补丁的泊松比(即轴向受到相同压力时，在径向的变形能力)，如果泊松比越大，其在非受力方向(即径向方向)的变形能力越强。因此发明人进一步进行了泊松比随浓度变化的实验，发现泊松比随浓度的上升而下降。这个现象也可以用高分子形变理论来解释，当单位体积内含高分子链越多，分子链之间缠绕越紧密，其链段的活动空间越小，形变越小，导致泊松比越小。因此，发明人经过长期大量研究和临床实践，认为在实际选用光敏修补材料的组分浓度时，不可以盲目提高各组分的浓度，需要选取一个合适的值，让其既能快速固化，良好成形，又具有一定的组织黏附性、生物可降解性和随组织变形的能力。

发明人接种进行了大量探索和研究，平衡各方面的约束和要求，发现在胎膜修补的应用中，将光敏修补材料中的GelMA浓度限定为15-20％(w/v)，优选16％；将聚丙烯酸酯的浓度限定为8％-12％(w/v)，优选10％，蓝光引发剂LAP在光敏修补材料中的浓度为0.5％-1.0％(w/v)，优选0.8％(w/v)，配合本发明其他技术参数和方法能够满足上述诸多要求，并取得胎膜破损修复的最佳效果。

本发明提供的一种体内原位生物制造的医疗设备，包括光敏修补材料输送装置，所述输送装置经人体自然腔道或微创进入人体并开展原位生物制造；所述光敏修补材料为含光引发剂、以甲基丙烯酸化明胶GelMA和聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯为主要成分的生物材料。所述体内原位包括消化道壁、胎膜、颅底腔膜、子宫壁、膀胱壁，肺和心脏等体内深层组织器官。

本发明发现现有的其他生物材料，无法起到对体内组织的原位修补作用，常用于生物组织修复的生物材料有：明胶，海藻酸钠，胶原，纤维蛋白原，壳聚糖，透明质酸等，但这些材料都无法作为体内原位修复包括胎膜修补的主要成分。如明胶为温敏材料，在体内37℃是液态，无法起到封堵的作用；海藻酸钠为离子交联，需要在Ca²⁺的作用下才可交联，而后者在液体环境中极容易被稀释，并且改变羊水的组分；胶原同样无法在液体环境中成形；纤维蛋白原也无法单独成形，需要借助凝血酶，但是在背景中已经介绍过该方法应用在胎膜修补了，效果较差；壳聚糖无法在液体环境中成形，并且只有在酸性环境中才可被溶解；透明质酸无法在液体环境中成形，并且机械性能差。

本发明提供一种用于体内原位生物制造的水凝胶，将光引发剂、甲基丙烯酸化明胶GelMA，聚丙烯酸酯加入PBS磷酸缓冲液中；所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在水凝胶中的终浓度为5％-20％(w/v)，聚丙烯酸酯在水凝胶中的终浓度为5％-30％(w/v)，光引发剂在水凝胶中的终浓度为0.5％-1％(w/v)。

优选地，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在水凝胶中的终浓度为15％-20％(w/v)，聚丙烯酸酯在水凝胶中的终浓度为8％-12％(w/v)，光引发剂在水凝胶中的终浓度为0.6％-0.9％(w/v)。

本领域技术人员应当理解，针对不同的体内组织器官，可选择不同浓度成分组成的水凝胶作为光敏修补材料，当针对胎膜早破进行修补时，优选的水凝胶组分为：甲基丙烯酸化明胶GelMA在水凝胶中的终浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯在水凝胶中的终浓度为10％(w/v)，光引发剂在水凝胶中的终浓度为0.8％(w/v)，溶剂为PBS磷酸缓冲溶液。

本发明提供一种体内原位生物制造的医疗设备，包括光敏修补材料输送装置，所述输送装置经人体自然腔道或微创进入人体并开展原位生物制造；所述光敏修补材料含光引发剂、甲基丙烯酸化明胶GelMA和聚丙烯酸。

所述体内原位生物制造的医疗设备中，所述光敏修补材料含光引发剂、甲基丙烯酸化明胶GelMA，聚丙烯酸酯；所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在水凝胶中的终浓度为5％-20％(w/v)，聚丙烯酸酯在水凝胶中的终浓度为5％-30％(w/v)，光引发剂在光敏修补材料中的终浓度为0.5％-1％(w/v)

所述一种体内原位生物制造的医疗设备中，所述体内原位包括体内深层组织器官，优选消化道，胎膜，颅底腔膜，子宫壁，膀胱壁，肺，心脏。

本发明还提供一种用于体内原位生物制造的医疗设备，可将其应用在包括胎膜早破修补在内的所有体内其他组织器官的原位修补上，其包括光敏修补材料递送装置，所述光敏修补材料递送装置配置有：光敏修补材料承载模块、控制承载模块递送和进行原位修复的操作模块、控制光源的操作模块和光源，所述光敏修补材料为以上所述的水凝胶。

所述光引发剂为蓝光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂(LAP)，其引发波长为405nm，在光敏修补材料的浓度为0.5％-1.0％，优选0.8％。现有技术中，选用的光引发剂多为I-2959，I-2959仅能在紫外光(365nm)下固化，不可避免对组织造成损伤。

LAP会在蓝光作用下产生自由基，自由基会对细胞产生一定的损伤，因此需要控制LAP的浓度，本发明实验结果证实，在LAP浓度小于1％时，细胞的成活率与无光引发剂没有显著差异，说明该浓度下的LAP对细胞是安全的；当LAP浓度过低(低于0.25％)时，将无法起到羊水环境下的光照引发的作用。为了提高光引发速度，本发明选用光引发剂浓度为0.5％-1.0％，优选0.8％。

所述医疗设备在应用于肺部损伤修复时，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为10％(w/v)，所述聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的浓度限定为15％(w/v)，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP，其在光敏修补材料中的浓度为0.8％(w/v)；

所述医疗设备在应用于胎膜早破修复时，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为16％(w/v)，所述聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的浓度限定为10％(w/v)，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP，其在光敏修补材料中的浓度为0.8％(w/v)；

所述医疗设备在应用于心脏修复时，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为20％(w/v)，所述聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的浓度限定为16％(w/v)，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP，其在光敏修补材料中的浓度为1％(w/v)。

现有的利用光敏修补材料进行组织修复的应用中，其主要成分多为单一的GelMA材料，并且常用的光照时长为5min，光照强度一般为300-500mW。但是在胎膜早破修补的应用中，由于胎膜的环境特殊，这种参数无法使修补材料在体内环境快速良好成形。

本发明的用于体内组织修复的医疗设备中，所述模块在体内原位修补应用时，控制光源的条件为：光源波长≤405nm，光照时长为0.5-3min，光照强度为1100-1300mW/cm²。

针对不同的修复对象和应用场景，可以选择不同的光源参数，如在胎膜早破修复的应用中，光源的条件为：光源波长405nm，光照时长为0.5-1min，优选40s；光照强度为1150-1250mW/cm²，优选1200mW/cm²。

本发明的用于体内组织修复的医疗设备中，光源距离待修复组织的距离是1.6-2.5cm，优选2cm，以保证光照强度，防止体内的非预期干扰因素对光照的影响。

本发明的用于体内组织修复的医疗设备还包括确定组织损伤位置的装置。

本发明提供的医疗设备中，所述控制承载模块递送和进行原位修复的操作模块通过操控所述光敏修补材料承载模块，将光敏修补材料以铆钉形式固定并均匀覆盖在待修复组织的表面，覆盖面积数倍大于组织损伤面积，进行体内组织原位修复。在胎膜早破修复的应用中，光敏修补材料在胎膜损伤处固化成形，并以铆钉形式固定在子宫内壁上，能够实现对胎膜破孔的牢固封堵于修复。

铆钉是机械领域常用的连接件，利用铆钉连接两个零件的基本步骤是根据待连接零件的大小形状，选用合适的现成的铆钉进行连接。在本发明中，使用的是原位铆钉成形技术，将材料在需要连接的部位直接制造出来，相比于传统的“制造-连接”方法，本方案将其简化成在制造的同时连接，简化了操作步骤。在具体使用时，其优势在于：体内的伤口一般都是未知的，无法预先判断应该选用多大的铆钉，并且如果选用的铆钉较大，则无法通过内窥镜送进体内。而本发明这种体内原位制造技术，可以在镜下先寻找破孔，再根据破孔的大小确定铆钉的大小，数量和位置，将补片(水凝胶预聚物)和铆钉结合在一起，进行精准、稳固的修补。比如想要制造一个10mm直径的铆钉，其大小远大于内窥镜直径(约3mm)，这是无法通过内窥镜送进体内的，但是如果用本发明的原位成形技术，在体内制造一个直径10mm的铆钉是非常轻松的，这体现了本发明的临床应用中的独特思维方式，通过制造铆钉的形状来提高机械结合的粘附性，进一步凸显本发明的医疗设备在体内原位生物制造方面的优势。

本发明还以胎膜早破修补为例，提供了光敏修补材料在体内原位生物制造方面的应用。所述甲基丙烯酸化明胶(GelMA)和聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯作为光敏修补材料的主要成分，用于体内原位生物制造，所述GelMA在光敏修补材料中的浓度为15％-20％(w/v)，优选16％(w/v)；所述聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的浓度为8％-12％(w/v)，优选10％(w/v)；所述光引发剂为蓝光引发剂LAP，其在水凝胶修补材料中的浓度为0.5％-1.0％(w/v)，优选0.8％(w/v)。

在胎膜早破修补的应用实例中，具体的发明实施方案如下：

光敏修复材料的配制方法：

1、聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯的合成

聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯是将N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺的偶联作用下接枝于聚丙烯酸(450kDa)聚合物主链上制备而成的。首先将二氯甲烷和二甲基甲酰胺以1∶1的比例混合，得到溶剂，并在冷却条件下分别将1g聚丙烯酸，4.13g二环己基碳二亚胺和2.30gN-羟基琥珀酰亚胺溶解于10ml上述溶剂中，得到溶液A，B和C。在冷却条件下，将B溶液逐滴加入A中，并在5分钟后以相同方式逐滴加入C溶液，搅拌1小时。将反应混合物在22℃下进一步搅拌12小时。反应结束后，通过过滤除去溶液中的沉淀，将剩余的有机溶剂减压蒸发得到晶状体。随后利用丙酮和二氯甲烷多次洗涤上述晶状体纯化产物，并在真空下干燥，得到聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯固体，其纯度约为95-98％。

2、聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯溶液的制备

精准称取1.03g聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯固体，溶于2ml去离子水中，搅拌至完全溶解，得到浓度为50％(w/v)的聚丙烯酸酯溶液。

3、GelMA预聚物溶液的制备

取5ml PBS缓冲液，加入装有0.05g光引发剂LAP的避光瓶中；以45℃水浴加热溶解15分钟，期间振荡数次，得到浓度为1.0％(w/v)的LAP引发剂溶液。精准称量GelMA固体1.0g，加入离心管中，取上述LAP引发剂5ml至离心管中，振荡使GelMA充分浸润；以45℃水浴避光加热溶解30分钟，期间振荡数次，得到浓度为20％(w/v)的GelMA预聚物溶液。

4、光敏修补材料的制备

取5mlGelMA预聚物溶液于离心管中，在45℃避光水浴下向其中加入1.25ml聚丙烯酸酯溶液，搅拌至均匀混合；立即用0.22μm无菌针头过滤器灭菌，并转移至避光离心管中置于4℃冰箱保存。最终得到的光敏修复材料中，GelMA预聚物浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为10％(w/v)，LAP光引发剂浓度为0.8％(w/v)。

本发明通过实验探索，发现本发明所述的光敏修补材料可被用于体内组织损伤的原位生物制造修复，以胎膜损伤修补为例：将材料通过内镜输送至胎膜破孔处，并在破孔处受蓝光光照固化成形。经过实验验证，该光敏修补材料在液体环境中受到蓝光激发也能成形，并且成形效果良好，而其他水凝胶没有受光固化的特性。

在本发明述及的最优实验参数下，液体环境中固化成形的光敏修补材料与在干燥环境中固化成形的光敏修补材料的力学性能近似，且具有良好的力学性能，可以克服胎膜内压的冲击；另外，通过在该材料组分中创新性地引入聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯，该组分能够在体内环境中与人体组织表面富含的伯氨基发生化学反应，形成稳定的共价键，进一步增强光敏修补材料与带修补部位的粘附性。通过黏附性拉伸对照实验，发现在组分中引入聚丙烯酸酯能够显著提高修补材料与待修复胎膜的界面韧性，能够起到有效、可靠的封堵作用。

在该实验条件下，为了进一步防止光敏修补材料与胎膜在非预期的情况下受羊水冲击发生脱落，出现无法长时间封堵的情况，本发明还创新性地提出了水凝胶铆钉结构，将光敏修补材料在胎膜破孔处一体成形，并将其铆定在子宫内壁上，除依靠材料的粘附力外，还通过机械力实现与胎膜的良好贴附，实现对胎膜的长期有效封堵，其具体的操作流程见图1，具体如下：

①产科医生使用内镜对产妇小腹进行穿刺，刺入羊膜囊内。通过内镜向羊膜囊内注入林格氏液，使羊膜囊在水压下充分扩张，通过形态观察以及漏水情况在镜下寻找到胎膜破孔的位置；或使用人工智能仪器设备对胎膜破孔的位置进行定位。

②找到胎膜破孔位置后，锁定内镜的位置，将本发明的光敏修补材料预聚物(GelMA浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为10％(w/v)，光引发剂浓度为0.8％(w/v))递送装置穿过胎膜破孔，并刺入相应位置的子宫内壁中。刺入子宫内壁后，将光敏修补材料预聚物注入子宫内壁，同时开启蓝光光源，使注入的光敏修补材料预聚物在子宫内壁内固化；

③保持光敏修补材料继续注射，并缓慢抽出递送装置，直至递送装置回到羊膜囊内，转动递送装置使挤出的光敏修补材料预聚物能够均匀覆盖胎膜破孔的表面，覆盖面积应数倍大于胎膜破孔的面积，具体情况取决于胎膜破孔的大小，位置和羊膜囊内压。整个过程中蓝光光源一直开启，上述过程中被挤出的光敏修补材料预聚物在蓝光照射下一体成形，实现对一个胎膜破孔的封堵。

④根据破孔的数量，重复②③步骤，实现对所有破孔的修复。

⑤将内镜从穿刺部位抽出，临抽出前利用同样的方式对穿刺造成的医源性破孔进行封堵，重新恢复羊膜囊内的封闭环境。

本发明中采用的光敏修补材料不仅具有良好的液体环境成形能力，优异的力学性能和组织粘附性外，还具有良好的生物相容性。将间充质干细胞接种在本发明的新型光敏修补材料中，进行3天培养并进行活死染色，观测结果显示在该体系下的间充质干细胞保持95％的细胞成活率。

本发明的光敏修补组织还适用于对其他体内原位包括体内深层组织器官破损的修复，比如消化道，胎膜，颅底腔膜，子宫壁，膀胱壁，肺，心脏等。

本发明的优异效果主要体现在：

(1)本发明首次提出体内原位生物制造的概念，将水凝胶从原本的递送到一个部位让其随机成形，改变为将水凝胶精准递送至目标部位，并使其在体内以较高精度受控成形，将水凝胶递送提升到水凝胶原位制造的概念，能够在体内、损伤处开展原位实时的生物制造，实现组织修复。

(2)本发明创先制备一种新型光敏修补材料，该材料由甲基丙烯酸化明胶、聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯以及蓝光引发剂LAP构成，并通过实验探索确定针对不同修复组织的最优配比。该新型光敏修复材料兼具两种组分的优势，甲基丙烯酸化明胶能够在光照作用下迅速固化成形，能够实现在体内特殊环境的原位制造；聚丙烯酸酯能够和体内组织表面富含的伯氨基发生化学反应，生成稳定的共价键，可以进一步提高与待修复组织的黏附与融合，促进组织修复再生，基于此材料的特性，适用于体内各种组织的原位修复(体内组织表面均富含伯氨基)。在本发明的应用实例中，在针对胎膜早破暂无有效治疗手段的背景下，本发明首次将上述光敏修补材料应用于胎膜早破的修补中，各项实验表明了该材料的应用能够有效解决胎膜早破的修复难题。

(3)本发明首次提出了水凝胶铆钉的概念，能够将体内制造的生物打印支架通过一体成形的方式铆定在组织待修复部位，以机械力的方式实现生物打印支架与待修复组织的良好贴附，进一步解决了体内组织修复中，由于待修复组织表面潮湿而不易于组织贴附等问题。在本发明的应用实例中，通过光敏修补材料补片铆钉在液体环境中实现对胎膜早破的长期黏附和良好封堵。

本发明通过体内原位生物制造的方式，将修复材料以无创或者微创的方式进入体内，并以增材制造的方式在损伤处开展实时治疗，本发明的水凝胶光敏修补材料具有三个(X、Y、Z)以上自由度，可以适用于表面更为复杂的组织修复，能够解决现在大部分体内损伤的治疗难题：如外科手术方式创口大，并发症风险高；微创手术只能开展切除等操作，适用的病症较少等。在本发明的应用实例中，针对胎膜早破的体内原位修复，目前胎膜早破在临床上暂无有效的治疗方案，而该方法能够以微创的方式实现对胎膜破孔的精准、长期、有效的封堵，起到防止羊水泄露和外界细菌介入引起的宫内感染等问题；此外，在本发明的光敏修补材料中载以细胞及生长因子，还可以在单纯的封堵作用的基础上进行胎膜的再生修复，实现更为长期有效的胎膜修复再生，保证羊膜内的封闭环境，为该临床问题和社会问题的解决提供有效的方案。

本发明的修补方法和修补材料在能对胎膜进行良好封堵的情况下，将对其他体内组织具有同样的修复效果。

附图说明

图1为水凝胶铆钉制造流程图：①：镜下寻找到胎膜破孔位置，锁定内镜位置后，将内镜通过破孔穿刺进入子宫内壁；②穿刺进入子宫内壁后，修补材料由材料输送系统递送入子宫内壁，同时蓝光光源开启，修补材料受光照固化；③材料输送系统缓慢从子宫内壁抽出，此时材料继续递送，蓝光持续照射；④进入羊膜囊内后，材料输送系统一边挤出材料，一边绕其轴线做缓慢回转运动，使其在胎膜内壁形成一层均匀的补片，实现对胎膜破孔的封堵，此时蓝光持续照射，由此得到的水凝胶铆钉能够起到对胎膜破孔的封堵作用。其中较薄的圆形补片能够起到对破孔的封堵，下方的圆球形材料起到铆钉的作用，将补片固定在破孔区域，防止其发生滑移。图中A：材料输送系统；B：蓝光光源；C：胎膜；D：子宫内壁；E：GelMA水凝胶铆钉。

图2为不同浓度的光敏修补材料在干燥环境下和液体环境中成形的压缩模量测试，其中采用对胎膜修复最佳的实验参数(16％(w/v)的GelMA和10％(w/v)的聚丙烯酸酯)的修补材料在液体环境中成形的压缩模量与在干燥环境中成形的模量近似，表明其在液体环境中成形的可行性。

图3不同光照时间和不同光照强度下对针对胎膜修复最佳实验参数的修补材料在液体环境中成形的压缩模量测试，选取最优实验条件为光照时长为40s，光照强度为1200mW/cm²。

图4不同聚丙烯酸酯浓度对光敏修补材料与接触表面的黏附性测试，以界面韧性和剪切强度量化。

图5为体外胎膜损伤模型的构建，A：圆通管(模拟羊膜囊)；B：人胎膜(模拟胎膜)；C：鸡胸肉(模拟子宫内壁)。

图6为用体外损伤模型验证不同参数下的材料封堵效果，其中本发明的最优参数能够起到与完整胎膜基本相同的封堵效果。

图7为实施例4中光敏修补材料培养间充质干细胞3天后的活死染色结果，其中绿色代表活细胞，红色代表死细胞(白色圆圈圈出)。

图8为实施例4中，在长达14天的细胞培养过程中，光敏修补材料细胞三维结构体中的ADSC的存活率均为95％以上。

图9为LAP光引发剂的吸收波长，可以看出该引发剂仅对波长小于405nm的光有吸收值。

图10为不同浓度的GelMA水凝胶泊松比，可以看出材料的泊松比随材料浓度的升高而降低。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别说明，本发明所用的方法均为本领域常规技术方法，以下实施例所用的耗材、试剂均为市售可得。本发明所述的PBS磷酸缓冲液为可直接购买的商品，广泛应用于生物医学领域，实施例中选用的PBS磷酸缓冲液型号为Solarbio品牌的PBS缓冲液，浓度为1倍浓度，pH值为7.2-7.4。

本发明实施例记载的数据均为平行试验5次后的平均值，且各平行试验数据之间差异不显著。

实施例1光敏修复材料中GelMA浓度的不同在干燥环境下和液体环境中成形的压缩模量测试

本发明制得的光敏修复材料中，甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为5％-20％(w/v)，聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的终浓度为5％-30％(w/v)，光引发剂在光敏修补材料中的终浓度为0.5％-1％(w/v)，光敏修复材料的溶剂为PBS磷酸缓冲溶液。发明人实验发现，蓝光引发剂LAP仅对波长小于405nm的光有吸收值，见图9，因此实验中，均采用405nm波长的蓝光照射。

1、配置不同浓度的光敏修复材料预聚物溶液

配制具有GelMA浓度梯度的光敏修复材料预聚物溶液，4个浓度梯度中，聚丙烯酸酯的浓度均为10％(w/v)，LAP光引发剂浓度均为0.8％(w/v)，GelMA的浓度分别为5％，10％，15％和20％，溶剂为PBS磷酸缓冲溶液。

2、将不同浓度的光敏修复材料预聚物注入标准试样模具

选用PDMS制成的水凝胶模具，其中有数个直径为6mm，深度为3mm的圆孔，将PDMS模具置于干燥环境中，向孔内注入不同浓度的光敏修复材料预聚物，注入后立即用功率为1200mW/cm²的405nm波长的蓝光照射40s，照射时保证光源距离模具为2cm。得到不同浓度下在干燥环境中得到的光敏修补材料水凝胶标准试样。将PDMS模具置于林格氏液(临床上的羊水替代溶液)中，重复上述步骤，得到液体环境中成形的光敏修复材料水凝胶标准试样。

3、利用单轴压缩实验台对标准试样进行压缩模量测试

将上述过程获得的不同浓度的光敏修复材料水凝胶标准试样放在实验台上，以压缩速度3mm/min进行压缩实验，获得力-位移曲线，并计算不同试样的压缩模量。

测试结果显示，在固定的光照参数下，在干燥环境中不同浓度的光敏修复材料的压缩模量分别为：

GelMA浓度5％：8.03±1.21kPa；

GelMA浓度10％：14.89±1.33kPa；

GelMA浓度15％：23.42±2.17kPa；

GelMA浓度20％：38.55±3.94kPa；

在液体环境中，相同参数下成形的光敏修补材料的压缩模量分别为：

GelMA浓度5％：4.98±2.25kPa；

GelMA浓度10％：11.96±3.29kPa；

GelMA浓度15％：19.24±4.12kPa；

GelMA浓度20％：38.25±3.35kPa。

证明含GelMA浓度较高的光敏修补材料可以在液体环境中良好成形，并且可以根据待修补组织的需求来选择合适的GelMA浓度。试验显示浓度20％GelMA液体环境中，压缩模量最高，但考虑到水凝胶的泊松比会随压缩模量的升高而降低，因此当水凝胶的压缩模量过大，其泊松比会很小(不同浓度的GelMA水凝胶泊松比见图10)，使其的径向变形能力很差，导致在胎膜破孔扩张后，水凝胶补丁跟随扩张的能力不足，从而导致羊水继续泄露。本申请经过大量实验研究比较后发现，选择光敏修补材料中GelMA最适浓度为16％，见图2，能够在确保修补材料在羊水环境下压缩模量具备较高数值的前提下，还能兼顾修补材料扩张力与胎膜伸缩的同步性，修补效果优异。

实施例2不同光照时间和不同光照强度下对上述最优浓度参数的光敏修复材料预聚物在液体环境中成形的压缩模量测试

1、参照实施例1的方法配置浓度为上述最优浓度参数的光敏修复材料预聚物。光敏修复材料中，甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的终浓度为10％(w/v)，光引发剂在光敏修补材料中的终浓度为0.8％(w/v)。

参照实施例1的方法将该溶液注入浸泡在林格氏液的标准试样模具中，注入后立即用不同功率的405nm波长的蓝光照射光敏修补材料，对于不同的组别，分别控制光源与水凝胶的距离为2cm，5cm和10cm，照射时间为40s，得到不同光照强度下的水凝胶压缩标准试样。另外，固定光源距离为2cm，控制光照时间分别为15s，30s，1min，2min，3min，得到不同光照时间下的水凝胶压缩标准试样。

2、利用紫外辐照仪测量光源在不同距离下的光照功率，在距离分别为2cm，5cm和10cm时，记录光照功率，多次测量取平均值。结果显示，当光源距离为2cm时，其能量为1253.4±17.3mW/cm²，当光源距离为5cm时，其能量为879.7±13.1mW/cm²，当光源距离为10cm时，其能量为547.2±9.4mW/cm²。

3、利用单轴压缩实验台对标准试样进行压缩模量测试

将上述过程获得的不同参数成形的光敏修复材料水凝胶标准试样放在实验台上，以压缩速度3mm/min进行压缩实验，获得力-位移曲线，并计算不同试样的压缩模量。

在不同的光照距离参数下，得到的光敏修复材料水凝胶的压缩模量分别为：2cm：25.55±2.72kPa；5cm：8.19±2.53kPa；10cm：4.54±1.32kPa。

在光源距离为2cm时，改变光照时长的光敏修复材料水凝胶压缩模量分别为：光照15s：4.50±1.55kPa；光照30s：14.63±3.42kPa；光照1min：23.58±3.75kPa；光照2min：35.24±2.57kPa；光照3min：39.34±3.15kPa。见图3。

综上选取最优实验条件为光照时长为30s-1min，优选40s，光照强度为1100-1300mW/cm²，优选1200mW/cm²。

实施例3光敏修复材料中聚丙烯酸酯浓度的不同对组织黏附性的影响

1、参照实施例1的光敏修复材料配方，配制具有聚丙烯酸酯浓度梯度的光敏修复材料预聚物，4个浓度梯度中，GelMA的浓度均为16％(w/v)，LAP光引发剂浓度均为0.8％(w/v)，聚丙烯酸酯的浓度分别为10％，15％和20％和30％，对照组中不添加聚丙烯酸酯，其他组分与实验组一致，溶剂均为PBS磷酸缓冲溶液。

2、黏附性表征参数的测量

选用表面修饰有伯氨基的载玻片模拟富含伯氨基的人体组织表面，将不同浓度的光敏修补材料滴加在载玻片上，并用另外一个载玻片的一端盖住上述载玻片的一端，使两个载玻片的重叠部分为长度1cm的矩形。利用上述最佳光照参数照射该矩形部位，使光敏修补材料固化。将两个载玻片分别安装在单轴拉伸实验台的两端进行拉伸试验，以测量修补材料与接触表面的界面韧性。所有测试以3mm/min的恒定速度进行，拉伸至两块载玻片剥离，获取力-位移曲线，计算光敏修复材料与接触表面的界面韧性和剪切强度。

3、测试结果显示，在光敏修补材料中没有添加聚丙烯酸酯(对照组)中，其与接触表面的界面韧性仅为32.9±4.3J·m^-2，剪切强度仅为2.35±1.26kPa，添加聚丙烯酸酯后，其与接触表面的界面韧性和剪切强度有了显著提升，聚丙烯酸酯浓度为10％，15％，20％和30％的光敏修补材料的界面韧性和剪切强度分别为186.3±23.5，315.4±37.8，442.5±35.5，571.8±43.1J·m^-2和13.91±2.44，31.34±2.13，39.58±2.95，45.72±3.36kPa。表明添加聚丙烯酸酯的光敏修复材料能够显著提升材料与待修复组织的界面韧性与剪切强度，表示其能够提高与待修复组织的黏附性，并且黏附性的提高程度与聚丙烯酸酯浓度成正相关，在针对不同组织修复时可以根据实际需要选择不同浓度的聚丙烯酸酯浓度。见图4。

但由于聚丙烯酸酯同样属于水凝胶，具有泊松比随压缩模量增大而降低的趋势，不能单纯为了提升界面韧性而提高浓度，去选择浓度含量较高的聚丙烯酸酯的水凝胶溶液。发明人研究发现，聚丙烯酸酯的浓度过高会使水凝胶的径向变形能力变差；另外，水凝胶整体浓度太高之后，会使其粘度太大，不利于挤出，在胎膜早破的修补中不适用。本申请经过不断摸索和研究，发现上述水凝胶体系中，5％-30％聚丙烯酸酯，能起到原位体内组织修补的作用，尤其是10％的聚丙烯酸酯特别适用于胎膜早破的修补，光敏修复材料与胎膜表面的界面韧性和剪切强度保持较高水平，黏附性恰到好处，径向变形能力优异，修补效果最佳。

实施例4光敏修补材料的生物相容性测试

1、间充质干细胞的培养

人脂肪来源间充质干细胞(Adipose-derived stem cell，ADSC)在ADSC细胞扩增培养液中进行培养。ADSC细胞扩增培养液按照MSCM培养基试剂盒进行配制。当细胞90％汇合时按照1:3的比例传代，每2-3天更换一次培养液。

2、配置针对胎膜修补的最佳浓度光敏修补材料预聚物

按照上述方法，配制包含GelMA浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为10％(w/v)光引发剂浓度为0.8％(w/v)的光敏修补材料预聚物，并立即用0.22μm无菌针头过滤器灭菌。将得到的溶液转移至15ml离心管中，利用巴氏灭菌法(烘箱70℃保温30分钟，立即转移到4℃冰箱中30分钟，重复该过程3次)对修复材料进行灭菌处理。

3、配制含细胞的光敏修补材料预聚物

500μl HGSMC细胞扩增培养液进行重悬，得HGSMC细胞悬液，离心，去除上清液，得到细胞沉淀。取上述步骤2的光敏修补材料预聚物溶液1.5ml对细胞沉淀进行重悬，均匀混合得到含细胞浓度为2×10⁶个/ml的光敏修补材料水凝胶预聚物，将预聚物装入1ml一次性无菌注射器中。

4、含细胞光敏修补材料水凝胶的获取

将上述光敏修补材料预聚物按照在胎膜早破修补应用中的最优光照参数：1200mW/cm²，40s下挤出并固化，得到含细胞的光敏修补材料水凝胶。将得到的水凝胶放入含ADSC细胞扩增培养液的培养皿中继续细胞培养，常规条件下(37℃，5％CO₂孵箱)培养细胞三维结构体14天，培养过程中每2～3天换液。

5、活死细胞染色检测

采用Live-Dead Cell Staining Kit活-死细胞染色试剂盒检测细胞存活情况，Live-Dye染料能对活细胞染色，是一种能穿透细胞的绿色荧光染料(Ex/Em＝488/518nm)。死细胞用碘化吡啶(PI)染色，PI是一种不能透过细胞膜的红色荧光染料(Ex/Em＝488/615)。使用荧光显微镜观察并记录。

6、细胞状态光镜观察

每3天对光敏修补材料三维结构体进行光镜下的观察拍照，并记录细胞的状态。

结果：光敏修补材料培养间充质干细胞3天后的活死染色结果见图7，其中绿色代表活细胞，红色代表死细胞(白色圆圈圈出)；在长达14天的细胞培养过程中，光敏修补材料细胞三维结构体中的ADSC的存活率均为95％以上，见图8。

结论：该新型光敏修补材料具有良好的生物相容性，且支持细胞生长增殖。

实施例5不同固连方式对修补材料耐冲击力的影响

1、配制针对胎膜修补应用最优浓度的光敏修补材料：包含GelMA浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为10％(w/v)光引发剂浓度为0.8％(w/v)。

2、利用体外胎膜损伤模型评估不同修复方式

将步骤1的光敏修补材料水凝胶溶液利用水凝胶递送装置递送至预先创造的体外胎膜损伤模型中(见图5)，实验组利用体内原位生物制造制作水凝胶铆钉，将光敏修补材料水凝胶补片利用铆钉状结构固连在子宫内壁上；对照组则不适用水凝胶铆钉结构，直接将光敏修补材料与预聚物溶液递送至破孔部位，并通过光照固化成形，对胎膜破孔进行封堵。将模型中的胎膜取出，在其侧方利用不同速度的水流冲击光敏修补材料水凝胶补片，对比不同方式能够承受的水流冲击速度，进而反映铆钉结构的稳定连接效果。

结果：不使用铆钉固连的水凝胶补片在水流速度为20ml/min的冲击下会脱落，而使用铆钉固连的水凝胶补片在水流速度220ml/min的冲击下仍然可以保持稳固的连接，体现了本发明胎膜修补方式的创新性与强的适用性。具有良好的修补、固定和耐冲击效果。

实施例6

常用于生物组织修复的材料有：明胶，海藻酸钠，胶原，纤维蛋白原，壳聚糖，透明质酸等，将上述材料配置成标准浓度的水凝胶(标准浓度指的是本领域内将上述材料制备成水凝胶的最常用的浓度，如明胶为10％，海藻酸钠为2％等)，参照实施例2确定的最佳光照参数方法在体外胎膜损伤模型中验证利用这些材料封堵胎膜破孔的可行性。

结果：由于上述材料的交联性质，均无法适用于胎膜的封堵。明胶为温敏材料，在体内37℃为液态，在胎膜破孔处随体液一起流出体外，无法起到封堵作用；海藻酸钠为离子交联，需要在Ca²⁺作用下才可交联，后者在液体环境中极容易被稀释，并且将改变羊水组分，造成不必要的风险，无法起到封堵作用；单纯的胶原水凝胶无法在液体环境中固化成形，无法起到封堵作用；纤维蛋白原无法单独成形，需要借助凝血酶，但是纤维蛋白原和凝血酶在羊水中相遇会发生随机沉淀，无法对破孔进行精准修复，修复效率低，成功率低；壳聚糖只能在酸性环境中才可被溶解，并且无法在液体环境中成形，无法起到封堵作用；透明质酸无法在液体环境中成形，无法起到封堵作用。

结论：在胎膜修补的应用中，利用本发明实施例1的新型光敏修补材料【甲基丙烯酸化明胶GelMA在水凝胶中的终浓度为5％-20％(w/v)，聚丙烯酸酯在水凝胶中的终浓度为5％-30％(w/v)，光引发剂在水凝胶中的终浓度为0.5％-1％(w/v)，溶剂为PBS磷酸缓冲溶液】可以实现对胎膜的长期、稳固的封堵，而现有的生物材料无法起到类似的作用。

实施例7用于胎膜早破修复的医疗设备与操作流程

用于胎膜早破修复的医疗设备包括光敏修补材料递送装置，所述光敏修补材料递送装置配置有光敏修补材料承载模块、控制承载模块递送和进行原位修复的操作模块、光源、控制光源的操作模块，所述光敏修补材料含光引发剂、甲基丙烯酸化明胶GelMA和聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的浓度5％-20％(w/v)，所述聚丙烯酸(N-羟基琥珀酰亚胺)酯在光敏修补材料的浓度为5％-30％(w/v)，光引发剂在光敏修补材料中的终浓度为0.5％-1％(w/v)，溶剂为PBS磷酸缓冲溶液。

采用水凝胶铆钉结构，将光敏修补材料在胎膜破孔处一体成形，并将其铆定在子宫内壁上，除依靠材料的粘附力外，还通过机械力实现与胎膜的良好贴附，实现对胎膜的长期有效封堵，其具体的操作流程见图1，描述如下：

①产科医生使用内镜对产妇小腹进行穿刺，刺入羊膜囊内。通过内镜向羊膜囊内注入林格氏液，使羊膜囊在水压下充分扩张，通过形态观察以及漏水情况在镜下寻找到胎膜破孔的位置；或使用人工智能仪器设备对胎膜破孔的位置进行定位。

②找到胎膜破孔位置后，锁定内镜的位置，将本发明的光敏修补材料预聚物递送装置穿过胎膜破孔，并刺入相应位置的子宫内壁中。刺入子宫内壁后，将光敏修补材料预聚物注入子宫内壁，同时开启蓝光光源，使注入的光敏修补材料预聚物在子宫内壁内固化；

③保持光敏修补材料继续注射，并缓慢抽出递送装置，直至递送装置回到羊膜囊内，转动递送装置使挤出的光敏修补材料预聚物能够均匀覆盖胎膜破孔的表面，覆盖面积应数倍大于胎膜破孔的面积，具体情况取决于胎膜破孔的大小，位置和羊膜囊内压。整个过程中蓝光光源一直开启，上述过程中被挤出的光敏修补材料预聚物在蓝光照射下一体成形，实现对一个胎膜破孔的封堵。

④根据破孔的数量，重复②③步骤，实现对所有破孔的修复。

⑤将内镜从穿刺部位抽出，临抽出前利用同样的方式对穿刺造成的医源性破孔进行封堵，重新恢复羊膜囊内的封闭环境。

按照体外胎膜损伤模型里的实验模型，最优浓度的光敏修补材料(包含GelMA浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为10％(w/v)光引发剂浓度为0.8％(w/v)的光敏修补材料)可以在28天中保持与完整胎膜一样的封堵作用，实际的封堵时间会更长，可以满足临床上对于胎膜早破修复的延长需求(约一个月)，通过图6也可看出，其他组分浓度的光敏修补材料也能够起到对胎膜的修补封堵作用，但在实际的封堵时间上存在差异，因此在临床使用中需要根据具体的临床带修复组织的情况选择合适的光敏修补材料浓度。

实施例8体外胎膜损伤模型的构建

应用在设计的体外胎膜损伤模型中。该体外胎膜损伤模型由圆通管、人胎膜和鸡胸肉构成。其中圆通管由20ml注射器去除注射端制成，其整体呈现一个通管；人胎膜由从知情书面同意下刚分娩的孕妇处获得，并将其切成直径5cm的圆形组织，固定在圆通管的一端。将鸡胸肉同样切成直径5cm的薄组织，固定在人胎膜的外侧，用于模拟羊膜囊外的子宫内壁。在圆通管内注入林格氏液至20ml刻度线，其产生的静水压力近似生理状况下的羊膜囊内压。之后利用2mm针头在该模型中的胎膜上创造破孔，圆通管内的林格氏液开始由破孔渗出，利用上述方法对该缺损模型进行封堵治疗，以圆通管内的20ml液体流尽时间作为评价指标，记录不同参数下的泄露时间，用于评估不同参数的封堵效果。如图5所示，在不做干涉的情况下，创造破孔后，模型中的液体仅用22.8min泄露完毕，对于完整的胎膜，模型中的液体流尽用时约42753±1780分钟；而在本发明的最优参数下【GelMA浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为10％(w/v)，光引发剂浓度为0.8％(w/v)，光源波长405nm，光照时长为40s，光照强度为1200mW/cm²，光源距离待修复组织的距离是2cm】，其泄露时间为41388.71±2159分钟，与完整胎膜的封堵效果相差无几，实验结果表示，在开展胎膜封堵的约28天后，经本方法封堵的胎膜可以与新鲜完整胎膜保持相似的固液屏障能力，满足临床上一般对于胎膜早破延长3-4周孕期的要求。并且该参数优于其他参数下的封堵效果，具有显著的统计学差异，证明了该方法的可行性与有效性。见图6。

实施例9使用体内原位生物制造方法利用光敏修补材料进行大鼠肺部损伤的封堵1、配制适用于肺部损伤封堵的光敏修补材料

按照实施例1中的方法配制光敏修复材料，在针对肺部损伤修复的应用中，选用GelMA浓度为10％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为15％(w/v)，光引发剂浓度为0.8％(w/v)，溶剂为PBS磷酸溶液(作为最优参数组)。另设3组平行对照，组分参数分别为：

①GelMA浓度为6％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为20％(w/v)，光引发剂浓度为0.6％，溶剂为PBS磷酸溶液；

②GelMA浓度为20％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为8％(w/v)，光引发剂浓度为1.0％；

③GelMA浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为10％(w/v)，光引发剂浓度为0.8％。

配制好溶液后立即用0.22μm无菌针头过滤器过滤，将得到的溶液转移至15ml离心管中，利用巴氏灭菌法(烘箱70℃保温30分钟，立即转移到4℃冰箱中30分钟，重复该过程3次)对修复材料进行灭菌处理。

2、创造大鼠肺部损伤模型

选用体重200-250g的雄性大鼠作为实验动物共12只，每组3只，实验前以异氟烷气体(2.0％(v/v))作为麻醉剂对大鼠进行麻醉。诱导吸入麻醉后，将大鼠经口气管插管，并通气(频率为每分钟80次，潮气量3ml)维持麻醉状态。通过第六肋间间隙的右侧执行开胸手术，用手术刀切割产生标准的肺叶切口(长3mm，深度约5mm)，此时大鼠伤口处出现气泡及少量血液。并且由于大鼠肺部丧失密闭性，右肺呈萎缩状。

3、利用新型光敏修补材料对大鼠肺部损伤进行修补

创建肺部损伤后，停止向右肺通气，立即使用体内原位修复装置经微创切口伸入大鼠体内，在损伤处递送新型光敏修补材料，递送的同时开启蓝光照射，光源波长≤405nm，照射参数为1200mW/cm²，照射时长为30s，实现对光敏修补材料的原位固化封堵。封堵完成后，恢复通气，使用温生理盐水冲刷密封损伤的渗漏处，发现修补补丁与受损处稳固黏附，并且未发现进一步的血液渗漏，同时右肺也恢复正常饱满的形态。将大鼠培养14天，观察大鼠的生活情况，实验前9天，所有组别的大鼠均表现正常，利用红外成像仪测量不同组别的大鼠体温，未发现显著差异。第10天起，实验组①组中的大鼠出现了活动量减小，呼吸急促，且体温升高的情况，且该情况保持至第14天；第12天起，实验组②和③的大鼠表现出运动量减少，呼吸急促，但未发现体温异常，该情况同样保持至第14天。最优参数实验组中的14天培养期间，大鼠各项指标均无异常。

第14天，将所有实验组的大鼠处死，并解剖进行组织学分析。实验组①中的大鼠发现封堵水凝胶的形态变小，推测由于实验组①中GelMA浓度较低，封堵实验中的成形效果一般，在大鼠培养期间受代谢而出现的部分溶解，导致大鼠在10天后出现了封堵失效、渗血和炎症的状况。实验组②和③的组织分析显示大鼠的伤口处的水凝胶出现了部分滑移，推测由于实验组②和③选用的聚丙烯酸酯浓度较低，对湿组织的黏附性不够强，在大鼠呼吸的时候受肺部的周期性影响而产生部分脱落，导致了部分封堵失效，但未出现渗血和炎症反应。最优参数实验组中大鼠肺部损伤处无上述问题，并且组织染色结果也显示损伤出现愈合和组织再生趋势证明该工艺和材料可以对临床中实现对肺部损伤的修补，不同的参数对于该损伤的修复效果不一致，但均能维持9天以上，利用最优参数，可以实现至少14天的稳固修复，并能够促进组织再生，在临床上的肺部损伤治疗方便具有应用潜力。

实施例10使用该新型光敏修补材料原位制备心脏补片，实现离体心脏的封堵

1、配制适用于离体心脏封堵的光敏修补材料

按照实施例1中的方法配制光敏修复材料，在针对离体心脏封堵的应用中，选用GelMA浓度为20％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为16％(w/v)，光引发剂浓度为1.0％(w/v)，溶剂为PBS磷酸缓冲溶液，作为最优参数组，另设3组平行对照，溶剂均为PBS磷酸缓冲溶液，组分参数分别为：

①GelMA浓度为10％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为15％(w/v)，光引发剂浓度为0.6％；

②GelMA浓度为8％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为8％(w/v)，光引发剂浓度为1.0％；

③GelMA浓度为16％(w/v)，聚丙烯酸酯浓度为10％(w/v)，光引发剂浓度为0.8％。

配制好溶液后立即用0.22μm无菌针头过滤器过滤，将得到的溶液转移至15ml离心管中，利用巴氏灭菌法(烘箱70℃保温30分钟，立即转移到4℃冰箱中30分钟，重复该过程3次)对修复材料进行灭菌处理。

2、制备离体心脏损伤模型

选用新鲜猪心脏，在其心房处创造一长2cm的切口，将离体心脏的主动脉连接至导管，使用可编程气泵，将程序化的加压空气输入心脏模拟心跳，气体出口处使用压力变送器记录气体压力。

3、利用新型光敏修补材料对大鼠肺部损伤进行修补

利用体内原位修复装置递送上述四种光敏修补材料，在心脏表面损伤处进行原位封堵修复。由于心脏组织较厚，在心脏组织中制造水凝胶铆钉，以增强水凝胶补片与待修复组织的黏附性。利用前述的原位制造方法，选用的实验参数为：光源波长≤405nm，光照强度为1200mW/cm²，照射时长为2min，在心脏表面损伤处制备面积为3cm²的水凝胶补丁，该补丁具备4个铆钉结构，可与心脏稳固连接，并随心脏的收缩跳动实现一定程度的扩张。

封堵完成后，通过气体出口处的压力变送器读取心脏内气体压力，发现较封堵前有显著上升，证明该方法对心脏封堵的有效性。保持离体心脏在室温下连续跳动12小时，并持续记录心脏内其他压力，发现在本实验的最优参数下，水凝胶补丁可保持离体心脏在12小时跳动中保持规律性变化，且没有显著的气压下降，水凝胶补丁也始终与离体心脏表面保持良好贴附。实验组①中，水凝胶补丁在12小时的检测中于离体心脏保持良好贴附，压力检测显示其在10小时后出现了缓慢下降趋势，说明在封堵处出现了微小的封堵失效；实验组②中，水凝胶补丁的在封堵7小时后出现了脱落，推测原因是水凝胶组分中的聚丙烯酸酯浓度较低，在心脏周期性的答复运动下被撕脱，导致了封堵失效；实验组③中，水凝胶补丁在12小时后同样能够保持良好贴附，也能够在气压检测中保持稳定的变化规律，但是其气压的低压值始终略小于最优参数的低压值，推测原因为水凝胶浓度未能随心脏的运动做适当的伸展，在心脏舒张时，气体从边缘的封堵失效处泄露。该对照实验表明该材料和工艺可以实现对心脏损伤的有效、可靠的封堵，通过选用最优的参数，可以让有效封堵时间达到12小时以上，同时也证实了该材料具有进一步应用于临床，作为心脏补片治疗心肌梗死等临床疾病的潜力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种体内原位生物制造的医疗设备，包括光敏修补材料输送装置，所述输送装置经人体自然腔道或微创进入人体并开展原位生物制造；所述光敏修补材料含光引发剂、甲基丙烯酸化明胶GelMA和聚丙烯酸。

2.根据权利要求1所述的医疗设备，其特征在于，所述体内原位包括体内深层组织器官，优选消化道，胎膜，颅底腔膜，子宫壁，膀胱壁，肺，心脏。

3.一种用于体内原位生物制造的水凝胶，其特征在于，将光引发剂、甲基丙烯酸化明胶GelMA，聚丙烯酸酯加入PBS磷酸缓冲液中得到；所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在水凝胶中的终浓度为5％-20％(w/v)，聚丙烯酸酯在水凝胶中的终浓度为5％-30％(w/v)，光引发剂在水凝胶中的终浓度为0.5％-1％(w/v)。

4.一种用于体内原位组织修复的医疗设备，其特征在于，包括光敏修补材料递送装置，所述光敏修补材料递送装置配置有：光敏修补材料承载模块、控制承载模块递送和进行原位修复的操作模块、控制光源的操作模块、和光源；所述光敏修补材料为权利要求3所述的水凝胶。

5.根据权利要求4所述的医疗设备，其特征在于，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为15％-20％(w/v)；所述光引发剂为蓝光引发剂LAP，其在光敏修补材料中的浓度为0.6％-0.9％(w/v)；所述聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的浓度限定为8％-12％(w/v)。

6.根据权利要求5所述的医疗设备，其特征在于，所述医疗设备在应用于肺部损伤修复时，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为10％(w/v)，所述聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的浓度限定为15％(w/v)，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP，其在光敏修补材料中的浓度为0.8％(w/v)；或

所述医疗设备在应用于胎膜早破修复时，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为16％(w/v)，所述聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的浓度限定为10％(w/v)，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP，其在光敏修补材料中的浓度为0.8％(w/v)；或

所述医疗设备在应用于心脏修复时，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA在光敏修补材料中的终浓度为20％(w/v)，所述聚丙烯酸酯在光敏修补材料中的浓度限定为16％(w/v)，所述光引发剂为蓝光引发剂LAP，其在光敏修补材料中的浓度为1％(w/v)。

7.根据权利要求4-6任一所述的医疗设备，其特征在于，所述医疗设备在应用时，控制光源的条件为：光源波长≤405nm，光照时长为0.5-3min，光照强度为1100-1300mW/cm²；

所述医疗设备在应用于胎膜早破修复时，控制光源的条件为：光源波长≤405nm，光照时长为0.5-1min，光照强度为1150-1250mW/cm²；优选光照时长为40s，光照强度为1200mW/cm²。

8.根据权利要求7所述的医疗设备，其特征在于，光源距离待修复组织的距离是1.6-2.5cm，优选2cm。

9.根据权利要求4-8任一所述的医疗设备，其特征在于，所述控制承载模块递送和进行原位修复的操作模块，通过操控所述光敏修补材料承载模块，将光敏修补材料以铆钉形式固定并均匀覆盖在体内破损孔的表面，覆盖面积数倍大于破孔面积，进行体内原位修复。

10.甲基丙烯酸化明胶GelMA，聚丙烯酸酯和光引发剂组合在制备用于体内组织器官损伤修复材料，或在制备体内原位修复的医疗设备中的应用，所述甲基丙烯酸化明胶GelMA作为光敏成形的主要成分，实现修补材料在体内待修复区域固化成形成特定形状；所述聚丙烯酸酯作为增强修补材料与修复组织粘附性的主要成分，通过与待修复组织形成共价键，实现与待修复组织的稳固贴附；所述甲基丙烯酸化明胶GelMA的终浓度为5％-20％(w/v)，聚丙烯酸酯终浓度为5％-30％(w/v)，蓝光引发剂LAP的终浓度为0.5％-1％(w/v)。

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