CN112206357A - 组织工程皮肤生物墨水及制备方法、再生方法及系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种组织工程皮肤生物墨水及制备方法、组织工程皮肤再生方法及系统，其中，组织工程皮肤再生系统包括三维扫描仪子系统、双目视觉识别子系统、上位机、皮肤修复3D打印子系统，三维扫描仪子系统及双目视觉识别子系统用于对作为待修复区的皮肤伤口缺损部位进行扫描及识别以获取待修复区域的点云数据和位置信息，上位机根据点云数据和位置信息构建出待修复区域的皮肤形貌特征，并根据形貌特征规划出打印路径，皮肤修复3D打印子系统用于根据打印路径将生物墨水打印在待修复区域处。采用本发明技术，修复后的皮肤接近天然皮肤。

Description

组织工程皮肤生物墨水及制备方法、再生方法及系统
技术领域
本发明涉及组织工程皮肤技术领域，尤其是涉及一种组织工程皮肤生物墨水及制备方法、再生方法及系统。
背景技术
皮肤是人体最大、最复杂的器官，也是人体抵御外界损伤的第一道屏障。当意外损伤或疾病等因素造成皮肤大面积缺损时，会引起体液流失，水电解质紊乱、低蛋白血症以及严重感染等，而皮肤移植时解决这一问题的关键。我国人口众多，每年烧伤患者达到1500万人，其中需要进行皮肤移植的病例大约为350万人，皮肤需求量在4亿平方厘米以上。由于自体与异体皮肤来源和应用在某些情况下受到限制，寻找一种理想的皮肤替代物一直是临床上一个亟需解决的难题。皮肤组织工程是一门新兴学科，它利用生物学和工程学的原理，构建出用于修复、维持和改善损伤组织功能的皮肤替代物——组织工程皮肤。
现有的利用组织工程皮肤治疗皮肤缺损的方法为：
1、选取构建组织工程皮肤需要的种子细胞及支架材料。
2、在体外构建出组织工程支架，并将种子细胞种植于支架表面。
3、在体外培养接种细胞的组织工程支架约14天至组织工程皮肤具有一定皮肤活性和功能。
4、将组织工程皮肤移植至患者皮肤缺损部位，治疗皮肤缺损。
然而，上述利用组织工程皮肤治疗皮肤缺损的方法仍有待改进：
1、理想的种子细胞应具有以下特点：①具有高增殖能力和多种分化潜能；②获取容易，对取材者损伤小；③获取的种子细胞能够在体外大量增殖等。
目前用于构建组织工程皮肤的种子细胞有人表皮干细胞、真皮成纤维细胞等。表皮干细胞为皮肤的组织特异性干细胞，在胎儿期主要集中于初级表皮嵴，至成人时呈片状分布在表皮基底层，并且随年龄增大，干细胞数量减少，且单纯利用表皮干细胞作为种子细胞存在培养周期长、创面愈合后瘢痕严重的问题，不能达到功能康复。真皮成纤维细胞作为真皮中重要的细胞组成部分，可分泌多种细胞因子，如角质形成细胞生长因子、类胰岛素生长因子等，对表皮细胞的生长、迁移和分化均有促进作用，有助于创面的愈合，但对皮肤创伤的修复效果有限。
2、体外构建出的组织工程支架需要与伤口的尺寸贴合，才能将工程皮肤修复创口的效果达到最好。尺寸的贴合存在两个方面：①组织支架和伤口的形貌及面积贴合；②组织支架的厚度与伤口的深度贴合。
目前利用组织工程支架构建人工皮肤的过程，往往是估测皮肤缺损的深度，并在体外培养大于伤口面积的形状规则的人工皮肤，再将皮肤裁剪至合适的形状移植至所需部位。一方面利用人眼观测得到的伤口三维形貌并不准确，若无法在深度方向模拟皮肤的真实解剖结构，如本应在真皮层缺损的部位填上了表皮层的人工皮肤，将不利于对皮肤创伤的修复；另一方面对培育后皮肤的裁剪将一定程度的浪费。
3、体外构建的人工皮肤需要在厚度方向上模拟人皮肤的解剖结构，如不同的层包含不同的细胞。但传统方式构建组织工程人工皮肤中，是先制备组织工程支架，再将种子细胞接种在其上面，利用扩散原理使种子细胞弥散在组织工程支架中。接种种子细胞往往是单方向接种，势必将使种子细胞在组织工程支架中具有浓度差，这种不规则的浓度差不利于人工皮肤对真实皮肤的模拟。另一方面，接种种子细胞无法使细胞在支架中具有可支配的空间位置，如无法保证真皮层细胞处于组织支架的底部，而表皮层细胞处于组织支架的顶部，并具有不同的厚度，这样也不利于对真实皮肤的模拟和重建。
4、体外进行人工皮肤组织培养需要在体外创建供细胞增殖分化的微环境，但目前对微环境的研究依然不透彻，对微环境的模拟不够完善，使得培养出的组织工程皮肤在培养后较难达到真实皮肤的状态。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种组织工程皮肤生物墨水的制备方法，制得的生物墨水用于皮肤损伤创面修复，皮肤结构再生的效果更好。
根据本发明第一方面实施例的组织工程皮肤生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
S1：从小鼠或者人体上取出皮肤，从取出的皮肤中分离出表皮细胞和真皮细胞；
S2：将分离出的表皮细胞和真皮细胞分别进行培养，以分别获得表皮干细胞和真皮干细胞；
S3：分别收集培养好的表皮干细胞和真皮干细胞；
S4：将收集好的表皮干细胞和真皮干细胞分别加入作为组织支架的水凝胶，然后混合均匀，从而制得所述生物墨水。
根据本发明第一方面实施例的组织工程皮肤生物墨水的制备方法，通过从皮肤中分离出表皮细胞和真皮细胞，再将分离出的表皮细胞和真皮细胞分别培养，并分别获得表皮干细胞和真皮干细胞，最后将表皮干细胞、真皮干细胞和水凝胶混合均匀，制得生物墨水。该制备方法选用了表皮干细胞和真皮干细胞的混合物作为种子细胞，这两种细胞同时均匀分布于水凝胶中，能够更好地模拟皮肤的真实结构，相比于传统的组织工程皮肤，在可再生毛囊、皮脂腺方面更接近天然皮肤，用于皮肤损伤创面修复、皮肤结构再生的效果更好，能够更有效恢复皮肤的功能。水凝胶作为组织支架材料，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖；水凝胶及其代谢产物具有良好的生物相容性，同时具有良好的力学性能，可以模拟真实的组织微环境。
根据本发明第一方面的一个实施例，在所述步骤S1中，在所述从小鼠或者人体上取出皮肤之前，对待取皮肤的部位进行消毒。
根据本发明第一方面的一个实施例，在所述步骤S1中，所述从取出的皮肤中分离出表皮细胞和真皮细胞的具体过程为：将取出的皮肤剪成小块皮肤，用蛋白分散酶将表皮和真皮分开；将分离出的表皮和真皮分别切碎，并将切碎的表皮和真皮分别用胶原酶消化后，再分别过40μm的细胞筛，以分别获得表皮细胞和真皮细胞。
根据本发明第一方面进一步的实施例，在所述步骤S1之后且所述步骤S2之前，还包括如下步骤：分别离心收集细胞筛下的表皮细胞和真皮细胞，并分别用标准细胞培养基洗表皮细胞和真皮细胞各一次，并分别用细胞计数板进行表皮细胞和真皮细胞计数。
根据本发明第一方面再进一步的实施例，在所述步骤S2中，将分离出的表皮细胞进行培养以获得表皮干细胞的具体过程为：将分离出的表皮细胞用表皮角质细胞培养基进行贴壁培养，在培养箱中培养后除去非贴壁细胞，从而获得表皮干细胞。
根据本发明第一方面再进一步的实施例，在所述步骤S2中，将分离出的真皮细胞分别进行培养以获得真皮干细胞的具体过程为：将分离的真皮细胞种于表面未处理的细胞培养皿中，并向细胞培养皿中加入含B-27的标准细胞培养基、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子，然后将细胞培养皿放在培养箱中悬浮培养。
根据本发明第一方面再进一步的实施例，在所述步骤3中，所述分别收集培养好的表皮干细胞和真皮干细胞的具体过程为：将表皮干细胞与真皮干细胞分离培养好后重悬于磷酸缓冲盐溶液中，分别离心收集表皮干细胞和真皮干细胞。
根据本发明第一方面的一些实施例，所述水凝胶为I型胶原或基质胶。
本发明还提出了一种组织工程皮肤生物墨水。
根据本发明第二方面实施例的组织工程皮肤生物墨水，所述生物墨水为表皮干细胞、真皮干细胞和水凝胶的混合物。
根据本发明第二方面实施例的组装工程皮肤生物墨水，选用表皮干细胞和真皮干细胞的混合物作为种子细胞，这两种细胞同时均匀分布于水凝胶中，能够更好地模拟皮肤的真实结构，相比于传统的组织工程皮肤，在可再生毛囊、皮脂腺方面更接近天然皮肤，用于皮肤损伤创面修复、皮肤结构再生的效果更好，能够更有效恢复皮肤的功能。水凝胶作为组织支架材料，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖；水凝胶及其代谢产物具有良好的生物相容性，同时具有良好的力学性能，可以模拟真实的组织微环境。
根据本发明第二方面的一些实施例，所述生物墨水为采用根据本发明第一方面任意一项实施例的制备方法制得。
本发明还提出了一种组织工程皮肤再生方法。
根据本发明第三方面实施例的组织工程皮肤再生方法，将根据本发明第二方面任意一项实施例的所述生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位，在皮肤伤口缺损部位处进行原位直接修复，并利用皮肤伤口缺损部位处自身的微环境对组织工程皮肤进行培养。
根据本发明第三方面实施例的组织工程皮肤再生方法，使用的生物墨水中同时存在表皮干细胞和真皮干细胞，即选用了表皮干细胞与真皮干细胞的混合物作为种子细胞，这两种细胞能够更好地模拟皮肤的真实结构，相比于传统的组织工程皮肤，在可再生毛囊、皮脂腺方面更接近天然皮肤，用于皮肤损伤创面修复、皮肤结构再生的效果更好，能够更有效恢复皮肤的功能。使用的生物墨水选用了水凝胶，水凝胶作为组织支架材料，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖；水凝胶及其代谢产物具有良好的生物相容性，同时具有良好的力学性能，可以模拟真实的组织微环境。水凝胶可以选用I型胶原、Matrigel基质胶或Geltrex基质胶等，这些水凝胶生物相容性非常好，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖，且具有良好的力学性能、易成型的生物材料。通过将生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位，在皮肤伤口处进行原位直接修复，并利用皮肤伤口缺损部位处自身的微环境对组织工程皮肤进行培养，由此，组织皮肤直接作用在伤口上，能够在尽可能短的时间内完成对伤口的初步修复，有效减小瘢痕的出现；皮肤组织直接作用在伤口上，也能够减小组织工程皮肤在培育过程中以及培育后的移植过程中可能出现的破损、染菌等风险。最重要的，在皮肤缺损处借助自身的微环境进行组织培养，将有助于克服对微环境了解的不足，更好地进行组织工程皮肤的培育。
根据本发明第三方面的一些实施例，将根据本发明第二方面任意一项实施例的所述生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位的具体步骤包括：
将皮肤伤口缺损部位作为待修复区域，获取待修复区域的点云数据及位置信息，根据所述点云数据及所述位置信息构建出所述待修复区域的皮肤形貌特征；
根据所述皮肤形貌特征规划出打印路径；
按照所述打印路径将所述生物墨水直接打印在所述待修复区域处。本发明还提出了一种组织工程皮肤再生系统。
根据本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统，包括：
三维扫描仪子系统，所述三维扫描仪子系统用于对作为待修复区的皮肤伤口缺损部位进行扫描以获取所述待修复区域的点云数据；
双目视觉识别子系统，用于对所述待修复区域进行识别，以获取所述待修复区域的位置信息；
上位机，所述上位机分别与所述三维扫描仪子系统和所述双目视觉识别子系统电连接，用于接收所述三维扫描仪子系统传输过来的所述点云数据和所述双目视觉识别子系统传输过来的所述位置信息，利用CAD软件构建出待修复区域的皮肤形貌特征，并根据所述形貌特征规划出打印路径；
皮肤修复3D打印子系统，所述皮肤修复3D打印子系统与所述上位机电连接，用于根据所述打印路径将本发明第二方面任意一项实施例的所述生物墨水打印在所述待修复区域处。
根据本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统，可以实现对皮肤伤口缺损部位的实时快速扫描、定位、识别以及修复。通过将生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位，在皮肤伤口处进行原位直接修复，并利用皮肤伤口缺损部位处自身的微环境对组织工程皮肤进行培养，由此，组织皮肤直接作用在伤口上，能够在尽可能短的时间内完成对伤口的初步修复，有效减小瘢痕的出现；皮肤组织直接作用在伤口上，也能够减小组织工程皮肤在培育过程中以及培育后的移植过程中可能出现的破损、染菌等风险。最重要的，在皮肤缺损处借助自身的微环境进行组织培养，将有助于克服对微环境了解的不足，更好地进行组织工程皮肤的培育。可以将生物墨水精准且均匀地打印在待修复区域处，有利于修复后的皮肤接近天然皮肤。
根据本发明第四方面的一些实施例，所述三维扫描仪子系统包括扫描仪支架和支撑在所述扫描仪支架上的扫描仪本体，所述扫描仪本体上设置有两个激光探头和位于两个所述激光探头之间的一个光学探头。
根据本发明第四方面的一些实施例，所述双目视觉识别子系统包括摄像头支架、摄像头安装架、两个识别摄像头和两个基线，其中，所述摄像头安装架安装在所述摄像头支架上，两个所述识别摄像头安装在所述摄像头安装架上，两个所述摄像头分别通过两个基线与所述上位机相连。
根据本发明第四方面的一些实施例，两个所述识别摄像头之间的间距可调节。
根据本发明第四方面的一些实施例，所述皮肤修复3D打印子系统包括控制器、六轴机械臂和直写装置，所述控制器与所述上位机电连接，所述控制器位于所述六轴机械臂的底座内，所述直写装置安装在所述六轴机械臂的末端，所述直写装置与所述控制器相互通讯；其中，所述上位机通过CAD-CAM-CNC的数据链模块将所述打印路径转化为所述六轴机械臂的真实工作路径，所述真实工作路径为所述控制器可识别代码，所述控制器用于接收所述可识别代码并根据所述可识别代码控制所述六轴机械臂的动作，同时用于控制所述直写装置在所述待修复区域的工作表面上进行打印。
真实工作路径真实工作路径根据本发明第四方面的一些实施例，所述直写装置包括：注射器底座、步进电机、丝杆、滑台和注射器；其中，所述注射器底座固定在所述六轴机械臂的末端上；所述步进电机固定在所述注射器底座上，所述丝杠的两端可转动地支撑在所述注射器底座上，所述丝杆的一端与所述步进电机相连，以使所述步进电机驱动所述丝杠正反向旋动；所述滑台设置在所述丝杠上，以使所述丝杆通过正反向旋转带动所述滑块沿所述丝杠往复移动；所述注射器包括料筒、喷头和注射泵，所述喷头安装在所述料筒的一端，所述注射泵的一端从所述料筒的另一端伸入所述料筒内，所述注射泵的另一端固定与所述滑台固定，所述料筒固定在所述注射器底座上。
根据本发明第四方面的一些实施例，所述直写装置还包括压板，所述压板压住所述料筒并与所述注射器底座固定，从而将所述料筒固定在所述注射器底座上。
根据本发明第四方面的一些实施例，还包修复平台，所述修复平台用于支撑皮肤待修复的小鼠或者人体。
根据本发明第四方面的一些实施例，还包括温控装置，所述温控装置设置在所述修复平台内。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统的示意图。
图2为本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统的三维扫描仪子系统的示意图。
图3为本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统的双目视觉识别子系统的摄像头安装架示意图。
图4为本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统的皮肤修复3D打印子系统的示意图。
图5为本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统的皮肤修复3D打印子系统的直写装置示意图。
图6为本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统的修复平台的剖面示意图。
图7为本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统的皮肤修复前处理的流程图。
图8为裸鼠实验的修复皮肤伤口的效果图。
图9为裸鼠实验的修复皮肤伤口的皮肤组织免疫荧光染色图。
附图标记：
组织工程皮肤再生系统1000
三维扫描仪子系统1
扫描仪支架11 扫描仪本体12 激光探头121 光学探头122
双目视觉识别子系统2
摄像头支架21 摄像头安装架22 安装板221 滑块222
识别摄像头23 基线24
皮肤修复3D 打印子系统3
控制器31 六轴机械臂32 直写装置33 注射器底座331
步进电机332 丝杆333 滑台334 注射器335 料筒3351 喷头3352 注射泵3353
压板336
修复平台4
温控装置5
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面描述本发明实施例的组织工程皮肤生物墨水及制备方法、组织工程皮肤再生方法及系统。
根据本发明第一方面实施例的组织工程皮肤生物墨水的制备方法，包括如下步骤：
S1：从小鼠或者人体上取出皮肤，从取出的皮肤中分离出表皮细胞和真皮细胞；
S2：将分离出的表皮细胞和真皮细胞分别进行培养，以分别获得表皮干细胞和真皮干细胞；
S3：分别收集培养好的表皮干细胞和真皮干细胞；
S4：将收集好的表皮干细胞和真皮干细胞分别加入作为组织支架的水凝胶，然后混合均匀，从而制得生物墨水。
根据本发明第一方面实施例的组织工程皮肤生物墨水的制备方法，通过从皮肤中分离出表皮细胞和真皮细胞，再将分离出的表皮细胞和真皮细胞分别培养，并分别获得表皮干细胞和真皮干细胞，最后将表皮干细胞、真皮干细胞和水凝胶混合均匀，制得生物墨水。该制备方法选用了表皮干细胞和真皮干细胞的混合物作为种子细胞，这两种细胞同时均匀分布于水凝胶中，能够更好地模拟皮肤的真实结构，相比于传统的组织工程皮肤，在可再生毛囊、皮脂腺方面更接近天然皮肤，用于皮肤损伤创面修复、皮肤结构再生的效果更好，能够更有效恢复皮肤的功能。水凝胶作为组织支架材料，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖；水凝胶及其代谢产物具有良好的生物相容性，同时具有良好的力学性能，可以模拟真实的组织微环境。
根据本发明第一方面的一个实施例，在步骤S1中，在从小鼠或者人体上取出皮肤之前，对待取皮肤的部位进行消毒，例如在待取皮肤的部位擦拭碘酒和酒精进行消毒去菌。
根据本发明第一方面的一个实施例，在步骤S1中，从取出的皮肤中分离出表皮细胞和真皮细胞的具体过程为：将取出的皮肤剪成小块皮肤，用蛋白分散酶(dispase II)将表皮和真皮分开；用无菌剪刀将分离出的表皮和真皮分别切碎，并将切碎的表皮和真皮分别用胶原酶(Collagenase I)消化后，再分别过40μm的细胞筛，以分别获得表皮细胞和真皮细。可以理解的是，分别通过细胞筛分离出的表皮细胞和真皮细胞中不包含组织支架材料。
根据本发明第一方面进一步的实施例，在步骤S1之后且步骤S2之前，还包括如下步骤：分别离心收集细胞筛下的表皮细胞和真皮细胞，并分别用标准细胞培养基洗表皮细胞和真皮细胞各一次，并分别用细胞计数板进行表皮细胞和真皮细胞计数。这样，可以方便表皮干细胞和真皮干细胞后续混合可以按照一定比例混合。
根据本发明第一方面再进一步的实施例，在步骤S2中，将分离出的表皮细胞进行培养以获得表皮干细胞的具体过程为：将分离出的表皮细胞用表皮角质细胞培养基(例如CNT-07或者Keratinocyte-SFM培养基)进行贴壁培养，在培养箱中培养后除去非贴壁细胞，贴壁的细胞即为表皮干细胞，由此获得了表皮干细胞。
根据本发明第一方面再进一步的实施例，在步骤S2中，将分离出的真皮细胞分别进行培养以获得真皮干细胞的具体过程为：将分离的真皮细胞种于表面未处理的细胞培养皿中，并向细胞培养皿中加入含B-27培养基添加剂的标准细胞培养基、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(bFGF)，然后将细胞培养皿放在培养箱中悬浮培养。可以理解的是，在标准细胞培养基中加入B-27培养基添加剂，有助于真皮干细胞的长期培养；表皮生长因子是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽，广泛存在于体液中，在标准细胞培养基中添加表皮生长因子和成纤维细胞生长因子，可以促进真皮细胞的增殖，促进新血管的生成，修复损害的真皮细胞。
根据本发明第一方面再进一步的实施例，在步骤3中，分别收集培养好的表皮干细胞和真皮干细胞的具体过程为：将表皮干细胞和真皮干细胞分离培养好后重悬于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，分别离心收集表皮干细胞和真皮干细胞。可以理解的是，将培养好后的表皮干细胞和真皮干细胞分别悬浮于磷酸缓冲盐溶液中，可以较好地保护表皮干细胞和真皮干细胞，为收集表皮干细胞和真皮干细胞作好准备；然后再分别离心，使得表皮干细胞和真皮干细胞沉淀，弃上清，即可分别收集好表皮干细胞和真皮干细胞。
根据本发明第一方面的一些实施例，水凝胶为I型胶原、Geltrex基质胶或Matrigel基质胶。可以理解的是，I型胶原、Geltrex基质胶及Matrigel基质胶这些都是生物相容性非常好，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖，且具有良好的力学性能、易成型的生物材料。
本发明还提出了一种组织工程皮肤生物墨水。
根据本发明第二方面实施例的组织工程皮肤生物墨水，该生物墨水为表皮干细胞、真皮干细胞和水凝胶的混合物。
根据本发明第二方面实施例的组装工程皮肤生物墨水，选用表皮干细胞和真皮干细胞的混合物作为种子细胞，这两种细胞同时均匀分布于水凝胶中，能够更好地模拟皮肤的真实结构，相比于传统的组织工程皮肤，在可再生毛囊、皮脂腺方面更接近天然皮肤，用于皮肤损伤创面修复、皮肤结构再生的效果更好，能够更有效恢复皮肤的功能。水凝胶作为组织支架材料，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖；水凝胶及其代谢产物具有良好的生物相容性，同时具有良好的力学性能，可以模拟真实的组织微环境。
根据本发明第二方面的一些实施例，该生物墨水可以采用根据本发明第一方面任意一项实施例的制备方法制得。
本发明还提出了一种组织工程皮肤再生方法。
根据本发明第三方面实施例的组织工程皮肤再生方法，将根据本发明第二方面任意一项实施例的生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位，在皮肤伤口缺损部位处进行原位直接修复，并利用皮肤伤口缺损部位处自身的微环境对组织工程皮肤进行培养。
根据本发明第三方面实施例的组织工程皮肤再生方法，使用的生物墨水中同时存在表皮干细胞和真皮干细胞，即选用了表皮干细胞与真皮干细胞的混合物作为种子细胞，这两种细胞能够更好地模拟皮肤的真实结构，相比于传统的组织工程皮肤，在可再生毛囊、皮脂腺方面更接近天然皮肤，用于皮肤损伤创面修复、皮肤结构再生的效果更好，能够更有效恢复皮肤的功能。使用的生物墨水选用了水凝胶，水凝胶作为组织支架材料，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖；水凝胶及其代谢产物具有良好的生物相容性，同时具有良好的力学性能，可以模拟真实的组织微环境。水凝胶可以选用I型胶原、Matrigel基质胶或Geltrex基质胶等，这些水凝胶生物相容性非常好，可以提供细胞附着位点，供细胞增殖，且具有良好的力学性能、易成型的生物材料。通过将生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位，在皮肤伤口处进行原位直接修复，并利用皮肤伤口缺损部位处自身的微环境对组织工程皮肤进行培养，由此，组织皮肤直接作用在伤口上，能够在尽可能短的时间内完成对伤口的初步修复，有效减小瘢痕的出现；皮肤组织直接作用在伤口上，也能够减小组织工程皮肤在培育过程中以及培育后的移植过程中可能出现的破损、染菌等风险。最重要的，在皮肤缺损处借助自身的微环境进行组织培养，将有助于克服对微环境了解的不足，更好地进行组织工程皮肤的培育。
根据本发明第三方面的一些实施例，将根据本发明第二方面任意一项实施例的生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位的具体步骤包括：
将皮肤伤口缺损部位作为待修复区域，获取待修复区域的点云数据及位置信息，根据点云数据及位置信息构建出待修复区域的皮肤形貌特征；
根据皮肤形貌特征规划出打印路径；
根据打印路径将生物墨水直接打印在待修复区域处。
可以理解的是，通过上述步骤，可以将生物墨水精准且均匀地打印在待修复区域处，使得修复后的皮肤接近天然皮肤。
如图1-6所示，本发明还提出了一种组织工程皮肤再生系统1000。
如图1所示，根据本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统1000，包括：
三维扫描仪子系统1，三维扫描仪子系统1用于对作为待修复区的皮肤伤口缺损部位进行扫描以获取待修复区域的点云数据；
双目视觉识别子系统2，用于对待修复区域进行识别，以获取待修复区域的位置信息；
上位机(图中未示出)，上位机分别与三维扫描仪子系统1和双目视觉识别子系统2电连接，用于接收三维扫描仪子系统1传输过来的点云数据和双目视觉识别子系统2传输过来的位置信息，利用CAD软件构建出待修复区域的皮肤形貌特征，并根据形貌特征规划出打印路径；
皮肤修复3D打印子系统3，皮肤修复3D打印子系统3与上位机电连接，用于根据打印路径将本发明第二方面任意一项实施例的生物墨水打印在待修复区域处。
根据本发明第四方面实施例的组织工程皮肤再生系统1000，可以实现对皮肤伤口缺损部位的实时快速扫描、定位、识别以及修复。通过将生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位，在皮肤伤口处进行原位直接修复，并利用皮肤伤口缺损部位处自身的微环境对组织工程皮肤进行培养，由此，组织皮肤直接作用在伤口上，能够在尽可能短的时间内完成对伤口的初步修复，有效减小瘢痕的出现；皮肤组织直接作用在伤口上，也能够减小组织工程皮肤在培育过程中以及培育后的移植过程中可能出现的破损、染菌等风险。最重要的，在皮肤缺损处借助自身的微环境进行组织培养，将有助于克服对微环境了解的不足，更好地进行组织工程皮肤的培育。可以将生物墨水精准且均匀地打印在待修复区域处，有利于修复后的皮肤接近天然皮肤。
如图1和图2所示，根据本发明第四方面的一些实施例，三维扫描仪子系统1包括扫描仪支架11和支撑在扫描仪支架11上的扫描仪本体12，扫描仪本体12上设置有两个激光探头121和位于两个激光探头121之间的一个光学探头122。可以理解的是，支架主要起对扫描仪本体12进行支撑的作用；扫描仪本体12上设置两个激光探头121和一个光学探头122，可以实现快速精准扫描，并将点云数据传输给上位机。
如图1和图3所示，根据本发明第四方面的一些实施例，双目视觉识别子系统2包括摄像头支架21、摄像头安装架22、两个识别摄像头23和两个基线24，其中，摄像头安装架22安装在摄像头支架21上，两个识别摄像头23安装在摄像头安装架22上，两个摄像头分别通过两个基线24与上位机相连。可以理解的是，摄像头支架21主要起对安装有识别摄像头23的摄像头安装架22起支撑作用；摄像头安装架22一方便用于安装两个识别摄像头23，另一方面与摄像头支架21相连；两个识别摄像头23安装在摄像头安装架22上，可以精准地识别待修复区域的位置信息，并通过基线24将识别信息实时传输给上位机。
根据本发明第四方面的一些实施例，两个识别摄像头23之间的间距可调节。可以理解的是，通过调节两个识别摄像头23之间的间距，有利于提高识别精度。例如，摄像头安装架22的安装板221上设有导槽，两个滑块222与安装板221上的导槽滑动配合，两个识别摄像头23分别对应地安装在两个滑块222上，这样，就可以实现两个识别摄像头23之间的距离调节。
如图1、图4和图5所示，根据本发明第四方面的一些实施例，皮肤修复3D打印子系统3包括控制器31、六轴机械臂32和直写装置33，控制器31与上位机电连接，控制器31位于六轴机械臂32的底座内，直写装置33安装在六轴机械臂32的末端，直写装置33与控制器31相互通讯；其中，上位机通过CAD-CAM-CNC的数据链模块将打印路径转化为六轴机械臂32的真实工作路径，真实工作路径为控制器31可识别代码，控制器31用于接收可识别代码并根据可识别代码控制六轴机械臂32的动作，同时用于控制直写装置33在待修复区域的工作表面上进行打印。由此，可以实现精准均匀打印。
需要说明的是，为达到皮肤修复3D打印子系统3便携化，高精度的要求，选用控制器31为DENSO公司的RC7M标准型六轴机械臂32作为打印系统的主体，该六轴机械臂32的基本参数如下：六轴机械臂32的最大运动半径为430mm，位移重复精度为±20μm，位姿重复精度为0.1mm。在六轴机械臂32的关节处安装传感器以进行对末端位移的闭环控制，达到高精度的3D打印。
如图5所示，根据本发明第四方面的一些实施例，直写装置33包括注射器底座331、步进电机332、丝杆333、滑台334和注射器335；其中，注射器底座331固定在六轴机械臂32的末端上；步进电机332固定在注射器底座331上，丝杠的两端可转动地支撑在注射器底座331上，丝杆333的一端与步进电机332相连，以使步进电机332驱动丝杠正反向旋动；滑台334设置在丝杠上，以使丝杆333通过正反向旋转带动滑块22沿丝杠往复移动；注射器335包括料筒3351、喷头3352和注射泵3353，喷头3352安装在料筒3351的一端，注射泵3353的一端从料筒3351的另一端伸入料筒3351内，注射泵3353的另一端固定与滑台334固定，料筒3351可拆卸地固定在注射器底座331上。可以理解的是，注射器底座331主要用于安装和支撑步进电机332、丝杆333、注射器335等功能部；步进电机332可与控制器31电连接，通过控制器31控制步进电机332，步进电机332控制和驱动丝杆333旋转；滑台334设置在丝杠上，以使丝杆333通过正反向旋转带动滑块22沿丝杠往复移动，注射器335的料筒3351可拆卸地安装在注射器底座331上，可以方便注射器335的安装和拆卸，注射器335的料筒3351可以盛放生物墨水，通过滑块22驱动注射泵3353，以使生物墨水从喷头3352喷出，从而实现3D打印功能。这里，需要特别说明的是，采用丝杆333螺旋式挤出作为进给系统，可以防止生物墨水喷出时较高的剪切力对打印细胞造成的损伤。直写装置33工作时，料筒3351中的生物墨水在注射泵3353的推动下从喷嘴中挤出，通过调整挤出速度，机械臂运动速度以及喷嘴直径，测试选取成型效果好，细胞成活率高的参数作为皮肤修复时的真实参数。由于选用的生物墨水能够在高于4℃的环境中成胶，直写装置33中无需额外的温控装置5，该皮肤修复过程能够在室温中正常进行。
如图5所示，根据本发明第四方面的一些实施例，直写装置33还包括压板336，压板336压住料筒3351并与注射器底座331固定，从而将料筒3351固定在注射器底座331上。由此，可以对料筒3351进行可靠地固定，且安装拆卸也方便。
如图1和图6所示，根据本发明第四方面的一些实施例，还包修复平台4，修复平台4用于支撑皮肤待修复的小鼠或者人体，由此，可以方便手术的进行。
如图6所示，根据本发明第四方面的一些实施例，还包括温控装置5，温控装置5设置在修复平台4内。由此，可以方便地保持小鼠或者人体的体温。
下面介绍一下有关本发明在裸鼠上开展组织工程皮肤修复创伤的实验。
1、生物墨水的制备，如下：
(1)表皮干细胞的提取及培养。
将生后1-3天C57新生小鼠用碘酒和酒精消毒后，剪取出背部皮肤，然后将皮肤组织剪成6-10mm2大小的小块，用蛋白分散酶(dispase II)37℃消化60-90min。用无菌镊子将表皮与真皮分开。用无菌剪刀将表皮充分切碎，用胶原酶(Collagenase I)37℃消化60min后过40μm的细胞筛。1300rpm离心5min收集细胞，用表皮角质细胞培养基(CNT-07或者Keratinocyte-SFM)进行贴壁培养，在37℃，5％CO2培养箱中培养1h后除去非贴壁细胞，贴壁的细胞即为表皮干细胞。
(2)真皮干细胞的提取及培养。
真皮干细胞的分离是用蛋白分散酶(dispase II)将真皮与表皮分开后，取真皮组织用无菌剪刀充分切碎，用胶原酶(Collagenase I)37℃消化40-60min后过40μm的细胞筛。1300rpm离心5min收集细胞，并用标准细胞培养基(DMEM/F12)洗细胞一次，用细胞计数板进行计数。将分离的真皮细胞种于10cm表面未处理的细胞培养皿中，加入10mL含B-27的标准细胞培养基(DMEM/F12)，并添加表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(bFGF)，于37℃5％CO2的培养箱中悬浮培养。
(3)表皮干细胞和真皮干细胞的收集。
将表皮干细胞与真皮干细胞分离培养好后分别重悬于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，并分别300g离心5min，取离心后的细胞，弃上清，收集下方沉淀的表皮干细胞和下方沉淀的真皮干细胞。
(4)混合。
将沉淀的表皮干细胞沉淀和沉淀的真皮干细胞及水凝胶(如50μL胶原、Geltrex基质胶或Matrigel基质胶)混合均匀(1:1体积比)。
2、皮肤伤口的建立，如下：
在4-6周裸鼠背部用打孔器制造直径不同的圆型全层伤口，直径分别为2mm、5mm、10mm。
3、组织工程皮肤修复的前处理
利用本发明的组织工程皮肤再生系统1000的激光三维扫描仪子系统1以及双目视觉识别子系统2对裸鼠背部伤口进行扫描和识别，以高精度获取待修复区域的点云数据及位置信息，通过CAD软件构建出伤口的形貌特征。对形貌特征进行细化处理，在形貌特征上规划打印区域，将打印表面的曲线轨迹通过CAD-CAM-CNC的数据链模型进行转化，获取打印机械臂的真实工作路径，路径信息以传统数控机床上的G代码表示，对于六轴机械臂而言这些代码是不可使用的，将G代码转化为六轴机械臂可识别的代码，实现六轴机械臂执行3D打印的前处理(如图7所示)。
4、3D打印原位修复
利用本发明的组织工程皮肤再生系统1000将生物墨水直接打印在裸鼠背部皮肤伤口处，在皮肤伤口上进行原位的修复。打印修复完成后，用3M膜覆盖、绑带包扎。然后在不同的时间取伤口皮肤固定染色检测伤口愈合及皮肤再生情况。
5、皮肤再生情况
图8为裸鼠实验的修复皮肤伤口的效果图，不同大小的伤口均可得到修复。A.裸鼠伤口修复后的整体图，显示伤口不仅得到了修复，还有毛囊的再生；B.裸鼠伤口修复后的皮肤正面及反面解剖图，显示修复后的皮肤不仅具有全层皮肤结果且含有血管及毛囊；C.裸鼠伤口修复后的皮肤HE染色图，显示修复后的皮肤具有表皮、真皮、皮脂腺、毛囊这些结构。
图9为裸鼠实验的修复皮肤伤口的皮肤组织免疫荧光染色图。A.CD31是血管的一个特征蛋白，CD31免疫荧光染色结果显示不同大小的裸鼠伤口通过本技术再生修复后均有血管的形成；B.通过角蛋白14的免疫荧光染色结果显示不同大小的裸鼠伤口处均再生了含表皮、真皮、毛囊、皮脂腺的全层皮肤。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (21)

1.一种组织工程皮肤生物墨水的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：从小鼠或者人体上取出皮肤，从取出的皮肤中分离出表皮细胞和真皮细胞；
S2：将分离出的表皮细胞和真皮细胞分别进行培养，以分别获得表皮干细胞和真皮干细胞；
S3：分别收集培养好的表皮干细胞和真皮干细胞；
S4：将收集好的表皮干细胞和真皮干细胞分别加入作为组织支架的水凝胶，然后混合均匀，从而制得所述生物墨水。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，在所述从小鼠或者人体上取出皮肤之前，对待取皮肤的部位进行消毒。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述从取出的皮肤中分离出表皮细胞和真皮细胞的具体过程为：将取出的皮肤剪成小块皮肤，用蛋白分散酶将表皮和真皮分开；将分离出的表皮和真皮分别切碎，并将切碎的表皮和真皮分别用胶原酶消化后，再分别过40μm的细胞筛，以分别获得表皮细胞和真皮细胞。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S1之后且所述步骤S2之前，还包括如下步骤：分别离心收集细胞筛下的表皮细胞和真皮细胞，并分别用标准细胞培养基洗表皮细胞和真皮细胞各一次，并分别用细胞计数板进行表皮细胞和真皮细胞计数。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，将分离出的表皮细胞进行培养以获得表皮干细胞细胞的具体过程为：将分离出的表皮细胞用表皮角质细胞培养基进行贴壁培养，在培养箱中培养后除去非贴壁细胞，从而获得表皮干细胞。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤S2中，将分离出的真皮细胞分别进行培养以获得真皮干细胞的具体过程为：将分离的真皮细胞种于表面未处理的细胞培养皿中，并向细胞培养皿中加入含B-27的标准细胞培养基、表皮生长因子和成纤维细胞生长因子，然后将细胞培养皿放在培养箱中悬浮培养。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，所述分别收集培养好的表皮干细胞和真皮干细胞的具体过程为：将表皮干细胞与真皮干细胞分离培养好后重悬于磷酸缓冲盐溶液中，分别离心收集表皮干细胞和真皮干细胞。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述水凝胶为I型胶原或基质胶。
9.一种组织工程皮肤生物墨水，其特征在于，所述生物墨水为表皮干细胞、真皮干细胞和水凝胶的混合物。
10.根据权利要求1所述的组织工程皮肤生物墨水，其特征在于，所述生物墨水为采用根据权利要求1-8中任意一项所述的制备方法制得。
11.一种组织工程皮肤再生方法，其特征在于，将根据权利要求9-10中任意一项所述生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位，在皮肤伤口缺损部位处进行原位直接修复，并利用皮肤伤口缺损部位处自身的微环境对组织工程皮肤进行培养。
12.根据权利要求11所述的组织工程皮肤再生方法，其特征在于，所述将根据权利要求9-10中任意一项所述生物墨水直接递送至小鼠或者人体的皮肤伤口缺损部位的具体步骤包括：
将皮肤伤口缺损部位作为待修复区域，获取待修复区域的点云数据及位置信息，根据所述点云数据及所述位置信息构建出所述待修复区域的皮肤形貌特征；
根据所述皮肤形貌特征规划出打印路径；
按照所述打印路径将所述生物墨水直接打印在所述待修复区域处。
13.一种组织工程皮肤再生系统，其特征在于，包括：
三维扫描仪子系统，所述三维扫描仪子系统用于对作为待修复区的皮肤伤口缺损部位进行扫描以获取所述待修复区域的点云数据；
双目视觉识别子系统，用于对所述待修复区域进行识别，以获取所述待修复区域的位置信息；
上位机，所述上位机分别与所述三维扫描仪子系统和所述双目视觉识别子系统电连接，用于接收所述三维扫描仪子系统传输过来的所述点云数据和所述双目视觉识别子系统传输过来的所述位置信息，利用CAD软件构建出待修复区域的皮肤形貌特征，并根据所述形貌特征规划出打印路径；
皮肤修复3D打印子系统，所述皮肤修复3D打印子系统与所述上位机电连接，用于根据所述打印路径将根据权利要求9-10中任意一项所述生物墨水打印在所述待修复区域处。
14.根据权利要求13所述的组织工程皮肤再生系统，其特征在于，所述三维扫描仪子系统包括扫描仪支架和支撑在所述扫描仪支架上的扫描仪本体，所述扫描仪本体上设置有两个激光探头和位于两个所述激光探头之间的一个光学探头。
15.根据权利要求13所述的组织工程皮肤再生系统，其特征在于，所述双目视觉识别子系统包括摄像头支架、摄像头安装架、两个识别摄像头和两个基线，其中，所述摄像头安装架安装在所述摄像头支架上，两个所述识别摄像头安装在所述摄像头安装架上，两个所述摄像头分别通过两个基线与所述上位机相连。
16.根据权利要求15所述的组织工程皮肤再生系统，其特征在于，两个所述识别摄像头之间的间距可调节。
17.根据权利要求13所述的组织工程皮肤再生系统，其特征在于，所述皮肤修复3D打印子系统包括控制器、六轴机械臂和直写装置，所述控制器与所述上位机电连接，所述控制器位于所述六轴机械臂的底座内，所述直写装置安装在所述六轴机械臂的末端，所述直写装置与所述控制器相互通讯；其中，所述上位机通过CAD-CAM-CNC的数据链模块将所述打印路径转化为所述六轴机械臂的真实工作路径，所述真实工作路径为所述控制器可识别代码，所述控制器用于接收所述可识别代码并根据所述可识别代码控制所述六轴机械臂的动作，同时用于控制所述直写装置在所述待修复区域的工作表面上进行打印。
18.根据权利要求17所述的组织工程皮肤再生系统，其特征在于，所述直写装置包括：注射器底座、步进电机、丝杆、滑台和注射器；其中，所述注射器底座固定在所述六轴机械臂的末端上；所述步进电机固定在所述注射器底座上，所述丝杠的两端可转动地支撑在所述注射器底座上，所述丝杆的一端与所述步进电机相连，以使所述步进电机驱动所述丝杠正反向旋动；所述滑台设置在所述丝杠上，以使所述丝杆通过正反向旋转带动所述滑块沿所述丝杠往复移动；所述注射器包括料筒、喷头和注射泵，所述喷头安装在所述料筒的一端，所述注射泵的一端从所述料筒的另一端伸入所述料筒内，所述注射泵的另一端固定与所述滑台固定，所述料筒固定在所述注射器底座上。
19.根据权利要求18所述的组织工程皮肤再生系统，其特征在于，所述直写装置还包括压板，所述压板压住所述料筒并与所述注射器底座固定，从而将所述料筒固定在所述注射器底座上。
20.根据权利要求13所述的组织工程皮肤再生系统，其特征在于，还包修复平台，所述修复平台用于支撑皮肤待修复的小鼠或者人体。
21.根据权利要求20所述的组织工程皮肤再生系统，其特征在于，还包括温控装置，所述温控装置设置在所述修复平台内。
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