CN109312381A - 工程化皮肤等同物、其制造方法以及由其衍生的产品 - Google Patents

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英格瓦·赫尔加森
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Vetro Laboratory Co
Kings College London
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Abstract

本文公开了合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、分层结构、由其制备的产品及其制备方法。

Description

工程化皮肤等同物、其制造方法以及由其衍生的产品
交叉引用
本申请要求于2016年4月21日提交的美国临时申请号62/325,819的优先权，该临时申请通过引用以其全文并入本文。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)资助号R21 ARO61583和R01 AR051930、医学研究理事会(英国)资助号G0801061、退伍军人事务部研究服务部和营养不良大疱性表皮松解症研究协会的支持下完成的。
发明内容
本文公开了制备合成皮革的方法。在一些实施方案中，该方法可包括形成包含成纤维细胞的人造真皮层。在一些实施方案中，该方法可包括鞣制真皮层的至少一部分，从而形成合成皮革。在一些实施方案中，成纤维细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，该方法可进一步包括形成人造表皮层。在一些实施方案中，表皮层可包含角质形成细胞。在一些实施方案中，该方法可包括将表皮层置于真皮层上，从而形成分层结构。在一些实施方案中，角质形成细胞可以是哺乳动物角质形成细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，合成皮革可包含色素。在一些实施方案中，黑素细胞可以是哺乳动物黑素细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是人。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物可以是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是非哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，非哺乳动物可以是鱼、鸟或爬行动物。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对表皮层进行进一步加工。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对分层结构进行进一步加工。在一些实施方案中，真皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对真皮层进行进一步加工。在一些实施方案中，加工可选自保存、浸泡、软化、酸洗、脱酸、减薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、挤水、剃刮、铬复鞣(rechroming)、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞、增白、固定、固着(setting)、干燥、调节、碾磨、拉软(staking)、磨光、整理、上油、刷涂、垫充填料(padding)、浸渍、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、电镀、压花、熨烫、上釉、滚鞣(tumbling)及其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白可至少部分地由胶原蛋白产生细胞产生，可单独添加，或其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞，其中上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括角质形成细胞，其中角质形成细胞可包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括平滑肌细胞。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白(dermatopontin)、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合中的一种或多种。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.02mm至约5mm的范围内。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.5mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一真皮层和第二真皮层。在一些实施方案中，第一真皮层可置于第二真皮层上。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.01mm至约2mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.2mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一表皮层和第二表皮层。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含基膜替代物。在一些实施方案中，基膜替代物可以在表皮层与真皮层之间。在一些实施方案中，基膜替代物可包括干燥的非细胞羊膜。在一些实施方案中，真皮层可以在支架上形成。在一些实施方案中，支架可以是天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可包含丝。在一些实施方案中，支架可包含壳聚糖。在一些实施方案中，支架可包含天然组织粘合剂。在一些实施方案中，天然组织粘合剂可包含纤维蛋白胶。在一些实施方案中，支架可部分地包含在合成皮革中。在一些实施方案中，真皮层或表皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以用补充物培养。在一些实施方案中，补充物可包含胶原蛋白、纤维蛋白、生长因子、抗坏血酸、硫酸葡聚糖或角叉菜胶中的一种或多种。在一些实施方案中，补充物可以是天然补充物。在一些实施方案中，补充物可以是合成补充物。在一些实施方案中，诱导的多能干细胞可以通过Oct3、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc或其组合在成年体细胞中的诱导基因表达而产生。在一些实施方案中，皮革制品的至少一部分可以由本文公开的方法形成。在一些实施方案中，皮革制品可包括表带、皮带、包装、鞋、靴子、鞋袜(footwear)、手套、服装、行李箱、包、手包(clutch)、手提袋、背包、钱包、马鞍、马具、鞭子、内饰、外饰、室内装饰品、书籍装订、家具、灯具、灯罩、桌布、墙面覆盖材料、地板覆盖物、天花板覆盖物、汽车内饰、汽车外饰、船内饰、船外饰、飞机内饰、游艇内饰、游艇外饰、枕套、床单、被套、珠宝、配件、眼镜、太阳镜或消费类电子产品中的一种或多种。在一些实施方案中，皮革制品可以是表带。在一些实施方案中，皮革制品可以是皮带。在一些实施方案中，皮革制品可以是包。包含在合成皮革中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在合成皮革中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在合成皮革中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了制备合成皮革的方法。在一些实施方案中，该方法可包括将人造表皮层置于人造真皮层上，从而形成分层结构。在一些实施方案中，表皮层可包含角质形成细胞，并且真皮层可包含成纤维细胞。在一些实施方案中，该方法可包括鞣制分层结构的至少一部分，从而形成合成皮革。在一些实施方案中，成纤维细胞或角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以是哺乳动物角质形成细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，合成皮革可包含色素。在一些实施方案中，黑素细胞可以是哺乳动物黑素细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是人。在一些实施方案中，成纤维细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物可以是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是非哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，非哺乳动物可以是鱼、鸟或爬行动物。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对表皮层进行进一步加工。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对分层结构进行进一步加工。在一些实施方案中，真皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对真皮层进行进一步加工。在一些实施方案中，加工可选自保存、浸泡、软化、酸洗、脱酸、减薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、挤水、剃刮、铬复鞣、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞、增白、固定、固着、干燥、调节、碾磨、拉软、磨光、整理、上油、刷涂、垫充填料、浸渍、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、电镀、压花、熨烫、上釉、滚鞣及其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白可至少部分地由胶原蛋白产生细胞产生，可单独添加，或其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞，其中上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括角质形成细胞，其中角质形成细胞可包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括平滑肌细胞。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合中的一种或多种。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.02mm至约5mm的范围内。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.5mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一真皮层和第二真皮层。在一些实施方案中，第一真皮层可置于第二真皮层上。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.01mm至约2mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.2mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一表皮层和第二表皮层。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含基膜替代物。在一些实施方案中，基膜替代物可以在表皮层与真皮层之间。在一些实施方案中，基膜替代物可包括干燥的非细胞羊膜。在一些实施方案中，真皮层可以在支架上形成。在一些实施方案中，支架可以是天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可包含丝。在一些实施方案中，支架可包含壳聚糖。在一些实施方案中，支架可包含天然组织粘合剂。在一些实施方案中，天然组织粘合剂可包含纤维蛋白胶。在一些实施方案中，支架可部分地包含在合成皮革中。在一些实施方案中，真皮层或表皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以用补充物培养。在一些实施方案中，补充物可包含胶原蛋白、纤维蛋白、生长因子、抗坏血酸、硫酸葡聚糖或角叉菜胶中的一种或多种。在一些实施方案中，补充物可以是天然补充物。在一些实施方案中，补充物可以是合成补充物。在一些实施方案中，诱导的多能干细胞可以通过Oct3、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc或其组合在成年体细胞中的诱导基因表达而产生。在一些实施方案中，皮革制品的至少一部分可以由本文公开的方法形成。在一些实施方案中，皮革制品可包含表带、皮带、包装、鞋、靴子、鞋袜、手套、服装、行李箱、包、手包、手提袋、背包、钱包、马鞍、马具、鞭子、内饰、外饰、室内装饰品、书籍装订、家具、灯具、灯罩、桌布、墙面覆盖材料、地板覆盖物、天花板覆盖物、汽车内饰、汽车外饰、船内饰、船外饰、飞机内饰、游艇内饰、游艇外饰、枕套、床单、被套、珠宝、配件、眼镜、太阳镜或消费类电子产品中的一种或多种。在一些实施方案中，皮革制品可以是表带。在一些实施方案中，皮革制品可以是皮带。在一些实施方案中，皮革制品可以是包。包含在合成皮革中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在合成皮革中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在合成皮革中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了制备合成皮革的方法。在一些实施方案中，该方法可包括将人造表皮层置于人造真皮层上，从而形成分层结构。在一些实施方案中，表皮层可包含角质形成细胞，并且真皮层可包含成纤维细胞。在一些实施方案中，该方法可包括从分层结构中移除表皮层的至少一部分，以形成经历移除的产品。在一些实施方案中，该方法可包括鞣制移除产品的至少一部分，从而形成合成皮革。在一些实施方案中，成纤维细胞或角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以是哺乳动物角质形成细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，合成皮革可包含色素。在一些实施方案中，黑素细胞可以是哺乳动物黑素细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是人。在一些实施方案中，成纤维细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，经历移除的产品可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对移除产品进行进一步加工。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物可以是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是非哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，非哺乳动物可以是鱼、鸟或爬行动物。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对表皮层进行进一步加工。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对分层结构进行进一步加工。在一些实施方案中，真皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，可以对真皮层进行进一步加工。在一些实施方案中，加工可选自保存、浸泡、软化、酸洗、脱酸、减薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、挤水、剃刮、铬复鞣、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞、增白、固定、固着、干燥、调节、碾磨、拉软、磨光、整理、上油、刷涂、垫充填料、浸渍、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、电镀、压花、熨烫、上釉、滚鞣及其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白可至少部分地由胶原蛋白产生细胞产生，可单独添加，或其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞，其中上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括角质形成细胞，其中角质形成细胞可包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括平滑肌细胞。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合中的一种或多种。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.02mm至约5mm的范围内。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.5mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一真皮层和第二真皮层。在一些实施方案中，第一真皮层可置于第二真皮层上。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.01mm至约2mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.2mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一表皮层和第二表皮层。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含基膜替代物。在一些实施方案中，基膜替代物可以在表皮层与真皮层之间。在一些实施方案中，基膜替代物可包括干燥的非细胞羊膜。在一些实施方案中，真皮层可以在支架上形成。在一些实施方案中，支架可以是天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可包含丝。在一些实施方案中，支架可包含壳聚糖。在一些实施方案中，支架可包含天然组织粘合剂。在一些实施方案中，天然组织粘合剂可包含纤维蛋白胶。在一些实施方案中，支架可部分地包含在合成皮革中。在一些实施方案中，真皮层或表皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以用补充物培养。在一些实施方案中，补充物可包含胶原蛋白、纤维蛋白、生长因子、抗坏血酸、硫酸葡聚糖或角叉菜胶中的一种或多种。在一些实施方案中，补充物可以是天然补充物。在一些实施方案中，补充物可以是合成补充物。在一些实施方案中，诱导的多能干细胞可以通过Oct3、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc或其组合在成年体细胞中的诱导基因表达而产生。在一些实施方案中，皮革制品的至少一部分可以由本文公开的方法形成。在一些实施方案中，皮革制品可包含表带、皮带、包装、鞋、靴子、鞋袜、手套、服装、行李箱、包、手包、手提袋、背包、钱包、马鞍、马具、鞭子、内饰、外饰、室内装饰品、书籍装订、家具、灯具、灯罩、桌布、墙面覆盖材料、地板覆盖物、天花板覆盖物、汽车内饰、汽车外饰、船内饰、船外饰、飞机内饰、游艇内饰、游艇外饰、枕套、床单、被套、珠宝、配件、眼镜、太阳镜或消费类电子产品中的一种或多种。在一些实施方案中，皮革制品可以是表带。在一些实施方案中，皮革制品可以是皮带。在一些实施方案中，皮革制品可以是包。包含在合成皮革中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在合成皮革中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在合成皮革中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了鞣制的合成皮革。在一些实施方案中，在鞣制之前，鞣制的合成皮革可包含含有成纤维细胞的人造真皮层。在一些实施方案中，成纤维细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，在鞣制之前，鞣制的合成皮革可进一步包含人造表皮层。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含角质形成细胞。在一些实施方案中，表皮层可以在真皮层上，从而形成分层结构。在一些实施方案中，角质形成细胞可以是哺乳动物角质形成细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含色素。在一些实施方案中，黑素细胞可以是哺乳动物黑素细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物可以是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是非哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，非哺乳动物可以是鱼、鸟或爬行动物。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，真皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白可至少部分地由胶原蛋白产生细胞产生，可单独添加，或其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞，其中上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括角质形成细胞，其中角质形成细胞包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括平滑肌细胞。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合中的一种或多种。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.02mm至约5mm的范围内。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.5mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一真皮层和第二真皮层。在一些实施方案中，第一真皮层可以在第二真皮层上。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.01mm至约2mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.2mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一表皮层和第二表皮层。在一些实施方案中，合成皮革可包含基膜替代物。在一些实施方案中，基膜替代物可以在表皮层与真皮层之间。在一些实施方案中，基膜替代物可包括干燥的非细胞羊膜。在一些实施方案中，真皮层可以在支架上形成。在一些实施方案中，支架可以是天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可包含丝。在一些实施方案中，支架可包含壳聚糖。在一些实施方案中，支架可包含天然组织粘合剂。在一些实施方案中，天然组织粘合剂可包含纤维蛋白胶。在一些实施方案中，支架可部分地包含在鞣制的合成皮革中。在一些实施方案中，真皮层或表皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在表带、皮带、包装、鞋、靴子、鞋袜、手套、服装、行李箱、包、手包、手提袋、背包、钱包、马鞍、马具、鞭子、内饰、外饰、室内装饰品、书籍装订、家具、灯具、灯罩、桌布、墙面覆盖材料、地板覆盖物、天花板覆盖物、汽车内饰、汽车外饰、船内饰、船外饰、飞机内饰、游艇内饰、游艇外饰、枕套、床单、被套、珠宝、配件、眼镜、太阳镜或消费类电子产品中的一种或多种中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在表带中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在皮带中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在包中。包含在鞣制的合成皮革中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在鞣制的合成皮革中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在鞣制的合成皮革中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了鞣制的合成皮革。在一些实施方案中，在鞣制之前，鞣制的合成皮革可包含分层结构。在一些实施方案中，分层结构可包含人造真皮层。在一些实施方案中，真皮层可包含成纤维细胞。在一些实施方案中，分层结构可包含人造表皮层。在一些实施方案中，表皮层可包含角质形成细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞或角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，成纤维细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以是哺乳动物角质形成细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含色素。在一些实施方案中，黑素细胞可以是哺乳动物黑素细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物可以是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是非哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，非哺乳动物可以是鱼、鸟或爬行动物。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，真皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白可至少部分地由胶原蛋白产生细胞产生，可单独添加，或其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞，其中上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括角质形成细胞，其中角质形成细胞包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括平滑肌细胞。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合中的一种或多种。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.02mm至约5mm的范围内。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.5mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一真皮层和第二真皮层。在一些实施方案中，第一真皮层可以在第二真皮层上。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.01mm至约2mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.2mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一表皮层和第二表皮层。在一些实施方案中，合成皮革可包含基膜替代物。在一些实施方案中，基膜替代物可以在表皮层与真皮层之间。在一些实施方案中，基膜替代物可包括干燥的非细胞羊膜。在一些实施方案中，真皮层可以在支架上形成。在一些实施方案中，支架可以是天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可包含丝。在一些实施方案中，支架可包含壳聚糖。在一些实施方案中，支架可包含天然组织粘合剂。在一些实施方案中，天然组织粘合剂可包含纤维蛋白胶。在一些实施方案中，支架可部分地包含在鞣制的合成皮革中。在一些实施方案中，真皮层或表皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在表带、皮带、包装、鞋、靴子、鞋袜、手套、服装、行李箱、包、手包、手提袋、背包、钱包、马鞍、马具、鞭子、内饰、外饰、室内装饰品、书籍装订、家具、灯具、灯罩、桌布、墙面覆盖材料、地板覆盖物、天花板覆盖物、汽车内饰、汽车外饰、船内饰、船外饰、飞机内饰、游艇内饰、游艇外饰、枕套、床单、被套、珠宝、配件、眼镜、太阳镜或消费类电子产品中的一种或多种中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在表带中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在皮带中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在包中。包含在鞣制的合成皮革中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在鞣制的合成皮革中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在鞣制的合成皮革中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了鞣制的合成皮革。在一些实施方案中，在鞣制之前，鞣制的合成皮革可包含含有分层结构的经历移除的产品。在一些实施方案中，分层结构可包含人造真皮层。在一些实施方案中，真皮层可包含成纤维细胞。在一些实施方案中，分层结构可包含人造表皮层。在一些实施方案中，表皮层可包含角质形成细胞。在一些实施方案中，可以移除表皮层的一部分。在一些实施方案中，成纤维细胞或角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，经历移除的产品可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，成纤维细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以是哺乳动物角质形成细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含色素。在一些实施方案中，黑素细胞可以是哺乳动物黑素细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物可以是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是非哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，非哺乳动物可以是鱼、鸟或爬行动物。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，真皮层可进一步包含胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白可至少部分地由胶原蛋白产生细胞产生，可单独添加，或其任何组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括上皮细胞，其中上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括角质形成细胞，其中角质形成细胞包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，胶原蛋白产生细胞可包括平滑肌细胞。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合中的一种或多种。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.02mm至约5mm的范围内。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.5mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一真皮层和第二真皮层。在一些实施方案中，第一真皮层可以在第二真皮层上。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.01mm至约2mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.2mm的范围内。在一些实施方案中，合成皮革可进一步包含第一表皮层和第二表皮层。在一些实施方案中，合成皮革可包含基膜替代物。在一些实施方案中，基膜替代物可以在表皮层与真皮层之间。在一些实施方案中，基膜替代物可包括干燥的非细胞羊膜。在一些实施方案中，真皮层可以在支架上形成。在一些实施方案中，支架可以是天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可包含丝。在一些实施方案中，支架可包含壳聚糖。在一些实施方案中，支架可包含天然组织粘合剂。在一些实施方案中，天然组织粘合剂可包含纤维蛋白胶。在一些实施方案中，支架可部分地包含在鞣制的合成皮革中。在一些实施方案中，真皮层或表皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，真皮层可以在体外培养。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在表带、皮带、包装、鞋、靴子、鞋袜、手套、服装、行李箱、包、手包、手提袋、背包、钱包、马鞍、马具、鞭子、内饰、外饰、室内装饰品、书籍装订、家具、灯具、灯罩、桌布、墙面覆盖材料、地板覆盖物、天花板覆盖物、汽车内饰、汽车外饰、船内饰、船外饰、飞机内饰、游艇内饰、游艇外饰、枕套、床单、被套、珠宝、配件、眼镜、太阳镜或消费类电子产品中的一种或多种中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在表带中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在皮带中。在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含在包中。包含在鞣制的合成皮革中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在鞣制的合成皮革中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在鞣制的合成皮革中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了人造表皮层。在一些实施方案中，人造表皮层可包含毛囊细胞和黑素细胞。在一些实施方案中，人造表皮层可包含毛囊细胞。在一些实施方案中，人造表皮层可包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，毛囊细胞可包括真皮乳头细胞、外根鞘细胞或其组合。在一些实施方案中，黑素细胞可以是哺乳动物黑素细胞。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含角质形成细胞。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，角质形成细胞可以是哺乳动物角质形成细胞。在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物可以是人哺乳动物。在一些实施方案中，非人哺乳动物可以是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。在一些实施方案中，成纤维细胞可以是非哺乳动物成纤维细胞。在一些实施方案中，非哺乳动物可以是鱼、鸟或爬行动物。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，表皮层可包含毛囊。包含在人造表皮层中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在人造表皮层中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在人造表皮层中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了分层结构。在一些实施方案中，分层结构可包含人造表皮层。在一些实施方案中，表皮层可包含毛囊细胞。在一些实施方案中，分层结构可包含人造真皮层。在一些实施方案中，真皮层可包含成纤维细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含角质形成细胞。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，毛囊细胞可以是真皮乳头细胞、外根鞘细胞或其组合。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，分层结构可以进行着色。在一些实施方案中，表皮层可以分层。在一些实施方案中，分层结构可包含基膜替代物。在一些实施方案中，基膜替代物可以在表皮层与真皮层之间。在一些实施方案中，基膜替代物可包括干燥的非细胞羊膜。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含支架。在一些实施方案中，支架可以是天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可包含丝。在一些实施方案中，支架可包含壳聚糖。在一些实施方案中，真皮层可以在支架上。在一些实施方案中，分层结构可包含选自角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合的一种或多种组分。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含两个或更多个真皮层。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含毛囊。在一些实施方案中，分层结构可进一步包含皮毛。包含在分层结构中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在分层结构中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在分层结构中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了用于制备分层结构的方法。在一些实施方案中，该方法可包括将包含毛囊细胞的人造表皮层置于包含从诱导的多能干细胞分化的细胞的人造真皮层上，从而形成分层结构。在一些实施方案中，从诱导的多能干细胞分化的细胞可以是成纤维细胞、黑素细胞、角质形成细胞或其组合。在一些实施方案中，从诱导的多能干细胞分化的细胞可以是成纤维细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含角质形成细胞。在一些实施方案中，角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，毛囊细胞可包含真皮乳头细胞、外根鞘细胞或其组合。在一些实施方案中，表皮层可进一步包含黑素细胞。在一些实施方案中，黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，真皮层可以用补充物培养。在一些实施方案中，补充物可包含胶原蛋白、纤维蛋白、生长因子、抗坏血酸、硫酸葡聚糖、角叉菜胶或其组合。在一些实施方案中，补充物可以是天然补充物。在一些实施方案中，补充物可以是合成补充物。在一些实施方案中，真皮层可以在支架上培养。在一些实施方案中，支架可以是天然的或合成的。在一些实施方案中，支架可包含丝。在一些实施方案中，支架可包含壳聚糖。在一些实施方案中，可将真皮层置于支架上。在一些实施方案中，表皮层可以分层。在一些实施方案中，真皮层可以在第二真皮层上培养。在一些实施方案中，真皮层可以在体内培养。在一些实施方案中，真皮层可以不在胶原蛋白基质上培养。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.02mm至约5mm的范围内。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.5mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.01mm至约2mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.2mm的范围内。包含在分层结构中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在分层结构中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在分层结构中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了分层结构。在一些实施方案中，分层结构可包含含有毛囊细胞和角质形成细胞或黑素细胞的人造表皮层；含有成纤维细胞的人造真皮层，其中成纤维细胞、角质形成细胞或黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化，其中黑素细胞表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合，其中成纤维细胞表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合，其中角质形成细胞表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，分层结构可包含人造表皮层。在一些实施方案中，表皮层可包含毛囊细胞。在一些实施方案中，表皮层可包含角质形成细胞或黑素细胞。在一些实施方案中，分层结构可包含人造真皮层。在一些实施方案中，真皮层可包含成纤维细胞。在一些实施方案中，成纤维细胞、角质形成细胞或黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，黑素细胞可以表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。在一些实施方案中，成纤维细胞可表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。在一些实施方案中，角质形成细胞可以表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.02mm至约5mm的范围内。在一些实施方案中，真皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.5mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.01mm至约2mm的范围内。在一些实施方案中，表皮层的厚度可以在约0.1mm至约0.2mm的范围内。包含在分层结构中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在分层结构中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在分层结构中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
本文公开了人造表皮层。人造表皮层可包含角质层。人造表皮层可包含颗粒层。人造表皮层可包含棘层。人造表皮层可包含基底层。在一些实施方案中，角质层、颗粒层、棘层或基底层可以如图6A或图8A所示进行组织。角质层的厚度可以在约0.01mm至约0.05mm的范围内。颗粒层的厚度可以在约0.01mm至约0.15mm的范围内。棘层的厚度可以在约0.01mm至约0.15mm的范围内。所述基底层的厚度可以在约0.01mm至约0.15mm的范围内。角质层的厚度可以在人造表皮层的约4％至约20％的范围内。颗粒层的厚度可以在人造表皮层的约4％至约60％的范围内。棘层的厚度可以在人造表皮层的约4％至约40％的范围内。基底层的厚度可以在人造表皮层的约4％至约40％的范围内。包含在人造表皮层中的至少约2％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在人造表皮层中的至少约10％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。包含在人造表皮层中的至少约50％的细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
本文所述的新颖特征在所附权利要求中特别地提出。通过参考以下对利用了本文所述的特征的原理的说明性实施例进行阐述的详细描述以及附图，将获得对本文所述的特征和特征的优点的更好的理解，在附图中：
图1示出了合成皮革制备示意图。
图2A-2F示出了分层结构。图2A描绘了包含表皮层和在支架上的真皮层的分层结构。图2B描绘了包含表皮层、基膜替代物和在支架上的真皮层的分层结构。图2C描绘了包含表皮层和在支架上的多个真皮层的分层结构。图2D描绘了包含表皮层、基膜替代物和在支架上的多个真皮层的分层结构。图2E描绘了包含表皮层、基膜替代物和多个真皮层的分层结构。图2F描绘了包含表皮层和多个真皮层的分层结构。
图3示出了分层结构发展。
图4A-4C示出了皮革(图4A)、天然皮肤(图4B)和表皮等同物(图4C)的比较分析。
图5A-5C示出了天然皮肤和表皮等同物的角质层的比较分析。图5A描绘了表皮表面图像。图5B描绘了角化粒图像。图5C描绘了CDSN/Hoechst图像。
图6A-6E示出了天然皮肤和表皮等同物的颗粒层的比较分析。图6A示出了Loricrin(LOR)染色。图6B描绘了通过透射电子显微术捕获为电子致密沉淀物的表皮Ca++梯度。图6C描绘了通过镧灌注对渗透屏障完整性的评估。图6D说明紧密连接蛋白1/闭锁小带-1(zonula occludens-1)(TJP1/ZO-1)将紧密连接链蛋白(其可以是脂双层内的原纤维样结构)锚定至肌动蛋白细胞骨架。图6E说明串联聚集成被称为聚丝蛋白原的350kDa大型蛋白前体的聚丝蛋白(FLG)单体存在于SG细胞中的透明角质颗粒中。
图7A-7C示出了用TEM评估的天然皮肤和表皮等同物中的脂双层形成。图7A描绘了SC和SG边界处的正常脂质分泌。图7B描绘了SG中的板层小体。图7C描绘了天然皮肤的正常脂双层(LB)形态。
图8A-8C示出了天然皮肤和表皮等同物的基底上层的标志物的比较分析，该标志物包括角蛋白10(KRT10；图8A)、角蛋白1(KRT1；图8B)、桥粒芯蛋白1(DCL1；图8C)——基底上层的标志物。图8D描绘了体内天然皮肤和体外产生的表皮等同物中的桥粒。
图9A-9C示出了天然皮肤和表皮等同物的基底层的比较分析。MKI67(图9A)——一种增殖标志物、角蛋白14(KRT14；图9B)和转录因子TP63(图9C)在体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物中均显示出典型的基底层分布。图9D示出了体内天然皮肤和体外产生的表皮等同物中的半桥粒。
图10A-10F示出了基膜的细胞外基质组分的比较分析。图10A描绘了整联蛋白β1的表达。图10B描绘了纤连蛋白的表达。图10C描绘了胶原蛋白IV的表达。图10D描绘了胶原蛋白VI的表达。图10E描绘了胶原蛋白VII的表达。图10F描绘了层粘连蛋白5的表达。
图11A-11I示出了全厚皮肤等同物(FSE)的结构分析。图11A和11B描绘了在2600x放大倍数(图11A)和5200x放大倍数(图11B)下显示不同的表皮细胞层的FSE的横截面。图11C描绘了900x放大倍数下的FSE表面。图11D-11F描绘了在91x放大倍数(图11D)、162x放大倍数(图11E)和405x放大倍数(图11F)下真皮支架的纵向截面，其具有驻留的真皮成纤维细胞和丰富的细胞外基质。图11G-11I描绘了在80x放大倍数(图11G)、695x放大倍数(图11H)和2700x放大倍数(图11I)下的真皮支架，其具有驻留的真皮成纤维细胞和丰富的细胞外基质。
图12A-12R示出了工程化真皮等同物的时间进程。图12A-12I描绘了将真皮成纤维细胞接种到支架上后第2天在36x放大倍数(图12A)、695x放大倍数(图12B)、1470x放大倍数(图12C)、7750x放大倍数(图12D)、2320x放大倍数(图12E)、2420x放大倍数(图12F)、6560x放大倍数(图12G)、17000x放大倍数(图12H)和22000x放大倍数(图12I)下的图像。图12J-12R描绘了将真皮成纤维细胞接种到支架上后第7天在64x放大倍数(图12J)、100x放大倍数(图12K)、364x放大倍数(图12L)、82x放大倍数(图12M)、253x放大倍数(图12N)、3940x放大倍数(图12O)、5550x放大倍数(图12P)、9440x放大倍数(图12Q)和21680放大倍数(图12R)下的图像。
具体实施方式
以下结合示例应用描述若干方面以进行说明。应当理解，阐述许多具体细节、关系和方法是为了提供对本文所述特征的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到，本文描述的特征可以在没有一个或多个具体细节的情况下或采用其他方法来实践。除非另有特别说明，否则本文描述的特征不受所示动作或事件顺序的限制，因为一些动作可能以不同的顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非所有所示的动作或事件都是实现根据本文描述的特征的方法所必需的。
本文使用的术语仅用于描述特定的情况，而非旨在限制。除非上下文另有明确说明，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式。此外，在详细描述和/或权利要求中使用术语“包括”、“含有”、“具有”、“有”或其变型的情况下，这些术语旨在是包含性的，类似于术语“包含”。
在本公开内容中，术语“约”或“大约”可以意指给定值加减最多10％的范围。在本公开内容中，术语“基本上”是指可以在很大程度上完成的事情。
如本文所用的，术语“多能干细胞”可以指具有形成任何成体细胞的能力的任何前体细胞。
如本文所用的，术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”或“ESC”可指具有形成任何成体细胞的能力的前体细胞。
如本文所用的，术语“诱导的多能干细胞”或“iPS细胞”或“iPSC”可指人工衍生自非多能细胞(例如成年体细胞)的一种多能干细胞。诱导的多能干细胞可以在形成任何成体细胞的能力方面与胚胎干细胞相同，但不是从胚胎衍生的。在一些情况下，本文公开的IPSC细胞可以是IPSC细胞。
如本文所用的，术语“合成皮革”可意味着，本文所述的皮肤等同物可用作任何哺乳动物或非哺乳动物的皮肤等同物。实施方案可以用人和非人哺乳动物实施，如非人灵长类动物，和牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物和猫科动物以及啮齿动物中的成员(如小鼠、大鼠和豚鼠)，包括兔在内的兔类动物家族中的成员；和非哺乳动物，如鱼类(包括鲨鱼和黄貂鱼)、鸟类(包括鸵鸟)以及爬行动物(包括蜥蜴、蛇和鳄鱼)。将形成的特定哺乳动物合成皮革可取决于本文所述实施方案中使用的细胞的来源，例如，角质形成细胞和成纤维细胞，例如，当使用牛科动物的角质形成细胞和成纤维细胞形成皮肤等同物时，可以形成牛科动物合成皮革。
概述
本文公开了合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、分层结构、其制备产品及其制备方法。在某些情况下，本文公开了合成皮革。在一些情况下，合成皮革包括一层或多层。在一些情况下，一层或多层包含细胞，其中所述细胞在体外培养。在一些情况下，本文所述的方法提供了能可靠、准确且可再现地将合成皮革生产规模放大到商业水平的高通量方法。本文公开的合成皮革、工程化表皮等同物、工程化全厚皮肤等同物及其制备方法的优点包括但不限于以可再现、高通量且易于放大的方式制备具有吸引人的外观、质地、厚度和耐久性的定制组织。如本文所用的，全厚皮肤等同物可包含至少一个真皮层和至少一个表皮层。如本文所用的，全厚皮肤等同物和全皮肤等同物可互换使用。
本文公开的合成皮革可包含含有成纤维细胞的人造真皮层和含有角质形成细胞的人造表皮层。真皮层和表皮层可以形成分层结构。合成皮革可包括一个或多个分层结构。可对合成皮革进行鞣制和进一步加工。形成合成层的细胞可以从干细胞如诱导的多能干细胞(iPSC)分化。真皮层可置于支架如丝上，以达到天然皮革的厚度和质地。
本文还公开了制备合成皮革的方法。该方法可包括形成包含人造真皮层和人造表皮层的分层结构，以及对该分层结构进行鞣制。该方法还可包括进一步加工人造真皮层和表皮层，例如，以达到天然皮革的厚度和质地。
合成皮革
合成皮革可包含一个或多个细胞层。例如，合成皮革可包含真皮层、表皮层和基膜或基膜替代物中的一个或多个。合成皮革可进一步包含皮下组织、鳞屑、盾板、皮肤骨化或其组合。在一些情况下，合成层包括全厚皮肤等同物。这样的全厚皮肤等同物可包括本文公开的任何一层或多层的组合。合成皮革中的一个或多个细胞层的一部分可以移除，例如，通过剃刮。在一些情况下，可以对合成皮革进行鞣制。鞣制可以在形成一个或多个细胞层或分层结构之后进行。鞣制可以在从合成皮革中移除细胞层的至少一部分之后进行。在一些情况下，可以对合成皮革进行进一步加工。在一些情况下，合成皮革可包含毛囊细胞和黑素细胞。毛囊细胞和/或黑素细胞可以从干细胞(例如，iPSC)分化。
在一些实施方案中，鞣制的合成皮革可包含分层结构。分层结构可包括含有成纤维细胞的人造真皮层。分层结构还可包含含有角质形成细胞的人造表皮层。在一些情况下，分层结构可包括含有成纤维细胞的人造真皮层和含有角质形成细胞的人造表皮层。在一些情况下，成纤维细胞或角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
在一些情况下，鞣制的合成皮革可包含真皮层的至少一部分。在一些情况下，鞣制的合成皮革不包含真皮层。在一些情况下，可以移除真皮层。
真皮层
合成皮革可包括真皮层(例如，人造真皮层)。真皮层可以是工程化真皮等同物，例如体外形成的人造真皮层。
真皮层可包含结缔组织细胞。例如，真皮层可包含成纤维细胞。真皮层中的成纤维细胞可以表达一种或多种标志物，包括但不限于分化群10(CD10)、分化群73(CD73)、分化群44(CD44)、分化群90(CD90)、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和脯氨酰-4-羟化酶β成纤维细胞。在一些情况下，真皮层还包含其他类型的细胞，如免疫细胞、巨噬细胞、脂肪细胞或其组合。
真皮层除了细胞以外，还可包含基质组分。基质组分的实例包括但不限于胶原蛋白、弹性蛋白和纤维外基质——主要由糖胺聚糖(例如透明质酸)、蛋白聚糖和糖蛋白组成的细胞外凝胶样物质中的任一种或多种。
真皮层可包含基质支持物。基质支持物可以是支架。基质支持物可包含收缩的胶原蛋白凝胶。纯胶原蛋白基质的替代物可以是聚乙二醇酸网，例如，如Hansbrough等人，J.Burn Care Rehabil.,15:346-53(1994)中所述，或者用硅橡胶膜覆盖的胶原蛋白和糖胺聚糖基质(C-GAG)，例如，如Burke等人，Ann.Surg.,194:413-420(1981)中所述的，或各种生物聚合物，例如，如Kellouche等人，Biochem Biophys Res Commun.,363:472-478(2007)中所述的壳聚糖。在一些情况下，基质可以与成纤维细胞一起接种，例如，以产生器官型模型。来自同种异体尸体皮肤的天然来源的真皮也可以与角质形成细胞片层一起使用。该技术的变型可以使用来自尸体皮肤的冻干失活的真皮来支持角质形成细胞片层。
皮革单元的厚度可以用毫米、盎司(ounce)或iron表示。(一盎司等于1/64英寸或0.0156英寸或0.396毫米。一iron等于1/48英寸或0.0208英寸或0.53毫米。)
真皮层的厚度可以设计成适合合成皮革的功能或使用。真皮层可具有约0.01mm至约50mm的厚度。例如，真皮层可以具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的厚度。例如，真皮层可具有约0.02mm至5mm的厚度。例如，真皮层可具有约0.1mm至0.5mm的厚度。例如，真皮层可具有约0.2mm至0.5mm的厚度。在一些情况下，真皮层的厚度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，真皮层的厚度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，真皮层可具有至少约50mm的厚度。
真皮层的长度可以设计成适合合成皮革的功能或使用。真皮层可具有约0.01mm至约50m的长度。例如，真皮层可具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的长度。例如，真皮层可具有约0.02mm至5mm的长度。例如，真皮层可具有约0.1mm至0.5mm的长度。例如，真皮层可具有约0.2mm至0.5mm的长度。在一些情况下，真皮层的长度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，真皮层的长度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，真皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的长度。在一些实施方案中，真皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的长度。在一些实施方案中，真皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的长度。
真皮层的宽度可以设计成适合合成皮革的功能或使用。真皮层可具有约0.01mm至约50m的宽度。例如，真皮层可具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的宽度。例如，真皮层可具有约0.02mm至5mm的宽度。例如，真皮层可具有约0.1mm至0.5mm的宽度。例如，真皮层可具有约0.2mm至0.5mm的宽度。在一些情况下，真皮层的宽度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，真皮层的宽度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，真皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的宽度。在一些实施方案中，真皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的宽度。在一些实施方案中，真皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的宽度。
合成皮革可包括一个或多个真皮层。例如，合成皮革可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、40、60、80或100个真皮层。当合成皮革包含多于一个真皮层时，真皮层可置于另一个真皮层上。例如，合成皮革可包括两个真皮层，例如第一真皮层和第二真皮层。第一真皮层可置于第二真皮层上。
真皮层可以是分层的，例如，有多个亚层。亚层可具有不同的组成，例如，不同浓度的纤维。真皮层的亚层可具有不同的厚度和密度。例如，真皮层可具有乳头状真皮层、网状真皮层或其任何组合。乳头状真皮层可包括松散的网状结缔组织和/或松散排列的纤维，例如胶原纤维。网状真皮层可包括致密的不规则结缔组织，包括胶原纤维和真皮弹性纤维。
真皮层可包含游离胶原蛋白基质或晶格，其可在所有方向收缩，并且是均匀的。成纤维细胞和适当的其他类型的真皮细胞可以分布在连续的胶原蛋白凝胶中。真皮等同物可包含至少一种I型胶原蛋白基质，在该基质中分布有成纤维细胞。真皮等同物还可以含有其他细胞外基质成分。细胞外基质成分可包括胶原蛋白例如IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖或透明质酸。真皮层可含有IV型胶原蛋白和层粘连蛋白、巢蛋白或其组合。这些不同成分的浓度可以进行调节。例如，层粘连蛋白的浓度可以是最终体积的约1％至约15％。例如，IV型胶原蛋白的浓度可以是最终体积的约0.3％至约4.5％。例如，巢蛋白的浓度可以是最终体积的约0.05％至约1％。使用的胶原蛋白可以是牛科动物来源的胶原蛋白，来自鼠尾或来自鱼，或允许在成纤维细胞的存在下收缩的任何其他来源的天然胶原蛋白或通过基因工程产生的胶原蛋白。在一些实施方案中，胶原蛋白可以来自非天然来源。基质可以是胶原蛋白凝胶，其可以通过水平和垂直收缩而获得，而不会拉紧，这不会对成纤维细胞的优先组织化产生影响。这样的基质也称为“游离的”，可以不粘附到支持物上，并且其体积可以无限制地改变，从而赋予其不同的厚度和直径。真皮等同物的厚度可以为至少0.05cm，并且在一些情况下为大约0.05cm至2cm。在不损害皮肤等同物或合成皮革的有利性能的情况下厚度也可以增加。在一些情况下，厚度可为约3mm至约20cm或更大。
表皮层
合成皮革可包括表皮层(例如，人造表皮层)。表皮层可以是工程化表皮等同物，例如体外形成的人造表皮层。
表皮层可包含一种或多种类型的细胞，包括角质形成细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞和炎性细胞。例如，表皮层可包含角质形成细胞。表皮层中的角质形成细胞可包含上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其任何组合。
在一些情况下，表皮层至少包含基底角质形成细胞，例如未分化的角质形成细胞。表皮层可进一步包含部分分化的角质形成细胞以及完全分化的角质形成细胞。在合成皮革中的一个或多个表皮层中，随着从基底角质形成细胞所在的真皮-表皮接合部进展，可能存在从未分化的基底角质形成细胞向完全分化的角质形成细胞的过渡。
基底角质形成细胞可以表达半桥粒，半桥粒用于帮助将表皮层和真皮层固定在一起。基底角质形成细胞也可用于再生皮肤。本文的合成皮革中的表皮层可具有提供这些功能的基底角质形成细胞。因此，包含这种基底角质形成细胞的合成皮革能够再生。合成皮革中一个或多个表皮层中的基底角质形成细胞与分化的角质形成细胞之间的其他区别可能是E-和P-钙粘蛋白都存在于沿基底膜区(BMZ)的表皮角质形成细胞中，但已分化并且远离BMZ的角质形成细胞只表达E-钙粘蛋白。
表皮层的基底角质形成细胞可以在与真皮层直接接触的层中排列，作为分化的角质形成细胞与成纤维细胞之间的边界。在其他情况下，基底角质形成细胞与真皮层之间存在间隙。此外，基底角质形成细胞与其他基底角质形成细胞之间可能存在间隙，从而在分化的角质形成细胞与真皮层之间留出间隙。在后一种情况下，在基底或分化的角质形成细胞与真皮层之间存在间隙，真皮层和表皮层并不彼此均匀接触，而是彼此相邻。它们是相邻的，因为通常可以是流体，但基本上没有其他介入材料，如真皮层与表皮层之间的细胞层、胶原蛋白、基质或其他支持物。
表皮层中的角质形成细胞可以表达一种或多种标志物。此类标志物包括但不限于角蛋白14(KRT14)、肿瘤蛋白p63(p63)、桥粒芯蛋白3(DSG3)、整联蛋白β4(ITGB4)、层粘连蛋白、α5(LAMA5)、角蛋白5(KRT5)、肿瘤蛋白p63的同种型(例如，TAp63)、层粘连蛋白β3(LAMB3)和角蛋白18(KRT18)。
表皮层的厚度可以设计成适合合成皮革的功能或使用。表皮层可具有约0.001mm至约10mm的厚度。例如，表皮层可具有约0.005mm至约10mm、约0.005mm至约5mm、约0.005mm至约2mm、约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约5mm、约0.01mm至约2mm、约0.01mm至约1mm、约0.01mm至约0.8mm、约0.01mm至约0.4mm、约0.01mm至约0.2mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.05mm至约0.4mm、约0.05mm至约0.2mm、约0.05mm至约0.1mm、约0.1mm至约0.4mm、约0.1mm至约0.2mm、约0.08mm至约1mm、或约0.05mm至约1.5mm的厚度。例如，表皮层可具有约0.01mm至约2mm的厚度。例如，表皮层可具有约0.1mm至约0.22mm的厚度。在一些情况下，表皮层的厚度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，真皮层的厚度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些情况下，本文描述的厚度值可以是表皮层和基膜替代物的厚度。
表皮层的长度可以设计成适合合成皮革的功能或使用。表皮层可具有约0.01mm至约50m的长度。例如，表皮层可具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的长度。例如，表皮层可具有约0.02mm至5mm的长度。例如，表皮层可具有约0.1mm至0.5mm的长度。例如，表皮层可具有约0.2mm至0.5mm的长度。在一些情况下，表皮层的长度可为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，表皮层的长度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，表皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的长度。在一些实施方案中，表皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的长度。在一些实施方案中，表皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的长度。
表皮层的宽度可以设计成适合合成皮革的功能或使用。表皮层可具有约0.01mm至约50m的宽度。例如，表皮层可具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的宽度。例如，表皮层可具有约0.02mm至5mm的宽度。例如，表皮层可具有约0.1mm至0.5mm的宽度。例如，表皮层可具有约0.2mm至0.5mm的宽度。在一些情况下，表皮层的宽度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，表皮层的宽度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，表皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的宽度。在一些实施方案中，表皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的宽度。在一些实施方案中，表皮层可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的宽度。
合成皮革可包含一个或多个表皮层。例如，合成皮革可具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、40、60、80或100个表皮层。当合成皮革包含多于一个表皮层时，一个表皮层可以置于另一个表皮层上。例如，合成皮革可包含两个表皮层，例如第一表皮层和第二表皮层。第一表皮层可置于第二表皮层上。
表皮层可以是分层的，例如，具有多个亚层。亚层可具有不同的细胞组成，例如，不同类型的角质形成细胞。表皮层的亚层可具有不同的厚度和/或密度。例如，表皮层可具有角化层(角质层)、透明/半透明层(透明层)、粒层(颗粒层)、棘层(棘层)、基底层/生发层(基底层/生发层)或其任何组合中的一种或多种。在一些情况下，表皮层包含功能性表皮渗透屏障(例如角质层中组织化的脂双层)。在一些情况下，角质层、透明层、颗粒层、棘层或基底层/生发层可具有约0.0001mm至约5mm的厚度。在一些情况下，角质层、透明层、颗粒层、棘层或基底层/生发层可具有至少约0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm的厚度。在一些情况下，角质层、透明层、颗粒层、棘层或基底层/生发层可具有至多约50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.15mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm的厚度。
表皮层可进一步包含产生色素例如黑色素的细胞。这种产生色素的细胞可以是黑素细胞。表皮层中的黑素细胞可以表达一种或多种标志物。此类标志物可包括但不限于含SRY-盒基因10(Sox-10)、小眼畸形相关转录因子(MITF-M)、前黑素体蛋白(gp-100)、多巴色素互变异构酶(DCT)、酪氨酸酶(TYR)和Melan-A(MLANA)。
合成皮革中的细胞
合成皮革可包含本文公开的真皮层和表皮层中的细胞。在一些情况下，合成皮革还包含毛囊细胞、内皮细胞、真皮乳头细胞、免疫系统细胞(例如，淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞或朗格汉斯细胞)、脂肪细胞、神经细胞及其混合物。
合成皮革中的一种或多种细胞可以是基因工程细胞。术语“基因工程”可以指对细胞的核酸含量的人为改变。因此，基因工程细胞可包括在细胞基因组中含有一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换，以及改变(包括插入细胞中的自我复制的染色体外核酸的引入)的细胞。基因工程细胞还包括其中一个或多个基因的转录已被改变(例如，增加或减少)的细胞。
在一些情况下，合成皮革具有天然皮肤的至少一种组分，例如黑素细胞、毛囊、汗腺和神经末梢。在某些情况下，合成皮革可以由于缺少这些组分中的至少一种而区别于正常的天然皮肤。在表现出异常表型或具有至少一个基因型发生改变的细胞的一些情况下，合成皮革可包括所有这些组分。
在一些情况下，可以将其他组分添加到合成皮革中。此类其他组分可包括肌上皮细胞、导管细胞、分泌细胞、肺泡细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、粘附物、乳腺或其任何混合物。在一些情况下，合成皮革包含以下一种或多种：神经细胞、结缔组织(包括骨、软骨、分化成骨形成细胞和软骨细胞的细胞以及淋巴组织)、上皮细胞(包括形成腔和血管或通道中的内衬的内皮细胞、外分泌上皮细胞、上皮吸收细胞、角质化上皮细胞和细胞外基质分泌细胞)和未分化的细胞(如胚胎细胞、干细胞和其他前体细胞)。
合成皮革可包含毛囊。毛囊可包括一种或多种结构，包括乳头、基质、根鞘、凸起、漏斗、立毛肌、皮脂腺和顶泌汗腺。毛囊可包含一种或多种毛囊细胞，包括真皮乳头细胞、外根鞘细胞或其任何组合。在一些情况下，毛囊可以在表皮层中。在一些情况下，毛囊可以在真皮层中。毛囊细胞可以从祖细胞，例如干细胞如iPSC分化。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的毛囊细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
在一些实施方案中，合成皮革可以没有毛发、血管、皮脂腺、毛囊、油腺、神经或其组合。
在一些情况下，合成皮革可包括毛发，例如，在一个或多个分层结构中。例如，合成皮革可包括皮毛。毛发(例如皮毛)可以是天然的、合成的或其组合。毛发(例如皮毛)可以从合成皮革中的细胞生长出，或者从外源来源添加到合成皮革中。在其他情况下，合成皮革可以没有任何毛发。
干细胞
合成皮革中的一种或多种细胞可以从祖细胞例如干细胞分化。例如，合成皮革中的成纤维细胞可以从干细胞分化。例如，合成皮革中的角质形成细胞可以从干细胞分化。例如，合成皮革中的黑素细胞可以从干细胞分化。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的本文公开的细胞可以从干细胞分化。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的成纤维细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的角质形成细胞可以从诱导的多能干细胞分化。在一些实施方案中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的黑素细胞可以从诱导的多能干细胞分化。
干细胞可以是胚胎干细胞(ESC)、成体干细胞(即体干细胞)或诱导的多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，干细胞可以是全能的、多能的或多潜能的，例如，成体干细胞和脐带血干细胞。胚胎干细胞可以来自不到一周的受精胚胎。诱导的多能干细胞可以通过Oct3、Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因中的一种或多种在任何体细胞(例如成年体细胞)如成纤维细胞中的诱导表达而获得。在一些情况下，还可诱导一种或多种其他基因，用于将体细胞重新编程为诱导的多能干细胞。此类基因的实例包括NANOG、UTF1、LIN28、SALL4、NR5A2、TBX3、ESSRB、DPPA4、SV40LT、REM2、MDM2和细胞周期蛋白D1。
可以使用各种递送方法来调节基因的表达，从而将体细胞重新编程为iPSC。示例性的递送方法包括裸DNA递送、腺病毒、电递送、化学递送、机械递送、基于聚合物的系统、微注射、逆转录病毒(例如，MMLV衍生的逆转录病毒)和慢病毒(例如，可切除的慢病毒)。在一些情况下，可以根据如Takahashi等人，Cell.2007年11月30日；131(5):861-72(2007)，或Yu等人，Science 318,1917-1920(2007)(2007)所述的方案获得诱导的多能干细胞。在一些情况下，体细胞(例如，成年体细胞)用病毒载体转染，该病毒载体例如是逆转录病毒载体，其包含Oct3、Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因。在一些情况下，仙台病毒被用作递送系统，例如由日本ID Pharma Co.，Ltd.制备的仙台病毒。
细胞来源
合成皮革可包含来自一个或多个物种的动物的细胞。例如，合成皮革中的细胞可以来自哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、无脊椎动物或其任何组合。
合成皮革可包含来自哺乳动物(例如哺乳动物细胞)或非哺乳动物的细胞。哺乳动物可以是非人哺乳动物。非人哺乳动物可以是羚羊、熊、海狸、野牛、野猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、北山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、猞猁、水貂、驼鹿、公牛、西貒、猪、兔、犀牛、海豹、绵羊、松鼠、虎、鲸鱼、狼、牦牛或斑马。在一些情况下，哺乳动物可以是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物。非哺乳动物可以是鱼、鸟或爬行动物。在一些情况下，哺乳动物可以是人。在一些实施方案中，人可以是名人。如本文所使用的，术语“名人”可以被定义为通过先前活动的恶名或一般名声得到社会关注的人。“名人”可以与行业相关联，包括但不限于职业和业余体育、娱乐、音乐、电影、商业、印刷和电子媒体、政治等。
合成皮革可包含来自其他物种的细胞。在一些情况下，所述细胞来自鸟类，如鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑或火鸡。在一些情况下，所述细胞来自爬行动物，如乌龟、蛇、鳄鱼或短吻鳄。在一些情况下，所述细胞来自两栖动物，如青蛙、蟾蜍、沙罗曼蛇或蝾螈。在一些情况下，所述细胞来自鱼类，如凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、海豚鱼、蝠鲼、马林鱼、橙连鳍鲑、河鲈鱼、梭子鱼、狭鳕鱼、鲑鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼或碧古鱼。
在一些情况下，合成皮革中的所有细胞均来自相同物种。例如，合成皮革中的所有细胞均可以是牛科动物细胞。在其他情况下，合成皮革包含来自多个物种的细胞。例如，合成皮革可包含牛科动物细胞和短吻鳄细胞。在一些情况下，合成皮革包含来自至少2、3、4、5、6、7、8或10个物种的细胞。
合成皮革中细胞的祖细胞也可来自本文所述的来源。例如，干细胞(例如，iPSC)、体细胞(例如，将被重新编程为iPSC)、用于合成的细胞的原代细胞、真皮层细胞、表皮层细胞或合成的细胞中的任何细胞及其祖细胞都可以从本文所述的来源获得。
任何细胞均可以是活细胞或死细胞。当存在多个细胞时，细胞可以是活细胞，可以是死细胞，或其任何组合。
分层结构
合成皮革可包含一个或多个分层结构。可以通过将第一类型的层置于第二类型的层上来形成分层结构。第一类型的层和第二类型的层可以相同或不同。在一些情况下，可以通过将表皮层置于真皮层上来形成分层结构。例如，可以通过将表皮层置于真皮层上来形成分层结构，其中表皮层与真皮层之间具有基膜替代物。
分层结构可包括两层或更多层。在一些情况下，分层结构包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000层。在一些情况下，分层结构包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000个第一类型的层，以及至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50个第二类型的层。例如，分层结构可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000层真皮层，以及至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、500或1000层表皮层。
分层结构可包含本文所述的一种或多种类型的细胞。例如，分层结构可包含真皮层中的细胞如成纤维细胞，表皮层中的细胞如角质形成细胞，或其任何组合。在一些情况下，分层结构进一步包含除成纤维细胞和角质形成细胞之外的细胞。例如，分层结构可包含黑素细胞。
分层结构可具有约0.001mm至约100mm的厚度。例如，分层结构可具有约0.005mm至约50mm、约0.005至约10、约0.01mm至约10mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、或约0.1至约0.5mm的厚度。在一些情况下，分层结构的厚度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm、10mm、20mm、40mm、60mm、80mm或100mm。在一些情况下，分层结构的厚度可以为至多100mm、50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，分层结构可具有至少约100、200、300、400、500、600、700、800mm的厚度。
分层结构的长度可以设计成适合合成皮革的功能或使用。分层结构可具有约0.01mm至约50m的长度。例如，分层结构可具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的长度。例如，分层结构可具有约0.02mm至5mm的长度。例如，分层结构可具有约0.1mm至0.5mm的长度。例如，分层结构可具有约0.2mm至0.5mm的长度。在一些情况下，分层结构的长度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，分层结构的长度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，分层结构可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的长度。在一些实施方案中，分层结构可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的长度。在一些实施方案中，分层结构可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的长度。
分层结构的宽度可以设计成适合合成皮革的功能或使用。分层结构可具有约0.01mm至约50m的宽度。例如，分层结构可具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的宽度。例如，分层结构可具有约0.02mm至5mm的宽度。例如，分层结构可具有约0.1mm至0.5mm的宽度。例如，分层结构可具有约0.2mm至0.5mm的宽度。在一些情况下，分层结构的宽度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，分层结构的宽度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，分层结构可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的宽度。在一些实施方案中，分层结构可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的宽度。在一些实施方案中，分层结构可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的宽度。
分层结构可包含成纤维细胞和角质形成细胞，其比例为至少约50：1、40：1、30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：10或1：100中的任何比例。在一些情况下，成纤维细胞与角质形成细胞的比例可为约20：1至约3：1、约20：1至约4：1、约20：1至约5：1、约20：1至约10：1、或约20：1至约15：1。
分层结构可包含成纤维细胞和黑素细胞，其比例为至少约50：1、40：1、30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：10或1：100中的任何比例。在一些情况下，成纤维细胞与黑素细胞的比例可为约20：1至约3：1、约20：1至约4：1、约20：1至约5：1、约20：1至约10：1、或约20：1至约15：1。
分层结构可包含角质形成细胞和黑素细胞，其比例为至少约50：1、40：1、30：1、29：1、28：1、27：1、26：1、25：1、24：1、23：1、22：1、21：1、20：1、19：1、18：1、17：1、16：1、15：1、14：1、13：1、12：1、11：1、10：1、9：1、8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1、1：2、1：10或1：100中的任何比例。在一些情况下，角质形成细胞与黑素细胞的比例可为约20：1至约3：1、约20：1至约4：1、约20：1至约5：1、约20：1至约10：1、或约20：1至约15：1。
分层结构中的一种类型的细胞可以占分层结构中的总细胞群体的至多99％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、10％、5％或1％。分层结构中的一种类型的细胞可以占分层结构中的总细胞群体的约至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。例如，分层结构中的成纤维细胞可以占分层结构中的总细胞群体的约至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
合成皮革
合成皮革可以由一个或多个分层结构形成。例如，合成皮革可以由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个分层结构形成。
合成皮革可具有各种厚度。例如，合成皮革可具有类似于天然皮革的厚度。在一些情况下，合成皮革可具有约0.001mm至约100mm的厚度。例如，分层结构可具有约0.005mm至约50mm、约0.005至约10、约0.01mm至约10mm、约0.1至约5mm、约0.5mm至约5mm、约0.5mm至约3mm、约0.8mm至约3mm、约0.8mm至约2mm、约0.8mm至约1.8mm、约0.8mm至约1.6mm、约0.9mm至约1.4mm、约1mm至约1.5mm、约1mm至约1.4mm、或约1mm至约1.3mm的厚度。在一些情况下，合成皮革的厚度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm、10mm、20mm、40mm、60mm、80mm或100mm。在一些情况下，合成皮革的厚度可以为至多100mm、50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些情况下，合成皮革的厚度可以为约1.2mm。
合成皮革可具有约0.01mm至约50m的长度。例如，合成皮革可具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的长度。例如，合成皮革可具有约0.02mm至5mm的长度。例如，合成皮革可具有约0.1mm至0.5mm的长度。例如，合成皮革可具有约0.2mm至0.5mm的长度。在一些情况下，合成皮革的长度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，合成皮革的长度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，合成皮革可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的长度。在一些实施方案中，合成皮革可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的长度。在一些实施方案中，合成皮革可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的长度。
合成皮革可具有约0.01mm至约50m的宽度。例如，合成皮革可具有约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约8mm、约0.01至约5mm、约0.02至约5mm、约0.05至约5mm、约0.1至约5mm、约0.1至约2mm、约0.1至约1mm、约0.1至约0.8mm、或约0.1至约0.5mm的宽度。例如，合成皮革可具有约0.02mm至5mm的宽度。例如，合成皮革可具有约0.1mm至0.5mm的宽度。例如，合成皮革可具有约0.2mm至0.5mm的宽度。在一些情况下，合成皮革的宽度可以为至少0.001mm、0.01mm、0.02mm、0.04mm、0.08mm、0.1mm、0.2mm、0.4mm、0.8mm、1mm、2mm、4mm、8mm或10mm。在一些情况下，合成皮革的宽度可以为至多50mm、40mm、20mm、10mm、8mm、4mm、2mm、1mm、0.8mm、0.4mm、0.2mm、0.1mm、0.08mm、0.04mm、0.02mm或0.01mm。在一些实施方案中，合成皮革可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、700、1000mm的宽度。在一些实施方案中，合成皮革可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700cm的宽度。在一些实施方案中，合成皮革可具有至少约50、60、70、80、90、100、200、300、400m的宽度。
基膜替代物
合成皮革可进一步包含基膜替代物。基膜替代物可以在两个细胞层之间，例如在真皮层和表皮层之间。从结构和/或生物化学的角度看，基膜替代物可以是与存在于体内的真皮-表皮接合部类似的真皮-表皮接合部。从生物化学角度来看，基膜替代物可以包含基底膜、致密层、透明层和亚基底区的组分，例如IV型胶原蛋白、VII型胶原蛋白、层粘连蛋白5、巢蛋白、纤连蛋白或其任何组合。
合成皮革中的基膜替代物可以是泌尿系统基膜(UBM)、肝基膜(LBM)、羊膜、绒毛膜、同种异体移植心包、同种异体移植非细胞真皮、羊膜、渥顿氏胶或其任何组合。例如，基膜替代物可以是干燥的非细胞羊膜。在某些情况下，基膜替代物可以是聚合物，例如纳米聚合物。例如，基膜替代物可以是纳米纤维状聚羟基丁酸酯-共羟基戊酸酯(PHBV)，如Bye等人，Journal of Biomaterials and Tissue Engineering Vol.4,1–7,2014所述。
支架
细胞层(例如，真皮层)、分层结构或合成皮革可置于支架上。支架可以提供一定的硬度(如抗撕裂)、弹性或两者兼而有之。在一些情况下，一部分或整个支架可包含在合成皮革中。在其他情况下，支架可以不包含在合成皮革中。在辅助在合成皮革中形成层之后，可以从最终的合成皮革产品中移除支架。在某些情况下，包含在合成皮革中的支架可在一段时间后降解。本文描述的支架可包括小梁结构。
支架可由天然材料、合成材料或其组合制成。支架的实例包括使用由生物可吸收的合成聚合物制成的网形成的支架，通过将尼龙网与硅膜附接形成的支架，具有胶原海绵和硅片双层结构的支架，使用制成片层的atelo胶原海绵形成的支架，通过匹配具有不同孔径的胶原海绵形成的支架，和使用纤维蛋白胶或已经无细胞的同种异体皮肤形成的非细胞真皮基质(ADM)。
支架可包含天然物质，如胶原蛋白(例如，胶原蛋白基质)、天然粘合剂(例如，纤维蛋白胶、冷胶、动物胶、血液白蛋白胶、酪蛋白胶或植物胶，例如淀粉和糊精胶)。在一些情况下，支架包含丝。例如，支架可以由丝制成。在一些实施方案中，支架可包含丝纤蛋白、纤维素、棉、醋酸纤维、丙烯酸纤维、乳胶纤维、亚麻、尼龙、人造丝(rayon)、天鹅绒、改性聚丙烯腈、烯烃聚酯、赛伦、维荣、羊毛、黄麻、大麻、竹子、亚麻或其组合。在一些实施方案中，支架可包含纤维。在一些实施方案中，纤维可以是丝、棉、羊毛、亚麻纤维，特别地从木材、蔬菜或藻类中提取的纤维素、聚酰胺、改性纤维素(人造丝、粘胶纤维、醋酸纤维，特别是醋酸人造丝)、聚对苯二甲酰对苯二胺纤维、丙烯酸纤维，例如聚甲基丙烯酸甲酯或聚-2-甲基丙烯酸羟乙酯纤维，聚烯烃纤维，例如聚乙烯或聚丙烯纤维、玻璃、二氧化硅、芳族聚酰胺、碳(例如石墨形式)、聚(四氟乙烯)、不溶性胶原、聚酯、聚氯乙烯或聚偏二氯乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯腈、壳聚糖、聚氨酯、聚(氨酯-脲)或聚邻苯二甲酸乙二醇酯，以及由聚合物(如上述提到的聚合物如聚酰胺/聚酯纤维)的共混物形成的纤维，或其任何组合。
支架可包含聚合物。聚合物可以是生物聚合物。生物聚合物可包括但不限于几丁质、壳聚糖、弹性蛋白、胶原蛋白、角蛋白或聚羟基烷酸酯。聚合物可以是生物降解的、生物稳定的或其组合。支架中的聚合物可以是天然聚合物。示例性的天然聚合物包括多糖，例如藻酸盐、纤维素、葡聚糖、pullane、聚透明质酸、几丁质、聚(3-羟基烷酸酯)、聚(3-羟基辛酸酯)或聚(3-羟基脂肪酸)。在一些情况下，支架还包含天然聚合物的化学衍生物。这些化学衍生物可包括化学基团的取代和/或添加，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化，以及本领域技术人员熟悉的其他修饰。天然聚合物还可以选自蛋白质，例如胶原蛋白、玉米醇溶蛋白、酪蛋白、明胶、谷蛋白和血清白蛋白。支架中的聚合物可以是可生物降解的合成聚合物，包括聚α-羟基酸，如聚L-乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)或其共聚物(例如聚D、L-乳酸-co-乙醇酸(PLGA))和透明质酸。
支架可以是生物可吸收的。生物可吸收支架可以是能够包含或支持活细胞，并在一段时间内使它们保持所需构型的非细胞毒性结构或物质。术语“生物可吸收的”可以指身体可以分解成从身体排泄或在其中代谢的无毒副产物的任何物质。用于支架的示例性的生物可吸收的材料包括聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(二甲基三亚甲基碳酸酯)、聚(氨基酸)、酪氨酸衍生的聚(碳酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(己内酯)、聚(对二氧六环酮)、聚(酯)、聚(酯-酰胺)、聚(酸酐)、聚(原酸酯)、胶原、明胶、血清白蛋白、蛋白质、多糖、粘多糖、碳水化合物、糖胺聚糖、聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯醇)、透明质酸、硫酸软骨素、肝素、硫酸皮肤素、蛋白聚糖、共聚物、聚合物的共混物和混合物，以及含有生物可吸收连接的低聚物。
支架可具有各种厚度。例如，支架可具有可适合形成细胞层的厚度。例如，支架可具有约0.1mm至约10mm，例如约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约4mm、约0.1mm至约3mm、约0.1mm至约2mm、约0.1mm至约1mm、约0.2mm至约1mm、约0.3mm至约1mm、约0.4mm至约1mm、约0.5mm至约1mm、0.3mm至约1.5mm、约0.4mm至约1.2mm、约0.6mm至约1.2mm、或约0.7mm至约1.5mm的厚度。例如，支架可具有约0.5mm至1mm的厚度。在一些情况下，支架的厚度可以为至少0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.8mm、1mm、2mm、3mm、4mm或5mm。在一些情况下，支架的厚度可以为至多0.5mm、0.8mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。在一些实施方案中，支架可以具有将放置和/或生长在支架上的细胞层的长度和/或宽度。在一些实施方案中，支架可具有本文所述的细胞层的长度和/或宽度。
支架可以具有在合成皮革的面上的表面积。例如，支架可具有约0.1mm2至约100mm2、约0.1mm2至约95mm2、约0.1mm2至约90mm2、约0.1mm2至约85mm2、约0.1mm2至约80mm2、约0.1mm2至约75mm2、约0.1mm2至约70mm2、约0.1mm2至约65mm2、约0.1mm2至约60mm2、约0.1mm2至约55mm2、约0.1mm2至约50mm2、约0.1mm2至约45mm2、约0.1mm2至约40mm2、约0.1mm2至约35mm2、约0.1mm2至约30mm2、约0.1mm2至约25mm2、约0.1mm2至约20mm2、约0.1mm2至约15mm2、约0.1mm2至约10mm2、约0.1mm2至约5mm2、或约0.1mm2至约1mm2的表面积。在一些情况下，支架可具有约0.1cm2至约100cm2、约0.1cm2至约95cm2、约0.1cm2至约90cm2、约0.1cm2至约85cm2、约0.1cm2至约80cm2、约0.1cm2至约75cm2、约0.1cm2至约70cm2、约0.1cm2至约65cm2、约0.1cm2至约60cm2、约0.1cm2至约55cm2、约0.1cm2至约50cm2、约0.1cm2至约45cm2、约0.1cm2至约40cm2、约0.1cm2至约35cm2、约0.1cm2至约30cm2、约0.1cm2至约25cm2、约0.1cm2至约20cm2、约0.1cm2至约15cm2、约0.1cm2至约10cm2、约0.1cm2至约5cm2、或约0.1cm2至约1cm2的表面积。在一些情况下，支架可具有约0.1m2至约100m2、约0.1m2至约95m2、约0.1m2至约90m2、约0.1m2至约85m2、约0.1m2至约80m2、约0.1m2至约75m2、约0.1m2至约70m2、约0.1m2至约65m2、约0.1m2至约60m2、约0.1m2至约55m2、约0.1m2至约50m2、约0.1m2至约45m2、约0.1m2至约40m2、约0.1m2至约35m2、约0.1m2至约30m2、约0.1m2至约25m2、约0.1m2至约20m2、约0.1m2至约15m2、约0.1m2至约10m2、约0.1m2至约5m2、或约0.1m2至约1m2的表面积。
在一些情况下，支架可具有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、75或100mm2的表面积。在一些情况下，支架可具有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、75或100cm2的表面积。在一些情况下，支架可具有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、75或100m2的表面积。
或者，细胞层可以不在支架上形成。例如，真皮层可以不在支架(例如，胶原蛋白基质)上形成。在某些情况下，合成皮革不包含支架。
色素
合成皮革可包含一种或多种色素。合成皮革的一个或多个层结构可以着色。合成皮革中的色素可以是在形成合成皮革的细胞中产生的天然色素。例如，色素可以是黑色素，包括真黑素(例如褐真色素和黑真色素)、褐黑素、神经黑色素或其任何组合。合成皮革中的色素可以是外源色素，例如皮革色素染料。
胶原蛋白
合成皮革可包含胶原蛋白。胶原蛋白可以指至少28种不同类型的胶原蛋白家族中的任何成员。胶原蛋白的特征可为重复的三联氨基酸-(Gly-X-Y)n-，使得胶原蛋白中大约三分之一的氨基酸残基是甘氨酸。X可以是脯氨酸，并且Y可以是羟脯氨酸。因此，胶原蛋白的结构可以具有不同长度的缠绕的肽链三单元。合成皮革可包含来自一个或多个物种的胶原蛋白。在一些情况下，合成皮革包含来自不同动物的胶原蛋白。不同的动物可以产生不同氨基酸组成的胶原蛋白，这可以导致不同的性质(以及所得皮革的差异)。胶原纤维单体可由约1050个氨基酸长的α-链产生，使得三螺旋采用约300nm长，直径约1.5nm的杆的形式。
合成皮革可包含一种或多种类型的胶原蛋白。包含在合成皮革中的胶原蛋白可包括纤维胶原蛋白、非纤维胶原蛋白或其组合。纤维胶原蛋白包括I型、II型、III型、V型和XI型胶原蛋白。非纤维胶原包括具有中断三螺旋的原纤维相关胶原蛋白(例如，IX型、XII型、XIV型、XVI型和XIX型)、短链胶原蛋白(例如，VIII型和X型)、基膜胶原蛋白(IV型)、Multiplexin(有中断的多个三螺旋域)(例如，XV型和XVIII型)、MACIT胶原蛋白(具有中断三螺旋的膜相关胶原蛋白)(例如，XIII型和XVII型)。
胶原蛋白可包含在合成皮革的一个或多个部分中。例如，胶原蛋白可以包含在合成皮革中的一个或多个真皮层、一个或多个表皮层或其组合中。例如，胶原蛋白可以包含在合成皮革中的一个或多个分层结构中。在一些情况下，当部分合成皮革在加工过程中被移除时，胶原蛋白也可以包含在经历移除的产品中。
合成皮革中的胶原蛋白可以来自一种或多种来源。例如，胶原蛋白可以由合成皮革中的胶原蛋白产生细胞产生。例如，胶原蛋白可以单独添加到皮革中。在一些情况下，合成皮革包含由胶原蛋白产生细胞产生的胶原蛋白和单独添加的胶原蛋白。
合成皮革中的至少部分胶原蛋白可以由胶原蛋白产生细胞产生。这样的胶原蛋白产生细胞可以包含在合成皮革中。示例性的胶原蛋白产生细胞包括上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞、平滑肌细胞或其组合。上皮细胞可包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。成纤维细胞可包括真皮成纤维细胞。角质形成细胞可包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。合成皮革中的胶原可以由一种或多种类型的胶原蛋白产生细胞产生。
添加剂
合成皮革可进一步包含一种或多种添加剂。这类添加剂可以增强商业吸引力(例如外观、颜色或气味)。示例性的添加剂包括矿物质、纤维、脂肪酸和氨基酸、蛋白质。添加剂可以是气味剂。
添加剂可包括以下一种或多种：基质蛋白、蛋白聚糖、抗氧化剂、全氟化碳和生长因子。生长因子可以是蛋白质、多肽或多肽复合物，包括细胞因子(例如，由细胞产生并可以影响其自身和/或多种其他相邻或远处细胞)。生长因子可以影响特定类型细胞的生长和/或分化，无论是在发育上，还是响应于对多种生理或环境刺激。一些(但不是全部)生长因子是激素。示例性的生长因子包括胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)，包括碱性FGF(bFGF)，血小板衍生生长因子(PDGFs)，包括PDGF-AA和PDGF-AB，肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)，包括TGFpi和TGFP3，表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-8等。其他多肽或分子(例如，愈合剂；酶，如基质降解酶和基质降解酶抑制剂(例如，TIMP)、抗生素和抗真菌剂)也可以添加到合成皮革中。
添加剂还可包括本领域已知的防腐剂。示例性的防腐剂包括抗微生物防腐剂，如丙酸钙、硝酸钠、亚硝酸钠、亚硫酸盐(例如二氧化硫、硫酸氢钠、亚硫酸氢钾等)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、抗氧化剂如丁羟茴醚(BHA)和丁羟甲苯(BHT)。
在某些情况下，合成皮革可包含细胞外基质或结缔组织。例如，合成皮革可进一步包含胶原蛋白、角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物及其组合。
合成皮革的图案
合成皮革可以进行图案化。例如，合成皮革可以在选择动物的皮肤图案后进行图案化，该动物选自羚羊、熊、海狸、野牛、野猪、骆驼、驯鹿、猫、牛、鹿、狗、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、北山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、猞猁、水貂、驼鹿、公牛、西貒、猪、兔、海豹、绵羊、松鼠、虎、鲸鱼、狼、牦牛、斑马、乌龟、蛇、鳄鱼、短吻鳄、恐龙、青蛙、蟾蜍、沙罗曼蛇、蝾螈、鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑、火鸡、凤尾鱼、鲈鱼、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、海豚鱼、蝠鲼、马林鱼、橙连鳍鲑、河鲈鱼、梭子鱼、狭鳕鱼、鲑鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎目鱼、黄貂鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、碧古鱼及其组合。图案可以是幻想动物的皮肤图案，该动物选自龙、独角兽、格里芬、塞壬、凤凰、狮身人面像、独眼巨人、萨堤尔、美杜莎、珀加索斯、塞伯拉斯、堤福俄斯、戈耳工、卡律布狄斯、恩浦萨、喀迈拉、弥诺陶洛斯、塞特斯、九头蛇、半人马、仙女、美人鱼、尼斯湖水怪、大足野人、雷鸟、雪人、卓柏卡布拉以及它们的组合。
合成皮革可制成与传统的动物皮肤、生皮或皮革产品类似的产品，其设计参数(例如，细胞类型、添加剂、大小、形状)。在一些情况下，合成皮革包含细胞层，该细胞层的特征在于其组成可基本上类似于传统的动物皮肤、生皮或皮革产品。例如，这样的层的特征在于其组成可以是基本上约60％至80％的水性流体、约14％-35％的蛋白质、约1％-25％的脂肪。在一些情况下，细胞层的角质形成细胞是对齐的。例如，角质形成细胞可以通过施加电场来对齐。例如，角质形成细胞可以通过施加机械刺激，例如周期拉伸和松弛基层来对齐。在一些情况下，对齐的(例如，电取向的和机械取向的)角质形成细胞彼此之间具有基本相同的取向，如在许多动物皮肤组织中可见的。
皮革制品
本文的合成皮革可以是皮革制品的至少一部分。例如，合成皮革可用作皮革制品中天然皮革的替代品。示例性的皮革制品包括表带、皮带、吊带、包装、鞋、靴子、鞋袜、手套、服装(例如，上衣、下装和外套)、行李箱、包(例如，带有不带肩带的手提包)、手包、手提袋、零钱包、皮夹、钥匙袋、信用卡包、笔盒、背包、盒、钱包、马鞍、马具、鞭子、旅行用品(例如，行李箱、手提箱、旅行袋、化妆袋或卫生用具包)、背囊、文件夹、文件袋、公事包、公文包、宠物用品(例如皮带或项圈)、打猎和钓鱼用品(例如，枪盒、餐具盒或用于坚固手臂的皮套)、固定物品(例如，书写板、书皮、相机包、眼镜盒、烟盒、雪茄盒、珠宝盒或移动电话套)、运动物品(例如，诸如篮球、足球或橄榄球等球)、建筑物内饰、建筑物外饰、室内装饰品、书籍装订、家具、灯具、灯罩、桌布、墙面覆盖材料、地板覆盖物、天花板覆盖物、汽车内饰、汽车外饰、船内饰、船外饰、飞机内饰、游艇内饰、游艇外饰、枕套、床单、被套、珠宝、配件、眼镜、太阳眼镜或消费类电子产品。例如，皮革制品可以是手表包装。例如，皮革制品可以是皮带。例如，皮革制品可以是包。
皮肤移植物
合成皮革或其部分也可用作皮肤移植物，例如用于移植到受试者的同种异体移植物或异种移植物。例如，合成皮革、真皮层、表皮层和/或分层结构可以是用于同种异体移植或异种移植的皮肤移植物的来源。在一些情况下，合成皮革、真皮层、表皮层和/或分层结构可以用为了减少移植物接受者中的免疫排斥而遗传修饰的细胞产生。
方法
本文还公开了合成皮革的制备方法。该方法可包括形成人造真皮层、形成人造表皮层或其组合。该方法可以进一步包括鞣制人造真皮层和/或人造表皮层的至少一部分。合成皮革中的细胞，例如真皮层和/或表皮层中的细胞，可以从干细胞(例如，iPSC)分化。本文的方法可以进一步包括使干细胞(例如iPSC)分化成合成皮革中的细胞，例如真皮层和/或表皮层中的细胞。在某些情况下，该方法包括将第一细胞层(例如，表皮层)置于第二细胞层(例如，真皮层)上，从而形成分层结构，并且鞣制该分层结构的至少一部分。在一些情况下，该方法可以进一步包括移除第一细胞层(例如，表皮层)的至少一部分。
形成细胞层
细胞层可以通过制备包含一种或多种类型的细胞的多个多细胞体，并将这些多细胞体排列成细胞层而形成。例如，可以通过相邻地排列多个多细胞体形成细胞层，其中这些多细胞体融合形成平面层。
形成细胞层可能需要支架。细胞层可以通过在支架上排列多个多细胞体而形成。例如，该形成步骤可包括将多细胞体排列或放置于支持基底上，该支持基底允许多细胞体融合形成层(例如，基本上是平面的层)。在一些情况下，多细胞体或层彼此相邻地水平和/或垂直排列。此外，形成细胞层可能不需要支架。
细胞层可以通过将细胞嵌入培养基或凝胶中而形成。在一些情况下，真皮层可以使用嵌入胶原蛋白I或纤维蛋白凝胶中的成纤维细胞形成。也可以使用其他类型的介质。例如，介质可以促进成纤维细胞分泌足量的细胞外基质，从而能够在不需要胶原蛋白凝胶的情况下延长表皮的维持。
形成多细胞体
制备具有本文所述特性的多细胞体有多种方法。在一些情况下，多细胞体可以由含有多个细胞的细胞糊制成，例如其具有所需的细胞密度和粘度。在进一步的情况下，该细胞糊可以成型为所需形状，并通过成熟(例如孵育)形成多细胞体。在一些情况下，可以通过将包含多个细胞的细胞糊成型为细长形状(例如圆柱体)而产生细长的多细胞体。在进一步的情况下，该细胞糊可以在受控环境中孵育，以允许细胞彼此粘附和/或凝聚，以形成细长的多细胞体。例如，可以通过在以三维形状保持细胞糊的装置中将包含多个活细胞的细胞糊成型，来产生多细胞体。在一些情况下，该细胞糊可以在受控环境中孵育，同时它可以以三维形状保持足够的时间，从而产生如本文所述具有足以在平坦表面上支撑自身的凝聚力的主体。
细胞糊可以通过以下方式提供：(A)将细胞或细胞聚集体(一种或多种细胞类型)和细胞培养基(例如，以预定比率)混合以产生细胞悬浮液，并且(B)压实该细胞悬浮液以产生具有所需细胞密度和粘度的细胞糊。压实可以通过许多方法实现，例如浓缩由细胞培养产生的特定细胞悬浮液，以达到细胞糊所需的细胞浓度(密度)、粘度和稠度。在一些情况下，可以将来自细胞培养的相对较稀的细胞悬浮液离心确定的一段时间，以在沉淀物中达到允许在模具中成型的细胞浓度。切向流过滤(“TFF”)是另一种适合浓缩或压实细胞的方法。在一些情况下，化合物与细胞悬浮液组合，以提供所需的挤出性能。合适的化合物包括胶原、水凝胶、基质胶、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶和纤维蛋白原。还可以通过将细胞沉淀物重新悬浮于含有ECM组分(或ECM组分的衍生物)的一种或多种生理学上可接受的缓冲液中，并将得到的细胞悬浮液再次离心以形成细胞糊，从而包括一种或多种ECM组分(或ECM组分的衍生物)。
可以使用各种方法来使细胞糊成型。例如，在一个特定的实施方案中，可以手动模塑或压制细胞糊(例如，在浓缩/压实后)以获得所需的形状。作为另一个实例，可将细胞糊吸收(例如，吸出)到预成型的器械如微量移液管(例如，毛细吸管)中，该器械使细胞糊成型以符合该器械的内表面。微量移液管(例如，毛细吸管)的横截面形状可以是圆形、正方形、矩形、三角形或其他非圆形横截面形状。在一些实施方案中，可以通过将细胞糊沉积到预成型的模具如塑料模具、金属模具或凝胶模具中来使其成型。在一些实施方案中，可采用离心浇铸或连续浇铸使细胞糊成型。
细胞糊可以进一步成熟。在一些情况下，细胞糊可以在约37℃孵育一段时间(其可以依赖于细胞类型)，以促进粘附和/或凝聚。备选地或者另外，细胞糊可以在含有因子和/或离子的细胞培养基的存在下保持，以促进粘附和/或凝聚。
将多细胞体排列在支持基底上以形成层
多细胞体可以排列在支持基底上，以产生所需的三维结构(例如，基本上为平面的层)。例如，多细胞体可以手动放置成彼此接触，通过从移液管、喷嘴或针挤出而沉积在适当位置，或通过自动化机器如生物制造器定位成接触。
支持基底可以是流体、气体和营养物可渗透的，并且允许细胞培养基在排列和随后的融合过程中接触多细胞体和/或层的所有表面。在一些情况下，支持基底可以由诸如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和其他细胞外基质等天然生物材料制成。在一些情况下，支持基底可由诸如羟基磷灰石、藻酸盐、琼脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸及其共聚物等合成生物材料制成。在一些情况下，支持基底可以是固体、半固体或固体和半固体支持元素的组合。在一些情况下，支持基底可以是平面的，以便于生成平面层。在一些情况下，支持基底可以上升或抬高到非渗透表面以上，例如细胞培养环境(例如培养皿、细胞培养瓶等)或生物反应器的一部分以上。可渗透的、抬高的支持基底可有助于预防过早的细胞死亡，有助于增强细胞生长，并促进多细胞体融合形成层。
一旦完成层的组装，就可以将组织培养基倒在构建体的顶部上。在一些情况下，组织培养基进入多细胞体之间的空间，以支持多细胞体中的细胞。可以使三维构建体中的多细胞体彼此融合，以产生用于形成合成皮革的层(例如，基本上平面的)。术语“融合”可以表示连续多细胞体的细胞通过细胞表面蛋白质之间的相互作用直接地，或通过细胞与ECM组分或ECM组分的衍生物的相互作用间接地彼此粘附和/或凝聚。融合层可以完全融合，并且该多细胞体成为基本上连续的。或者，融合层可以基本上融合或部分融合，并且多细胞体的细胞已经粘附和/或凝聚到允许完整地移动和操纵该层所必需的程度。
多细胞体可以在细胞培养环境(例如，培养皿、细胞培养瓶或生物反应器)中融合形成层。在一些情况下，多细胞体在环境中融合形成层，该环境具有适于促进包括在多细胞体中的细胞类型生长的条件。在一些情况下，融合进行约15、20、25、30、35、40、45、50、55和60分钟，以及其中的增量。在其他情况下，融合进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48小时，以及其中的增量。在其他情况下，融合进行约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12和14天，以及其中的增量。在进一步的情况下，融合进行约2小时至约24小时。与融合时间相关的因素可包括细胞类型、细胞类型比率、培养条件和添加剂如生长因子的存在。
一旦层的融合完成，层和支持基底就可以分离。在其他情况下，当层的融合基本完成或部分完成时，将层和支持基底分离，但是该层的细胞彼此粘附和/或凝聚到允许移动、操纵和堆叠该层而不会将其分散所必需的程度。可以通过熔化、溶解或降解支持基底的标准程序分离层和支持基底。在一些情况下，例如，可以通过温度变化、光或其他对层没有不利影响的刺激来溶解支持基底。在某些情况下，支持基底可以由柔性材料制成，并从该层上剥离。分离的层可以转移到生物反应器中，以进一步成熟。在一些情况下，分离的层在并入工程化动物皮肤、生皮或皮革产品后成熟并进一步融合。
或者，层和支持基底可以不分离。在包装、冷冻、销售或消费组装的工程化动物皮肤、生皮或皮革产品之前，支持基底降解或生物降解。
细胞层可以在一段时间内形成。在一些情况下，细胞层，例如表皮层或真皮层，可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、120、300天内形成。在一些情况下，真皮层可以在约1至15天，例如5至10天，或10至12天内形成。在一些情况下，真皮层可以在约5至25天，例如14至15天内形成。
本公开内容提供了制备屏障功能改善的合成皮革的方法。在一些情况下，该方法包括提供角质形成细胞和包含抗坏血酸和亚油酸的培养基；并且在可以形成具有改善的屏障功能的合成皮革的条件下培养该角质形成细胞。在一些情况下，培养条件包括在约50％至95％的湿度，例如约75％的湿度下培养。在一些情况下，抗坏血酸可以以约10至100μg/ml的浓度提供。在更进一步的情况下，亚油酸可以以约5-80μmol的浓度提供。本公开内容不限于由特定来源的角质形成细胞形成的合成皮革。实际上，合成皮革可以由多种原代和永生化角质形成细胞形成，包括但不限于近二倍体永生化角质形成细胞(NIKS)。在更进一步的情况下，该角质形成细胞表达外源野生型或变异Kruppel样因子(GKLF)。在更进一步的情况下，该角质形成细胞来自于两种不同的来源。在其他情况下，该合成皮革的表面电容为约40pF至约240pF。在一些优选的情况下，皮肤等同物的表面电容为约80pF至约120pF。在其他优选的情况下，皮肤等同物中神经酰胺5、6和7的含量可以是总神经酰胺含量的约20％至约50％。在另外其他优选的情况下，皮肤等同物中神经酰胺2的含量可以是总神经酰胺含量的约10％至约40％。在更进一步的情况下，本公开内容提供了由刚刚描述的方法制成的皮肤等同物。
排列各层以形成分层结构
可以排列多个细胞层以形成分层结构，从而产生本文所述的合成皮革。在一些情况下，真皮层和表皮层分开形成，并通过将表皮层置于真皮层之上(例如，当表皮层和真皮层完全形成时)来组装。在一些情况下，表皮层可以在真皮层之上生长。在一些情况下，可以在真皮层与表皮层之间放置基膜或基膜替代物。例如，可以将细胞层手动放置成彼此接触，或者根据计算机脚本，通过自动化的、计算机辅助的机器，如生物制造器，将其沉积在适当位置。
在组装多个细胞层之前，可以进行一个或多个质量控制步骤。例如，可以在置于真皮上之前对表皮进行跨上皮电阻测量(TEER)(例如，0天)，然后进行组织学分析(例如，最少3～5天)。使用本文提供的方法，不正确地形成分层结构或全厚皮肤等同物的风险可能较低。
多个细胞层可以由各种方式组装。在一些情况下，将表皮层和真皮层(具有或不具有基膜替代物)置于支架(例如丝)上，例如，以达到天然皮革的厚度和拉伸强度。在一些情况下，在不使用支架的情况下组装表皮层和多个真皮层(具有或不具有基膜替代物)。这样的组装可以达到类似于天然皮革的厚度和拉伸强度。在一些情况下，将表皮层和多个真皮层(具有或不具有基膜替代物)置于支架(例如，丝)上，达到类似于天然皮革的厚度和拉伸强度。
在一些实施方案中，化学、机械、性能、强度、耐久性、湿度、尺寸测试或其组合可以在一个或多个多细胞层、合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、分层结构、由其生产的产品上进行。在一些实施方案中，可以使用非标准测试进行化学、机械、性能、强度、耐久性、湿度、尺寸测试或其组合。在一些实施方案中，可以使用标准测试进行化学、机械、性能、强度、耐久性、湿度、尺寸测试或其组合。在一些实施方案中，可以进行由国际标准组织(ISO)、欧洲标准组织(CEN)、ASTM国际或国际皮革技师和化学家联合会(IULTCS)指示和/或采用和/或批准和/或开发的测试。在一些实施方案中，可以使用任何一种或多种相应的方法或其任何变型进行表1-表11任一个中的测试或其任何变型。
表1
表2
表3
表4
ASTM的皮革标准-服装测试标题
名称 测试标题
D1913-00(2015) 服装型皮革耐湿性的标准测试方法(喷射测试)
D2096-11 皮革洗涤中色牢度和颜色转移的标准测试方法
D2821-14 用扭丝仪测量皮革相对刚度的标准测试方法
D5053-03(2015) 皮革摩擦脱色色牢度的标准测试方法
D5552-10(2015) 有色皮革耐洗后褪色的标准测试方法
D6012-03(2013) 测定皮革耐(洗后褪色)色渍转移的标准测试方法
D6013-00(2010) 测定皮革对洗烫的区域稳定性的标准测试方法
D6014-00(2015) 测定皮革表面的动态吸水性的标准测试方法
表5
表6
表7
ASTM的皮革标准-鞋袜
名称 测试标题
D2098-13 用Dow Corning皮革测试仪测定鞋面皮革的动态耐水性的标准测试方法
D2099-14 用Maeser水渗透测试仪测定鞋面皮革的动态防水性的标准测试方法
D2210-13 用Mullen测试测定皮革的晶粒裂纹和伸长的标准测试方法
D2322-14 鞋面皮革对人造汗液的抵抗性的标准测试方法
D2346-13 皮革的表观密度的标准测试方法
D2941-13 测量皮革的断裂模式的标准测试方法(断裂标尺)
D6015-14 皮革的静态吸水性的标准测试方法
D7340-07(2012)e1 皮革导热性的标准实施规程
表8
ASTM的皮革标准-物理性质
名称 测试标题
D1516-05(2010) 皮革宽度的标准测试方法
D1610-01(2013) 为了测试而调节皮革和皮革产品的标准实施规程
D1813-13 测量皮革试样厚度的标准测试方法
D1814-70(2015) 测量皮革单元厚度的标准测试方法
D1815-00(2015) 植鞣皮革的吸水性(静态)的标准测试方法
D2207-00(2015) 通过球法测定皮革破裂强度的标准测试方法
D2209-00(2015) 皮革抗拉强度的标准测试方法
D2211-00(2015) 皮革伸长率的标准测试方法
D2212-00(2015) 皮革抗撕裂性的标准测试方法
D2347-00(2015) 测量皮革试样面积的标准测试方法
D2813-03(2013) 为了物理和化学测试进行皮革取样的标准实施规程
D4704-13 皮革切口撕裂的撕裂强度的标准测试方法
D4705-13 皮革的缝合撕裂强度的标准测试方法，双孔
D5052-00(2010) 皮革对水蒸气的渗透性的标准测试方法
D6076-08(2013) 皮革收缩温度的标准测试方法
D6182-00(2015) 皮革饰面柔韧性和附着力的标准测试方法
D6183-00(2015) 皮革饰面粘着性的标准测试方法
D7255-14 皮革耐磨性的标准测试方法(旋转平台，磨损法)
表9
ASTM的皮革标准-室内装饰品
名称 测试标题
D1912-00(2010) 室内装饰用皮革的耐冷裂性的标准测试方法
D2097-03(2010) 室内装饰用皮革表面屈折测试的标准测试方法
D2208-00(2010) 通过抓样法测定皮革断裂强度的标准测试方法
D6077-10 皮革梯形撕裂强度的标准测试方法
D6116-00(2010) 封阻的标准测试方法
D7912-14 饰面耐热老化性的标准测试方法(饰面稳定性)
表10
表11
ASTM的皮革标准-蓝湿皮
名称 标题
D4576-08(2013) 蓝湿皮的霉菌生长抗性的标准测试方法
D6656-14b 测定蓝湿皮中的氧化铬的标准测试方法(高氯酸氧化)
D6657-14ae1 蓝湿皮pH值的标准测试方法
D6658-08(2013) 通过烘箱干燥法测定蓝湿皮的挥发性物质(水分)的标准测试方法
D6659-10(2015) 为了物理和化学测试进行蓝湿皮取样和制备的标准实施规程
D6714-01(2015) 灰化蓝湿皮中的氧化铬的标准测试方法(高氯酸氧化)
D6715-13 为了化学和物理测试进行新鲜或盐保存(固化)生皮和皮肤取样和制备的标准实施规程
D6716-08(2013) 蓝湿皮或白湿皮的总灰分的标准测试方法
D7476-08(2013) 固化(盐保存)生皮和皮肤的盐水饱和值的标准测试方法
D7477-08(2013) 测定蓝湿皮浸没在沸水中的区域稳定性的标准测试方法
D7584-10(2015) 评估蓝湿皮表面对环境室中真菌生长的抗性的标准测试方法
D7674-14a 蓝湿皮和白湿皮的己烷/石油醚萃取物的标准测试方法
D7816-12 Raceway盐水、盐水固化的生皮和皮肤中嗜盐和蛋白水解细菌计数的标准测试方法
D7817-12 Raceway盐水、盐水固化的生皮和皮肤中酵母和霉菌计数的标准测试方法
D7818-12 新鲜(未固化)生皮和皮肤中蛋白水解细菌计数的标准测试方法
D7819-12 新鲜(未固化)生皮和皮肤上酵母和霉菌计数的标准测试方法
在一些实施方案中，皮革产品可具有类似于真皮的物理性质。在一些实施方案中，通过ASTM D-2209-95测量，本文公开的合成皮革或由其制成的皮革产品可具有至少约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000lbs/in2的拉伸强度。在一些实施方案中，通过ASTM D-2209-95测量，本文公开的合成皮革或由其制成的皮革产品可具有小于约5000、4000、3000、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20lbs/in2的拉伸强度。
在一些实施方案中，通过ASTM-D2212-94测量，本文公开的合成皮革或由其制成的皮革产品可具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100lbs的狭缝(slit)。在一些实施方案中，通过ASTM-D2212-94测量，本文公开的合成皮革或由其制成的皮革产品可具有小于约200、150、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1lbs的狭缝。在一些实施方案中，按照ASTM-D4705-93测量时，本文公开的合成皮革或由其制成的皮革产品可具有至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100的针脚。在一些实施方案中，本文公开的合成皮革或由其制成的皮革产品可具有少于约200、150、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1的针脚。在一些实施方案中，本文公开的合成皮革或由其制成的皮革产品，当根据它们各自的试验测量时，可具有至少约30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100lbs的狭缝和针脚值。在一些实施方案中，根据ASTMD6182测量，本文公开的合成皮革或由其制成的皮革产品可具有至少约5000、6000、7000、8000、9000、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、80000的Bally屈折。
可以组装多个细胞层以形成合成皮革(例如，全厚皮肤等同物)。合成皮革可包括顶部、中部和底部。顶部可包括表皮层。例如，顶部可以是单层表皮层。中部可包括基膜替代物。在一些情况下，中部没有基膜替代物。例如，中部可具有厚度可忽略不计的层。底部可具有一个或多个真皮层。在一些情况下，底部具有置于支架(例如丝)上的单个真皮层。在一些情况下，底部具有多个真皮层(例如，多达5层)，而没有任何支架。在一些情况下，底部具有多个彼此堆叠并置于支架(例如丝)上的真皮层。
表皮层与真皮层之间的粘合性可强到足以抵抗层分裂。在一些情况下，细胞层可以通过粘附在支架上来组装。天然或合成粘合剂可用于组装。天然粘合剂可以是纤维蛋白胶、冷胶、动物胶(例如骨胶、鱼胶、皮胶、蹄胶、兔皮胶、肉胶)、血液白蛋白胶、酪蛋白胶、植物胶(例如淀粉、糊精胶、加拿大香脂、松香基胶、cocconia、阿拉伯树胶、背胶、乳胶、厚浆糊、甲基纤维素、粘液、间苯二酚树脂或脲醛树脂)或其任何组合。合成粘合剂可以是丙烯腈、氰基丙烯酸酯(例如，正丁基-2-氰基丙烯酸酯胶)、丙烯酸、间苯二酚胶、环氧树脂、环氧油灰、乙烯-乙酸乙烯酯、酚醛树脂、聚酰胺、聚酯树脂、聚乙烯、聚丙烯、聚硫化物、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯(包括白胶(例如Elmer's Glue)和黄木匠胶(脂肪族树脂)、聚乙烯醇、聚氯乙烯(PVC)、聚氯乙烯乳液(PVCE)、聚乙烯吡咯烷酮橡胶胶水、有机硅和苯乙烯丙烯酸共聚物。例如，可以使用纤维蛋白胶进行组装。例如，可以使用正丁基-2-氰基丙烯酸酯胶进行组装。
在一些情况下，堆叠细胞层(例如，基本为平面的层)以形成合成皮革。细胞层可以具有由多细胞体的放置、图案或取向限定的取向。在一些情况下，每一层可以相对于支持基底和/或一个或多个其他层以特定取向堆叠。例如，可以堆叠一层或多层，其取向包括相对于以下支持基底和/或层的旋转，其中该旋转可以在0.1至180度之间，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175和180度，或其中的增量。在其他情况下，所有层的取向基本相似。
一旦层的堆叠完成，可以使三维构造体中的层彼此融合，以产生合成皮革。在一些情况下，这些层在细胞培养环境(例如，培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中融合。在一些情况下，融合进行约15、20、25、30、35、40、45、50、55和60分钟，以及其中的增量。在其他情况下，融合进行1至48小时，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46和48小时，以及其中的增量。例如，融合可以在约2小时至约24小时内进行。
培养条件
细胞和细胞层可以在各种细胞培养条件下培养。细胞或细胞层可以在体外培养。例如，真皮层和/或表皮层可以在体外培养。或者，细胞或细胞层可以在体内培养。例如，真皮层和/或表皮层可以在体内培养。
细胞和细胞层可以用一种或多种补充物培养。所述一种或多种补充物可以是天然补充物、合成补充物或其组合。在一些情况下，补充物可以是添加剂。在一些情况下，一种或多种补充物诱导由iPSC衍生的成纤维细胞产生和组装细胞外基质，从而增强合成皮革的自然外观。示例性的补充物可包括ECM组分如胶原蛋白和纤维蛋白、生长因子、小分子如抗坏血酸等、大分子如硫酸葡聚糖、角叉菜胶等。
细胞层可以在一定的空气湿度下培养。例如，细胞层(例如，真皮层或表皮层)可以在约20％至约100％的湿度下培养。例如，湿度可以是约40％至约100％，约50％至约95％，约45％至约90％，约55％至约95％，约60％至约90％，约70％至约80％，约71％至约79％，约72％至约78％，约73％至约77％，约74％至约76％，约60％至约70％，约65％至约75％，约70％至约80％，约75％至约85％，约80％至约90％，约85％至约95％，约90％至约100％，约40％至约60％，约45％至约55％，约46％至约54％，约47％至约53％，约48％至约52％，约48％至约53％，约49％至约54％，或约47％至约51％。
皮革加工
鞣制
本文的方法可包括鞣制合成皮革的至少一部分，例如合成皮革中的真皮层和/或表皮层的至少一部分。鞣制可以使合成皮革类似于天然皮革，它可以是由动物生皮和皮肤(通常是牛皮)鞣制而成的耐用且柔韧的材料。本文中的鞣制可以指处理动物皮肤以生产皮革的方法。鞣制可以以各种方式进行，包括植鞣(例如，使用单宁)、铬鞣(铬盐，包括硫酸铬)、醛鞣(使用戊二醛或噁唑烷化合物)、合成鞣制(合成单宁，使用芳族聚合物)、细菌染色等。
可以进行鞣制，以将生皮/皮肤中的蛋白质转化为不会腐败的稳定的材料，同时保持该材料的柔韧性。铬可用作鞣制材料。可调节细胞层或分层结构的pH(例如，降低；例如pH降至约2.8-3.2)以增强鞣制；在鞣制之后，可以升高pH(“碱化”至略高的水平，例如pH约3.8-4.2)。
鞣制可以在细胞层，例如真皮层和表皮层上进行。鞣制也可以在分层结构，例如，包括至少真皮层和至少表皮层的分层结构上进行。在某些情况下，鞣制也可以在合成皮革上进行。例如，鞣制可以在形成细胞层(例如真皮层或表皮层)之后进行。例如，鞣制可以在形成分层结构之后进行。
鞣制可以通过改变细胞外基质(ECM)材料进行。鞣制可以通过改变ECM中的胶原蛋白进行。鞣制可以使用鞣剂，例如硫酸铬(III)([Cr(H2O)6]2(SO4)3)进行。硫酸铬(III)可以溶解，从而得到六水合铬(III)阳离子[Cr(H2O)6]3+，其在较高的pH值下经历被称为羟联的过程，得到在鞣制中有活性的多铬(III)化合物，即胶原蛋白亚单位的交联物。一些配体包括硫酸根阴离子、胶原蛋白的羧基、来自氨基酸侧链的胺基团以及掩蔽剂。掩蔽剂可以是羧酸，例如乙酸，其用于抑制多铬(III)链的形成。掩蔽剂可以使鞣剂进一步提高pH，以增加胶原蛋白的反应性，而不会抑制铬(III)络合物的渗透。鞣制可以增大胶原蛋白中蛋白质链之间的由于羟联和氧联产生的间距(例如，从增大到)，这与采用多铬物质交联一致。铬可以与胶原蛋白交联。铬鞣皮革可含有约4％至5％的铬。这种效率的特征可在于增加的皮革水热稳定性，以及它对热水收缩的抵抗性。其他鞣剂可用于鞣制层状体以及使胶原蛋白改性。
鞣制也可以使用其他矿物质进行。在一些情况下，鞣制可以使用基于明矾、锆、钛、铁盐或其组合的试剂进行。
进一步的加工
此处制备的细胞层、分层结构和合成皮革可在鞣制后进一步加工。在一些情况下，本文提供的方法还包括一个或多个皮革加工步骤(例如，在传统皮革形成中使用的步骤)。加工步骤的实例包括：保存、浸泡、浸灰、脱毛、去肉、分裂、脱灰、再灰、软化、脱脂、起绒、漂白、着色、酸洗、脱酸、鞣制、再鞣制(例如，如果在加工过程中失去颜色)、减薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、挤水、剃刮、铬复鞣、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞、增白、固定、固着、干燥、调节、碾磨(例如，干磨)、拉软、磨光、整理、上油、刷涂、垫充填料、浸渍、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、电镀、压花、熨烫、上釉和滚鞣。
例如，可以通过控制用于构建动物皮肤、生皮或皮革的多细胞体和/或层的数目、大小和排列来使合成皮革成形。在其他情况下，动物皮肤、生皮或皮革可以通过例如切割、压制、模制或冲压来成形。合成皮革的形状可以制成类似于传统的动物皮肤、生皮或皮革产品。
本文的方法可包括移除此处生产的合成皮革的一部分。在一些情况下，该方法包括去除表皮层的至少一部分以形成移除的产品。例如，移除可以是剃刮。
色素沉着
本文的方法可包括使合成皮革着色。在一些情况下，可以通过在合成皮革中引入色素产生细胞(例如，黑素细胞)来进行色素沉着。在一些情况下，合成皮革包含功能性活黑素细胞。黑素细胞的位置可以与人类皮肤中的位置相似。在一些情况下，黑色素可以由黑素细胞组成型产生。在一些情况下，黑色素可以转移到角质形成细胞。在一些情况下，黑素细胞在刺激后产生，例如在紫外线辐射或色素原性活性剂如α黑素细胞刺激素(aMSH)、内皮素1(ET1)、干细胞因子(SCF)、前列腺素E2和F2α(PGE2、PGF2α)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或神经生长因子(NGF)刺激后产生。
祖细胞向合成皮革中的细胞的分化
表皮层中的细胞，如角质形成细胞和黑素细胞，以及真皮层中的细胞，如成纤维细胞，可以从祖细胞如iPSC衍生，例如分化。在其他情况下，原代细胞或源自原代细胞的培养细胞可用来形成细胞层，以制备合成皮革。
可以使用各种将iPSC分化为合成皮革中的细胞，例如角质形成细胞、黑素细胞或成纤维细胞的方法。在一些情况下，可以使用Petrova等人,3D In vitro model of afunctional epidermal permeability barrier from human embryonic stem cells andinduced pluripotent stem cells.Stem Cell Reports.2014年4月24日；2(5):675-89描述的方法，进行iPSC向角质形成细胞的分化和从iPSC衍生的角质形成细胞构建3D表皮。在其他情况下，可以使用原代细胞形成细胞层。例如，可以使用Sun R等人,Lowered humidityproduces human epidermal equivalents with enhanced barrier properties.TissueEng Part C Methods.2015年1月；21(1):15-22描述的方法，进行从原代角质形成细胞构建3D表皮。
在一些情况下，本文所述的方法提供了能可靠、准确且可再现地将合成皮革生产规模放大到商业水平的高通量方法。本文公开的合成皮革、工程化表皮等同物、工程化全厚皮肤等同物及其制备方法的优点包括但不限于以可再现、高通量且易于放大的方式制备具有吸引人的外观、质地、厚度和耐久性的定制组织。在一些实施方案中，本文所述的方法可以产生表皮层、真皮层、分层结构或合成皮革中的一种或多种的增加产量。在一些实施方案中，与可比较的方法相比，增加产量可以是至少约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或约15倍的产量。在一些实施方案中，本文公开的方法可降低合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、分层结构和由其产生的产品的制造成本。在一些实施方案中，本文公开的方法可以产生均匀厚度的合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、分层结构和由其产生的产品。在一些实施方案中，该合成皮革、人造表皮层、人造真皮层、分层结构和由其产生的产品可具有基本均匀的厚度、长度和/或宽度。在一些实施方案中，该表皮层、真皮层、分层结构中的任何一种或多种的细胞可以均匀地分布。在一些实施方案中，该表皮层、真皮层、分层结构中的任何一种或多种的细胞可以非均匀地分布。
表皮等同物的比较分析
图4A-4C示出了精细皮革、天然皮肤和表皮等同物的比较分析。图4A示出了天然皮肤和精细皮革的纵向截面的FESEM。图4A显示表皮(e)和真皮(d)的不同形态学结构。鞣制永久性地改变了皮肤的结构。表皮中各个细胞之间的边界变得难以区分。移除水分导致真皮中的胶原蛋白束变得更紧致和耐用。放大倍数：1000x。
图4B示出了FESEM图像。在一个实例中，图4B示出了精细皮革的表面和表皮等同物的表面均具有类似的光滑外观，表明它们可能引起有可比性的触觉(触摸)体验。放大倍数：2000x。
图4C示出了精细皮革和表皮等同物的纵向截面的FESEM。在鞣制发生之前，类似于图4A的天然皮肤的表皮，各个细胞层在表皮等同物中可区分。由于真皮中的胶原蛋白在很大程度上可决定皮肤的拉伸强度，因此胶原蛋白束可以赋予皮革厚度和耐久性(插入)，但可能无法提供感官体验，后者可能完全依赖于表皮的外层。
图5A-5C示出了天然皮肤和表皮等同物的角质层(SC；角化层)的比较分析。图5A示出了FESEM图像，其显示表皮等同物的表面比天然皮肤的表面看起来更光滑，这可能是由于细胞培养的受控环境所导致的。图5B示出了使用TEM，角化粒(箭头)——SC的主要“机械”连接部——可被检测为表皮等同物中的电子密度较大的区域。图5C说明角膜锁链蛋白(corneodesmosin，CDSN)可在角质化开始前不久由SG中的细胞合成，并排出到细胞外隙。CDSN可以嵌入由钙粘蛋白占据的SG桥粒的细胞间部分内，并以这种方式可形成角化粒。箭头指向天然皮肤和表皮等同物的SC中类似对齐的点状CDSN积累，可能代表角化粒。SC，角质层；SG，颗粒层；SS，棘层。
图6A-6E示出了天然皮肤和表皮等同物的颗粒层(SG；粒层)的比较分析。图6A示出了Loricrin(LOR)染色。LOR是角质化细胞被膜的主要蛋白质组分，并可以在角质化上皮的颗粒层中表达。在天然皮肤的表皮(图左侧)和表皮等同物(图右侧)中均检测到SG中类似的LOR表达图案(箭头指向的H&E染色的组织切片上的深褐色色素)。d，真皮；H&E，苏木精和曙红；SB，基底层；SC，角质层；SG，颗粒层；SS，棘层；*，Transwell滤膜。在图6B中，表皮Ca++梯度可以通过透射电子显微术捕获为电子致密沉淀物。在体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物(图右侧)中，Ca++沉积物存在于SG中，而不存在于SC中。SG，颗粒层；SS，棘层。在图6C中，通过镧灌注评估了渗透屏障完整性。镧在活SG的细胞外隙中可视化为电子致密沉积物，表明镧以及推而广之的水和其他小离子可以在该层中的角质形成细胞之间通过。相反，镧不能进一步渗透到SC中，因为功能性脂质屏障阻止其向上运动。在体外产生的表皮等同物表现出与天然皮肤同样功能性的渗透屏障。SG，颗粒层；SS，棘层。图6D说明紧密连接蛋白1/闭锁小带-1(TJP1/ZO-1)将紧密连接链蛋白质(其为脂双层内的原纤维样结构)锚定至肌动蛋白细胞骨架。箭头指向体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物(图右侧)的SG中类似对齐的亮绿色细胞膜相关的TJP1/ZO-1积累。SC，角质层；SG，颗粒层；SS，棘层。图6E说明串联聚集成被称为聚丝蛋白原的350kDa大型蛋白质前体的聚丝蛋白(FLG)单体存在于SG细胞中的透明角质颗粒中。箭头指向体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物(图右侧)的SG中类似对齐的亮红色颗粒和细胞膜相关的FLG积累。SC，角质层；SG，颗粒层；SS，棘层。
图7A-7C示出了用TEM评估的天然皮肤和表皮等同物中的脂双层形成。在图7A中，白色箭头指向体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物(图右侧)的SC和SG边界处的正常脂质分泌。在图7B中，在体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物(图右侧)的SG中看到板层小体(白色箭头)。图7C示出了体内天然皮肤(图左侧)的正常脂双层(LB)形态。在体外产生的表皮等同物(图右侧)中的脂双层具有类似的外观。SC，角质层。
图8A-8D示出了天然皮肤和表皮等同物的基底上层的标志物的比较分析。图8A、图8B和图8C显示，角蛋白10(KRT10)、角蛋白1(KRT1)、桥粒芯蛋白1(DCL1)——基底上层、棘层(SS)和颗粒层(SG)的标志物——在体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物(图右侧)中具有相似的表达图案，如通过免疫组织化学(KRT10；箭头指向的H&E染色的组织切片上的深褐色色素)和免疫荧光(箭头指示的红色细胞质/KRT1/和红细胞膜/DCL1/染色)所证明的。d，真皮；H&E，苏木精和曙红；SB，基底层；SC，角质层；SG，颗粒层；SS，棘层；*，Transwell滤膜。在图8D中，在体内天然皮肤和体外产生的表皮等同物中均清楚地限定了桥粒(箭头)。SS，棘层。
图9A-9D示出了天然皮肤和表皮等同物的基底层(SB；基底层)的比较分析。关于图9A、图9B、图9C和图9D，MKI67——一种增殖标志物、角蛋白14(KRT14)和转录因子TP63在体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物(图右侧)中均显示出典型的基底层分布，如通过免疫组织化学(MKI67；箭头指向的H&E染色的组织切片上的深褐色色素)和免疫荧光(箭头指示的绿色细胞质/KRT14/和白色细胞核/TP63/染色)所证明的。在体内天然皮肤和体外产生的表皮等同物中均清楚地限定了半桥粒(箭头)。BM，基膜；Cy，细胞质；d，真皮；H&E，苏木精和曙红；SB，基底层；SS，棘层；TM，Transwell滤膜。
图10A-10F示出了基膜的细胞外基质组分的比较分析。基膜(BM)可以由细胞外基质(ECM)蛋白的凝缩网络形成，其可以在真皮-表皮接合处提供必需的结构支架。整联蛋白β1通过将细胞与ECM连接来调节多种上皮细胞功能，其对于在真皮-表皮接合处维持BM可能是至关重要的。在图10A中，整联蛋白β1在体内天然皮肤(图左侧)和体外产生的表皮等同物(图右侧)中均显示出典型的基底层分布，如箭头(细胞膜相关染色)和箭头头部(在穿过Transwell膜上的孔突出的细胞的尖端上)所示。BM，基膜；d，真皮；SB，基底层；SS，棘层；SG，颗粒层；TM，Transwell膜。
纤连蛋白可以在细胞粘附中起作用。图10B说明在体内天然皮肤(图左侧)中，纤连蛋白可以主要在真皮中表达，而在BM区域中可以检测到相对较少的纤连蛋白。类似地，在体外产生的表皮等同物(图右侧)中，可以在穿过Transwell膜上的孔突出的细胞的尖端(红色箭头头部)上检测到纤连蛋白。d，真皮；SB，基底层；SS，棘层；SG，颗粒层；TM，Transwell膜。
由BM提供的机械支撑可以由胶原蛋白IV决定，或者在表皮等同物的情况下，由支架决定。在图10C中，如箭头头部所示，胶原蛋白IV表达在体内天然皮肤(图左侧)中和在体外产生的表皮等同物(图右侧)中具有类似的斑片状图案。BM，基膜；d，真皮；SB，基底层；SS，棘层；SG，颗粒层；TM，Transwell膜。
胶原蛋白VI可以在细胞粘附中起作用，并且可能与纤连蛋白相关。在体内天然皮肤(图左侧)中，胶原蛋白VI可以主要在真皮中表达，而在BM区域中可以检测到相对较少的胶原蛋白，如图10D所示。类似地，在体外产生的表皮等同物(图右侧)中，可以在穿过Transwell膜中的孔突出的细胞的尖端(箭头头部)上检测到胶原蛋白VI，图10D。BM，基膜；d，真皮；SB，基底层；SS，棘层；SG，颗粒层；TM，Transwell膜。
胶原蛋白VII可以针对真皮中的胶原蛋白I和III原纤维锚定基膜。在图10E中，如箭头头部所示，胶原蛋白VII表达在体内天然皮肤(图左侧)中和在体外产生的表皮等同物(图右侧)中具有类似的斑片状图案。BM，基膜；d，真皮；SB，基底层；SS，棘层；SG，颗粒层；TM，Transwell膜。
层粘连蛋白5(链组合物α3β3γ2)可以是锚定细丝的主要组分，并且对于体内BM的初始组装可能是必需的。在图10F中，如箭头头部所示，层粘连蛋白5在体内天然皮肤(图左侧)中与在体外产生的表皮等同物(图右侧)中具有相似的图案。除了其在表皮等同物中的额外丰度之外，在基底层细胞的细胞膜上还可以看到痕量的层粘连蛋白5(箭头)。BM，基膜；d，真皮；SB，基底层；SS，棘层；SG，颗粒层；TM，Transwell膜。
图11A-11I示出了全厚皮肤等同物(FSE)的结构分析。图11A和11B描绘了在2600x放大倍数(图11A)和5200x放大倍数(图11B)下显示不同的表皮细胞层的FSE的横截面。图11C描绘了900x放大倍数下的FSE表面，其具有与精细皮革类似的光滑外观，表明FSE可以引起有可比性的触觉(触摸)体验。图11D-11F描绘了在91x放大倍数(图11D)、162x放大倍数(图11E)和405x放大倍数(图11F)下真皮支架的纵向截面，其具有驻留的真皮成纤维细胞和丰富的细胞外基质。图11G-11I描绘了在80x放大倍数(图11G)、695x放大倍数(图11H)和2700x放大倍数(图11I)下的真皮支架，其具有驻留的真皮成纤维细胞和丰富的细胞外基质。
图12A-12R示出了工程化皮肤等同物的时间进程。图12A-12I描绘了将真皮成纤维细胞接种到支架上后第2天在36x放大倍数(图12A)、695x放大倍数(图12B)、1470x放大倍数(图12C)、7750x放大倍数(图12D)，2320x放大倍数(图12E)、2420x放大倍数(图12F)、6560x放大倍数(图12G)、17000x放大倍数(图12H)和22000x放大倍数(图12I)下的图像。细胞可以开始迁移到支架的中空结构中并分泌细胞外基质。图12J-12R描绘了将真皮成纤维细胞接种到支架上后第7天在64x放大倍数(图12J)、100x放大倍数(图12K)、364x放大倍数(图12L)、82x放大倍数(图12M)、253x放大倍数(图12N)、3940x放大倍数(图12O)、5550x放大倍数(图12P)、9440x放大倍数(图12Q)和21680x放大倍数(图12R)下的图像。纵向(图12J-12L)和横向截面(图12M-12R)可显示更密集的细胞和更丰富的细胞外基质，其中一些区域几乎完全阻塞了支架的中空结构(图12M-12P)。
实施例
实施例1.iPSC向角质形成细胞的分化
为了诱导分化，将未分化的iPSC转移到20％O2气氛环境中，并用mTESR1或补充有1mM ATRA(Sigma-Aldrich)和25ng/ml BMP4(R&D)的其他多能干细胞基础培养基处理7天(诱导)。
为了选择早期获得外胚层命运的细胞，收获细胞，以5～10X 103个细胞/cm2的密度重新接种到新制备的3D HDF ECM或其他类型的ECM上，并在Dulbecco改良的Eagle培养基/Ham F12(3:1；Life Technologies)或补充有血清替代物如人血小板裂解物以及1mM ATRA和25ng/ml BMP4的角质形成细胞培养基中再生长7天(选择)。
为了富集推定的表皮祖细胞，可以使用快速粘附到IV型胶原蛋白包被的培养皿上，并在确定成分的角质形成细胞-SFM或补充有1mM ATRA的其他角质形成细胞培养基中培养快速粘附的细胞7天(富集)。在此之后，细胞在EpiLife培养基(Life Technologies)或其他角质形成细胞培养基中再培养7天(扩充)，最后收获并分析。
实施例2.诱导多能干细胞分化为角质形成细胞谱系
用Geltrex和Col包被组织培养皿
本过程可以使用无菌技术在生物安全柜中进行。与基质胶(Matrigel)相似，Geltrex基质在室温(RT)下迅速固化。在到达时等分每批新的基质，并在使用试剂时使用预先冷却的移液管吸头、支架和管，制备50、100和200μL等份，并储存在-80℃。以1：100稀释度使用Geltrex。
可以对60mm组织培养皿描述以下包被过程。如果要使用较大的培养皿，需相应调整包被溶液的体积。1.从-80℃冰箱中取出50μL等份的Geltrex，并将其置于生物安全柜中的冰上。2.将5mL冷无菌DMEM/F12加入15mL锥形管中。3.使用1mL玻璃移液管，从步骤2中制备的15mL锥形管中取1mL冷DMEM/F12，并加入冷冻的Geltrex中。轻轻上下移液以解冻并溶解Geltrex。将溶解的Geltrex转移到步骤2中制备的15mL锥形管中的剩余DMEM/F12中。移液以混合稀释的Geltrex。4.将50μL的3mg/mL ColI储备液加入到来自步骤3的稀释的Geltrex中。移液以将稀释的Geletrex与ColI混合。将4mL包被溶液加入到60mm培养皿中。敲击或旋转该板，以确保整个表面都被包被。5.将培养皿与Geltrex/ColI包被溶液在组织培养箱中在37℃下孵育至少1小时。6.一旦包被完成，就将包被溶液留在培养皿中，然后如下一小节所述进行iPSC的平板接种。或者，吸出包被溶液，并将2mL新鲜DMEM/F12加入到包被的培养皿中，以防止其在细胞接种前干燥。
iPSC接种以用于分化
准备一个60mm组织培养皿，其中无饲养层(feeder)的iPSC生长至约70％汇合。在显微镜下检查细胞，以确认没有污染并维持其未分化的表型。如果细胞遭受应激或濒于死亡，它们就开始分化，自身呈现为具有较大多态性细胞的“鹅卵石”区域，并且不应当用于向角质形成细胞分化。
对于iPSC向角质形成细胞的分化，iPSC的分流比为1：8。1.在37℃水浴中预热N2B27培养基和分散酶(Dispase)。2.使用显微镜确认集落已准备好进行传代。从培养皿中轻轻吸出培养基。加入2mL1x PBS，旋转平板以洗涤细胞，轻轻吸出PBS。3.加入1mL分散酶，将平板放回37℃组织培养箱中3-5分钟。4.当细胞与分散酶一起孵育时，在Geltrex/ColI包被过程中轻轻吸出来自步骤6的Geltrex/ColI包被溶液(或DMEM/F12)，并将4mL完全N2B27培养基加入到包被的培养皿中。5.与分散酶孵育3～5分钟后，通过查看集落周围的卷边或折叠边缘确认细胞已准备好被挑取。6.将平板转移到生物安全柜中，小心吸出分散酶。在用分散酶处理后，集落非常松散地附着在培养皿的表面上，并且如果用力过大，集落可能脱落。7.轻轻加入2mL纯DMEM/F12。吸出培养基并重复洗涤3次。8.将2mL完全N2B27加入培养皿中，轻轻刮去平板上的集落。将细胞从培养皿转移到15mL锥形管中，加入6mL完全N2B27，使细胞悬浮液的总体积达到8mL。9.轻轻混合细胞悬浮液，以打破大的细胞团块。将1mL细胞悬浮液转移至在本小节的步骤3中制备的包被培养皿中。使用为给定实验室建立的条件，丢弃或重新接种剩余的细胞。10.将新接种的细胞移入培养箱，轻轻地前后左右摇动平板，以使细胞均匀分布。将细胞在37℃组织培养箱中孵育过夜。
用RA和BMP4分化iPSC
iPSC衍生的角质形成细胞的分化和传代培养将使用无菌技术在生物安全柜中进行。在传代后第二天检查新平板，以确认iPSC成功附着。如果iPSC开始形成集落，则继续进行下面的分化方案。
1.在37℃水浴中预热完全DKSFM(含抗生素和DKSFM补充物)。2.将来自前一步骤中5mL预热的DKSFM加入15mL锥形管中，并加入5μL的1mM RA以达到1μM的最终工作浓度和5μL的25μg/mL BMP4以达到25ng/mL的最终工作浓度，混合均匀。3.从接种有iPSC的培养皿中吸出N2B27培养基，用4mL的1x PBS洗涤一次，并添加4mL来自上一步骤的含有1μM RA和25ng/mL BMP4的DKSFM。这是分化过程的第1天。4.将细胞移入培养箱中并孵育48小时。5.孵育48小时后，用含有1μM RA和25ng/mL BMP4的新鲜DKSFM替换培养基。将细胞移入培养箱中，再孵育48小时。6.在第二轮48小时诱导(分化的第4天)后，用不含RA和BMP4的完全DKSFM替换培养基。在培养箱中，在完全DKSFM中孵育细胞10天，每隔一天更换一次培养基。7.在分化的第14天，通过添加抗生素和提供的补充物来制备完全CnT-07培养基，预热培养基。到该天为止，长大的iPSC集落中的大多数细胞开始表现出上皮样表型。8.从分化的细胞中吸出DKSFM，并用4mL完全CnT-07替换。将细胞在组织培养箱中再孵育10天，每隔一天更换一次完全CnT-07。
iPSC衍生的角质形成细胞的快速附着和培养
在分化第24天，远离长大的iPSC集落迁移的许多细胞表现出角质形成细胞样表型，并开始表达p63——外胚层向角质形成细胞命运定向所需的主要调节物，和Krt14。到该天为止，用于iPSC分化的60mm培养皿完全汇合，并且需要传代。为了在传代过程中富集iPSC衍生的角质形成细胞，将分化的iPSC培养物快速附着到ColI/ColIV包被的平板上。使用最多四个100mm ColI/ColIV包被的组织培养皿，从一个含有分化iPSC的60mm培养皿中进行快速附着过程。如果仅使用一个100mm培养皿，则接种四分之一的分化iPSC培养物以用于快速附着过程。
用ColI和ColIV包被平板
本过程可以使用无菌技术在生物安全柜中进行。1.在无菌0.25％冰醋酸中重建ColIV粉末至浓度为2mg/mL。在2～8℃下溶解数小时，偶尔旋转。制作等份，并在-20℃储存。2.通过将小瓶置于冰桶中，并在4℃下保持数小时，非常缓慢地解冻ColIV储备液(2mg/mL)的等份。3.将ColIV储备溶液重新悬浮于适当体积(5mL/100mL培养皿)的无菌0.25％冰醋酸中至最终工作浓度为7μg/mL。添加适当体积的ColI储备溶液，以达到30μg/mL的ColI最终工作浓度。使用5mL工作溶液包被平板以覆盖100mm培养皿。将平板在生物安全柜中在室温下孵育1小时。4.从包被的平板上吸出液体，用5mL无菌1x PBS漂洗培养皿一次，并用5mLddH2O漂洗一次。5.在生物安全柜中使洗过的培养皿风干。直接使用平板或用Parafilm密封，并在4℃下储存长达6个月。如果使用先前储存的经ColIV包被的平板，在细胞接种之前，使平板在生物安全柜中在室温下升温至少1小时。
iPSC衍生的角质形成细胞的快速附着
1.在分化第24天，预热完全CnT-07、Accutase和ColI/ColIV包被的培养皿。2.用1×PBS洗涤细胞，加入2mL Accutase，并在组织培养箱中孵育5分钟。在显微镜下确认细胞开始脱壁。3.加入3mL完全Cnt-07，上下移液，以移出细胞并将细胞悬浮液收集到15mL锥形管中。将细胞以260×g离心5分钟并吸出上清液。将沉淀物重新悬浮于10mL完全Cnt-07培养基中，以260×g重复离心5分钟，并吸出上清液。4.将沉淀物重新悬浮于4mL完全CnT-07中，上下移液，以将细胞团块破碎成单细胞。5.将9mL完全CnT-07培养基加入每个ColI/ColIV包被的培养皿中，并将1mL来自上述步骤4的细胞悬浮液转移到每个ColI/ColIV包被的培养皿中。使细胞在室温下附着到包被的培养皿上15-30分钟。6.小心吸出漂浮有细胞的培养基(这些是未分化的或部分分化的iPSC)。不要干扰附着的细胞(这些是iPSC衍生的Krt14阳性细胞)。将10mL新鲜的完全CnT-07培养基加入到具有附着的细胞的平板中。让细胞在37℃组织培养箱中扩充，每隔一天更换一次培养基。根据需要，在ColI包被的培养皿上使用在CnT-07或EpiLife(具有EDGS补充物)中的Accutase对细胞进行传代。在第2代或第3代之后，在快速附着步骤之后，培养物应由约90％的表现出角质形成细胞样表型的Krt14阳性细胞组成。所得培养物的角质形成细胞样表型可通过Krt14表达的标准免疫荧光分析以及根据在器官型培养物中重建正常分层表皮的能力来验证。
实施例3.从原代角质形成细胞制备表皮层
从单个新生儿包皮中分离原代角质形成细胞，并在补充有人角质形成细胞生长补充物的0.07mM Ca 2+154CF培养基(Life Technologies)中生长。根据制造商的方案，将第一代角质形成细胞(2.21×105/cm2插入物)的悬浮液接种到Cellstart CTS(LifeTechnologies)(或其他ECM底物)包被的PET、0.4-mm插入物(EMD Millipore)上的CntT-07培养基(CELLnTEC)或CnT-Prime培养基(CELLnTEC)中。
接种后第3天(D3)，将培养基换成CnT-02-3D(CELLnTEC)或CnT-3D Barrier(CELLnTEC)。第4天，通过向插入物的底部提供CnT-02-3D或CnT-3D Barrier，使HEE暴露于空气。从第4天开始，每天向HEE提供CnT-02-3D或CnT-3D Barrier，直至收获。HEE在37℃和5％CO2下，在潮湿(100％RH)或干燥培养箱(50％RH)中生长。使用表盘液体比重计(FisherScientific)测量培养箱的湿度。通过移除水盘保持低培养箱湿度。
为了控制摩尔渗透压浓度的可能变化，每天更新培养基。使用该方案未检测到摩尔渗透压浓度的显著变化，如通过Micro Osmometer(Precision Systems)所测量的。十二孔插入物用于跨上皮电阻(TEER)测量、光学显微术和电子显微术，而六孔插入物用于跨表皮水分损失(TEWL)测量和免疫印迹分析。
实施例4.培养表皮层
角质形成细胞以2.0-2.5×105个细胞/cm2聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜(具有0.4μm孔插入物)(EMD Millipore；目录号：MCHT12H48)的密度接种于CnT-07培养基(CELLnTEC)或CnT-Prime培养基(CELLnTEC)中。
接种后第3天(D3)，将培养基换成CnT-02-3D(CELLnTEC)或CnT-3D Barrier(CELLnTEC)。在第4天，通过向插入物的底部提供CnT-02-3D CnT-3D Barrier使细胞暴露于空气。从第4天开始，每天向表皮层提供CnT-02-3D或CnT-3D Barrier，直至第14天收获。
实施例5.制备支持基底
为了制备2％琼脂糖溶液，将2g超纯低熔点(LMP)琼脂糖溶解在100mL超纯水/缓冲溶液(1：1，v/v)中。该缓冲溶液可以任选地是PBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水1x)或HBSS(Hanks平衡盐溶液1x)。可将琼脂糖溶液置于含有温水(超过80℃)的烧杯中，并保持在热板上，直至琼脂糖完全溶解。只要温度高于36℃，琼脂糖溶液就保持液态。低于36℃时，发生相变，粘度增加，最后琼脂糖形成凝胶。
为了制备琼脂糖支持基底，可以将10mL液态2％琼脂糖(温度>40℃)沉积在10cm直径的培养皿中，并均匀铺展以形成均匀的层。让琼脂糖在冰箱中在4℃下形成凝胶。
实施例6.产生包含成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞的合成皮革
该方案的概要可以如下所述：a)使成纤维细胞和胶原蛋白溶液接触，然后孵育足够的一段时间，以获得其中分布有成纤维细胞的收缩的胶原蛋白基质，从而构成真皮等同物，b)用角质形成细胞和黑素细胞的混合物接种在a)中获得的真皮等同物，在液体培养基中浸泡培养，c)浸泡在b)中获得的整个培养物(接种在真皮等同物上的角质形成细胞和黑素细胞)，并在气-液界面处继续培养，直到在胶原蛋白基质中含有成纤维细胞的真皮等同物上获得含有黑素细胞的多层表皮等同物，从而构成皮肤等同物。
步骤a)可以用均相悬浮液中的I型胶原蛋白，特别是牛源I型胶原蛋白，或胶原蛋白I和III的混合物(相对于晶格最终体积约为30％)进行。有利地，向其中添加其他成分，如层粘连蛋白(特别是相对于最终体积为1％至15％)、胶原蛋白IV(特别是相对于最终体积为0.3％至4.5％)和/或巢蛋白(特别是相对于最终体积为0.05％至1％)，以获得均相悬浮液。成纤维细胞获自皮肤。将其在合适的培养基中培养，然后悬浮，之后与胶原蛋白和生长因子的悬浮液混合。将混合物在约37℃，通常36℃至37.5℃的温度下孵育1至6天，优选4或5天。有利地，将混合物在支持物上孵育，该支持物不允许其粘附，特别是防止混合物粘附到支持物边缘；这样的支持物尤其可以通过预先处理其表面，例如通过用牛白蛋白或血清包被所述表面而获得。由此获得胶原蛋白凝胶，其在几个方向上自由收缩，同时排出营养介质，并在其中嵌入成纤维细胞。
为了进行步骤b)，可以使用源自皮肤的角质形成细胞，优选来自成年皮肤的角质形成细胞。根据Rheinwald和Green(Cell,vol.6,331-344,1975)的技术，通过在生长因子，特别是氨基酸、血清、霍乱毒素、胰岛素、三碘甲状腺原氨酸和pH缓冲溶液的存在下，在本领域技术人员已知的合适的培养基中，在由3T3成纤维细胞构成的饲养支持物上培养，在接种前扩增角质形成细胞。特别地，这样的培养基可特别含有至少一种用于角质形成细胞的促有丝分裂生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)和/或角质形成细胞生长因子(KGF)，特别是KGF)、胰岛素、氢化可的松和可选的抗生素(例如：庆大霉素、两性霉素B)。
黑素细胞可以是源自年轻或成年动物皮肤的黑素细胞。通过在包含基础培养基如DMEM/F12或MCDB153并补充有黑素细胞特异性生长因子(例如，bFGF、SCF、ET-1、ET3或αMSH)、不存在佛波酯的合适的培养基中培养，特别是在M2培养基(Promocell)或其他培养基如M254(Cascades BiologicsTM)中培养，来扩增黑素细胞。
从这些培养物制备黑素细胞和角质形成细胞的细胞悬浮液，并混合，以获得混合的角质形成细胞/黑素细胞悬浮液。黑素细胞/角质形成细胞比例可以是1：10至2：1，通常约为1：1。将该混合悬浮液沉积在真皮等同物上。该真皮等同物有利地通过诸如胶原蛋白等生物材料附着到支持物上。将黑素细胞/角质形成细胞悬浮液沉积在环或任何等效装置中，以将其保持在分界的表面部分上。以覆盖细胞混合物的方式添加液体营养培养基。该培养基含有本领域技术人员已知的生长因子，特别是EGF和/或KGF。定期更换培养基，并作为浸泡继续培养，通常持续2至10天，特别是5至8天，和约7天。从浸泡第2天开始，理想的是从浸泡第4天开始，该培养基含有KGF。
随后，以本身已知的方式浸泡皮肤，以实现角质形成细胞的分化和分层的表皮等同物的形成。继续进行对应于在气-液界面处浸泡培养的该步骤c)，直到获得分化的结构，通常约7天。然而，步骤c)可以持续更长的一段时间，例如约28天，同时保留具有以上文本中规定的有益特性的皮肤等同物。营养培养基定期更新。随后移除皮肤等同物，以进行所需的测试。
实施例7.培养的皮肤样本中毛囊形成的诱导
将扩充的DP细胞与培养的ORS细胞混合，洗涤，并小心地以合适的细胞密度重新悬浮于20ml无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS，Sigma)中。由于DP和ORS细胞的不同培养时间不允许从同一供体制备两种细胞类型，因此每次实验所用的培养的DP和ORS细胞都是从不同供体获得的。在建立培养后1天将细胞悬浮液缓慢注入培养的皮肤片的真皮内。
实施例8.培养毛囊细胞群体
从枕骨区域获得毛囊。如Randall等人,A comparison of the culture andgrowth of dermal papilla cells from hair follicles from non-balding andbalding(androgenetic alopecia)scalp.Br J Dermatol 1996:134:437–444所述，制备并培养真皮乳头(DP)细胞。
简言之，在解剖显微镜下分离毛囊的DP，并单独转移至24孔组织培养板(Sarstedt)。细胞培养在补充有15％FCS(Sigma)的DMEM中进行。在细胞增殖开始后，将细胞培养至汇合，并扩充两代。为了分离外根鞘(ORS)细胞，切下含有凸起区域的毛囊中间部分，并进行温和的胰蛋白酶化。每次培养至少使用10个毛囊的细胞。将获得的细胞在RPMI-1640培养基(Sigma)中洗涤两次，并在标准角质形成细胞培养基(Epilife，Sigma)中进行细胞培养。培养1周后收获细胞。
实施例9.鞣制全厚皮肤等同物
全厚皮肤等同物通过铬鞣制法进行鞣制。第一步是冰和硫酸处理。这打开组织，使其可以接收铬。然后加入铬以及氧化镁。
该过程使全厚皮肤等同物的pH水平降低至约3。铬通过全厚皮肤等同物起作用后，引入鞣制液，使pH水平达到约4。随后进行温水浴，然后辊压，以去除多余的液体。然后，最后一步是在必要时进行表面处理，然后在拉伸的同时干燥全厚皮肤等同物，然后在完成时再次压制。
实施例10.X-tan鞣制方案
全厚皮肤等同物可以使用X-tan程序鞣制。在鞣制之前，用石灰处理全厚皮肤等同物，其包括浸泡皮肤等同物、添加基质、调节pH和洗涤的步骤。然后通过洗涤皮肤等同物、添加预脱灰缓冲液、对皮肤等同物进行脱灰和洗涤来对皮肤等同物进行脱灰。然后通过回湿、加入鞣制基质、将pH调节至有利于鞣制的pH、进行固定和固定循环以及加脂来鞣制皮肤等同物，以获得经鞣制的皮肤等同物。
实施例11.全厚皮肤等同物
I型胶原蛋白基质(含有0.5×106个iPSC衍生的成纤维细胞)可沉积在聚对苯二甲酸乙二醇酯膜(BD Biosciences)上，并使之聚合。将聚合的基质孵育约7天后，可将1×106个iPSC衍生的角质形成细胞和0.1×106个iPSC衍生的黑素细胞接种到该基质上，再孵育7天。可以将复合培养物抬高至气-液界面，并从下方进料，以诱导表皮分化。约14天后可以收获全厚皮肤等同物，并在LN2中快速冷冻或包埋到蜡中。用于黑色素定量。
实施例12.冷冻切片的免疫染色
固定：组织可在3.8％低聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.2-7.6中固定30分钟。样品可在PBS中洗涤3次，每次5分钟。组织样品可以在4℃和旋转下用一系列无菌蔗糖梯度(10％蔗糖过夜，15％蔗糖6-8小时，30％蔗糖过夜，最后在与最佳切割温度(OCT)复合物1：1混合的30％蔗糖中过夜)浸透。样品可包埋在OCT中，并冷冻于液氮蒸汽中。低温块可以在-80℃储存。
切割切片：切割前一天，可将低温块转移至-20℃过夜。可以使用标准低温恒温器制备切片(10μm)。加工之前，这些切片可以在-20℃保存。
加工：可以包括对照孵育。可以使用免疫前血清或同种型匹配的非免疫抗体代替第一抗体。切片可在90％冷丙酮中浸没10分钟或在0.2％triton X-100/PBS中浸泡5分钟，以暴露抗原。样品可在PBS中洗涤3次，每次5分钟。通过将切片浸没在含有0.1％triton X-100的5％BSA中1小时来封闭非特异性抗体反应性。然后将切片与两种抗体的混合物在4℃下孵育过夜：i)2.5μg/ml的ChromPure驴完整IgG(用于封闭；所有第二抗体都可以在驴中制备)；ii)1μg/ml合适的第一抗体。切片可在PBS中漂洗3次，每次5分钟。切片可与适当的物种特异性第二抗体一起在室温下孵育30至60分钟，所述第二抗体在驴中制备，并与红色或绿色荧光团缀合。切片可在PBS中洗涤3次，每次5分钟。然后切片可与10μg/ml Hoechst 33342在室温下孵育10分钟。切片可用PBS洗涤3次，每次5分钟。
可视化：样品可用Vectashield培养基(Vector)封固，并可用配备有适当滤光器的落射荧光显微镜(Zeiss)使样品可视化。
实施例13.石蜡包埋切片的免疫染色
固定：组织可在3.8％低聚甲醛/磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.2-7.6中固定30分钟。样品可在PBS中洗涤3次，每次5分钟。组织样品可在递增的乙醇系列(50％，70％，2×100％；各20分钟)和清洁剂(二甲苯，2×20分钟)中脱水。样品可以用石蜡在65℃下灌注2x 1小时，并包埋在石蜡块中。石蜡块可以在室温下储存，直至进一步使用。
切割切片：使用标准切片机将组织切成5μm厚。这些切片可以保存在室温下，直到加工。
加工：可以包括对照孵育。可以使用免疫前血清或同种型匹配的非免疫抗体代替第一抗体。这些切片可以在递增系列的二甲苯/乙醇系列2x二甲苯、2x 100％乙醇和1x70％和50％中再水合；各10分钟。然后切片可以用自来水短时漂洗。然后切片可以用苏木精染色5分钟。然后切片可以用dH2O洗涤，直至溶液澄清。切片可用0.5％曙红染色10分钟。然后切片可以在自来水中短时漂洗。通过将切片浸没在5％BSA中1小时来封闭非特异性抗体反应性。然后可以将切片与两种抗体的混合物一起在4℃下孵育过夜：i)2.5μg/ml的ChromPure驴完整IgG(用于封闭；所有第二抗体都在驴中制备)；ii)1μg/ml合适的第一抗体。切片可以在PBS中漂洗3次，每次5分钟。切片可以与适当的物种特异性第二抗体一起在室温下孵育30分钟，所述第二抗体在驴中制备，并与辣根过氧化物酶(HRP)缀合。切片可在PBS中洗涤3次，每次5分钟。
可视化：样品可以用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)底物试剂盒(VectorLaboratories)按照制造商的方案孵育。DAB产生褐色染色。如果将氯化镍加入到底物溶液中，则可产生灰黑色染色。样品可以在递增的乙醇系列(50％，70％，2×100％；各10分钟)和清洁剂(二甲苯，2×10分钟)中脱水。样品可以在封固介质中封固，并使用配备有数码相机的相差显微镜(Zeiss)可视化。
实施例14.场发射扫描电子显微术(FESEM)
固定：样品可在4℃下用4％低聚甲醛和2％戊二醛在0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.4)中固定24小时，并放置在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中，进一步加工之前保持在4℃。
加工：样品可用1％OsO4水溶液后固定1小时。在递增的乙醇系列(50％，70％，2×100％；各10分钟)中脱水后，样品可在Tousimis Autosamdri-815B仪器中用液态CO2进行临界点干燥，用双面铜带安装到15mm铝制支架上，并使用Denton DeskII Sputter Coater溅射涂覆金-钯。
可视化：可将重复样品的横截面安装到低轮廓45/90度SEM支架上，以分析内部形貌。可使用在2-3kV下运行的Zeiss Sigma FESEM(Carl Zeiss Microscopy，Thornwood，NY)，使用inLens Secondary Electron(SE)检测，以及在工作距离3-5mm处的混合信号InLens/SE2(75/25％)检测，进行可视化。可以使用存储分辨率2048x1536和行平均降噪算法以TIFF格式捕获图像。
加工：可以使用Denton DeskII Sputter Coater，将先前干燥的样品(即皮革)切割成一定大小，并溅射涂覆的金-钯。
可视化：可以将重复样品的横截面安装到低轮廓45/90度SEM支架上，以分析内部形貌。使用在2-3kV下运行的Zeiss Sigma FESEM(Carl Zeiss Microscopy，Thornwood，NY)，使用inLens Secondary Electron(SE)检测，以及工作距离3-5mm处的混合信号InLens/SE2(75/25％)检测，进行可视化。可以使用存储分辨率2048x1536和行平均降噪算法以TIFF格式捕获图像。
实施例15.透射电子显微术(TEM)
固定：样品可以在4℃下在0.1M二甲胂酸钠缓冲液(pH 7.4)中的2％戊二醛和2％低聚甲醛与0.06％氯化钙中固定30分钟。然后可将样品放置在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中，并在进一步加工之前保持在4℃。
加工：然后可以洗涤样品，并将其置于0.1M二甲胂酸钠(pH7.4)中的0.2％四氧化钌(用于脂双层的可视化)或1.5％四氧化锇与1.5％亚铁氰化钾中，在室温下避光45分钟。在缓冲液中漂洗后，样品可以在梯度乙醇系列(50％，70％，2×100％；各10分钟)中脱水，随后包埋在低粘度环氧树脂中。
可视化：半薄切片可用1％硼砂溶液中的1％甲苯胺蓝与1％天青II染色，并在相差显微镜(Zeiss)下观察。可以收集超薄切片，并用水饱和的3％乙酸铀酰染色，并且/或者在未涂覆的镍网格上用2.5％柠檬酸铅进行对比染色。可使用在60kV下运行的Zeiss 10A电子显微镜观察超薄切片。图像可以用TIFF格式捕获。
离子捕获细胞化学(Ca++梯度)：
固定：对于超微结构Ca++定位，可将样品在含有0.04M蔗糖的2％低聚甲醛、2％戊二醛、0.09M草酸钾中固定。样品随后可在4℃下固定过夜。
加工：样品可在含有2％焦锑酸钾的1％四氧化锇(pH 7.4)中在4℃下避光后固定2小时。然后组织样品可在碱化水(pH 10)中洗涤，并转移到乙醇溶液(50％，70％，2×100％；各10分钟)中，进行脱水并包埋在低粘度环氧树脂中。
可视化：可以收集超薄切片，并用水饱和的3％乙酸铀酰染色，并且/或者在未涂覆的镍网格上用2.5％柠檬酸铅进行对比染色。可以使用在60kV下运行的Zeiss 10A电子显微镜观察超薄切片。图像可以用TIFF格式捕获。
镧灌注：
固定：通过将样品在室温下浸入在含有2％戊二醛、1％低聚甲醛的0.05M Tris缓冲液(pH 7.4)中的4％硝酸镧中1小时，对所有受试样品评估灌注途径。
加工：可洗涤样品，并将其置于0.1M二甲胂酸钠(pH 7.4)中的1.5％四氧化锇和1.5％亚铁氰化钾中，在室温下避光45分钟。在二甲胂酸盐缓冲液中漂洗后，样品可在梯度乙醇系列(50％，70％，2×100％；各10分钟)中脱水，随后包埋在低粘度环氧树脂中。
可视化：可以收集超薄切片，并用水饱和的3％乙酸铀酰染色，并且/或者在未涂覆的镍网格上用2.5％柠檬酸铅进行对比染色。可以使用在60kV下运行的Zeiss 10A电子显微镜观察超薄切片。图像可以用TIFF格式捕获。
虽然本文已经展示和描述了一些实施方案，但这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本文提供的公开内容的情况下，本领域技术人员目前将想到许多变化、改变和替换。应该理解，可以使用本文所述实施方案的各种替代方案。

Claims (198)

1.一种制备合成皮革的方法，该方法包括：
a.形成包含成纤维细胞的人造真皮层；
b.鞣制所述真皮层的至少一部分，从而形成所述合成皮革，其中所述成纤维细胞从诱导的多能干细胞分化。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括形成人造表皮层。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述表皮层包含角质形成细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其进一步包括将所述表皮层置于所述真皮层上，从而形成分层结构。
5.一种制备合成皮革的方法，该方法包括：
a.将人造表皮层置于人造真皮层上，从而形成分层结构，其中所述表皮层包含角质形成细胞，并且所述真皮层包含成纤维细胞；以及
b.鞣制所述分层结构的至少一部分，从而形成所述合成皮革，其中所述成纤维细胞或所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
6.一种制备合成皮革的方法，该方法包括：
a.将人造表皮层置于人造真皮层上，从而形成分层结构，其中所述表皮层包含角质形成细胞，并且所述真皮层包含成纤维细胞；
b.移除所述表皮层的至少一部分，以形成经历移除的产品；以及
c.鞣制所述经历移除的产品的至少一部分，从而形成所述合成皮革；其中所述成纤维细胞或所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞是哺乳动物角质形成细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。
9.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述角质形成细胞表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。
11.如权利要求4-10中任一项所述的方法，其中所述分层结构进一步包含黑素细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述黑素细胞从诱导的多能干细胞分化。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述黑素细胞表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中所述合成皮革进一步包含色素。
15.如权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述黑素细胞是哺乳动物黑素细胞。
16.如权利要求7所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
17.如权利要求5-6中任一项所述的方法，其中所述成纤维细胞从诱导的多能干细胞分化。
18.如权利要求1或17所述的方法，其中所述成纤维细胞表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述成纤维细胞是哺乳动物成纤维细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。
21.如权利要求8或20所述的方法，其中所述非人哺乳动物是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。
22.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述表皮层进一步包含胶原蛋白。
23.如权利要求22所述的方法，其中对所述表皮层进行进一步加工。
24.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其中所述分层结构进一步包含胶原蛋白。
25.如权利要求24所述的方法，其中对所述分层结构进行进一步加工。
26.如权利要求6所述的方法，其中所述经历移除的产品进一步包含胶原蛋白。
27.如权利要求26所述的方法，其中对所述经历移除的产品进行进一步加工。
28.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述真皮层进一步包含胶原蛋白。
29.如权利要求28所述的方法，其中对所述真皮层进行进一步加工。
30.如权利要求23、25、27或29所述的方法，其中所述加工选自保存、浸泡、软化、酸洗、脱酸、减薄、复鞣、润滑、结壳、润湿、挤水、剃刮、铬复鞣、中和、染色、加脂、填充、剥离、填塞、增白、固定、固着、干燥、调节、碾磨、拉软、磨光、整理、上油、刷涂、垫充填料、浸渍、喷涂、辊涂、幕涂、抛光、电镀、压花、熨烫、上釉、滚鞣及其任何组合。
31.如权利要求22、24、26或28所述的方法，其中所述胶原蛋白至少部分地由胶原蛋白产生细胞产生，单独添加，或其任何组合。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述胶原蛋白产生细胞包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞或其组合。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述胶原蛋白产生细胞包括所述上皮细胞，其中所述上皮细胞包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述胶原蛋白产生细胞包括所述角质形成细胞，其中所述角质形成细胞包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述胶原蛋白产生细胞包括平滑肌细胞。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述合成皮革进一步包含角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合中的一种或多种。
37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述真皮层的厚度在约0.02mm至约5mm的范围内。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述真皮层的所述厚度在约0.1mm至约0.5mm的范围内。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述合成皮革进一步包含第一真皮层和第二真皮层。
40.如权利要求39所述的方法，其中将所述第一真皮层置于所述第二真皮层上。
41.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述表皮层的厚度在约0.01mm至约2mm的范围内。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述表皮层的所述厚度在约0.1mm至约0.2mm的范围内。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述合成皮革进一步包含第一表皮层和第二表皮层。
44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述合成皮革进一步包含基膜替代物。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述基膜替代物在所述表皮层与所述真皮层之间。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述基膜替代物包括干燥的非细胞羊膜。
47.如权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述真皮层在支架上形成。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述支架是天然的或合成的。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述支架包含丝。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述支架包含天然组织粘合剂。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述天然组织粘合剂包括纤维蛋白胶。
52.如权利要求47-51中任一项所述的方法，其中所述支架部分地包含在所述合成皮革中。
53.如权利要求1-51中任一项所述的方法，其中将所述真皮层或所述表皮层在体外培养。
54.如权利要求53所述的方法，其中将所述真皮层在体外培养。
55.如权利要求54所述的方法，其中将所述真皮层用补充物培养。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述补充物包含胶原蛋白、纤维蛋白、生长因子、抗坏血酸、硫酸葡聚糖或角叉菜胶中的一种或多种。
57.如权利要求55或56所述的方法，其中所述补充物是天然补充物。
58.如权利要求55或56所述的方法，其中所述补充物是合成补充物。
59.如权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述诱导的多能干细胞通过Oct3、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc或其组合在成年体细胞中的诱导基因表达而产生。
60.一种制备皮革制品的至少一部分的方法，该方法包括：
由通过权利要求1-59中任一项所述的方法产生的所述合成皮革形成所述皮革制品的所述至少一部分。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述皮革制品包括表带、皮带、包装、鞋、靴子、鞋袜、手套、服装、行李箱、包、手包、手提袋、背包、钱包、马鞍、马具或鞭子中的一种或多种。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述皮革制品是表带。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述皮革制品是皮带。
64.如权利要求61所述的方法，其中所述皮革制品是包。
65.通过权利要求1-59中任一项所述的方法制备的鞣制的合成皮革。
66.一种鞣制的合成皮革，其在鞣制之前包含：
含有成纤维细胞的人造真皮层，其中所述成纤维细胞从诱导的多能干细胞分化。
67.如权利要求66所述的鞣制的合成皮革，其在鞣制之前进一步包含人造表皮层。
68.如权利要求67所述的鞣制的合成皮革，其中所述表皮层进一步包含角质形成细胞。
69.如权利要求67或68所述的鞣制的合成皮革，其中所述表皮层在所述真皮层上，从而形成分层结构。
70.一种鞣制的合成皮革，其在鞣制之前包含：
分层结构，其包含：
含有成纤维细胞的人造真皮层，以及
含有角质形成细胞的人造表皮层，
其中所述成纤维细胞或所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
71.一种鞣制的合成皮革，其在鞣制之前包含：
包含分层结构的经历移除的产品，
其中所述分层结构包含：
含有成纤维细胞的人造真皮层，以及
含有角质形成细胞的人造表皮层，
其中所述表皮层的一部分被移除，其中所述成纤维细胞或所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
72.如权利要求68-71中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述角质形成细胞是哺乳动物角质形成细胞。
73.如权利要求72所述的鞣制的合成皮革，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。
74.如权利要求68-73中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
75.如权利要求74所述的鞣制的合成皮革，其中所述角质形成细胞表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。
76.如权利要求69-75中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述分层结构进一步包含黑素细胞。
77.如权利要求76所述的鞣制的合成皮革，其中所述黑素细胞从诱导的多能干细胞分化。
78.如权利要求77所述的鞣制的合成皮革，其中所述黑素细胞表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。
79.如权利要求77或78所述的鞣制的合成皮革，其中所述合成皮革进一步包含色素。
80.如权利要求76-79中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述黑素细胞是哺乳动物黑素细胞。
81.如权利要求80所述的鞣制的合成皮革，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。
82.如权利要求70或71所述的鞣制的合成皮革，其中所述成纤维细胞从诱导的多能干细胞分化。
83.如权利要求66或82所述的鞣制的合成皮革，其中所述成纤维细胞表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。
84.如权利要求66-82中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述成纤维细胞是哺乳动物成纤维细胞。
85.如权利要求84所述的鞣制的合成皮革，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。
86.如权利要求73、81或85所述的鞣制的合成皮革，其中所述非人哺乳动物是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。
87.如权利要求67-71中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述表皮层进一步包含胶原蛋白。
88.如权利要求69-71中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述分层结构进一步包含胶原蛋白。
89.如权利要求71所述的鞣制的合成皮革，其中所述经历移除的产品进一步包含胶原蛋白。
90.如权利要求66-89中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述真皮层进一步包含胶原蛋白。
91.如权利要求87-90中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述胶原蛋白至少部分地由胶原蛋白产生细胞产生，单独添加，或其任何组合。
92.如权利要求91所述的鞣制的合成皮革，其中所述胶原蛋白产生细胞包括上皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞、朗格汉斯细胞、基底细胞或其组合。
93.如权利要求92所述的鞣制的合成皮革，其中所述胶原蛋白产生细胞包括所述上皮细胞，其中所述上皮细胞包括鳞状细胞、立方细胞、柱状细胞、基底细胞或其组合。
94.如权利要求92所述的鞣制的合成皮革，其中所述胶原蛋白产生细胞包括所述角质形成细胞，其中所述角质形成细胞包括上皮角质形成细胞、基底角质形成细胞、增殖基底角质形成细胞、分化的基底上角质形成细胞或其组合。
95.如权利要求92所述的鞣制的合成皮革，其中所述胶原蛋白产生细胞包括平滑肌细胞。
96.如权利要求66-95中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述合成皮革进一步包含角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合中的一种或多种。
97.如权利要求66-96中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述真皮层的厚度在约0.02mm至约5mm的范围内。
98.如权利要求97所述的鞣制的合成皮革，其中所述真皮层的所述厚度在约0.1mm至约0.5mm的范围内。
99.如权利要求66-98中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述合成皮革进一步包含第一真皮层和第二真皮层。
100.如权利要求99所述的鞣制的合成皮革，其中所述第一真皮层在所述第二真皮层上。
101.如权利要求67-71中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述表皮层的厚度在约0.01mm至约2mm的范围内。
102.如权利要求101所述的鞣制的合成皮革，其中所述表皮层的所述厚度在约0.1mm至约0.2mm的范围内。
103.如权利要求101或102所述的鞣制的合成皮革，其中所述合成皮革进一步包含第一表皮层和第二表皮层。
104.如权利要求101-103中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述合成皮革包含基膜替代物。
105.如权利要求104所述的鞣制的合成皮革，其中所述基膜替代物在所述表皮层与所述真皮层之间。
106.如权利要求105所述的鞣制的合成皮革，其中所述基膜替代物包括干燥的非细胞羊膜。
107.如权利要求66-106中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述真皮层在支架上形成。
108.如权利要求107所述的鞣制的合成皮革，其中所述支架是天然的或合成的。
109.如权利要求107所述的鞣制的合成皮革，其中所述支架包含丝。
110.如权利要求109所述的鞣制的合成皮革，其中所述支架包含天然组织粘合剂。
111.如权利要求110所述的鞣制的合成皮革，其中所述天然组织粘合剂包含纤维蛋白胶。
112.如权利要求107-111中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述支架部分地包含在所述鞣制的合成皮革中。
113.如权利要求66-112中任一项所述的鞣制的合成皮革，其中所述真皮层或所述表皮层在体外培养。
114.如权利要求113所述的鞣制的合成皮革，其中所述真皮层在体外培养。
115.如权利要求66-114中任一项所述的鞣制的合成皮革，其包含在表带、皮带、包装、鞋、靴子、鞋袜、手套、服装、行李箱、包、手包、手提袋、背包、钱包、马鞍、马具或鞭子中的一种或多种中。
116.如权利要求115所述的鞣制的合成皮革，其包含在表带中。
117.如权利要求115所述的鞣制的合成皮革，其包含在皮带中。
118.如权利要求115所述的鞣制的合成皮革，其包含在包中。
119.一种人造表皮层，其包含：
毛囊细胞和黑素细胞，其中所述黑素细胞从诱导的多能干细胞分化。
120.如权利要求119所述的表皮层，其中所述毛囊细胞包括真皮乳头细胞、外根鞘细胞或其组合。
121.如权利要求119或120所述的表皮层，其中所述黑素细胞是哺乳动物黑素细胞。
122.如权利要求119-121所述的表皮层，其中所述表皮层进一步包含角质形成细胞。
123.如权利要求122所述的表皮层，其中所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
124.如权利要求123所述的表皮层，其中所述角质形成细胞表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。
125.如权利要求122、123或124所述的表皮层，其中所述角质形成细胞是哺乳动物角质形成细胞。
126.如权利要求121或125所述的表皮层，其中所述哺乳动物是非人哺乳动物。
127.如权利要求126所述的表皮层，其中所述非人哺乳动物是灵长类动物、牛科动物、绵羊、猪、马、犬科动物、猫科动物、啮齿动物或兔类动物中的一种。
128.如权利要求119-127中任一项所述的表皮层，其中所述黑素细胞表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。
129.如权利要求119-127中任一项所述的表皮层，其进一步包含毛囊。
130.一种分层结构，其包含：
a.含有毛囊细胞的人造表皮层；以及
b.含有成纤维细胞的人造真皮层，其中所述成纤维细胞从诱导的多能干细胞分化。
131.如权利要求130所述的分层结构，其中所述成纤维细胞表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。
132.如权利要求130所述的分层结构，其中所述表皮层进一步包含角质形成细胞。
133.如权利要求132所述的分层结构，其中所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
134.如权利要求133所述的分层结构，其中所述角质形成细胞表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。
135.如权利要求132所述的分层结构，其中所述毛囊细胞是真皮乳头细胞、外根鞘细胞或其组合。
136.如权利要求130所述的分层结构，其中所述表皮层进一步包含黑素细胞。
137.如权利要求136所述的分层结构，其中所述黑素细胞从诱导的多能干细胞分化。
138.如权利要求137所述的分层结构，其中所述黑素细胞表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。
139.如权利要求136、137或138所述的分层结构，其中所述分层结构被着色。
140.如权利要求137所述的分层结构，其中所述表皮层是分层的。
141.如权利要求130-140中任一项所述的分层结构，其进一步包含基膜替代物。
142.如权利要求141所述的分层结构，其中所述基膜替代物在所述表皮层与所述真皮层之间。
143.如权利要求142所述的分层结构，其中所述基膜替代物包括干燥的非细胞羊膜。
144.如权利要求130所述的分层结构，其进一步包含支架。
145.如权利要求144所述的分层结构，其中所述支架是天然的或合成的。
146.如权利要求144所述的分层结构，其中所述支架包含丝。
147.如权利要求144所述的分层结构，其中所述真皮层在所述支架上。
148.如权利要求130-147中任一项所述的分层结构，其进一步包含选自角蛋白、弹性蛋白、明胶、蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖、糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、皮连蛋白、脂质、脂肪酸、碳水化合物或其组合的一种或多种组分。
149.如权利要求130-148中任一项所述的分层结构，其进一步包含两个或更多个真皮层。
150.如权利要求130-149中任一项所述的分层结构，其进一步包含毛囊。
151.如权利要求130-149中任一项所述的分层结构，其进一步包含皮毛。
152.一种制备分层结构的方法，所述方法包括：
将包含毛囊细胞的人造表皮层置于包含从诱导的多能干细胞分化的细胞的人造真皮层上，从而形成所述分层结构。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述从诱导的多能干细胞分化的细胞是成纤维细胞、黑素细胞、角质形成细胞或其组合。
154.如权利要求153所述的方法，其中所述从诱导的多能干细胞分化的细胞是成纤维细胞。
155.如权利要求154所述的方法，其中所述成纤维细胞表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合。
156.如权利要求152-154中任一项所述的方法，其中所述表皮层进一步包含角质形成细胞。
157.如权利要求156所述的方法，其中所述角质形成细胞从诱导的多能干细胞分化。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述角质形成细胞表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。
159.如权利要求152-158中任一项所述的方法，其中所述毛囊细胞包括真皮乳头细胞、外根鞘细胞或其组合。
160.如权利要求152-159中任一项所述的方法，其中所述表皮层进一步包含黑素细胞。
161.如权利要求160所述的方法，其中所述黑素细胞从诱导的多能干细胞分化。
162.如权利要求161所述的方法，其中所述黑素细胞表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合。
163.如权利要求152-163中任一项所述的方法，其中所述真皮层用补充物培养。
164.如权利要求163所述的方法，其中所述补充物包含胶原蛋白、纤维蛋白、生长因子、抗坏血酸、硫酸葡聚糖、角叉菜胶或其组合。
165.如权利要求163所述的方法，其中所述补充物是天然补充物。
166.如权利要求163所述的方法，其中所述一种或多种补充物是合成补充物。
167.如权利要求152-166中任一项所述的方法，其中所述真皮层在支架上培养。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述支架是天然的或合成的。
169.如权利要求167所述的方法，其中所述支架包含丝。
170.如权利要求152-166中任一项所述的方法，其中将所述真皮层置于支架上。
171.如权利要求170所述的方法，其中所述支架是天然的或合成的。
172.如权利要求170所述的方法，其中所述支架包含丝。
173.如权利要求152-172中任一项所述的方法，其中所述表皮层是分层的。
174.如权利要求152所述的方法，其进一步包括在第二真皮层上培养所述真皮层。
175.如权利要求152-174中任一项所述的方法，其中所述真皮层在体内培养。
176.如权利要求175所述的方法，其中所述真皮层不在胶原蛋白基质上培养。
177.如权利要求152-176中任一项所述的方法，其中所述真皮层的厚度在约0.02mm至约5mm的范围内。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述真皮层的所述厚度在约0.1mm至约0.5mm的范围内。
179.如权利要求152-178中任一项所述的方法，其中所述表皮层的厚度在约0.01mm至约2mm的范围内。
180.如权利要求179所述的方法，其中所述表皮层的所述厚度在约0.1mm至约0.2mm的范围内。
181.一种分层结构，其包含：
含有毛囊细胞和角质形成细胞或黑素细胞的人造表皮层；
含有成纤维细胞的人造真皮层，其中所述成纤维细胞、所述角质形成细胞或所述黑素细胞从诱导的多能干细胞分化，其中所述黑素细胞表达Sox-10、MITF-M、gp-100、DCT、TYR、MLANA或其组合，其中所述成纤维细胞表达CD10、CD73、CD44、CD90、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、脯氨酰-4-羟化酶β或其组合，其中所述角质形成细胞表达KRT14、p63、DSG3、ITGB4、LAMA5、KRT5、TAp63、Lamb3、KRT18或其组合。
182.如权利要求181所述的分层结构，其中所述真皮层的厚度在约0.02mm至约5mm的范围内。
183.如权利要求182所述的分层结构，其中所述真皮层的所述厚度在约0.1mm至约0.5mm的范围内。
184.如权利要求181-183中任一项所述的分层结构，其中所述表皮层的厚度在约0.01mm至约2mm的范围内。
185.如权利要求184所述的分层结构，其中所述表皮层的所述厚度在约0.1mm至约0.2mm的范围内。
186.一种人造表皮层，其包含：
a.角质层；
b.颗粒层；
c.棘层；以及
d.基底层，其中所述角质层、所述颗粒层、所述棘层和所述基底层如图6A、图8A所示进行组织。
187.如权利要求186所述的人造表皮层，其中所述角质层的所述厚度在约0.01mm至约0.05mm的范围内。
188.如权利要求186-187中任一项所述的人造表皮层，其中所述颗粒层的所述厚度在约0.01mm至约0.15mm的范围内。
189.如权利要求186-188中任一项所述的人造表皮层，其中所述棘层的所述厚度在约0.01mm至约0.15mm的范围内。
190.如权利要求186-189中任一项所述的人造表皮层，其中所述基底层的所述厚度在约0.01mm至约0.15mm的范围内。
191.一种人造表皮层，其包含：
a.角质层；
b.颗粒层；
c.棘层；以及
d.基底层。
192.如权利要求191所述的人造表皮层，其中所述角质层的所述厚度在所述人造表皮层的约4％至约20％的范围内。
193.如权利要求191-192中任一项所述的人造表皮层，其中所述颗粒层的所述厚度在所述人造表皮层的约4％至约60％的范围内。
194.如权利要求191-193中任一项所述的人造表皮层，其中所述棘层的所述厚度在所述人造表皮层的约4％至约40％的范围内。
195.如权利要求191-194中任一项所述的人造表皮层，其中所述基底层的所述厚度在所述人造表皮层的约4％至约40％的范围内。
196.如权利要求186-195中任一项所述的人造表皮层，其中包含在所述人造表皮层中的至少约2％的细胞从诱导的多能干细胞分化。
197.如权利要求186-196中任一项所述的人造表皮层，其中包含在所述人造表皮层中的至少约10％的细胞从诱导的多能干细胞分化。
198.如权利要求186-196中任一项所述的人造表皮层，其中包含在所述人造表皮层中的至少约50％的细胞从诱导的多能干细胞分化。
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