CN112642002B - 可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法，涉及生物医学工程领域，利用脱细胞方法获得人和猪的皮肤支架；通过蛋白裂解获取能激活干细胞功能的活性蛋白成分；利用串联质谱鉴定，获得人和猪的皮肤基质蛋白成份；然后获得人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白；比较其成分差异，找出人特有蛋白；功能分析获得能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分；利用上述能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分和猪的皮肤基质蛋白成分，制备可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料。

Description

可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，具体为一种可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法。
背景技术
皮肤是最大的器官，能抵抗各种各样的机械、化学和生物损伤。皮肤坚韧而柔韧的结构有助于适应外界条件，受伤时能迅速修复。在哺乳动物中，不同的皮肤细胞群形成如下基本层：表皮、真皮、皮下或皮下脂肪。真皮的结缔组织富含真皮成纤维细胞和内皮细胞，这些细胞可产生胶原蛋白、弹性蛋白，可溶性细胞因子以及大多数其他类型的细胞外基质(ECM)。细胞外基质是一个复杂的三维微环境，为细胞提供细胞功能所需的大量化学和生物物理信号。ECM蛋白在伤口愈合中也起着关键作用。例如，血小板释放的细胞因子(ECM相关蛋白)如血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子b(TGF-b)、血管内皮生长因子(VEGF)等因子，可激活特定的信号通路，刺激免疫细胞反应、血管生成、胶原合成，纤维蛋白和维生素C支持巨噬细胞、其他白细胞和中性粒细胞的迁移。TNF、IL-6、IL-1、βFGF等炎症因子也能促进血管生成。总之，ECM的组成和组织既有物理效应，又有维持体内平衡所需的各种效应，这些特性使ECM成为制造仿生学的绝佳候选。例如，基于ECM的生物材料可引发多种有利的细胞反应，如血管生成、干细胞招募和先天免疫反应的调节，所有这些都促进功能性组织重建(参考文章Sadtler,K.；Estrellas,K.；Allen,B.W.；Wolf,M.T.；Fan,H.；Tam,A.J.；Patel,C.H.；Luber,B.S.；Wang,H.；Wagner,K.R.；Powell,J.D.；Housseau,F.；Pardoll,D.M.；Elisseeff,J.H.,Developing a pro-regenerative biomaterial scaffoldmicroenvironment requires T helper 2cells.Science 2016,352(6283),366-370.)。尽管某些ECM蛋白已得到充分研究，基质蛋白的整体分子组成和调控功能尚不清楚，使得无法评价脱细胞生物材料的活性和有效性。
此外，为了促进组织工程的临床应用，仿生材料必须精确模拟人体微环境。虽然一些结构蛋白作为细胞生长的支架在皮肤组织工程中已经足够了，但对于保证和维持细胞的生物学功能同样至关重要，支架中保留的原始成分越多，它们就越能支持组织和细胞的功能。猪的解剖学、生理学和基因组与人类相比更为相似，因此，猪可以被视为临床异种移植的首选人体组织来源(参考文献Suna,G.；Wojakowski,W.；Lynch,M.；Barallobre-Barreiro,J.；Yin,X.；Mayr,U.；Baig,F.；Lu,R.；Fava,M.；Hayward,R.；Molenaar,C.；White,S.J.；Roleder,T.；Milewski,K.P.；Gasior,P.；Buszman,P.P.；Buszman,P.；Jahangiri,M.；Shanahan,C.M.；Hill,J.；Mayr,M.,Extracellular Matrix ProteomicsReveals Interplay of Aggrecan and Aggrecanases in Vascular Remodeling ofStented Coronary Arteries.Circulation 2018,137(2),166-183.)。但是，人、猪和其它动物之间物种的差异，可能与它们特定的皮肤功能有关。因此，在皮肤细胞外基质的实验研究和临床应用中，应充分考虑人与其他动物的物种差异。
发明内容
针对当前组织工程产品脱细胞皮肤支架的功能不足问题，本发明的目的是提出一种可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法，制备一种可以用来激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
1)利用脱细胞方法获得人和猪的皮肤支架；
2)将人和猪的皮肤支架进行蛋白裂解，获取能激活干细胞功能的活性蛋白成分；
3)利用串联质谱鉴定上述活性蛋白成分，获得人和猪的皮肤基质蛋白成份；
4)基于人和猪的皮肤基质蛋白成份，获得人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白；
5)比较人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白的成分差异，找出人特有蛋白；
6)通过生物信息学工具对人特有蛋白进行功能分析，获得能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分；
7)利用上述能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分和猪的皮肤基质蛋白成分，制备可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料。
进一步地，步骤1)中的脱细胞方法为：用电动皮肤采集器切割采集人和猪的皮肤组织，皮肤组织去除表皮，得到去细胞真皮样品；将去细胞真皮样品清洗，然后利用酶进行脱细胞。
进一步地，步骤1)中脱细胞后，通过定量胶原的数量来测试皮肤支架的完整性，并使用胶原检测试剂盒定量胶原蛋白含量，具体地通过测定胶原蛋白的吸光度来测量其浓度；然后用硫酸化糖胺聚糖法测定GAG含量，通过测定指示剂的吸光度来测量其浓度；当上述测量的浓度达到一预设标准时，则认定获得的皮肤支架具备完整性。
进一步地，步骤2)中的蛋白裂解的方法为：将去细胞化的人和猪的皮肤支架匀浆，用蛋白提取试剂(Sigma-Aldrich)提取活性蛋白成分。
进一步地，步骤2)中在提取活性蛋白成分以后，离心30分钟，将上清液转移到干净的试管中并在-80℃下储存。
进一步地，步骤2)中从裂解的蛋白中提取肽段，并将肽段混合物使用配备有简易nLC纳米流液相色谱系统(Thermo Fisher Scientific)的Orbitrap Q-Exactive质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行分析。
进一步地，步骤3)中利用Matrisome数据库对质谱鉴定的人和猪的活性蛋白成分进行比对，获得人和猪的皮肤基质蛋白成分。
进一步地，步骤4)中利用David工具对人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白进行功能富集，获得人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白，该基质蛋白包括：对于人的皮肤基质，多为酶、酶抑制剂、生长因子、胰岛素因子、转化生长因子、抗微生物、抗血管生成等蛋白成分；对于猪的皮肤基质，多为金属结合、酶抑制剂和基底膜相关蛋白。
进一步地，步骤5)中人特有蛋白包括：COL4A6COL28A1、COL11A1、FMOD、LUM、OGN、OMD、PRG3、PRG2、ADIPOQ、FBLN2、VTN WISP2、SPARC、ELN、EFEMP2、CTHRC1、THBS3、COMP、HMCN1、CILP、MGP、LTBP4、THBS2、LTBP1、THBS4、SRPX2、IGFALS、VWA5A、FBLN7、PXDN、MFGE8、MXRA5、THSD4、VIT、MMRN2、ECM2、MATN4、MMRN1、SNED1、HMCN2、LAMB4、SERPINA1、CTSG、HTRA1、SERPINF1、SERPING1、SERPINA3、HRG、KNG1、SERPINB6、F2、SERPINF2、SLPI、MMP19、TIMP3、CST6、CSTB、AGT、MMP12、SERPINA6、ITIH3、ITIH5、SERPINA4、P4HA2、TGM2、CTSC、A2ML1、SERPINB3、CTSZ、CPN2、SERPINE2、SERPINA5、CTSK、SERPINB8、F12、F9、CTSV、MMP14、SERPINB4、F10、SERPINB9、SERPINB7、PAPPA、P4HA1、PLOD3、LPA、LGALS1、C1QB、C1QTNF3、ANXA8L1、CLEC11A、C1QTNF7、S100A6、S100A8、CXCL12、S100A13、CXCL14、S100B、S100A2、ANGPTL2、SFRP2、S100A7、MEGF6、CCL18、ANGPTL5、MST1L、TGFB1。
进一步地，步骤6)中的能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分包括：TGFBI、ANXA2、COL7A1、VTN、FBN1、HSPG2、COL5A1、LAMC1、TNC、LAMB2、SERPINF1、NID1、NID2、COL4A1、VWA1、COL18A1、EFEMP2、LAMA4、LAMA3、MATN2、HMCN1、LAMA5、TIMP3、LAMB1、THBS2、COL17A1、COL28A1、THBS4、LAMA2、COL2A1、MMRN2、HMCN2、LAMB4、LAMC3、FRAS1、LOXL1、FREM2。
进一步地，根据已有的评价脱细胞皮肤支架功能性数据中的蛋白分子列表对能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分进行比对，比较重合的蛋白成分多少，重合的越多证明支架产品功能性越强，当重合数量达到某一门槛值时，则判定为能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分合格。
本发明具有以下优点：
1.本发明提出了一种新的生物材料的制备方法，并利用系统生物学对本发明制备的生物材料进行生物活性和功能性鉴定，证明本发明材料活性成分全部保留，并能够促进皮肤再表皮化，毛囊干细胞活性，创面血管的生成，创面成纤维细胞的趋化，生长和增殖等各项功能性指标，更有利于创面的愈合和延缓皮肤衰老。
2.本发明制备的材料保留了皮肤干细胞重要的微环境，能够维持皮肤干细胞极性和命运决定能力。
3.本发明制备的材料的成分和空间组成为其它生物材料的功能和应用评价提供了新标准。另外，产品剂型还可以制成粉剂、液剂和凝胶等不同形状，均具有有效功能，让使用更灵活，甚到更简单、方便、无痛。
附图说明
图1是本发明制备的生物材料对比其它生物材料的示意图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案能更明显易懂，特举实施例并结合附图详细说明如下。
本实施例公开一种可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)利用脱细胞方法获得人和猪的皮肤支架；
步骤2)将人和猪的皮肤支架进行蛋白裂解，获取能激活干细胞功能的活性蛋白成分；
步骤3)利用串联质谱鉴定上述蛋活性白成分，获得人和猪的皮肤基质蛋白成份；
步骤4)基于人和猪的皮肤基质蛋白成份，获得人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白；
步骤5)比较人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白的成分差异，获得人特有蛋白；
步骤6)通过生物信息学工具对人特有蛋白进行功能分析，获得功能性的能够支持皮肤干细胞生长的基质蛋白成分；
步骤7)利用上述能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分，制备可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料。
进一步地，步骤1)用一个电动皮肤采集器切割采集人和猪的皮肤组织；皮肤组织去除表皮，用手术刀的背面轻轻地刮去皮肤表面；将去细胞真皮样品清洗后，利用酶进行脱细胞；脱细胞后，通过定量胶原的数量来测试生物支架的完整性，并使用Sircol染料(可溶性胶原蛋白分析，Sircol Biocolor)定量GAGs胶原蛋白含量，通过测定其在555nm处的吸光度来测量其浓度；用Blyscan法(Blyscan法、硫酸化糖胺聚糖法、Sircol Biocolor法)测定GAG含量，在625nm处测定指示剂的吸光度，并将值标准化为肝素钠标准值。
进一步地，步骤2)中的蛋白裂解的方法为：将去细胞化的人和猪的皮肤支架匀浆，用蛋白提取试剂(Sigma-Aldrich)提取活性蛋白成分；离心30分钟后，将上清液转移到干净的试管中并在-80℃下储存。
进一步地，步骤2)裂解蛋白，提取肽段，并将肽混合物使用配备有简易nLC纳米流液相色谱系统(Thermo Fisher Scientific)的Orbitrap Q-Exactive质谱仪(ThermoFisher Scientific)进行分析。
进一步地，步骤3)中利用Matrisome数据库对质谱鉴定的人和猪的活性蛋白成分进行比对，获得人和猪的皮肤基质蛋白成分。
进一步地，步骤4)中利用David工具对人和猪的异性表达的基质蛋白进行功能富集，发现人的皮肤基质多为酶、酶抑制剂、生长因子、胰岛素因子、转化生长因子、抗微生物、抗血管生成等蛋白成分；猪的皮肤基质多为金属结合、酶抑制剂和基底膜相关蛋白。
进一步地，步骤5)人特有蛋白为：COL4A6COL28A1、COL11A1、FMOD、LUM、OGN、OMD、PRG3、PRG2、ADIPOQ、FBLN2、VTN WISP2、SPARC、ELN、EFEMP2、CTHRC1、THBS3、COMP、HMCN1、CILP、MGP、LTBP4、THBS2、LTBP1、THBS4、SRPX2、IGFALS、VWA5A、FBLN7、PXDN、MFGE8、MXRA5、THSD4、VIT、MMRN2、ECM2、MATN4、MMRN1、SNED1、HMCN2、LAMB4、SERPINA1、CTSG、HTRA1、SERPINF1、SERPING1、SERPINA3、HRG、KNG1、SERPINB6、F2、SERPINF2、SLPI、MMP19、TIMP3、CST6、CSTB、AGT、MMP12、SERPINA6、ITIH3、ITIH5、SERPINA4、P4HA2、TGM2、CTSC、A2ML1、SERPINB3、CTSZ、CPN2、SERPINE2、SERPINA5、CTSK、SERPINB8、F12、F9、CTSV、MMP14、SERPINB4、F10、SERPINB9、SERPINB7、PAPPA、P4HA1、PLOD3、LPA、LGALS1、C1QB、C1QTNF3、ANXA8L1、CLEC11A、C1QTNF7、S100A6、S100A8、CXCL12、S100A13、CXCL14、S100B、S100A2、ANGPTL2、SFRP2、S100A7、MEGF6、CCL18、ANGPTL5、MST1L、TGFB1。
进一步地，步骤6)获得能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分：TGFBI、ANXA2、COL7A1、VTN、FBN1、HSPG2、COL5A1、LAMC1、TNC、LAMB2、SERPINF1、NID1、NID2、COL4A1、VWA1、COL18A1、EFEMP2、LAMA4、LAMA3、MATN2、HMCN1、LAMA5、TIMP3、LAMB1、THBS2、COL17A1、COL28A1、THBS4、LAMA2、COL2A1、MMRN2、HMCN2、LAMB4、LAMC3、FRAS1、LOXL1、FREM2。
进一步地，根据已有的评价脱细胞皮肤支架功能性数据中的蛋白分子列表对能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分进行比对，比较重合的蛋白成分多少，重合的越多证明支架产品功能性越强，当重合数量达到某一门槛值时，则判定为能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分合格。
图1所示是本发明制备的生物材料对比其它生物材料的示意图。比较可知，本发明制备的生物材料更能够促进原代分离的皮肤表皮干细胞的功能，包括能够增强皮肤的表皮干细胞的增殖活性(PCNA)和干性标志物(CK14)的表达。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，本领域的普通技术人员可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，本发明的保护范围以权利要求所述为准。

Claims (8)

1.一种可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）利用脱细胞方法获得人和猪的皮肤支架；
2）将人和猪的皮肤支架进行蛋白裂解，获取能激活干细胞功能的活性蛋白成分；
3）利用串联质谱鉴定上述活性蛋白成分，获得人和猪的皮肤基质蛋白成份；
4）基于人和猪的皮肤基质蛋白成份，获得人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白；
5）比较人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白的成分差异，找出人特有蛋白，该人特有蛋白包括：COL4A6、 COL28A1、COL11A1、FMOD、LUM、OGN、OMD、PRG3、PRG2、ADIPOQ、FBLN2、VTNWISP2、SPARC、ELN、EFEMP2、CTHRC1、THBS3、COMP、HMCN1、CILP、MGP、LTBP4、THBS2、LTBP1、THBS4、SRPX2、IGFALS、VWA5A、FBLN7、PXDN、MFGE8、MXRA5、THSD4、VIT、MMRN2、ECM2、MATN4、MMRN1、SNED1、HMCN2、LAMB4、SERPINA1、CTSG、HTRA1、SERPINF1、SERPING1、SERPINA3、HRG、KNG1、SERPINB6、F2、SERPINF2、SLPI、MMP19、TIMP3、CST6、CSTB、AGT、MMP12、SERPINA6、ITIH3、ITIH5、SERPINA4、P4HA2、TGM2、CTSC、A2ML1、SERPINB3、CTSZ、CPN2、SERPINE2、SERPINA5、CTSK、SERPINB8、F12、F9、CTSV、MMP14、SERPINB4、F10、SERPINB9、SERPINB7、PAPPA、P4HA1、PLOD3、LPA、LGALS1、C1QB、C1QTNF3、ANXA8L1、CLEC11A、C1QTNF7、S100A6、S100A8、CXCL12、S100A13、CXCL14、S100B、S100A2、ANGPTL2、SFRP2、S100A7、MEGF6、CCL18、ANGPTL5、MST1L、TGFB1；
6）通过生物信息学工具对人特有蛋白进行功能分析，获得能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分，该基质蛋白成分包括：TGFBI、ANXA2、COL7A1、VTN、FBN1、HSPG2、COL5A1、LAMC1、TNC、LAMB2、SERPINF1、NID1、NID2、COL4A1、VWA1、COL18A1、EFEMP2、LAMA4、LAMA3、MATN2、HMCN1、LAMA5、TIMP3、LAMB1、THBS2、COL17A1、COL28A1、THBS4、LAMA2、COL2A1、MMRN2、HMCN2、LAMB4、LAMC3、FRAS1、LOXL1、FREM2；
7）利用上述能够支持人皮肤干细胞生长的基质蛋白成分和猪的皮肤基质蛋白成分，制备可用于激活和修复皮肤干细胞功能的生物材料。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中的脱细胞方法为：用电动皮肤采集器切割采集人和猪的皮肤组织，皮肤组织去除表皮，得到去细胞真皮样品；将去细胞真皮样品清洗，然后利用酶进行脱细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1）中脱细胞后，通过定量胶原的数量来测试皮肤支架的完整性，并使用胶原检测试剂盒定量胶原蛋白含量，具体地通过测定胶原蛋白的吸光度来测量其浓度；然后用硫酸化糖胺聚糖法测定GAG含量，通过测定指示剂的吸光度来测量其浓度；当上述测量的浓度达到一预设标准时，则认定获得的皮肤支架具备完整性。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中的蛋白裂解的方法为：将去细胞化的人和猪的皮肤支架匀浆，用蛋白提取试剂提取活性蛋白成分。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中在提取活性蛋白成分以后，离心30分钟，将上清液转移到干净的试管中并在−80°C下储存。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中从裂解的蛋白中提取肽段，并将肽段混合物使用配备有简易nLC纳米流液相色谱系统的Orbitrap Q-Exactive质谱仪进行分析。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中利用Matrisome数据库对质谱鉴定的人和猪的活性蛋白成分进行比对，获得人和猪的皮肤基质蛋白成分。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）中利用David工具对人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白进行功能富集，获得人和猪的皮肤特异性表达的基质蛋白，该基质蛋白包括：对于人的皮肤基质，为酶、酶抑制剂、胰岛素因子、转化生长因子、抗微生物、抗血管生成的蛋白成分；对于猪的皮肤基质，为金属结合、酶抑制剂和基底膜相关蛋白。
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