CN109970848B - 由wjmsc干细胞萃取具再生修复功效的胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是关于一种由瓦顿氏凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells)萃取具再生修复功效的胶原蛋白的方法，包含：将WJMSC干细胞于第一培养液中培养16～24小时；移除第一培养液，并加入第二培养液培养36～48小时；收集细胞，并加入细胞裂解液，作用0.5～2小时，加入无机盐溶液以获得混合液，并于4℃作用24～48小时；离心混合液并收集沉淀物，并以保存溶液回溶沉淀物，以获得胶原蛋白。
Description
技术领域
本发明是关于一种由瓦顿氏凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymalstem cells)萃取具再生修复功效的胶原蛋白的方法，尤其指一种利用特定培养方法促进细胞产生胶原蛋白并萃取的方法。
背景技术
胶原蛋白为一种具有伸张能力的蛋白质，存在于人体皮肤、骨骼、软骨、韧带、血管壁或结缔组织当中，此外胶原蛋白亦是使皮肤保持弹性的重要因子，若皮肤胶原蛋白流失会导致皮肤松弛甚至产生皱纹。目前胶原蛋白可以被应用于相当多的产业当中，包含美容保养产品或医药产品的制备。
目前胶原蛋白的来源主要为动物组织萃取，例如可由猪皮、鱼鳞，动物内脏等组织中萃取；中国台湾专利第TW I435881(B)号发明专利是一种自猪肺分离胶原蛋白的方法及应用，是以特定成分的萃取液与猪肺作用，再以胃蛋白酶进行水解，最后利用盐析法获得含猪肺胶原蛋白的材料；又中国台湾第TW I362393(B)号发明专利，为一种鱼鳞胶原蛋白胜肽产品的制作方法，包含分离鱼鳞与鱼皮，冷冻硬化处理鱼鳞并获得鱼鳞粉末，以酶水解后再以柑橘类果皮处理以降低萃取物的鱼腥味，以获得具有淡淡柑橘香味的胶原蛋白。但，动物来源的胶原蛋白除了具有腥味或苦味之外，亦可能引起过敏反应。
发明内容
本案发明人有鉴于现今胶原蛋白主要来自于动物，具有腥味以及诱发过敏的缺失，于是乃一本孜孜不倦的精神，并藉由其丰富专业知识及多年的实务经验所辅佐，而加以改善，并据此研创出本发明。
本发明是一种由瓦顿氏凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stemcells，简称WJMSC干细胞)萃取具再生修复功效的胶原蛋白的方法，包含：将WJMSC干细胞于第一培养液中培养16～24小时；移除第一培养液，并加入第二培养液培养36～48小时；收集细胞，并加入细胞裂解液，作用0.5～2小时，再加入无机盐溶液以获得混合液，并将混合液于4℃作用24～48小时；离心混合液并收集沉淀物，并以保存溶液回溶沉淀物，以获得胶原蛋白。
于本发明的一实施例中，第一培养液中含有人类碱性纤维母细胞生长因子(humanbasic fibroblast growth factor)。
于本发明的一实施例中，第一培养液中含有2～8ng/mL的人类碱性纤维母细胞生长因子。
于本发明的一实施例中，第一培养液中含有4ng/mL的人类碱性纤维母细胞生长因子。
于本发明的一实施例中，第二培养液包含人类碱性纤维母细胞生长因子、脯氨酸(proline)与维生素C(ascorbic acid)其中至少之一。
于本发明的一实施例中，第二培养液包含2～8ng/mL的人类碱性纤维母细胞生长因子、0.2～2mM的脯氨酸与5～50μM的维生素C其中至少之一。
于本发明的一实施例中，第二培养液包含4ng/mL的人类碱性纤维母细胞生长因子，0.2mM的脯氨酸与5～50μM的维生素C。
于本发明的一实施例中，无机盐溶液为硫酸铵(ammonium sulfate)溶液或是氯化钠(NaCl)溶液。
藉此，本案WJMSC干细胞萃取胶原蛋白的方法，提供一种简易且能大量制备胶原蛋白的方法。
附图说明
图1：氨基酸影响胶原蛋白表达分析图。
图2：生长因子与氨基酸影响胶原蛋白表达分析图。
图3A：维生素C与氨基酸影响胶原蛋白表达分析图。
图3B：维生素C与氨基酸影响胶原蛋白表达定量分析图。
图4：生长因子、维生素C与氨基酸影响第1型胶原蛋白表达定量分析图。
图5：生长因子、维生素C与氨基酸影响第3型胶原蛋白表达定量分析图。
图6：WJMSC干细胞胶原蛋白促进创伤愈合的显微镜观察图。
具体实施方式
本发明的目的及其功能上的优点，将依据以下附图所示的结果，配合具体实施例予以说明，以使阅读者能对本发明有更深入且具体的了解。
本发明为一种由瓦顿氏凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stemcells，简称WJMSC干细胞)萃取具再生修复功效的胶原蛋白的方法，包含：将WJMSC干细胞于第一培养液中培养16～24小时；移除第一培养液，并加入第二培养液培养36～48小时；收集细胞，并加入细胞裂解液，作用0.5～2小时，加入无机盐溶液以获得混合液，将混合液于4℃作用24～48小时；以及，离心混合液并收集沉淀物，并以保存溶液回溶沉淀物，以获得胶原蛋白。
此外，藉由下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用的范围，但不意欲以任何形式限制本发明的范围。
一、瓦顿氏凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells，WJMSC干细胞)的培养方法
WJMSC干细胞为BCRC编号BCRC H-WJ001的人类瓦顿氏凝胶间叶干细胞(Wharton’sJelly mesenchymal stem cells)，已公开于美国专利第US 9284527(B)号专利(发明名称：Use of stem cell conditioned medium to inhibit melanin formation for skinwhitening)；此实验中是将WJMSC干细胞培养于含有10～20％胎牛血清(Fetal bovineserum，FBS)、2～8ng/mL人类碱性纤维母细胞生长因子(human basic fibroblast growthfactor，bFGF)的α-MEM培养液中；本发明中是将WJMSC干细胞培养于含有10％FBS、4ng/mLbFGF的α-MEM培养液。另，WJMSC干细胞皆培养于37℃，5％二氧化碳的培养箱中。
进行试验时，以5X104cells/cm2的密度，将细胞培养于含有10％FBS、4ng/mL bFGF的α-MEM培养液中24小时；24小时之后移除细胞培养液，并以1X PBS缓冲液清洗细胞2～3次；依照实验设计，将细胞培养于含有bFGF、脯氨酸(Proline)、精氨酸(Arginine)或是维生素C(L-ascorbic acid)的α-MEM培养液中；于培养后48小时之后收取蛋白质，并测量细胞的第1型胶原蛋白(collagen 1)与第3型胶原蛋白(collagen 3)的表达。其中bFGF是购自ProSpece公司(产品编号cyt-218-b)，维生素C是购自Sigma公司(产品编号SI-A8960)，脯氨酸是购自Calbiochem公司(产品编号分别为#5370)以及精氨酸是购自Merck公司(产品编号为#1.011542)。
二、细胞内胶原蛋白萃取
移除细胞培养基，并以1X PBS缓冲液清洗2次之后，再加入10mM EDTA-PBS溶液或0.5M乙酸(acetic acid)，并在4℃的温度下刮下细胞并将混合液置入离心管中以超音波震荡仪，于20Hz的强度震荡15秒，共震荡3次，每次震荡的间隔时间为30秒，以将细胞裂解；再于4℃、2000rpm的作用条件离心30分钟，以获得细胞蛋白质粗萃液。
此外，亦可以直接使用细胞裂解液裂解细胞以萃取蛋白质，简述如下：移除细胞培养基，并以1X PBS缓冲液清洗2次之后，再加入含有10mM EDTA的RIPA细胞裂解液，并持续于4℃的温度下持续摇晃至少30分钟，刮下细胞并将混合液置入离心管中并以12000rpm的转速离心15分钟，以获得细胞蛋白质粗萃液。
将细胞蛋白质粗萃液加入25％的饱和过硫酸铵(ammonium persulfate)溶液或是3M的氯化钠溶液(NaCl)，于4℃中作用24小时以进行盐析反应；次日再于4℃、3500g的作用条件离心30分钟，并移除上清液保留沉淀的团块；以1X PBS缓冲液清洗细胞，并于4℃、3500g离心30分钟，并以0.5M的乙酸溶液(acetic acid)回溶所述团块，以获得细胞蛋白质液。所得到的蛋白质后续以西方点墨法进行分析，以侦测胶原蛋白的表达；所有实验至少进行二重复，为避免篇幅过于冗长故以具代表性的结果图呈现。
三、WJMSC干细胞胶原蛋白生成的分析
(一)脯氨酸(Proline)促进细胞胶原蛋白表达
请参见图1，为添加不同剂量的脯氨酸(Proline)或精氨酸(Arginine)对于WJMSC干细胞胶原蛋白表达的影响，图中Control为未添加其他成分的对照组，Pro(2)代表添加2mM的脯氨酸，Arg(0.2)代表添加0.2mM的精氨酸，以此类推。根据图1，2mM的脯氨酸能提高WJMSC干细胞表达第1型胶原蛋白与第3型胶原蛋白，但是更高量的脯氨酸，如5mM～20mM的脯氨酸并无法达成相同的功效；此外，添加0.2mM～20mM的精氨酸并无法促进细胞表达第1型胶原蛋白与第3型胶原蛋白。
(二)人类碱性纤维母细胞生长因子对胶原蛋白表达的影响
请参阅图2，为人类碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)合并使用脯氨酸或精氨酸对于细胞胶原蛋白表达的影响，图中bFGF的使用量为4ng/mL，标示为bFGF(4)；脯氨酸的使用量为0.2mM与2mM，分别标示为Pro(0.2)与Pro(2)；精氨酸的使用量为0.2mM，标示为Arg(0.2)。根据图2，单独处理bFGF、0.2mM脯氨酸或2mM的脯氨酸都可以促进细胞表达第1型胶原蛋白与第3型胶原蛋白，且合并使用bFGF与脯氨酸无法使细胞产生更多第1型胶原蛋白，但是合并使用4ng/mL的bFGF与0.2mM的脯氨酸可使细胞产生更多的第3型胶原蛋白。单独使用精氨酸或是精氨酸与bFGF合并使用都无法使细胞产生较多的胶原蛋白。
(三)维生素C与脯氨酸对于胶原蛋白生成的影响
请参见图3A，为维生素C(L-ascorbic acid，简称AA)以及脯氨酸对于细胞产生胶原蛋白的影响，图中AA(5)表示给予细胞5μM的维生素C，而Pro(2)代表给予细胞2mM的脯氨酸，而bFGF(4)为给予4ng/mL的bFGF；此外，前第1型胶原蛋白(pro-collagen1)、第1型胶原蛋白、前第3型胶原蛋白(pro-collagen 3)、第3型胶原蛋白的位置分别以箭号标示。参见图3A，添加5μM的维生素C、2mM的脯氨酸或是4ng/mL的bFGF皆会促进细胞表达第1型胶原蛋白与第3型胶原蛋白表达，但是合并使用维生素C与脯氨酸并无法进一步促进胶原蛋白生成。再请参见图3B，为图3A结果的定量图；将西方点墨法所获得的结果，以Image J软体进行定量，并将获得的数值先以该样本的β-actin定量数值进行标准化(normalization)，再以Control做为1倍，以与其他组别进行相对蛋白质表达量的倍数比较：图中显示5μM的维生素C、2mM的脯氨酸或是4ng/mL的bFGF皆会促进细胞表达前第1型胶原蛋白、第1型胶原蛋白、前第3型胶原蛋白与第3型胶原蛋白的表达，其中又以前第1型胶原蛋白与前第3型胶原蛋白的变化较为明显。
(四)bFGF、脯氨酸与维生素C对胶原蛋白生成的影响
请参见图4与图5，为合并使用bFGF、脯氨酸或维生素C对于细胞表达胶原蛋白的影响的定量图，是先以西方点墨法分析蛋白质的表达情形，再Image J软体进行定量，并将获得的数值先以该样本的β-actin定量数值进行标准化(normalization)，再以Control做为1倍，并与其他组别与之比较。根据图4，单独给予5μM维生素C、2mM脯氨酸、5μM的维生素合并2mM的脯氨酸以及4ng/mL bFGF的组别的第1型胶原蛋白表达量较佳。
请再参见图5，仅有4ng/mL bFGF合并50μM的维生素C的组别的第3型胶原蛋白表达较差，其他组别的处理皆能促进第3型胶原蛋白的表达。
四、WJMSC干细胞胶原蛋白对伤口愈合的影响
将人类纤维母细胞株HS68细胞以密度2X104cells/cm2培养于10％FBS DMEM培养液中，并使其贴附生长于培养盘中，并分为(1)对照组以及(2)胶原蛋白组，对照组使用的培养盘为无处理的培养盘，而胶原蛋白组使用的培养盘则是将WJMSC干细胞胶原蛋白以50μg/mL浓度均匀涂布(coating)于培养盘上，并于37℃培养箱放置隔夜所获得；HS68细胞于培养盘生长24小时之后，移除培养基并以1X PBS缓冲液清洗细胞，再于贴附的细胞中制造出一创伤(wound)，并于0、2、4、6与20小时之后以显微镜观察并照相；以Image J软体进行分析所得的显微镜照片，显微镜照片中整体未被细胞覆盖的范围比例被称为创伤宽度(woundsize)，并计算创伤预合度(wound healing)，以获得表一的结果；创伤愈合度的计算公式为：
(观测时间的创伤宽度-2hr创伤宽度)/2hr创伤宽度X 100％
根据表一，两组细胞的创伤皆随着培养时间增加而渐渐愈合，但是胶原蛋白组的创伤愈合度明显快于对照组：6小时的观测结果中，对照组的创伤愈合度仅达到16.1％，但是胶原蛋白组的创伤愈合度已经达到38％；20小时的观测结果中，对照组的创伤愈合度为81.7％，但是胶原蛋白组的愈合度已达到100％。
表一
| 组别 | 创伤宽度(％) | 创伤愈合度(％) |
| 对照组(2hr) | 18.7 | --- |
| 对照组(4hr) | 16.5 | 11.7 |
| 对照组(6hr) | 15.7 | 16.1 |
| 对照组(20hr) | 3.4 | 81.7 |
| 胶原蛋白组(2hr) | 15.2 | --- |
| 胶原蛋白组(4hr) | 13.3 | 13.0 |
| 胶原蛋白组(6hr) | 9.4 | 38.0 |
| 胶原蛋白组(20hr) | 0.0 | 100.0 |
另请参阅图6，为二组别的显微镜观察的照片，无标示的组别是以4X的物镜进行观察的结果，另使用10X物镜观察20小时的创伤愈合情形(标示为20hr(10X))；创伤后4小时与6小时，对照组的细胞已有向创伤处生长的状况，而胶原蛋白组的细胞生长情形更为明显；20小时的观察结果中，对照组的创伤还留有一些空间，但胶原蛋白组的创伤已经覆盖满细胞，且根据以10X物镜观察的照片，胶原蛋白组的细胞密度亦高于对照组，暗示胶原蛋白可能会促进伤口的愈合。
由上述的实施说明可知，本发明与现有技术相较之下，本发明具有以下优点：
1.本发明由WJMSC干细胞萃取胶原蛋白的方法，利用特定的培养方法提高细胞表达胶原蛋白的含量，操作简单且所获得的胶原蛋白为人类胶原蛋白，降低诱发使用者过敏的机率。
2.本发明由WJMSC干细胞萃取胶原蛋白的方法，所用材料为体外培养的细胞，因此不会如源于动物组织的胶原蛋白具有腥味或异味等缺失。
3.本发明获得的WJMSC干细胞胶原蛋白具有促进创伤愈合(wound healing)的功效，后续可应用于制备促进伤口愈合的医药美容组成物或是外用敷料。
Claims (6)
1.一种由瓦顿氏凝胶间叶干细胞(Wharton’s Jelly mesenchymal stem cells)萃取胶原蛋白的方法，包含：
步骤一：将瓦顿氏凝胶间叶干细胞于第一培养液中培养16～24小时；其中所述第一培养液中含有人类碱性纤维母细胞生长因子(human basic fibroblast growthfactor)；
步骤二：移除第一培养液，并加入第二培养液培养36～48小时；所述第二培养液包含人类碱性纤维母细胞生长因子、脯氨酸(proline)与维生素C(L-ascorbic acid)；
步骤三：收集细胞，并加入细胞裂解液，作用0.5～2小时，加入无机盐溶液以获得混合液，将混合液于4℃作用24～48小时；以及
步骤四：离心混合液并收集沉淀物，并以保存溶液回溶沉淀物，以获得胶原蛋白样品。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一培养液中含有2～8ng/mL的人类碱性纤维母细胞生长因子。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一培养液中含有4ng/mL的人类碱性纤维母细胞生长因子。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第二培养液包含2～8ng/mL的人类碱性纤维母细胞生长因子、0.2～2mM的脯氨酸与5～50μM的维生素C。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述第二培养液包含4ng/mL的碱性纤维母细胞生长因子、0.2mM的脯氨酸与5～50μM的维生素C。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述无机盐溶液为过硫酸铵(ammonium sulfate)溶液或是氯化钠(NaCl)溶液。
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