TWI434931B - 細胞培養基之營養添加劑 - Google Patents

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Description

細胞培養基之營養添加劑
本發明關於一種新式細胞培養基添加劑。
幹細胞於近幾年來成為組織工程的首要研究之一，其可分化為多種組織細胞以應用於再生醫療，如：骨細胞、神經細胞、心肌細胞及胰島細胞等，但臨床及組織應用最大的瓶頸是無法在體外快速培養至治療所需之數量，以致難以普遍實際應用於醫療上。
目前許多研究胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)普遍被應用做為細胞培養基添加劑。胎牛血清是一種源自未出生胎牛血液藉離心程序去除紅血球後所得之血清，一般添加5~20%之胎牛血清於培養基中以促進細胞之增生(Hodgson,J.(1995). "To treat or not to treat: that is the question for serum."Biotechnology (NY) 13 (4): 333-4,337-8,342-3)。使用胎牛血清做為培養基補充劑，一直是受到爭議的問題，其生產與使用始終伴隨著倫理及科學之爭議。通常胎牛血清之收集部分是一導管插入臍帶收集血液，另一方法則是利用12到16 gauge之針頭直接插入胎牛之心臟並抽取血液，兩種方式皆可能造成胎牛的痛苦。目前全球每年胎牛血清的生產量約為50萬公升，而每頭胎牛僅能取得約0.5公升之血清，推算可得知每年約有百萬頭胎牛因此而犧牲，而此胎牛血清的製造一直被動物保護人士所詬病(Jochems,C. E.,J. B. van der Valk,et al.(2002). "The use of fetal bovine serum: ethical or scientific problem？"Altern Lab Anim 30 (2): 219-27;van der Valk,J.,D. Mellor,et al.(2004). "The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture."Toxicol In Vitro 18 (1): 1-12)。而在科學上，血清含豐富的蛋白質、生長因子、激素、營養素與代謝物、脂質、礦物質與抑制物，其組成複雜且具有存在汙染物之可能性，常對研究品質造成影響。
在台灣，一頭達上市體重的肉豬約可取得2.5公升的血液，則台灣一年應可收集約2200萬公升之豬血液(農委會網站http://www.coa.gov.tw/show_index.php，2009畜牧統計)。目前台灣境內收集豬血液後的利用主要加工成為食品或經噴霧乾燥後製成飼料用血粉，同時豬的生理組成及構造與人類相似，可將其血液做為利用。而血液製劑(blood product,BP)則是一種經處理的血小板濃縮血漿，其較全血高出約8倍之血小板濃度(Eppley,B. L.,W. S. Pietrzak,et al.(2006). "Platelet-rich plasma: a review of biology and applications in plastic surgery."Plast Reconstr Surg 118 (6): 147e-159e;Eppley,B. L.,J. E. Woodell,et al.(2004). "Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing."Plast Reconstr Surg 114 (6): 1502-8)，其中每個血小板約含有50~80個α顆粒(α-granules)，血小板在正常生理凝血反應下，會聚集於受傷組織並刺激α顆粒釋放生長因子使傷口癒合(Eppley,B. L.,W. S. Pietrzak,et al.(2006). "Platelet-rich plasma: a review of biology and applications in plastic surgery."Plast Reconstr Surg ll8 (6): 147e-159e;Kakudo,N.,T. Minakata,et al.(2008). "Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts."Plast Reconstr Surg l22 (5): 1352-60)，其α顆粒經活化後可釋放多種生長因子，如：類胰島素生長因子(insulin-like growth factor,IGF)、角質化細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth,PDGF)及轉形生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)等。
本發明自豬血液開發一合適於細胞培養用之新式營養添加劑，自豬血液以不同離心方式濃縮製成豬血液血液製劑(porcine blood product,P-BP)，加入不同活化劑組合配方活化血小板以釋放生長因子。經定量分析後以Design-Expert軟體設計最佳之活化劑配方，並檢測重金屬及纖維連結素含量。配製成培養基與胎牛血清及市售無血清培養基，以比較對人類幹細胞貼附率、增生率及存活率之影響。本發明中設計Co(+)T(+)Ca(-)、Co(+)T(-)Ca(-)及Co(-)T(+)Ca(-)等三組為最佳活化配方。含量分析結果顯示P-BP不含有害之重金屬，而纖維連結素含量較市售血清少，在細胞培養之結果同時顯示細胞之貼附較緩慢。細胞培養結果顯示三種P-BP可促進細胞增生率及存活率。由此可知，本發明之細胞培養基之營養添加劑可更有效地促進細胞之增生速度，並達市售培養基2倍以上之效果。本發明之細胞培養基之營養添加劑可使細胞於較短時間內大量增生，可快速培養細胞將其應用於組織工程，或應用於再生醫療上使用。相較於市售培養基，本發明之細胞培養基之營養添加劑可顯著地降低細胞的破裂及型態上傷害，並提供細胞一最適生長環境。本發明之細胞培養基之營養添加劑還可與生醫材料結合，放置於生物體內達傷口快速修復及癒合之效果，以幫助再生醫療領域之發展。
本文中所使用的術語意義除非另有特別界定，否則均與熟習此項技藝者的普遍認知相同。本申請案中使用的術語其意義如下所列：
「血小板活化劑」意指任何可刺激血小板釋放生長因子的物質，該生長因子通常可促進細胞快速增生。生長因子包括但不限於IGF、KGF、PDGF或TGF-β。
因此，本發明提供一種製造細胞培養基之營養添加劑的方法，包含：a.將哺乳動物的血液離心後取出上清液；b.添加血小板活化劑至該上清液中以得出上清活化液；及c.滅菌該上清活化液。在較佳實施例中，步驟a之離心方式係100g 至5000g 離心三次；在更佳實施例中，步驟a之離心方式係第一次100g 至500g 離心5至10分鐘、第二次100g 至500g 離心5至10分鐘、第三次1000g 至5000g 離心5至10分鐘。在較佳實施例中，步驟a之上清液中血小板濃度範圍為每毫升500000至1000000個血小板。
在較佳實施例中，該血小板活化劑包含選自膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣所組成群組的活化劑。在更佳實施例中，該血小板活化劑包含膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣，其中膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣之濃度範圍較佳為膠原蛋白1000μg/ml至5000μg/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化鈣0.1%至4.0%；膠原蛋白1000μg/ml至5000μg/ml、凝血酶0.1U/ml至2.0U/ml、氯化鈣0.1%至4.0%；或膠原蛋白10μg/ml至800μg/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化鈣0.1%至4.0%。
在較佳實施例中，該細胞培養基係幹細胞培養基。
在較佳實施例中，該哺乳動物係豬。
本發明亦提供一種以上述方法製造之細胞培養基之營養添加劑。在較佳實施例中，該細胞培養基之營養添加劑具有促進細胞增生及存活之效用。
本發明還提供一種包含以上述方法製造之營養添加劑的細胞培養基，以及將該細胞培養基用於在組織工程或再生醫療上培養或處理細胞的用途。
本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
實施例1 豬血液血液製劑之製備：
1.豬隻經屠宰人員以頸動脈放血後，將血液裝入含抗凝劑之離心管中，以冰浴方式保存至實驗室內處理。
2.將採集之血液於室溫經5-10分鐘三次100~5000g 離心，先以低轉速 二次將血球沉澱後，取出上清液以高速離心加以濃縮(第一次100-500g 離心5-10分鐘、第二次100-500g 離心5-10分鐘、第三次1000-5000g 離心5-10分鐘方式濃縮)。
3.加入不同濃度的膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣配方組合，Co(+)添加膠原蛋白之濃度為1000~5000μg/ml，Co(-)為膠原蛋白10~800μg/ml，T(+)為添加凝血酶5~50U/ml，T(-)為凝血酶0.1~2.0U/ml，Ca(+)則為氯化鈣5~30%，Ca(-)為氯化鈣0.1~4.0%(表1)，再於15至45℃水浴下50-100rpm震盪活化10~60分鐘，活化完畢後再以500-15,000g 離心萃取上清活化液。
4.以0.10~0.50μm濾膜過濾，便取得豬血液血液製劑。
實施例2
生長因子含量檢測：
1.利用R＆D系統DG100生長因子ELISA分析套組分析P-BP生長因子含量，依照標準曲線計算出P-BP的IGF含量。
2.利用CUSABIO CSE-E06800p生長因子ELISA分析套組分析P-BP生長因子含量，依照標準曲線計算出P-BP的KGF含量。
3.利用R＆D系統DHD00B生長因子ELISA分析套組分析P-BP生長因子含量，依照標準曲線計算出P-BP的PDGF含量。
4.利用R＆D系統MB100B生長因子ELISA分析套組分析P-BP生長因子含量，依照標準曲線計算出P-BP的TGF-β含量。
5.結果顯示於表2，P-BP經活化後所有生長因子分泌量皆顯著提高(p ＜0.05)，TGF-β、PDGF、KGF的分泌量高於FBS，特別是TGF-β達顯著的差異(p ＜0.05)，並參照下方表格。生長因子可促進細胞增生，降低細胞增生之所需時間，P-BP生長因子含量較市售胎牛血清及無血清培養基高，其在培養時可較快速增生細胞，使細胞達一定數量於醫療或試驗上利用。
實施例3
最佳活化配方設計：
以Design-Expert軟體分析生長因子含量之結果，計算出各活化劑對各生長因子釋放之影響，並以ANOVA數值表示(表3)，A為膠原蛋白、B為凝血酶、C為氯化鈣，ANOVA指數顯示活化劑對生長因子釋放之影響，數值大則表示活化劑能使血小板釋放更多含量之生長因子。其中經膠原蛋白、氯化鈣活化會增加TGF-β及PDGF的釋放，氯化鈣則增加KGF的分泌，結果參考RSM(response surface methodology)及Cube效益圖(圖1至圖8)，最後得Co-T+Ca-、Co+T-Ca-及Co+T+Ca-為可能之最佳配方。
表3　經Design-Expert軟體分析，各活化劑對生長因子釋放之指數
實施例4
重金屬分析：
1.樣品添加酸劑及雙氧水後，以400℃高溫加熱進行降解程序。降解完之產物回溶至硝酸中，再以原子吸收光譜儀檢測離子含量。結果顯示(表4)P-BP之Cu離子含量高於市售胎牛血清，而鐵離子無顯著差異，其他有害重金屬則未被檢出。
實施例5
以毛細管電泳測定纖維連結素(fibronectin)：
1.以0.1N NaOH活化毛細管。
2.以DDH2 O將NaOH洗脫。
3.將緩衝液注入毛細管中。
4.將樣本注入毛細管。
5.加以25 KV的電壓進行電泳分離。
6.分離結束後，以DDH2 O將毛細管內清洗。
7.毛細管電泳操作過程之條件如表5所示。
8.緩衝液系統：三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)緩衝液，在1000 mL DDH2 O溶液中含有0.33%三羥甲基氨基甲烷(Tris)、1.44%胺基乙酸(glycine)、0.1% SDS(pH=8.3)。
9.　纖維連結素會在2-5分鐘之間出現波鋒，檢測結果為圖9，圖中顯示三種P-BP纖維連接蛋白含量皆低於市售胎牛血清，而纖維連接蛋白為細胞貼附因子，其含量可能影響細胞於一定時間內之貼附率。
實施例6
幹細胞的分離：
1.　檢體取得皆符合中國文化大學及台北榮民總醫院之倫理規範。
2.　由榮總取得脂肪檢體，先添加含5%抗生素之PBS，以離心方式清洗檢體並分離多餘雜質。
3.　再加入0.075%膠原酶(collagenase)於37℃進行降解作用30分鐘。
4.　加入10%胎牛血清培養基終止反應，再以離心方式分離沉澱之幹細胞。
5.　以20-100 μm濾膜過濾，於燒瓶內培養。
實施例7
人類幹細胞培養基製備：
1.將粉狀DMEM培養基以無菌水配置，添加抗生素1%之比例，再添加市售FBS(Hyclone,USA)、無血清培養基(serum-free medium,SFM;StemPro,USA)、SFM(CEF,USA)、Co(-)T(+)Ca(-)、Co(+)T(-)Ca(-)及Co(+)T(+)Ca(-)血液製劑10%之含量至培養基中，以0.10~0.50 μm濾膜過濾，以完成人類幹細胞培養基。
實施例8
人類幹細胞培養試驗：
1.使用豬血液製劑培養基與胎牛血清(Hyclone,USA)及市售兩種SFM(Invitrogen,USA,California；Cellular Engineering Technologies Inc.,CET,USA,Iowa)比較對人類幹細胞培養之影響，細胞皆種入1×104 cell/cm2 ，以75T燒瓶(Orange Scientific)並於5% CO2 、37℃環境下培養。
實施例9
細胞貼附率試驗：
1.添加豬血液製劑培養基、胎牛血清培養基及市售無血清培養基至幹細胞培養上。
2.培養24小時後以錐蟲藍(trypan Blue)染色，並以細胞計數儀(invitrogen,USA)計數已貼附及未貼附之細胞數。
3. 計算出細胞貼附率，結果為圖10。貼附率計算公式：
4.其中胎牛血清貼附率為最佳之85%，因胎牛血清在纖維連結素測定之結果顯示其纖維連結素含量較高，而纖維連結素為可助於細胞貼附之因子，可證明兩試驗之結果相符。
實施例10
細胞增生率試驗：
1.添加豬血液製劑培養基、胎牛血清培養基及市售無血清培養基至幹細胞培養上。
2.培養人類幹細胞24、48、72及96小時後以錐蟲藍染色，以細胞計數儀(invitrogen,USA)計數貼附之細胞取得增生率，其結果表示於圖11。
3.其結果顯示三種血液製劑對人類幹細胞皆有較佳之增生率：
Co(+)T(+)Ca(-)：221%
Co(+)T(-)Ca(-)：253%
Co(-)T(+)Ca(-)：164%
4.本發明與市售培養基相比，能花費較短時間使細胞生長至一定細胞數量，如此能快速增生大量細胞，並於其他試驗或醫療上使用。
實施例11
細胞存活率試驗：
1.添加豬血液製劑培養基、胎牛血清培養基及市售無血清培養基至幹細胞培養上。
2.培養24、48及96小時後添加MTT試劑，再於37℃培養3-5小時。
3.添加DMSO將晶體溶出，經分光光度計測定吸光值後計算出存活率，其結果為圖12。
4.結果顯示三種血液製劑對人類幹細胞皆高於市售胎牛血清有較佳之存活率：
Co(+)T(+)Ca(-)：160%
Co(+)T(-)Ca(-)：176%
Co(-)T(+)Ca(-)：174%
表示P-BP較市售培養基更可減少細胞死亡之發生率，可保有細胞原有形態及結構，並可提供人類幹細胞一最適生長之環境。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之培養基及其製造程序與方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
圖1係TGF-β之RSM圖。
圖2係PDGF之RSM圖。
圖3係IGF之RSM圖。
圖4係KGF之RSM圖。
圖5係TGF-β之Cube圖。
圖6係PDGF之Cube圖。
圖7係IGF之Cube圖。
圖8係KGF之Cube圖。
圖9係毛細管電泳結果圖。
圖10係細胞貼附率試驗結果。
圖11係細胞增生率試驗結果。
圖12係細胞存活率試驗結果。

Claims (9)

  1. 一種製造細胞培養基之營養添加劑的方法，包含a.將哺乳動物的血液離心後取出上清液加以濃縮；b.添加血小板活化劑至該經濃縮之上清液中以得出上清活化液；及c.滅菌該上清活化液；其中，該血小板活化劑包含膠原蛋白、凝血酶及氯化鈣，其濃度範圍為：膠原蛋白1000μg/ml至5000μg/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化鈣0.1%至4.0%；膠原蛋白1000μg/ml至5000μg/ml、凝血酶0.1U/ml至2.0U/ml、氯化鈣0.1%至4.0%；或膠原蛋白10μg/ml至800μg/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化鈣0.1%至4.0%。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟a之離心方式為第一次100g 至500g 離心5至10分鐘、第二次100g 至500g 離心5至10分鐘，取出上清液後進行第三次離心，以1000g 至5000g 離心5至10分鐘加以濃縮。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟a之該經濃縮之上清液中血小板濃度範圍為每微升500000至1000000個血小板。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該細胞培養基係幹細胞培養基。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該哺乳動物係豬。
  6. 一種以如申請專利範圍第1項之方法製造之細胞培養基之營養添加劑。
  7. 如專利申請範圍第6項之營養添加劑，其具有促進細胞增生及存活之效用。
  8. 一種包含如申請專利範圍第6項之營養添加劑的細胞培養基。
  9. 一種將如申請專利範圍第8項之細胞培養基用於在組織工程或再生醫療上培養或處理細胞的用途。
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