TWI493035B

TWI493035B - Human umbilical cord mesenchymal stem cells in vitro culture method, promote cell growth and wound healing of the relevant components of the manufacturing method and its application.

Info

Publication number: TWI493035B
Application number: TW097118244A
Authority: TW
Inventors: Sieber Martin
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2008-05-16
Publication date: 2015-07-21
Also published as: TW200948960A

Description

人類臍帶間質幹細胞體外培養方法、促進細胞生長與傷口癒合之相關組成物之製造方法及其應用。

本發明係關於一種人類臍帶間質幹細胞體外培養方法。

本發明亦關於一種具有促進生長效果的關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法及其應用。

以往在間質幹細胞之應用方面，係以培養骨髓間質幹細胞作為取得間質幹細胞的主要手段。但骨髓幹細胞取得困難，並且在取得時對骨髓提供者(donor)不得不施行需全身麻醉之侵入式醫療行為，且骨髓間質幹細胞在培養時生長較慢，分泌物質較低。另外，由於骨髓間質幹細胞成熟程度較高，因此其體外培養的活性及骨髓幹細胞之分泌物質之性質均不理想，促進傷口癒合能力亦遜於人類臍帶間質幹細胞。

然而，既有的人類臍帶間質幹細胞體外培養方法產量低，不能有效地取得人類臍帶間質幹細胞，更難以進行實施或應用，是一亟待改善的缺點。

有鑒於前述骨髓間質幹細胞體外培養的活性與骨髓幹細胞之分泌物質之性質不理想之缺點，以及既有的人類臍帶間質幹細胞體外培養方法之缺點，本發明之目的在於提供一種有效的人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，並提供關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法及其應用。

為達成上述目的，本發明所提供之人類臍帶間質幹細胞體外培養方法主要包括有：齊備一除去血管之人類臍帶；自前述人類臍帶刮取一人類臍帶組織；以一蛋白分解酵素處理前述人類臍帶組織；分離出一單核間質幹細胞；將前述單核間質幹細胞置入一含有一培養基(medium)之培養皿；將前述培養皿於一提供二氧化碳並維持常溫之保濕培養器放置8至24小時，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；以前述培養基更換前述細胞懸浮液並除去未伏貼於培養皿之間質幹細胞；將伏貼於培養皿之間質幹細胞以前述培養基培養一適當時間，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液等步驟。

本發明所提供之關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法及其應用，主要係在進行前述人類臍帶間質幹細胞體外培養時取其細胞懸浮液，並利用該細胞懸浮液製得前述關於人類臍帶間質幹細胞之組成物，且進一步提供前述關於人類臍帶間質幹細胞之組成物製作具療效的醫療組成物之應用。

如上所述，本發明之主要特徵之一在於採用人類臍帶間質幹細胞作為培養對象，且成功的在體外大量培養間質幹細胞。由於臍帶需於短時間內快速將間質幹細胞釋出並純化，而其間質幹細胞具有未成熟化(premature)之特性，故該人類臍帶間質幹細胞體外培養的活性及釋放因子比骨髓間質幹細胞更佳，藉由本發明之方法所獲取之關於人類臍帶間質幹細胞之組成物，比既有方法所能獲取的產量更高，且更能有效地促進傷口癒合。

臍帶原本被視為醫療廢棄物，以往均將之丟棄而未加以利用，因此自臍帶取得間質幹細胞係一新技術，且藉由在本發明方法以特定濃度與作用時間採用分解酵素進行處理以及採用具有特定成份之培養液進行培養等手段所呈現的技術特徵，讓本發明之方法可有效地大量培養間質幹細胞。

辭彙定義

「間質幹細胞(Mesenchymal stem cell,MSC)」於本文定義為具有可資辨識之特殊表面抗原；較佳的是，其具有CD44、CD29、CD90、CD105、CD73、CD166、HLA－ABC等表面抗原但不具有CD34、CD45、CD14、HLA－DR表面抗原。

「人類臍帶間質幹細胞」於本文定義為取自人類臍帶之間質幹細胞；較佳的是，其係由臍帶中之花頓氏膠(Wharton’s Jelly，係臍帶內呈膠狀之結締組織)分離出之間質幹細胞，且其通常以類似纖維母細胞的貼附型態生長之細胞。

「同種異體(allogenic)」於本文定義為生物學分類中同一物種不同生物個體之意。此術語尤指將來自一生物個體之器官、組織、細胞或其衍生物植入或移殖至另一同種之生物個體之狀況。在此狀況下，接受前述器官、組織、細胞或其衍生物之生物個體若具有可發揮相當免疫能力之免疫系統，將可能針對前述器官、組織、細胞或其衍生物發動排斥(reject)反應。

「同種自體(autologous)」於本文定義為生物學分類中同一物種且同一生物個體之意。此術語尤指將之器官、組織、細胞或其衍生物植入或移殖至其所由來之生物個體之狀況。在此狀況下，由取得及接受前述器官、組織、細胞或其衍生物之生物個體係同一生物個體，因此即使前述生物個體具有可發揮相當免疫能力之免疫系統，通常亦不會對於前述器官、組織、細胞或其衍生物發動排斥反應。

「傷口(wound)」於本文定義為生物個體之體表遭受破壞而呈現割裂、穿刺、撕裂或受燒燙之樣態。較佳的是，其係皮膚之表皮(epidermis)、真皮(dermis)受到破壞、形成開口而露出皮下組織，或甚至皮下組織亦遭受破壞呈現之樣態。

「癒合(healing或repairing)」於本文定義為傷口重建的過程。此術語意指形成於皮膚之傷口藉由皮膚組織新生(regeneration)而重建的過程，尤指表皮組織及真皮組織新生使受到破壞而形成之開口恢復為封閉狀態的過程。

「感染(infection)」於本文定義為諸如病毒或細菌等作為病原(pathogen)之其他物種進入作為宿主(host)之生物個體內或該生物個體之細胞內，進行有害的複製、繁殖之過程。就形成有開口之開放性傷口而言，該感染通常導因於前述其他物種經該傷口進入前述生物個體內而發生，因此隨著前述開放性傷口曝露(exposure)於前述其他物種時間增長，其受感染之機會亦將隨之增加。

「發炎(inflammation)」於本文定義為生物個體對於諸如受損細胞或外來病原等有害刺激所發生之防御反應，其係位於形成傷口處及傷口週圍的組織或器官細胞釋出包括組織胺在內的化學物質，而引發免疫細胞及巨噬細胞(macrophage)的侵潤，並刺激附近的血管，導致局部血管擴張及微血管通透性增大。但發炎亦可能引起自體免疫反應等負面效果。在生物個體受感染的情況下，前述防御反應係為排除因感染而進入生物個體內之外來病原而發動，因此若感染機會較低，則發生發炎機會通常也會降低；若前述外來病原能被快速地排除，則發炎反應亦通常較早結束。

「疤痕(scar)」於本文定義為在傷口癒合的修復過程中所造成之永久痕跡。前述痕跡係由於傷口癒合時產生纖維化組織等替代性組織以替代原來之皮膚組織而形成者。

「釋放因子(secreted factors)」於本文定義為體外培養之間質幹細胞釋放到細胞外之物質；尤指以液態培養基體外培養人類臍帶間質幹細胞時，由該人類臍帶間質幹細胞釋放到液態培養基之物質。

「細胞懸浮液」於本文定義為以液態培養基體外培養細胞時，包括有前述細胞之分泌物與前述液態培養基，且可進一步包括有懸浮分散於其中之細胞。在本發明中，以液態培養基體外培養人類臍帶間質幹細胞時，此用語「細胞懸浮液」係指包括有該人類臍帶間質幹細胞所釋放之釋放因子與該液態培養基；又因在培養過程中，部分人類臍帶間質幹細胞係懸浮分散於該液態培養基中，因此該「細胞懸浮液」於此狀態下係進一步包括有懸浮分散之人類臍帶間質幹細胞，且該懸浮分散之人類臍帶間質幹細胞可能為活細胞。

發明詳述

(一)人類臍帶間質幹細胞體外培養方法本發明之一個方面係關於一種人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，該方法主要包括有：a.齊備一除去血管之人類臍帶；b.自前述人類臍帶刮取一人類臍帶組織；c.以一蛋白分解酵素處理前述人類臍帶組織；d.分離出一單核間質幹細胞；e.將前述單核間質幹細胞置入一含有一培養基之培養皿；f.將前述培養皿於一提供二氧化碳並維持常溫之保濕培養器放置8至24小時，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；g.以前述培養基更換前述細胞懸浮液並除去未伏貼於培養皿之間質幹細胞；h.將伏貼於培養皿之間質幹細胞以前述培養基培養一適當時間，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；等步驟。

請參閱第一圖，研究顯示，人體內的間質幹細胞會隨著年齡的增加而逐漸的減少。換言之，新生兒擁有最為豐富的間質幹細胞。由此可見，與新生兒密切相關之臍帶中的花頓氏膠及臍帶血將是較好的間質幹細胞來源。

另外，從組織中所含間質幹細胞(MSC)比例結果如下表1所示：

從以上可知，臍帶中的花頓氏膠是最佳的間質幹細胞(MSC)來源。

本發明之人類臍帶間質幹細胞體外培養方法利用人類臍帶間質幹細胞所提供較骨髓間質幹細胞最明顯之發明效果，在於其可於短時間內，自具有複雜組織之臍帶中，分離出間質幹細胞並加以純化；且其得力於人類臍帶間質幹細胞年輕、未成熟化之特性，因此該人類臍帶間質幹細胞在體外培養時，其生長繼代速率比傳統骨髓間質幹細胞快。藉由本發明之方法更換培養基加以培養，可以令被培養的人類臍帶間質幹細胞倍增到一定的細胞數目。

因此，在本發明一個較佳的方面，就該方法之b步驟及c步驟而言，前述人類臍帶組織係花頓氏膠，亦即以含有高濃度人類臍帶間質幹細胞之花頓氏膠作為獲取之來源。

為有效獲取人類臍帶間質幹細胞，需對於諸如花頓氏膠等前述人類臍帶組織以蛋白分解酵素在適當的環境條件下進行分解(digest)等處理。為有效達到該處理之目的，在該方法之c步驟可採用胰蛋白分解酵素(trypsin)或膠原蛋白分解酵素(collagenase)，或採用胰蛋白分解酵素與膠原蛋白分解酵素所構成之組合等，作為前述蛋白分解酵素。進行處理時，可令其於攝氏37度下處理前述人類臍帶組織1小時，以提供適當之處理效果。

該方法之d步驟可採用離心之方式分離前述單核間質幹細胞。其中一可行之離心環境條件係於140G下離心10分鐘進行。配合適當之離心機，可採用每分鐘8,000轉之轉速進行10分鐘的離心。

在該方法之f步驟之中，可令前述保濕培養器提供5%之二氧化碳並維持攝氏37度之溫度。其二氧化碳之濃度與溫度亦可配合需要加以適當之調整。

在該方法的e步驟至g步驟之中，可採用至少包括有：alpha－最小必需培養基、1%抗生素、10%胎牛血清、1mM L－麩醯胺、1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉之培養基，且可令h步驟中的適當時間為小於84小時之時間。

申言之，在前述將伏貼於培養皿之間質幹細胞以前述培養基培養一週的時間之中，可以至少更換二次前述細胞懸浮液。亦即，前述適當時間係大於84小時之時間，且培養每經過84小時至少以前述培養基更換一次前述細胞懸浮液。具體更換前述細胞懸浮液之方法，係自前述培養皿取出前述細胞懸浮液，再將前述培養基加入前述培養皿。藉著每經過前述適當時間即以前述培養基更換前述細胞懸浮液之方式，可周而復始的循環實施該方法的g步驟與h步驟，從而持續不斷地培養該等人類臍帶間質幹細胞，並讓該等人類臍帶間質幹細胞增殖至相當之數量。

又，由於前述人類臍帶間質幹細胞在前述培養基中被培養的過程中，其所分泌之釋放因子將進入前述培養基內，且前述培養基所含之營養素亦受到相當之消耗，使得前述培養基之成份組成發生變化，進而轉變成前述細胞懸浮液。此外，雖然人類臍帶間質幹細胞主要係以類似纖維母細胞的貼附型態生長，但在培養過程中，部分人類臍帶間質幹細胞不復貼附而懸浮分散於前述培養基中。因此，前述細胞懸浮液亦包括有相當數量之人類臍帶間質幹細胞，且該懸浮分散於前述細胞懸浮液中之人類臍帶間質幹細胞可能為活細胞或死亡之細胞。由此可知，在該方法之f步驟或h步驟中皆能夠獲取由前述培養基轉變而成的前述細胞懸浮液。

(二)關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法本發明之另一個方面係關於一種關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法。

為製造本發明所提供關於人類臍帶間質幹細胞之組成物，首先需以適當之手段培養人類臍帶間質幹細胞，在培養過程中獲取細胞懸浮液，再藉由該細胞懸浮液以冷凍乾燥法等技術手段製得該關於人類臍帶間質幹細胞之組成物。本發明關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法係包括有：a.齊備一除去血管之人類臍帶；b.自前述人類臍帶刮取一人類臍帶組織；c.以一蛋白分解酵素處理前述人類臍帶組織；d.分離出一單核間質幹細胞；e.將前述單核間質幹細胞置入一含有一培養基之培養皿；f.將前述培養皿於一提供二氧化碳並維持常溫之保濕培養器放置8至24小時，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；g.獲取前述細胞懸浮液；h.以冷凍乾燥法將前述細胞懸浮液乾燥而製得一粉末；i.以前述粉末為有效成分製得一組成物；等步驟。

由於在該方法之f步驟中前述培養基轉變為一細胞懸浮液，故可於g步驟獲取前述細胞懸浮液並進而藉由實施h步驟及i步驟製得前述組成物。但參照前述人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，可知亦得以採用以前述培養基更換細胞懸浮液的方式進行持續培養該人類臍帶間質幹細胞，從而能夠在每次更換時獲取該細胞懸浮液。職是，本發明另關於一種關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法，包括有：a.齊備一除去血管之人類臍帶；b.自前述人類臍帶刮取一人類臍帶組織；c.以一蛋白分解酵素處理前述人類臍帶組織；d.分離出一單核間質幹細胞；e.將前述單核間質幹細胞置入一含有一培養基之培養皿；f.將前述培養皿於一提供二氧化碳並維持常溫之保濕培養器放置8至24小時，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；g.以前述培養基更換前述細胞懸浮液並除去未伏貼於培養皿之間質幹細胞；h.將伏貼於培養皿之間質幹細胞以前述培養基培養一適當時間，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；i.更換並獲取前述細胞懸浮液；j.以冷凍乾燥法將前述細胞懸浮液乾燥而製得一粉末；k.以前述粉末為有效成分製得一組成物；等步驟。

在此方法的e步驟至k步驟之中，可採用前揭包括有alpha－最小必需培養基、1%抗生素、10%胎牛血清、1mM L－麩醯胺、1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉等成分之培養基，且可令h步驟中的適當時間為小於84小時之時間。藉著每經過前述適當時間即以前述培養基更換前述細胞懸浮液，並在更換之際收集前述細胞懸浮液，可循環實施該方法的g步驟以至於h步驟，從而持續不斷地培養該等人類臍帶間質幹細胞並獲取前述細胞懸浮液，且可依此方法j步驟與k步驟所示，從前述細胞懸浮液製得一關於人類臍帶間質幹細胞之組成物。

本發明所提供由於根據關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法係以前述人類臍帶間質幹細胞之體外培養方法為基礎。因此，當被體外培養的人類臍帶間質幹細胞增殖至相當之數量時，可以更有效地取得含有高濃度釋放因子之細胞懸浮液，對於促進細胞修復傷口癒合能力有更佳的表現。

(三)關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法所製得之組成物的應用本發明之另一個方面係關於一種關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法所製得之組成物的應用。

如前述，本發明能夠基於前揭人類臍帶間質幹細胞體外培養方法有效取得前述細胞懸浮液，並據以提供一種關於人類臍帶間質幹細胞之組成物的製造方法，以製得一種關於人類臍帶間質幹細胞之組成物。

於一實驗動物皮膚上造出傷口，再使用前述細胞懸浮液或前述組成物塗抹該傷口，可觀察到前述細胞懸浮液及前述組成物皆能發揮促進傷口癒合，降低傷口感染、抑制發炎及減少疤痕之作用，故可知前述組成物能夠應用於一般皮膚傷口癒合治療的發明，進而可將該組成物應用於製造具有促進傷口癒合，降低傷口感染、抑制發炎及減少疤痕等作用之醫藥組成物。

實施例

本發明之實際實施態樣及實施方法如下所示，但本發明所屬領域中常用、眾所周知或可得而知的各種已確立之技術手段，則酌減冗贅重覆之說明。又，各實施例係用以說明本發明而非限定本發明於該等實施例上。

實施例1

以免疫不全小鼠之傷口測試關於人類臍帶間質幹細胞之細胞懸浮液的傷口癒合促進效果 (一)獲取關於人類臍帶間質幹細胞之細胞懸浮液 1、分離並培養人類臍帶間質幹細胞為分離並培養人類臍帶間質幹細胞，在本實施例中所採取的具體技術手段係自一來源人類個體獲取一人類臍帶。前述人類臍帶需先去除血管後切碎臍帶組織。接著在分離出臍帶中的花頓氏膠後，或不分離該花頓氏膠即進一步利用胰蛋白分解酵素及膠原蛋白分解酵素進行分解處理。在本實施例中所採取的具體技術手段係以wuensch的0.3單位之膠原蛋白分解酵素，以及0.05%濃度之胰蛋白分解酵素於攝氏37度下作用1小時，然後以140G下離心10分鐘的方式分離出單核間質幹細胞後，植入盛有培養基之培養皿。前述培養基成分包括：alpha－最小必需培養基、1%抗生素、10%胎牛血清、1mM L－麩醯胺、1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉(此培養基係一周知的先前技術。參見(2003)Stem Ceｌｌｓ 21：105－110,(2004)Stem Cells 22：649－658)，並於37度的及含5%二氧化碳的潮濕培育器中培育。第二天，亦即經過約8至24小時後，係以新鮮的前述培養基更換含有不貼附之間質幹細胞之細胞懸浮液。呈貼附形態的間質幹細胞則再一次以前述培養基更換細胞懸浮液進行培養。

為保存前述體外培養而增殖的間質幹細胞，可利用一種可調控升降溫速率之冷藏庫冷藏保存於10%的DMSO溶液中。且為確保間質幹細胞的品質，所有欲保存的間質幹細胞需要經過關於細菌污染試驗傳染性疾病如(HBV,HCV,HTLV,HIV,梅毒and CMV)，類菌質體及內毒素之測試。類菌質體係利用PCR套組測驗。利用凝血法來測試內毒素。又，為了測量此欲保存的間質幹細胞的純度，可進一步利用常見標記(如：negative：CD14,CD34,CD45,HLA－ABC；positive：CD29,CD44,CD90,CD105,HLA－DR,CD61,CD71,CD73,CD166)分析間質幹細胞的表面抗原。應用此方法可成功地在體外大量培養臍帶間質幹細胞到足夠使用的細胞濃度以供以下的應用。

2、製造關於人類臍帶間質幹細胞之細胞懸浮液在前述第二天，亦即經過約8至24小時後，以新鮮的前述培養基更換前述細胞懸浮液時，即可收集該含有不貼附之間質幹細胞之細胞懸浮液。又，在其後再次以前述培養基更換細胞懸浮液時，亦同樣可取得該細胞懸浮液。

(二)測試前述關於人類臍帶間質幹細胞之細胞懸浮液之效果就一般認知而言，間質幹細胞最多繼代20次，在本實施例中，係使用繼代10次之內的人類臍帶間質幹細胞。

本實施例使用免疫不全小鼠(Nude mice：BLAB/cAnN－Cg－Foxn1nu/CrlNarl)，來自於財團法人國家動物中心，飼養在無菌環境，其鼠齡為8週大。

本實施例之實施方法先將前述免疫不全小鼠分為人類臍帶間質幹細胞治療組及控制組(Control Group)等二組。將二組之小鼠背部皆以穿刺刀(Punch)製造直徑5毫米之深及皮下組織的傷口。二組小鼠的傷口建立後，人類臍帶間質幹細胞治療組的小鼠傷口滴入50微升的細胞懸浮液內含10^4－5 人類臍帶間質幹細胞)，控制組的小鼠傷口則滴入50微升無處理過之培養基，二組皆以諸如O.P.site等透明薄膜狀的貼布將傷口貼起來。

本實施例共進行14天。在14天後，發現人類臍帶間質幹細胞治療組小鼠的傷口癒合較良好，傷口已完全癒合，表皮層已完全覆蓋傷口(epithelilization)，且因真皮層受傷後所產生的凹陷的疤痕(depressed scar)也較淺。反觀對照組在第14天傷口並未完全癒合，表皮層仍未完全覆蓋傷口，仍有痂皮及明顯之真皮缺陷之凹陷疤痕。

此實驗證明臨床上可利用體外培養人類臍帶間質幹細胞而取得之細胞懸浮液來應用於加速皮膚傷口之癒合。又根據前述觀察之傷口癒合效果，所屬領域中具有通常知識者可合理推知包括褥瘡、糖尿病傷口、挫瘡、燒燙傷、青春痘、電射美容術後傷口，及一切未提及所有可能之皮膚傷口均可能藉由前述細胞懸浮液達到促進傷口癒合之效果。並且根據前述細胞懸浮液有效促進傷口癒合之效果，可合理推測以前述細胞懸浮液作為有效成份之藥劑，將可能提供使過敏及交叉污染降至最低的效果。

由本實施例可知，藉由體外培養人類臍帶間質幹細胞所獲取之細胞懸浮液具有促進傷口癒合，降低傷口感染、抑制發炎及減少疤痕之效果。

實施例2

以具免疫力之ICR老鼠(ICR mice)之傷口測試人類臍帶間質幹細胞釋放因子之傷口癒合促進效果 (一)製造關於人類臍帶間質幹細胞之組成物由前述實施例1可知在體外培養人類臍帶間質幹細胞的過程中所獲取之細胞懸浮液具有促進傷口癒合等效果。在本實施例中藉由冷凍乾燥法將前述細胞懸浮液乾燥而製得一粉末，並以前述粉末為有效成分製得一關於人類臍帶間質幹細胞之組成物。

在本實施例中，首先係將前述組成物回溶於純水中而形成一組成物溶液，接採用蛋白質定量之相關技術手段，將前述組成物溶液製成蛋白質濃度與前述培養基相等的液體。

(二)測試前述關於人類臍帶間質幹細胞之組成物之效果本實施例使用8週大ICR小鼠(ICR mice：來自於財團法人國家動物中心)，其具有免疫力。該等ICR小鼠被分為人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組及控制組等二組。

前述二組之小鼠背部皆以穿刺刀製造傷口，人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組及控制組，傷口直徑皆為5毫米。人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組小鼠每日分別滴20微升包括有包括有人類臍帶間質幹細胞釋放因子的前述組成物溶液於傷口，並貼上諸如o.p.site等透明薄膜貼布。控制組小鼠每日分別滴20微升的前述培養基於傷口，並貼上諸如o.p.site等透明薄膜貼布。

在本實施例進行至第17天時，人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組組小鼠傷口直徑為2毫米，控制組小鼠傷口直徑為4毫米。顯示人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組小鼠傷口癒合速度較控制組小鼠快，表示人類臍帶間質幹細胞分泌的釋放因子有助於傷口癒合。

實施例3

以具免疫力之C57老鼠(C57mice)之傷口測試人類臍帶間質幹細胞細胞懸浮液之傷口癒合促進效果 (一)取用關於人類臍帶間質幹細胞之組成物在本實施例中，係取用前述實施例2所述將前述組成物回溶於純水中而形成之組成物溶液。

(二)測試前述關於人類臍帶間質幹細胞之組成物之效果本實施例使用8週大C57小鼠(C57 mice：來自於財團法人國家動物中心)，具有免疫力。該等C57小鼠被分為人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組及控制組等二組。

前述二組之小鼠實驗老鼠背部以穿刺刀製造傷口，人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組及控制組，傷口直徑皆為5毫米。人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組小鼠每日分別滴20微升包括有包括有人類臍帶間質幹細胞釋放因子的前述組成物溶液於傷口，並貼上諸如o.p.site等透明薄膜貼布。控制組小鼠每日分別滴20微升的前述培養基於傷口，並貼上諸如o.p.site等透明薄膜貼布。

在本實施例進行至第9天時，人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組組小鼠傷口直徑為1毫米，控制組小鼠傷口直徑為2毫米。顯示人類臍帶間質幹細胞釋放因子實驗組小鼠傷口癒合速度較控制組小鼠快，表示人類臍帶間質幹細胞分泌的釋放因子有助於傷口癒合。

第一圖係人體內的間質幹細胞相對年齡增長之存在比例(其係國際細胞治療協會(International Society for Cellular Therapy,ISCT)於2006年公開之資料)。

Claims

一種人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，包括有：齊備一除去血管之人類臍帶；自前述人類臍帶刮取一人類臍帶組織；以一蛋白分解酵素處理前述人類臍帶組織；分離出一單核間質幹細胞；將前述單核間質幹細胞置入一含有一培養基之培養皿；將前述培養皿於一提供二氧化碳並維持常溫之保濕培養器放置8至24小時，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；以前述培養基更換前述細胞懸浮液並除去未伏貼於培養皿之間質幹細胞；將伏貼於培養皿之間質幹細胞以前述培養基培養一適當時間，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；前述人類臍帶組織係花頓氏膠；前述蛋白分解酵素係選自由胰蛋白分解酵素、膠原蛋白分解酵素及其組合所構成之群組；前述培養基係至少包括有：alpha-最小必需培養基、1%抗生素、10%胎牛血清、1mM L-麩醯胺、1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉。
如申請專利範圍第1項所述之人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，前述蛋白分解酵素係於攝氏37度下處理前述人類臍帶組織1小時。
如申請專利範圍第1項所述之人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，前述分離出單核細胞之步驟係以140G下離心10分鐘的方式進行。
如申請專利範圍第1項所述之人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，前述保濕培養器提供5%之二氧化碳並維持攝氏37度之溫度。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，前述適當時間係小於84小時之時間。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之人類臍帶間質幹細胞體外培養方法，在前述將伏貼於培養皿之間質幹細胞以前述培養基培養一適當時間之步驟中，前述適當時間係大於84小時之時間，且培養每經過84小時至少以前述培養基更換一次前述細胞懸浮液。
一種組成物製造方法，包括有：齊備一除去血管之人類臍帶；自前述人類臍帶刮取一人類臍帶組織；以一蛋白分解酵素處理前述人類臍帶組織；分離出一單核間質幹細胞；將前述單核間質幹細胞置入一含有一培養基之培養皿；將前述培養皿於一提供二氧化碳並維持常溫之保濕培養器放置8至24小時，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；獲取前述細胞懸浮液；以冷凍乾燥法將前述細胞懸浮液乾燥而製得一粉末；以前述粉末為有效成分製得一組成物；前述人類臍帶組織係花頓氏膠；前述蛋白分解酵素係選自由胰蛋白分解酵素、膠原蛋白分解酵素及其組合所構成之群組；前述培養基係至少包括有：alpha-最小必需培養基、1%抗生素、10%胎牛血清、1mM L-麩醯胺、1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉。
如申請專利範圍第7項所述之組成物製造方法，前述蛋白分解酵素係於攝氏37度下處理前述人類臍帶組織1小時。
如申請專利範圍第7項所述之組成物製造方法，前述分離出單核細胞之步驟係於140G下離心10分鐘的方式進行。
如申請專利範圍第7項所述之組成物製造方法，前述保濕培養器提供5%之二氧化碳並維持攝氏37度之溫度。
一種組成物製造方法，包括有：齊備一除去血管之人類臍帶；自前述人類臍帶刮取一人類臍帶組織；以一蛋白分解酵素處理前述人類臍帶組織；分離出一單核間質幹細胞；將前述單核間質幹細胞置入一含有一培養基之培養皿；將前述培養皿於一提供二氧化碳並維持常溫之保濕培養器放置8至24小時，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；以前述培養基更換前述細胞懸浮液並除去未伏貼於培養皿之間質幹細胞；將伏貼於培養皿之間質幹細胞以前述培養基培養一適當時間，其後，前述培養基轉變為一細胞懸浮液；更換並獲取前述細胞懸浮液；以冷凍乾燥法將前述細胞懸浮液乾燥而製得一粉末；以前述粉末為有效成分製得一組成物；前述人類臍帶組織係花頓氏膠；前述蛋白分解酵素係選自由胰蛋白分解酵素、膠原蛋白分解酵素及其組合所構成之群組；前述培養基係至少包括有：alpha-最小必需培養基、1%抗生素、10%胎牛血清、1mM L-麩醯胺、1mM非必需胺基酸及1mM丙酮酸鈉。
如申請專利範圍第11項所述之組成物製造方法，前述蛋白分解酵素係於攝氏37度下處理前述人類臍帶組織1小時。
如申請專利範圍第11項所述之組成物製造方法，前述分離出單核細胞之步驟係於140G下離心10分鐘的方式進行。
如申請專利範圍第11項所述之組成物製造方法，前述保濕培養器提供5%之二氧化碳並維持攝氏37度之溫度。
如申請專利範圍第11至14項中任一項所述之組成物製造方法，前述適當時間係小於84小時之時間。
如申請專利範圍第11至14項中任一項所述之組成物製造方法，在前述將伏貼於培養皿之間質幹細胞以前述培養基培養一適當時間之步驟中，前述適當時間係大於84小時之時間，且培養每經過84小時至少以前述培養基更換一次前述細胞懸浮液，並獲取前述細胞懸浮液。
一種由如申請專利範圍第7至16項中任一項所述之方法所製得的組成物用以製造促進生物個體傷口癒合之醫藥組成物之應用。
如申請專利範圍第17項所述之應用，前述生物個體與前述來源人類個體係同種自體。
如申請專利範圍第17項所述之應用，前述生物個體與前述來源人類個體係同種異體。
一種由如申請專利範圍第7至16項中任一項所述之方法所製得的組成物用以製造降低生物個體傷口感染之醫藥組成物之應用。
如申請專利範圍第20項所述之應用，前述生物個體與前述來源人類個體係同種自體。
如申請專利範圍第20項所述之應用，前述生物個體與前述來源人類個體係同種異體。
一種由如申請專利範圍第7至16項中任一項所述之方法所製得的組成物用以製造抑制生物個體傷口發炎之醫藥組成物之應用。
如申請專利範圍第23項所述之應用，前述生物個體與前述來源人類個體係同種自體。
如申請專利範圍第23項所述之應用，前述生物個體與前述來源人類個體係同種異體。