CN108472410B - 用于生产皮肤等同物的方法及其用于体外测试和体内移植的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于生产皮肤等同物的方法，所述方法包括以下步骤：a)生产含有第一层和第二层的真皮基质，其包括以下步骤：i)提供所述第一层；ii)提供包含液体和选自胶原蛋白、弹性蛋白和/或透明质酸的至少一种聚合物的可聚合溶液；iii)将所述可聚合溶液添加到所述第一层中；iv)使所述溶液聚合以形成所述第二层；v)压缩所述第二层，其中由于所述压缩，所述第二层的液体含量降低，并且使所述第一层与所述第二层结合在一起以形成所述真皮基质；以及vi)将至少一个腔引入所述真皮基质中；b)将至少一个毛囊和/或毛囊胚芽引入步骤a)中产生的所述真皮基质的所述至少一个腔中以产生皮肤替代物；以及c)将选自成纤维细胞、内皮细胞、脂细胞、神经细胞、腺细胞、黑素细胞或角化细胞的至少一种另外的细胞群添加到所述皮肤替代物中以产生所述皮肤等同物。

Description

用于生产皮肤等同物的方法及其用于体外测试和体内移植的 用途
背景技术
皮肤是身体与其环境之间的界面。其是抵抗潜在有害外部影响(如机械负荷或病原微生物入侵)的第一个关键屏障。当皮肤的自我再生能力不再足以维持该保护时，皮肤对人类健康的重要意义变得尤其明显。在患有慢性或广泛急性伤口的患者中尤其如此，如在损伤(如烧伤)的情况下所发生的。如果这些伤口没有得到充分的治疗以使皮肤再生，那么这些病症对生活质量有相当大的影响，甚至可能是致命的。
众所周知，除了使受损的皮肤再生的可能性之外，尤其同样包含毛囊的人造皮肤等同物还可以用于不同形式的脱发或秃发的治疗性处理。
此外，需要可用于研究多种类型的秃发的原因的适当的测试系统。这同样适用于调查毛发的生长、结构和色素沉着。除了生物医学研究之外，制药和化妆品行业尤其迫切需要合适的系统来测试物质对人类皮肤或毛发的功效或毒性。
近十年来，为了模仿皮肤代替物形式的人类皮肤的复杂结构和多种功能而做出了很大努力。尽管人造皮肤的发展取得了重大进展，但相对于天然人类皮肤的生理机能，人造皮肤在结构和功能上仍存在很大差异，这仍然是问题。特别地，人造皮肤的毛囊、脂肪组织和血管供应的植入迄今为止只取得了令人不满意的效果。此外，迄今为止，还不可能大规模生产这样的人造皮肤，因为目前这样的产品的高生产能力方法仍然受到限制。
发明内容
本发明的目的是减少或避免现有技术的一个或多个缺点。特别地，本发明的一个目的是提供一种可以生产皮肤等同物的方法。
本发明通过提供一种用于生产皮肤等同物的方法来实现该目的，所述方法包括以下步骤：a)生产含有第一层和第二层的真皮基质，其包括以下步骤：i)提供第一层；ii)提供包含液体和选自胶原蛋白、弹性蛋白和/或透明质酸的至少一种聚合物的可聚合溶液；iii)将可聚合溶液添加到第一层中；iv)使溶液聚合以形成第二层；v)压缩第二层，其中由于压缩，第二层的液体含量降低，并且使第一层与第二层结合在一起以形成真皮基质；以及vi)将至少一个腔引入真皮基质中；b)将至少一个毛囊和/或毛囊胚芽引入步骤a)中产生的真皮基质的所述至少一个腔中以产生皮肤替代物；以及c)将选自成纤维细胞、内皮细胞、脂细胞、神经细胞、腺细胞、黑素细胞或角化细胞的至少一种另外的细胞群添加到皮肤替代物中以产生皮肤等同物。
本发明的生产方法在体外进行。“体外”意指不位于活生物体(例如，人体或动物体)内的任何环境。因此，根据本发明的体外检测方法明确地不包括在人体或动物体上进行的方法。
除非上下文另外明确地指出，否则单数或复数形式的使用总是包括单数和复数两者。
根据本发明的方法涉及皮肤等同物的生产。术语“皮肤等同物”表示在性质和功能方面可用作天然皮肤的基本等同代替物的皮肤模型。皮肤等同物优选地具有生理皮肤的大致形式和结构。
根据本发明的用于生产皮肤等同物的方法包括以下步骤：a)生产含有第一层和第二层的真皮基质；b)将至少一个毛囊和/或毛囊胚芽引入步骤a)中产生的真皮基质的至少一个腔中以产生皮肤替代物；以及c)将选自成纤维细胞、内皮细胞、脂细胞、神经细胞、腺细胞、黑素细胞或角化细胞的至少一种另外的细胞群加入到皮肤替代物中以产生皮肤等同物。
在根据本发明的用于生产皮肤等同物的方法中，在第一步骤a)中生产真皮基质。真皮基质的生产包括以下步骤：i)提供第一层；ii)提供包含液体和选自胶原蛋白、弹性蛋白和/或透明质酸的至少一种聚合物的可聚合溶液；iii)将可聚合溶液添加到第一层中；iv)使溶液聚合以形成第二层；v)压缩第二层，其中由于压缩，第二层的液体含量降低，并且使第一层与第二层结合在一起以形成真皮基质；以及vi)将至少一个腔引入真皮基质中。
真皮基质含有两层，即第一层和第二层。在当前的情形中，“真皮基质”意指在根据本发明的方法中用作皮肤等同物的生产的起始材料的材料基底。这里的真皮基质具有与生理皮肤的分层结构相似的结构，因此第一层类似于(下部)真皮结构，而第二层类似于生理皮肤的乳头状和网状结构。
在步骤i)中，提供真皮基质的第一层。真皮基质的第一层优选地基本上不含活细胞。
真皮基质的第一层可以包含天然皮肤物质。“皮肤物质”是指类似于或具有生理皮肤的(下部)真皮的结缔组织样结构的材料。天然皮肤物质在用于根据本发明的方法之前优选地已经进行脱细胞化。天然皮肤物质可以是例如供体皮肤。该供体皮肤是动物来源的。供体皮肤优选来源于脊椎动物，其可以是哺乳动物、鸟类、爬行动物或两栖动物，优选是鸟类或哺乳动物。该哺乳动物可以是人类、猴、猪、狗、猫或啮齿动物，优选是人类。一种人类来源的供体皮肤例如在现有技术中已知，称为
Figure BDA0001721646660000031
供体皮肤在此可以来源于身体的任何合适部位，例如来自躯干，例如来自胸部、腹部或背部，或者来自四肢，例如来自手臂或腿部。
一旦皮肤已经从供体取出，就可以使所述皮肤经历一个或多个清洁步骤，以便从皮肤移除可能存在的任何干扰物质。这样的清洁步骤可以例如包括消除活细胞。
真皮基质的第一层可以包含人造皮肤物质。例如，人造皮肤物质可以是包含结构蛋白质、优选为胶原蛋白和/或弹性蛋白、特别优选为胶原蛋白和弹性蛋白的材料。一种人造皮肤物质例如在现有技术中已知，称为
Figure BDA0001721646660000041
以下步骤ii)涉及提供可聚合溶液。该可聚合溶液适合于在聚合反应中从液态转化为基本上固态。可聚合溶液包含液体。液体可以是例如水、盐水溶液或营养介质。液体可以是被缓冲了的。
可聚合溶液的pH值优选为2至12，优选为4至10，特别地优选为5至9，非常特别地优选为6至8。
可聚合溶液还包含选自胶原蛋白、弹性蛋白和/或透明质酸的至少一种聚合物。可聚合溶液优选地包含胶原蛋白。
胶原蛋白优选为I型、II型、III型、IV型或V型的胶原蛋白，优选为I型胶原蛋白。可聚合溶液同样优选地包含胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸。
所述至少一种聚合物以≥0.01％、优选为0.01％至50％、特别地优选为0.1％至10％、非常特别地优选为0.125％至5％的浓度存在于可聚合溶液中。
可聚合溶液还可以包含细胞。这些细胞优选为活细胞。细胞可以是间充质来源的细胞，例如多能间充质干细胞——其为结缔组织前体细胞。细胞优选为结缔组织细胞，特别优选为成纤维细胞。
接下来的步骤iii)涉及将可聚合溶液添加到第一层中。
在接下来的步骤iv)中，使溶液聚合以形成真皮基质的第二层。这优选地在大于或等于室温的温度下进行。“室温”指定为18℃至25℃范围内的温度。所述溶液优选地在≥25℃、优选≥30℃、特别地优选30℃至50℃、非常特别地优选35℃至45℃、尤其优选37℃至42℃的温度下聚合。
形成第二层的溶液的聚合可以在基本上静态的条件下或在搅拌下进行。聚合优选地在转动、旋转或摇动搅拌下进行。形成第二层的溶液的聚合同样可以在组合了刚刚上述两种方法的条件下进行，使得聚合反应例如首先通过搅拌而开始，然后在基本静态的条件下完成。
使溶液形成第二层的聚合进行至少1分钟，优选为2分钟至24小时，特别优选为5分钟至12小时，特别优选为10分钟至4小时，非常特别优选为15分钟至1小时。
在步骤iv)之前，可选地通过搅拌使可聚合溶液中的聚合物图案化。聚合物的图案化导致聚合物在溶液中的均匀分布，使得由此产生的聚合的第二层具有基本上统一的结构。
接下来的步骤v)涉及压缩第二层，其中由于压缩，第二层的液体含量降低并且使第一层与第二层结合在一起以形成真皮基质。第二层的压缩在此可以通过离心、沉降或力的机械施加来进行。力的机械施加优选为施压。通过压缩从第二层移除的一部分液体含量在此可以被第一层吸收。
由于压缩，第一层和第二层结合在一起形成以真皮基质。真皮基质的层厚度为至少0.1mm，优选为0.25mm至10mm，特别优选为0.5mm至5mm，非常特别优选为1mm至3mm。真皮基质内的第一层和第二层在此可以各自具有相同或不同的层厚度。第一层的层厚度为至少0.01mm，优选为0.05mm至5mm，特别优选为0.1mm至2.5mm。第二层的层厚度为至少0.01mm，优选为0.05mm至5mm，特别优选为0.1mm至2.5mm。
在接下来的步骤vi)中，将至少一个腔引入真皮基质中。真皮基质的腔的平均直径为≥0.001mm至5mm，优选为0.005mm至1mm，特别优选为0.01mm至0.08mm，非常特别优选为0.02mm至0.06mm，尤其优选为0.05mm至0.04mm。真皮基质的腔的深度为≥0.05mm至10mm，优选为0.1mm至8mm，特别优选为0.15mm至6mm，非常特别优选为0.2mm至4mm，尤其优选为0.5mm至2.5mm。
优选地，将1个腔/cm2至400个腔/cm2引入真皮基质中，优选为10个/cm2至200个/cm2，特别优选为20个/cm2至100个/cm2，非常特别优选为30个/cm2至100个/cm2。在此可以将腔以固定或不固定的间隔引入真皮基质中；优选地将腔以固定的间隔引入真皮基质中。
可以通过从真皮基质中移除材料来引入所述至少一个腔。优选地通过穿刺、切除或通过压印模具将所述至少一个腔引入真皮基质中。穿刺例如借助于针、特别是插管进行。切除可以例如通过解剖刀进行，可选地借助于另外的工具例如一对镊子进行，以便从真皮基质中移除所切除的材料。
可替代地，可以通过压印模具将所述至少一个腔引入真皮基质中。压印模具包括基部。基部可以具有多种形状，例如，其可以例如具有圆形、椭圆形或多边形基部区域。基部可以是平面的或图案化的。压印模具优选地包括至少一个圆筒。术语“圆筒”是指适于将腔引入真皮基质中的细长圆筒体。所述至少一个圆筒的直径为≥0.001mm至5mm，优选为0.005mm至1mm，特别优选为0.01mm至0.08mm，非常特别地优选为0.02mm至0.06mm，尤其优选为0.05mm至0.04mm。所述至少一个圆筒的长度为≥0.05mm至10mm，优选为0.1mm至8mm，特别优选为0.15mm至6mm，非常特别地优选为0.2mm至4mm，尤其优选为0.5mm至2.5mm。
优选地将所述至少一个圆筒紧固到所述基部；特别优选地将所述至少一个圆筒集成在所述基部中。所述至少一个圆筒优选地垂直于所述基部的基部区域定向。
压印模具优选地包括多于或等于一个圆筒。压印模具优选地包括10个至10000个圆筒，特别优选为20个至5000个，非常特别地优选为100个至1000个。圆筒可以以固定或不固定的间隔存在于压印模具中。圆筒优选地以固定的间隔存在于压印模具中。
所述至少一个圆筒优选至少部分地包括中空空间；圆筒特别优选为基本上完全中空。
所述至少一个圆筒可在其一端具有漏斗形扩口部分。在这种情况下，圆筒优选为基本上完全中空。圆筒的漏斗形扩口部分在其外端处的直径为≥0.01mm，优选为0.1mm至4mm，特别优选为0.2mm至3mm，非常特别地优选为0.3mm至2.5mm，尤其优选为0.5mm至2mm。
压印模具优选地同样包括至少一个凸起部分。表述“凸起部分”表示基本上为圆锥形的隆起。凸起部分优选地具有正锥体的形状，其中锥体的顶端优选为圆形。借助于所述至少一个凸起部分将波状图案压印到真皮基质中，这种结构类似于表皮/真皮边界处的天然皮肤的生理乳头状结构。圆锥形凸起部分的基部区域的直径为≥0.001mm，优选为0.1mm至4mm，特别优选为0.2mm至3mm，非常特别地优选为0.3mm至2.5mm，尤其优选为0.5mm至2mm。锥体的圆形顶端的直径为≥0.001mm，优选为0.01mm至3.5mm，特别优选为0.1mm至2.5mm，非常特别地优选为0.2mm至2mm，尤其优选为0.3mm至1mm。
优选地将所述至少一个凸起部分紧固到所述基部；特别优选地将所述至少一个凸起部分集成在所述基部中。同样可能的是，所述至少一个凸起部分是图案化单元，其赋予被图案化的基部相应的形状。所述至少一个凸起部分的高度优选地垂直于所述基部的基部区域定向。
压印模具优选地包括多于或等于一个凸起部分。压印模具优选地包括10个至10000个凸起部分，特别优选为20个至5000个，非常特别地优选为100个至1000个。凸起部分可以以固定或不固定的间隔存在于压印模具中。凸起部分优选地以固定的间隔存在于压印模具中。
压印模具优选地包括至少一个圆筒和至少一个凸起部分。压印模具优选地包括10个至10000个圆筒和凸起部分，特别优选为20个至5000个，非常特别地优选为100个至1000个。圆筒和/或凸起部分可以分别以固定或不固定的间隔存在于压印模具中。圆筒和/或凸起部分优选地以固定的间隔存在于压印模具中；圆筒和凸起部分优选地以固定的间隔存在于压印模具中。圆筒和凸起部分优选地以使得其基本上彼此偏移的方式存在于压印模具中。
压印模具的基部、所述至少一个圆筒和/或所述至少一个凸起部分可以例如由金属、塑料、橡胶或硅树脂例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)组成或包含这些材料。压印模具的基部、所述至少一个圆筒和所述至少一个凸起部分优选地由相同的材料组成。基部、所述至少一个圆筒和所述至少一个凸起部分特别优选地基本上采用单件式压印模具的形式。
用于生产真皮基质的方法步骤iv)、v)或vi)可以依次和/或同时进行。在步骤vi)中将所述至少一个腔引入真皮基质中优选地在步骤iv)中的聚合期间或之后进行。步骤iv)和vi)特别优选地同时进行，以使得在聚合期间将所述至少一个腔优选地引入到真皮基质中。步骤iv)和vi)特别优选地同时进行，其中聚合优选地在搅拌下进行，特别优选地在转动、旋转或摇动搅拌下进行。
一旦在步骤a)中已经产生了真皮基质，则在根据本发明的方法的步骤b)中将至少一个毛囊和/或毛囊胚芽引入真皮基质的所述至少一个腔中以产生皮肤替代物。在步骤b)中引入毛囊和/或毛囊胚芽之前，优选地用细胞外基质蛋白质包被真皮基质中的一个、多个或所有的腔。
术语“毛囊”指的是围绕毛根并因此将毛发锚定在皮肤中的天然结构。在横截面中，毛囊包括两层，即外部上皮毛根鞘和内部上皮毛根鞘。外部上皮毛根鞘是在形成毛根包膜的皮肤基底层上的漏斗状内陷。内部上皮毛根鞘包括毛根并且由三层组成，即内层(角质层)、中间层(赫胥黎层)和外层(亨勒层)。产生和分泌皮脂和其他物质(例如气味)的腺体通向毛囊。在皮脂腺附近，能够使毛发在端部直立并负责“鸡皮疙瘩”的毛发竖立肌或立毛肌同样位于毛囊上。用于触觉和控制毛发竖立肌的细神经纤维也终止于毛囊中。根据本发明，术语“毛囊”同样包括与天然微囊相比不完全的微囊结构，所述结构可以包括外部和/或内部上皮毛根鞘，但不包含另外的细胞类型如肌肉或神经细胞、血管等，以使得毛囊的尺寸与天然毛囊相比较小。毛囊具有三维形状，可选地为空间限定的形状，其类似于生理毛囊的三维外观。毛囊可以具有极性结构，例如在毛囊的一侧上的尖突起，这使人想起早期毛发形态形成中的结构。
因此，所使用的毛囊可以是从组织分离的毛囊。从组织中移除毛囊的方法是本领域技术人员已知的。优选地根据良好的医疗实践从组织中移除毛囊。优选地以使得毛囊保持基本上完整(即，未受损)的方式从组织中移除毛囊。例如，可以如下从组织中移除毛囊：i)优选地使用解剖刀将组织中的表皮与下层真皮或脂肪组织分离；ii)从组织的真皮或脂肪组织中解剖出毛发。所移除的毛发在其近端包含毛囊。在步骤ii)之前，可选地，可以压缩真皮或脂肪组织以有助于随后解剖出存在于其中的毛囊。在此可以例如借助于一对镊子进行压缩。优选地在显微镜下移除毛囊。
从其中获得毛囊的组织来源于哺乳动物。该哺乳动物可以是人类、猴、猪、狗、猫或啮齿动物，优选为人类。因此，哺乳动物是含有毛囊的组织的供体。
所述组织优选地包含皮肤。在此，可以从身体的任何毛发区域获得组织，优选地从头部、眉毛、胡须、生殖器部位、腿部或身体的其他区域获得。优选地通过活组织检查来获得组织。
在从组织中移除毛囊之前，可以使所述组织经历一个或多个清洁步骤，以便从组织移除可能存在的任何干扰物质。
优选地将同种异体毛囊用于皮肤等同物，即，从其中分离毛囊的组织的供体与包含分离的毛囊的皮肤等同物的受体属于相同物种，因此，例如供体和受体两者都是人。特别优选的是将自体毛囊用于皮肤等同物，即，从其中分离毛囊的组织的供体与包含分离的毛囊的皮肤等同物的受体是同一个人，例如相同的人类。
毛囊形成同样可能在真皮基质的腔中进行。为此，在根据本发明的方法的步骤b)中，将至少一个毛囊胚芽引入真皮基质的所述至少一个腔中。
术语“毛囊胚芽”表示毛囊的早期阶段，所述毛囊从其发育而来。毛囊胚芽优选为毛囊分离后的毛囊的生理真皮乳头(DP)的至少一半大小。毛囊胚芽同样优选地具有毛囊分离后的毛囊的生理DP的大致形状。毛囊胚芽由约2个至约20000个细胞、优选10个至15000个、特别地优选为1000个至10000个、非常特别地优选为1500个至5000个细胞组成。
毛囊胚芽包含真皮乳头成纤维细胞(DPF)。毛囊胚芽还可以含有结缔组织鞘成纤维细胞(CTSF)。毛囊胚芽可选地包含选自内皮细胞、间质血管碎片(SVF)的细胞、角化细胞(KC)、黑素细胞(MC)或成纤维细胞例如CTSF的至少一种另外的细胞群。
毛囊胚芽的DPF从至少一个DP中分离，其中DP来源于至少一个毛囊。
获得DP或DPF的方法是本领域技术人员已知的，并且例如在文献EP 2 274 419 B1和DE 101 62 814 B4中进行了描述。可以由毛囊提供DP，并且从DP分离DPF，例如如下地分离：例如用一对镊子将分离的毛囊固定在毛干上，并且例如用另一对镊子将结缔组织鞘与毛干径向分离，从而翻转毛球，因此使具有毛发基质的DPF和毛干暴露。以这种方式，可以使DP与毛囊的剩余部分分离，这可以例如借助于针或插管来实现。
然后将分离的DP例如转移到细胞培养容器中并机械固定在细胞培养容器的表面上。优选地以如下方式获得DPF：例如通过针尖或解剖刀将分离的DP机械地保持在细胞培养容器的底部。这里，在很大程度上保留DP的形态，但是DP的基底层略微穿孔，使得DPF可以迁移出DP。也可以借助于酶分离从DP获得DPF。
在分离之后并且在使用于根据本发明的方法之前，可以对DPF进行扩大培养，例如使其数量倍增。在根据本发明的方法中使用的DPF因此可以是最初分离的DPF的后代或克隆。
从其中分离DP和DPF的毛囊来源于组织。从组织中移除毛囊的方法是本领域技术人员已知的。优选地根据良好的医疗实践从组织中移除毛囊。优选地以使得毛囊保持基本上完整(即，未受损)的方式从组织中移除毛囊。例如，可以如下所述地从组织中移除毛囊：i)优选地使用解剖刀将组织中的表皮与下层真皮或脂肪组织分离；ii)从组织的真皮或脂肪组织中解剖出毛发。所移除的毛发在其近端包含毛囊。在步骤ii)之前，可选地，可以压缩真皮或脂肪组织以有助于随后解剖出存在于其中的毛囊。在此可以例如借助于一对镊子进行压缩。优选地在显微镜下移除毛囊。
可以从其中获得毛囊(例如用于分离DP或DPF)的组织来源于哺乳动物。该哺乳动物可以是人类、猴、猪、狗、猫或啮齿动物，优选为人类。因此，哺乳动物是含有毛囊的组织的供体。哺乳动物特别优选为患有脱发的人类患者。
所述组织优选地包含皮肤。在此，可以从身体的任何毛发区域获得组织，优选地从头部、眉毛、胡须、生殖器部位、腿部或身体的其他区域获得。优选地通过活组织检查来获得组织。
在从组织中移除毛囊(例如用于分离DP或DPF)之前，可以使所述组织经历一个或多个清洁步骤，以便从组织移除可能存在的任何干扰物质。
除了DPF之外，毛囊胚芽还可以含有结缔组织鞘成纤维细胞(CTSF)。毛囊胚芽的CTSF来源于至少一个毛囊。
可以例如如下地从毛囊分离CTSF：例如用一对镊子将分离的毛囊固定在毛干上，并且例如用另一对镊子将结缔组织鞘与毛干径向分离，从而翻转毛球。以这种方式，可以使具有CTSF的毛球的近端部分与毛囊的剩余部分分离，这可以例如借助于针或插管来实现。
在分离之后并且在使用于根据本发明的方法之前，可以对CTSF进行扩大培养，例如使其数量倍增。在根据本发明的方法中使用的CTSF因此可以是最初分离的DPF的后代或克隆。
从其中分离CTSF的毛囊来源于组织。从组织中移除毛囊的方法是本领域技术人员已知的。优选地根据良好的医疗实践从组织中移除毛囊。优选地以使得毛囊保持基本上完整(即，未受损)的方式从组织中移除毛囊。例如，可以如下地从组织中移除毛囊：i)优选地使用解剖刀将组织中的表皮与下层真皮或脂肪组织分离；ii)从组织的真皮或脂肪组织中解剖出毛发。所移除的毛发在其近端包含毛囊。在步骤ii)之前，可选地，可以压缩真皮或脂肪组织以有助于随后解剖出存在于其中的毛囊。在此可以例如借助于一对镊子进行压缩。优选地在显微镜下移除毛囊。
可以从其中获得毛囊(例如用于分离CTSF)的组织来源于哺乳动物。该哺乳动物可以是人类、猴、猪、狗、猫或啮齿动物，优选为人类。因此，哺乳动物是含有毛囊的组织的供体。哺乳动物特别优选为患有脱发的人类患者。
所述组织优选地包含皮肤。在此，可以从身体的任何毛发区域获得组织，优选地从头部、眉毛、胡须、生殖器部位、腿部或身体的其他区域获得。优选地通过活组织检查来获得组织。
在从组织中移除毛囊(例如用于分离CTSF)之前，可以使所述组织经历一个或多个清洁步骤，以便从组织中移除可能存在的任何干扰物质。
由此，从分离的毛囊获得DPF和CTSF。在此从相同的毛囊获得DPF和CTSF。然而，也可以从不同的毛囊获得DPF和CTSF。如果DPF和CTSF是从不同的毛囊获得的，那么这些毛囊可能是从相同的组织中分离出来的，例如，从例如从供体头部的颈背区域获取的组织中分离出来的。如果DPF和CTSF是从不同的毛囊获得的，那么这些毛囊也可能是从不同的组织中分离出来的，使得例如其中一个组织例如从供体头部的颈部区域获取，而另一个组织例如从供体胡须中获取。在后一种情况下，供体可能是相同或不同的供体。如果是不同的供体，则所述供体优选为同种异体的供体。供体优选为相同的，即自体供体。
除了DPF和可选的CTSF之外，毛囊胚芽还可以含有选自内皮细胞、间质血管碎片(SVF)的细胞、角化细胞(KC)、黑素细胞(MC)或成纤维细胞的至少一种另外的细胞群。任选地存在于毛囊胚芽中的内皮细胞(EC)可以借助现有技术中已知的用于获得EC的方法来分离。
EC可以从淋巴或血管中获得，优选地从位于毛囊附近的淋巴或血管中获得。EC优选地从人类供体中获得。EC特别优选为自体的。在分离之后并且在使用于根据本发明的方法之前，可以对EC进行扩大培养，例如使其数量倍增。在根据本发明的方法中使用的EC因此可以是最初分离的EC的后代或克隆。
毛囊胚芽可以包含间质血管碎片(SVF)的细胞。SVF包含多种细胞群，例如脂细胞(前脂肪细胞)、内皮细胞、内皮肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞或血细胞的前体。SVF可以例如通过切除脂肪组织或通过抽脂获得。用于获得SVF的方法是本领域技术人员已知的。例如在文献WO 2014036 094 A1中描述了从脂肪组织中分离SVF。SVF优选地从人类供体获得，SVF特别优选地是自体的。在从供体获得SVF之后，可以从SVF中移除SVF的特异性组分，所述移除可以通过一个或多个洗涤、清洁或分离步骤进行，或者也可以通过靶向分离或移除组分进行。在分离之后并且在使用于根据本发明的方法之前，同样可以对SVF进行扩大培养，例如使其数量倍增。在根据本发明的方法中使用的SVF因此可以是最初分离的SVF的后代或克隆。由于SVF的存在，实现了DPF和CTSF的提高的或更快的细胞增殖，并且因此加速了毛囊胚芽的形成。
毛囊胚芽还可以包含角化细胞(KC)、黑素细胞(MC)和/或CTSF。KC、MC和/或CTSF不需要来源于毛囊，而是可以从其他哺乳动物组织例如皮肤中获得。用于获得KC、MC和CTSF的方法是本领域技术人员已知的并且描述在例如文献DE 101 62 814 B4和Toma等人的Stemcells 23,727–37(2005),Barrandon和Green的Proc.Natl.Acad.Sci.82,5390–4(1985),Tobin等人的J.Invest.Dermatology 104(1),86–88(1995)和Magerl等人的MethodExp.Dermat.11,381–385(2002)中。所述至少一个另外的细胞群可以优选地从毛囊获得和/或是从毛囊获得的。
可以从相同的毛囊获得KC、MC和/或CTSF。然而，也可以从不同的毛囊获得KC、MC和/或CTSF。如果KC、MC和/或CTSF是从不同的毛囊获得的，那么这些毛囊可能是从相同的组织中分离出来的，例如，从例如从供体头部的颈背区域获取的组织中分离出来的。如果KC、MC和/或CTSF是从不同的毛囊获得的，那么这些毛囊也可能是从不同的组织中分离出来的，使得例如其中一个组织例如从供体头部的颈部区域获取，而另一个组织例如从供体胡须中获取。在后一种情况下，供体可以是相同或不同的供体。如果是不同的供体，则所述供体优选为同种异体的供体。供体优选为相同的，即自体供体。
所述至少一种另外的细胞群特别优选地从分离出DP的相同的毛囊中获得。在分离之后并且在使用于根据本发明的用于生产毛囊的方法之前，可以对KC、MC和/或CTSF进行扩大培养，例如使其数量倍增。在根据本发明的方法中使用的KC、MC和/或CTSF因此可以是最初分离的KC、MC和/或CTSF的后代或克隆。
毛囊胚芽优选地包含DPF和CTSF。毛囊胚芽特别优选地包含DPF、CTSF和SVF。毛囊胚芽非常特别优选地包含DPF、CTSF、SVF、KC和MC。
毛囊胚芽可以包含含有一种或多种不同的细胞外基质蛋白例如胶原蛋白IV、纤连蛋白和/或层粘连蛋白的包被。该包被可以由DPF或CTSF自身在其形成毛囊胚芽时产生。可替代地或另外地，毛囊胚芽一旦形成，就可以用一种或多种不同的细胞外基质蛋白进行包被。
如果在根据本发明的方法的步骤b)中将毛囊胚芽引入真皮基质中，则所述步骤b)可以例如如下地进行：优选地首先用细胞外基质蛋白包被真皮基质的腔，然后用DPF和/或CTSF定殖。优选地，首先将CTSF引入腔中，然后引入DPF。然后，可选地，可以将EC和/或SVF引入腔中。在随后的步骤中添加MC和/或KC，优选添加MC和KC两者。
将至少一种毛囊和/或毛囊胚芽引入真皮基质中产生了皮肤替代物。根据本发明，“皮肤替代物”意指不完全足够的皮肤代替物。认为皮肤替代物是据此生产皮肤等同物的中间体。
在步骤b)之后，在进行步骤c)之前，优选地将皮肤替代物孵育至少10分钟。孵育优选地进行20分钟至48小时，特别优选地进行30分钟至24小时，特别优选地进行1小时至12小时。
根据本发明的方法的以下步骤c)涉及将选自成纤维细胞、内皮细胞、脂细胞、神经细胞、腺细胞、黑素细胞或角化细胞的至少一种另外的细胞群添加到皮肤替代物中以产生皮肤等同物。用于获得脂细胞、神经细胞或腺细胞的方法是本领域技术人员已知的。
在根据本发明的方法的步骤c)之后，将皮肤等同物孵育至少10分钟，然后将皮肤等同物投入进一步使用，例如，作为移植物或用于对物质进行测试。孵育优选地进行至少20分钟，特别优选地进行1小时至21天，特别优选地进行5天至15天，非常特别优选地进行8天至12天。
本发明还涉及通过根据本发明的方法生产的皮肤等同物。
本发明还包括移植物，所述移植物包含有效量的皮肤等同物以及可选的可药用佐剂。
用于生产皮肤等同物的方法的一个实施方式包括以下步骤：a)生产含有第一层和第二层的真皮基质，其包括以下步骤：i)提供第一层；ii)提供包含液体和选自胶原蛋白、弹性蛋白和/或透明质酸的至少一种聚合物的可聚合溶液；iii)将可聚合溶液添加到第一层中；iv)使溶液聚合以形成第二层；v)压缩第二层，其中由于压缩，第二层的液体含量降低，并且使第一层与第二层结合在一起以形成真皮基质；以及vi)将至少一个腔引入真皮基质中；b)将至少一个毛囊和/或毛囊胚芽引入步骤a)中产生的真皮基质的至少一个腔中以产生皮肤替代物；以及c)将选自成纤维细胞、内皮细胞、脂细胞、神经细胞、腺细胞、黑素细胞或角化细胞的至少一种另外的细胞群添加到皮肤替代物中以产生皮肤等同物。
第一层优选为人造皮肤物质；人造皮肤物质特别优选地包含胶原蛋白和/或弹性蛋白，特别优选地包含胶原蛋白和弹性蛋白两者。
可聚合溶液包含作为聚合物的胶原蛋白，优选为I型胶原蛋白。可聚合溶液特别优选地还包含结缔组织细胞，优选为成纤维细胞。
在步骤iv)之前，优选地通过搅拌使可聚合溶液中的聚合物图案化。
在步骤iv)中使溶液聚合以形成第二层和在步骤vi)中将至少一个腔引入到真皮基质中优选地同时进行。步骤iv)和步骤vi)特别优选地同时地并在搅拌下进行，特别优选地在转动搅拌下进行。
步骤v)中第二层的压缩优选地通过离心进行。
在步骤b)中，优选地将至少一个毛囊胚芽引入真皮基质的所述至少一个腔中，其中所述腔特别优选地用细胞外基质蛋白进行包被，然后首先将CTSF和DPF引入腔中。优选地另外将EC和/或SVF引入到腔中。然后将MC和/或KC、优选将MC和KC两者添加到腔中。
在步骤c)中，将EC、脂细胞、MC和/或KC，优选将EC、脂细胞、MC和KC添加到步骤b)中所产生的皮肤替代物中。特别优选地另外将神经细胞和腺细胞添加到皮肤替代物中。
本发明还涉及通过根据本发明的方法生产的皮肤等同物和/或包含所述皮肤等同物的移植物用于治疗性皮肤再生或用于治疗皮肤量减少的用途。在此优选地使用同种异体细胞来生产皮肤等同物，这意味着所使用的细胞的供体和所生产的皮肤等同物的受体属于相同物种，即，供体和受体都是例如人类。特别优选的是，涉及皮肤量减少的病症的治疗性处理使用自体细胞来生产皮肤等同物，这意味着所使用的细胞的供体和所生产的皮肤等同物的受体是同一的，即，例如是相同的人类。
此外，本发明还涉及根据本发明的皮肤等同物用于针对化妆特性、药理学特性或毒性特性对物质进行体外测试的用途。
本发明还涉及根据本发明的皮肤等同物用于体外测试皮肤和/或毛发调节物质的用途。
本发明还包括用于实施根据本发明的方法的试剂盒。为此，试剂盒可以包含根据本发明的皮肤等同物和/或移植物，从而例如实施根据本发明的方法来进行涉及皮肤量减少的病症或物质筛选的治疗性皮肤再生或处理。可选地，试剂盒还可以包括用于使用试剂盒和/或实施根据本发明的方法的说明书。试剂盒还可以包括用于实施根据本发明的方法的另外部件，例如反应容器、过滤器、溶液和/或其他试剂。
本发明还涉及用于体外筛选具有皮肤和/或毛发调节特性的物质的方法，其包括以下步骤：a)提供皮肤等同物的样品；b)将相应的样品分成几个部分；c)将至少一部分与要测试的物质一起孵育；以及d)将所述部分中的皮肤和/或毛发特性的参数与未与所述物质一起孵育的另一部分进行比较。
本发明还包括用于体外调查由疾病引起的脱发原因的测试系统，所述测试系统包括通过根据本发明的方法生产的皮肤等同物。
下面参照示例性实施方式和相关附图更详细地解释本发明。
附图说明
图1是真皮基质的照片图像。
图2是皮肤等同物、毛囊和毛囊胚芽的照片图像。
图3是用于将腔引入真皮基质的压印模具的照片图像。
图4是用于将腔引入真皮基质中的压印模具的示意图。图4A是截面图，图4B是平面图。
图5是用于将腔引入真皮基质中的压印模具的示意图。图5A是压印模具顶部的平面图，图5B是压印模具底部的平面图，图5C和图5D是侧视图。
具体实施方式
从毛囊分离多种细胞类型
根据标准方案的修改形式(例如在Magerl等人的上述文献中描述的)从人类毛囊中分离DPF、CTSF、MC和KC。将来自穿孔活组织检查的分离的毛囊或来自FUT毛发移植的解剖的毛囊用一对镊子固定在毛干上，将结缔组织鞘切开并用另一对镊子小心地与其径向分离，从而翻转毛球并使具有毛发基质的真皮乳头和毛干暴露。以这种方式，在针/插管的协助下，具有结缔组织鞘成纤维细胞和真皮乳头的毛球的近端部分可以非常容易地与毛囊的其余部分分离。也将含有同样需要的毛发基质角化细胞和黑素细胞的毛干最佳地解剖以进一步培养。
将以这种方式从所取毛囊中提取的真皮乳头和结缔组织包膜各自收集在包含培养基的单独容器中。通过使用组织解离器和相关的提取试剂盒(例如，gentleMACSDissociator#130-093-235、全皮肤解离试剂盒#130-101-540、Miltenyi Biotec)的温和的组织解离从周围组织中溶解出和分离DPF和CTSF。为此，将分离的组织片段(真皮乳头、结缔组织包膜和具有上皮/神经外胚层细胞的毛干)、435μl缓冲液L以及12.5mg酶P和/或4.50mg酶D和/或2.5mg酶A的酶混合物各自引入gentleMACS C管中并小心混合。
将样品在37℃的水浴中孵育1小时至3小时或整夜，更长的孵育时间增加了细胞产量。在孵育之后，通过添加0.5ml冷细胞培养基来稀释样品。将C管密封并倒置固定在gentleMACS解离器的套管上。然后运行“h_skin_01”程序。一旦程序完成，就进行短的离心步骤以将测试材料收集在底部上。可以用新鲜培养基洗涤细胞，并通过70μm过滤器分离细胞悬液。在进一步的解离操作的帮助下，可以省去上述酶添加过程(尽管这样做一定会预期到更低的细胞产量)，酶的添加在直接自体治疗的情况下是不期望的。
生产来自间质血管碎片(SVF)的细胞
取来自皮下腹部或臀部脂肪的肿胀吸脂术的1升级分并且例如使用建立的PureGraftTM方法(Cytori GmbH，瑞士)进行制备。这涉及离心和浓缩以去除肿胀溶液。然后在37℃下，在稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco)中的0.15％(w/v)的来自溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)的胶原酶NB 6 GMP级(0.12U/mg胶原酶；SERVAElectrophoresis GmbH)中消化60分钟。在180g(g为重力加速度)下离心10分钟后，丢弃富脂层并用PBS将细胞沉淀洗涤一次。然后通过在裂解缓冲液(0.15M氯化铵，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))中孵育2分钟来溶解红细胞。将所获得的间质血管碎片(SVF)悬浮于完全培养基(CM，Gibco)中。
生产皮肤等同物
基于2mm厚的胶原蛋白/弹性蛋白基质(
Figure BDA0001721646660000191
博士苏韦拉克护肤保健公司(Dr.Suwelack Skin&Health Care AG))建立真皮等同物。用圆形冲头冲出一块并转移到
Figure BDA0001721646660000192
中。将其用含有真皮成纤维细胞的胶原蛋白I溶液在冰上进行包被。轻轻转动带有圆筒的硅柱塞。然后将凝胶聚合15分钟，之后将其转移到离心机中。在离心之后，移除水，将所形成的腔依次用ECM包被并用毛囊细胞定殖。

Claims (60)

1.一种用于生产皮肤等同物的方法，包括以下步骤：
a）生产含有第一层和第二层的真皮基质，其包括以下步骤：
i）提供所述第一层；
ii）提供包含液体和选自胶原蛋白、弹性蛋白和/或透明质酸的至少一种聚合物的可聚合溶液，其中所述可聚合溶液还包含活细胞；
iii）将所述可聚合溶液添加到所述第一层中；
iv）使所述溶液聚合以形成所述第二层；
v）压缩所述第二层，其中由于所述压缩，所述第二层的液体含量降低，并且使所述第一层与所述第二层结合在一起以形成所述真皮基质；以及
vi）将至少一个腔引入所述真皮基质中；
b）将至少一个毛囊和/或毛囊胚芽引入步骤a）中产生的所述真皮基质的所述至少一个腔中以产生皮肤替代物；以及
c）将选自成纤维细胞、内皮细胞、脂细胞、神经细胞、腺细胞、黑素细胞或角化细胞的至少一种另外的细胞群添加到所述皮肤替代物中以产生所述皮肤等同物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一层包含天然皮肤物质或人造皮肤物质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一层不含活细胞。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述可聚合溶液的活细胞包括间充质干细胞和结缔组织细胞中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述可聚合溶液的活细胞包括间充质干细胞和结缔组织细胞中的至少一种。
6.根据权利要求1、2和5中任一项所述的方法，其中，在步骤iv）之前，通过搅拌使所述可聚合溶液中的聚合物图案化。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤iv）之前，通过搅拌使所述可聚合溶液中的聚合物图案化。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤iv）之前，通过搅拌使所述可聚合溶液中的聚合物图案化。
9.根据权利要求1、2、5和7-8中任一项所述的方法，其中，通过离心、沉降或力的机械施加来进行所述第二层的压缩。
10.根据权利要求3所述的方法，其中，通过离心、沉降或力的机械施加来进行所述第二层的压缩。
11.根据权利要求4所述的方法，其中，通过离心、沉降或力的机械施加来进行所述第二层的压缩。
12.根据权利要求6所述的方法，其中，通过离心、沉降或力的机械施加来进行所述第二层的压缩。
13.根据权利要求1、2、5、7-8和10-12中任一项所述的方法，其中，方法步骤iv）、v）或vi）依次或同时进行。
14.根据权利要求3所述的方法，其中，方法步骤iv）、v）或vi）依次或同时进行。
15.根据权利要求4所述的方法，其中，方法步骤iv）、v）或vi）依次或同时进行。
16.根据权利要求6所述的方法，其中，方法步骤iv）、v）或vi）依次或同时进行。
17.根据权利要求9所述的方法，其中，方法步骤iv）、v）或vi）依次或同时进行。
18.根据权利要求1、2、5、7-8、10-12和14-17中任一项所述的方法，其中，在步骤vi）中将所述至少一个腔引入所述真皮基质中在步骤iv）中的聚合期间或聚合之后进行。
19.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤vi）中将所述至少一个腔引入所述真皮基质中在步骤iv）中的聚合期间或聚合之后进行。
20.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤vi）中将所述至少一个腔引入所述真皮基质中在步骤iv）中的聚合期间或聚合之后进行。
21.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤vi）中将所述至少一个腔引入所述真皮基质中在步骤iv）中的聚合期间或聚合之后进行。
22.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤vi）中将所述至少一个腔引入所述真皮基质中在步骤iv）中的聚合期间或聚合之后进行。
23.根据权利要求13所述的方法，其中，在步骤vi）中将所述至少一个腔引入所述真皮基质中在步骤iv）中的聚合期间或聚合之后进行。
24.根据权利要求1、2、5、7-8、10-12、14-17和19-23中任一项所述的方法，其中，通过穿刺、切除或通过压印模具将所述至少一个腔引入所述真皮基质中。
25.根据权利要求3所述的方法，其中，通过穿刺、切除或通过压印模具将所述至少一个腔引入所述真皮基质中。
26.根据权利要求4所述的方法，其中，通过穿刺、切除或通过压印模具将所述至少一个腔引入所述真皮基质中。
27.根据权利要求6所述的方法，其中，通过穿刺、切除或通过压印模具将所述至少一个腔引入所述真皮基质中。
28.根据权利要求9所述的方法，其中，通过穿刺、切除或通过压印模具将所述至少一个腔引入所述真皮基质中。
29.根据权利要求13所述的方法，其中，通过穿刺、切除或通过压印模具将所述至少一个腔引入所述真皮基质中。
30.根据权利要求18所述的方法，其中，通过穿刺、切除或通过压印模具将所述至少一个腔引入所述真皮基质中。
31.根据权利要求1、2、5、7-8、10-12、14-17、19-23和25-30中任一项所述的方法，其中，所述腔的平均直径为大于或等于0.001mm至5mm。
32.根据权利要求3所述的方法，其中，所述腔的平均直径为大于或等于0.001mm至5mm。
33.根据权利要求4所述的方法，其中，所述腔的平均直径为大于或等于0.001mm至5mm。
34.根据权利要求6所述的方法，其中，所述腔的平均直径为大于或等于0.001mm至5mm。
35.根据权利要求9所述的方法，其中，所述腔的平均直径为大于或等于0.001mm至5mm。
36.根据权利要求13所述的方法，其中，所述腔的平均直径为大于或等于0.001mm至5mm。
37.根据权利要求18所述的方法，其中，所述腔的平均直径为大于或等于0.001mm至5mm。
38.根据权利要求24所述的方法，其中，所述腔的平均直径为大于或等于0.001mm至5mm。
39.根据权利要求1、2、5、7-8、10-12、14-17、19-23、25-30和32-38中任一项所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
40.根据权利要求3所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
41.根据权利要求4所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
42.根据权利要求6所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
43.根据权利要求9所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
44.根据权利要求13所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
45.根据权利要求18所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
46.根据权利要求24所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
47.根据权利要求31所述的方法，其中，所述腔的深度为大于或等于0.05mm至10mm。
48.根据权利要求1、2、5、7-8、10-12、14-17、19-23、25-30、32-38和40-47中任一项所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
49.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
50.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
51.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
52.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
53.根据权利要求13所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
54.根据权利要求18所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
55.根据权利要求24所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
56.根据权利要求31所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
57.根据权利要求39所述的方法，其中，在步骤b）中引入所述毛囊和/或毛囊胚芽之前，用细胞外基质蛋白包被所述真皮基质中的一个腔或多个腔或所有的腔。
58.一种使用根据权利要求1至57中任一项所述的方法生产的皮肤等同物。
59.一种移植物，包含有效量的根据权利要求58所述的皮肤等同物以及可选的可药用佐剂。
60.一种用于体外筛选具有皮肤和/或毛发调节特性的物质的方法，包括以下步骤：
a）提供根据权利要求58所述的皮肤等同物的样品；
b）将所述样品分成几个部分；
c）将至少一部分与要测试的物质一起孵育；以及
d）将所述部分中的所述皮肤和/或毛发特性的参数与未与所述物质一起孵育的另一部分进行比较。
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