KR20220093401A - 조직 생성 방법 - Google Patents

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모히트 비 바티아
로버트 제이 하리리
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Abstract

본 발명은 표면 위에 세포 및 세포외 기질을 침착시키는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체외에서 조직 및 기관을 생성하는 방법, 및 상기 조직 및 기관의 사용 방법에 관한 것이다. 한 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용되는 세포 및 ECM은 동일 조성물의 일부로서 침착된다. 또 다른 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용되는 세포 및 ECM은 상이한 조성물의 일부로서 침착된다.

Description

조직 생성 방법{METHODS OF TISSUE GENERATION}
본 발명은 표면 위에 세포 및/또는 세포외 기질을 침착시키는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체외에서 조직 및 기관을 생성하는 방법, 및 상기 조직 및 기관을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2012년 9월 4일자로 출원된 미국 가출원 제 61/696,479 호(이의 전체 내용은 본원에 참고로서 인용됨)를 우선권 주장한다.
바이오프린팅(bioprinting)(예를 들면, 기관 프린팅)은 생물학적 물질을 침착시키는 프린팅 장치, 예를 들면, 변형된 잉크-젯 프린터를 수반하는 연구 및 공학 분야이다. 상기 기술은 세포를 포함하는 액체 소적의 신속한 생성 및 방출에 이어 표면 위에 이의 정확한 침착을 수반한다. 바이오프린팅에 의해 기본 세포 물질을 사용하여 조작된 조직 및 기관은 오늘날 표준 이식 접근방법에서 사용되는 공여체-유래 조직 및 기관에 대한 유망한 대안을 나타낸다.
한 양태에서, 본원에는 조직을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및/또는 세포외 기질(ECM)을 침착시키는 것을 포함하는, 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 또는 기관을 생성하는 방법이 제공된다. 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용될 수 있는 세포는 하기 단락 1.1에 기술되어 있다. 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 조작될 수 있는 조직 및 기관은 하기 단락 1.2에 기술되어 있다. 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용될 수 있는 ECM은 하기 단락 1.3에 기술되어 있다. 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 하기 단락 1.4에 기술되어 있다.
한 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용되는 세포 및 ECM은 동일 조성물의 일부로서 침착된다. 또 다른 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용되는 세포 및 ECM은 상이한 조성물의 일부로서 침착된다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용되는 ECM은 유동성 ECM을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용되는 세포 및 ECM은 상이한 조성물의 일부로서 침착되며, 예를 들면, 이때 ECM은 세포의 침착과 별도로, 예를 들면, 세포 침착 전에 침착되고/되거나, ECM은 세포의 침착 전에 탈수된다. ECM이 탈수되는 태양에서, 상기 ECM은 나중에 원하는 시간에, 예를 들면, ECM 및 세포가 침착된 표면 위에 세포가 침착될 때에 재수화될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 생체내에서 3-차원 조직을 형성하는 방법에 사용되는 세포 및 ECM은, 하나 이상의 추가 성분들, 예를 들면, 성장 인자(들), 가교결합제(들), 중합성 단량체(들), 중합체, 하이드로겔(들) 등의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 표면 위에 침착된다. 특정 태양에서, 그 위에 상기 세포 및 ECM이 침착되는 표면은 본원에 기술된 방법에 따라 바이오프린팅된 표면이다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용되는 세포 및 유동성 ECM(및 추가 성분들)은 상기 표면 위에 프린팅되고, 예를 들면, 세포 및 ECM은 바이오프린팅된다. 특정 태양에서, 그 위에 상기 세포 및 ECM이 침착되는 표면은 본원에 기술된 방법에 따라 바이오프린팅된 표면이다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용되는 세포 및/또는 유동성 ECM(및 추가 성분들)은 상기 표면 위에 프린팅되지 않고, 예를 들면, 상기 세포 및 ECM은 바이오프린팅되지 않고, 바이오프린팅을 포함하지 않는 방법에 의해 상기 표면에 적용된다. 특정 태양에서, 표면 위에 바이오프린팅되지 않는 세포 및/또는 유동성 ECM(및 추가 성분들)은 바이오프린팅된 표면에 적용되고, 예를 들면, 상기 세포 및/또는 유동성 ECM(및 추가 성분들)은 스캐폴드, 예를 들면, 합성 스캐폴드, 예를 들어, 합성 기질에 적용된다. 특정 태양에서, 세포 및/또는 유동성 ECM(및 추가 성분들)은 스캐폴드(예를 들면, 표면)의 일부분에만, 예를 들면, 한쪽 측면에만 적용된다. 또 다른 특정 태양에서, 세포 및/또는 유동성 ECM(및 추가 성분들)은 스캐폴드의 모든 측면에 적용되고, 즉, 전체 스캐폴드에 세포 및/또는 유동성 ECM이 적용된다. 또 다른 특정 태양에서, 스캐폴드는 폴리카프로락톤(PCL)이다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 인공 표면, 즉, 인공적으로 제조된 표면을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 대상(예를 들면, 인간 대상)으로부터 떼어낸 조직 또는 기관(또는 이의 일부분)을 포함한다. 특정 태양에서, 대상으로부터 떼어낸 상기 조직 또는 기관의 표면은 세포제거될 수 있고, 예를 들면, 조직 또는 기관 표면의 전부 또는 일부로부터 세포를 제거하도록 처리될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 2-차원이다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 3-차원이다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 바이오프린팅, 예를 들면, 본원에 기술된 방법에 따라서 바이오프린팅된 표면이다. 특정 태양에서, 상기 표면은 폴리카프로락톤(PCL)이다.
또 다른 양태에서, 본원에는, 본원에 기술된 방법을 이용하여 생성된 조직 및 기관, 및 상기 조직 및 기관을 사용하는 방법이 제공된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 조작된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관은 피부 이식 및 수술적 이식 절차를 포함하여 이식 절차에 사용된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 조작된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관은, 예를 들면, 상기 조직 또는 기관에 대한 약물 또는 화합물의 영향을 평가하기 위한 실험 절차에 사용된다.
또 다른 양태에서, 본원에는, 본원에 기술된 방법에 사용하기에 적합한, 세포 및 ECM(예를 들면, 유동성 ECM)을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본원에는, 하나 이상의 용기에, 상기 조성물, 및 본원에 기술된 방법중 하나 이상에 따라 상기 조성물을 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트가 제공된다.
도 1은 다양한 각도에서 및 다양한 기공 크기의 스캐폴드들이 생성되는 방식으로 바이오프린팅된 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는 스캐폴드를 나타낸 것이다.
도 2는 그 위에 세포외 기질(ECM)이 스캐폴드의 양쪽 측면에 적용되고 이어서 탈수된 바이오프린팅된 스캐폴드의 여러 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 세포 증식 분석 결과를 나타낸 것이다. 바이오프린팅된 PCL 및 탈수된 ECM을 포함하는 하이브리드 스캐폴드 상에서 배양된 태반 줄기 세포는 8-일의 배양 기간동안 증식된다.
도 4는 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 것이다. 바이오프린팅된 PCL 및 탈수된 ECM을 포함하는 하이브리드 스캐폴드 상에서 배양된 태반 줄기 세포는 8-일의 배양 기간동안 증식되고 생존가능하게 유지되었다.
도 5는 각각이 층(PCL 층 및 ECM/세포 층)으로 바이오프린팅된 PCL, ECM 및 태반 줄기 세포를 포함하는 온전한 3-차원 하이브리드 스캐폴드를 나타낸 것이다.
도 6은 태반 줄기 세포가 7-일의 배양 기간동안 3-차원 바이오프린팅된 스캐폴드 전체에 분포함을 보여준다.
도 7은 세포 생존율 분석 결과를 나타낸 것이다. 3-차원 하이브리드 스캐폴드를 형성하기 위해 ECM 및 PCL로 바이오프린팅된 태반 줄기 세포는 7-일의 배양 기간동안 증식하고 생존가능하게 유지된다.
도 8은 3-차원 하이브리드 스캐폴드를 형성하기 위해 ECM 및 PCL로 바이오프린팅된 태반 줄기 세포가 7-일의 배양 기간동안 하이브리드 스캐폴드에서 ECM 전체에 확산됨을 보여준다.
도 9는 세포 증식 분석 결과를 나타낸 것이다. PCL, ECM 및 태반 줄기 세포를 바이오프린팅하여 제조된 3-차원 하이브리드 스캐폴드에서 배양된 태반 줄기 세포는 7-일의 배양 기간동안 증식된다.
도 10은 PCL, 태반 ECM 및 인슐린-생성 세포(β-TC-6 세포)를 포함하는 바이오프린팅된 스캐폴드를 나타낸 것이다.
도 11은 세포 증식 분석 결과를 나타낸 것이다. PCL, 태반 ECM 및 인슐린-생성 세포를 포함하는 바이오프린팅된 스캐폴드중 인슐린-생성 세포(β-TC-6 세포)의 수는 14-일의 배양 기간동안 변함없이 유지되었다.
도 12는 PCL, 태반 ECM 및 인슐린-생성 세포(β-TC-6 세포)를 포함하는 바이오프린팅된 스캐폴드로부터의 인슐린 생성 수준을 나타낸 것이다.
도 13은 당 부하(A)에 노출후 또는 대조군 조건(B, C) 하에서 PCL, 태반 ECM 및 인슐린-생성 세포(β-TC-6 세포)를 포함하는 바이오프린팅된 스캐폴드로부터의 인슐린 생성 수준을 나타낸 것이다.
한 양태에서, 본원에는 조직을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및/또는 세포외 기질(ECM)을 침착시키는 것을 포함하는, 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 또는 기관을 생성하는 방법이 제공된다. 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용될 수 있는 세포는 하기 단락 1.1에 기술되어 있다. 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 조작될 수 있는 조직 및 기관은 하기 단락 1.2에 기술되어 있다. 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 사용될 수 있는 ECM은 하기 단락 1.3에 기술되어 있다. 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 하기 단락 1.4에 기술되어 있다.
한 태양에서, 본원에는 조직 또는 기관을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및 ECM을 침착시키는 것을 포함하는, 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 또는 기관을 생성하는 방법이 제공된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에는 조직 또는 기관을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및 ECM을 침착시키는 것을 포함하는, 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 또는 기관을 생성하는 방법이 제공되며, 이때 상기 ECM은 유동성 ECM을 포함하고, 상기 세포 및 상기 유동성 ECM은 동일 조성물의 일부로서 배합된다. 특정 태양에서, 상기 세포 및 상기 ECM은 바이오프린터를 사용하여 침착된다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 단일 유형의 세포를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 하나보다 많은 유형의 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에는 조직 또는 기관을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및 ECM을 침착시키는 것을 포함하는, 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 또는 기관을 생성하는 방법이 제공되며, 이때 상기 ECM은 유동성 ECM을 포함하고, 상기 세포 및 상기 유동성 ECM은 별개 조성물의 일부로서 배합된다. 특정 태양에서, 상기 세포 및 상기 ECM은 바이오프린터를 사용하여 침착된다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 단일 유형의 세포를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 하나보다 많은 유형의 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에는 조직 또는 기관을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및 ECM을 침착시키는 것을 포함하는, 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 또는 기관을 생성하는 방법이 제공되며, 이때 상기 ECM은 유동성 ECM을 포함하고, 상기 세포 및 상기 유동성 ECM은 별개 조성물의 일부로서 배합된다. 특정 태양에서, 상기 세포 및 상기 ECM은 바이오프린터를 사용하여 침착된다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 단일 유형의 세포를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 하나보다 많은 유형의 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에는 조직 또는 기관을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포, ECM 및 하나 이상의 추가 성분을 침착시키는 것을 포함하는, 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 또는 기관을 생성하는 방법이 제공된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에는 조직 또는 기관을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포, ECM 및 하나 이상의 추가 성분을 침착시키는 것을 포함하는, 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 또는 기관을 생성하는 방법이 제공된다. 특정 태양에서, 상기 세포, 상기 ECM 및 상기 하나 이상의 추가 성분은 바이오프린터를 사용하여 침착된다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 단일 유형의 세포를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 하나보다 많은 유형의 세포를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포, 상기 ECM 및 상기 하나 이상의 추가 성분은 동일한 조성물의 일부로서 배합된다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포, 상기 ECM 및 상기 하나 이상의 추가 성분은 별개 조성물의 일부로서 배합된다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 하나 이상의 추가 성분은 성장 인자, 중합성 단량체, 가교결합제, 중합체 또는 하이드로겔이다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라서 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 인공 표면, 즉, 인공적으로 제조된 표면을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라서 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 대상(예를 들면, 인간 대상)으로부터 떼어낸 조직 또는 기관(또는 이의 일부분)을 포함한다. 특정 태양에서, 대상으로부터 떼어낸 상기 조직 또는 기관의 표면은 세포제거될 수 있고, 예를 들면, 조직 또는 기관 표면의 전부 또는 일부로부터 세포를 제거하도록 처리될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라서 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 2-차원이다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라서 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 3-차원이다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 조직(예를 들면, 3-차원 조직) 및 기관을 생성하는 방법에 따라서 그 위에 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 표면은 바이오프린팅, 예를 들면, 본원에 기술된 방법에 따라서 바이오프린팅된 표면이다. 특정 태양에서, 상기 표면은 합성 물질, 예를 들면, 합성 중합체를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 합성 중합체는 PCL이다.
특정 태양에서, 세포 및 ECM(예를 들면, 유동성 ECM)은 동시에 프린팅되지 않고, 층으로 프린팅된다. 특정 태양에서, 세포의 층이 표면 위에 프린팅된 후, ECM의 층이 프린팅된다. 또 다른 특정 태양에서, ECM의 층이 표면 위에 프린팅된 후, 세포의 층이 프린팅된다. 특정 태양에서, ECM의 다중 층이 표면 위에 프린팅된 후, 세포의 다중 층이 프린팅될 수 있고, 그 반대도 가능하다. 유사하게, 세포 및/또는 ECM의 프린팅과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 프린팅되는 추가 성분은 본원에 기술된 방법에 따라 세포와 ECM 중에 적층될 수 있다.
특정 태양에서, 세포 및 ECM(예를 들면, 유동성 ECM)은, 프린팅되는 표면이 세포와 ECM 둘 다에 의해 완전히 덮이도록 프린팅된다. 다른 태양에서, 세포 및 ECM(예를 들면, 유동성 ECM)은, 프린팅되는 표면이 세포와 ECM 둘 다에 의해 부분적으로 덮이도록 프린팅된다.
특정 태양에서, 세포 및 ECM(예를 들면, 유동성 ECM)은 프린팅되는 표면이 특정한 목적하는 영역에서 세포로 덮이고; 특정한 목적하는 영역에서는 ECM으로 덮이도록 프린팅되며, 이때 상기 특정한 영역은 중복되거나 중복되지 않을 수 있다.
특정 태양에서, 세포 및 ECM(예를 들면, 유동성 ECM)은 표면 위에 3차원적으로 프린팅될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "3-차원 프린팅"은, 예를 들면, 바이오프린터의 프린트 헤드가 3-차원 표면의 아래, 위 또는 주위로 이동하도록, 예를 들면, 프린터 헤드가 지정된 경로를 따라 회전하도록 기계적으로 제어되는 프린팅 과정을 말한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 3-차원 프린팅은, 편평한/평면상/2-차원 표면 위에 조직을 구성하는 것을 개시함으로써 프린팅이 수행되는, 당해 분야에 공지되어 있는 표준 바이오프린팅 방법과 뚜렷이 다르다.
한 태양에서, ECM은 시험관내 또는 생체외에서 표면(예를 들면, 인공기관 또는 뼈) 위에 프린팅되고, 세포는 나중에 표준 세포 배양 접근방법을 이용하여 ECM을 포함하는 상기 표면 위에 접종된다. 상기 표면은 이어서 대상내에 이식될 수 있다. 또 다른 태양에서, ECM은 시험관내 또는 생체외에서 표면(예를 들면, 인공기관 또는 뼈) 위에 프린팅되고, ECM을 포함하는 상기 표면은 대상내에 이식되고, 여기서 대상의 세포는 상기 표면에 부착하고/하거나 상기 표면 위에서 성장한다.
특정 태양에서, 본원에는 조직을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및 ECM을 침착시키는 것을 포함하는 조직의 생성 방법이 제공되며, 이때 상기 표면은 내면 및 외면을 갖는 뼈를 포함하고, 제 1 유형의 세포를 포함하는 제 1 세포 조성물이 상기 내면 위에 프린팅되고, 제 2 유형의 세포를 포함하는 제 2 세포 조성물이 상기 외면 위에 프린팅된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 뼈의 "내면"은 기질 및 근육 조직에 대해 위치하는 뼈의 표면을 나타내고, 뼈의 "외면"은 수혜자 신체의 외부에 노출되는 뼈의 표면을 나타낸다. 상기 태양에 따라서, 내면은 부분적으로 또는 완전히, 예를 들면, 기질 세포, 지방 조직, 중간엽 줄기 세포, 근아세포 또는 유사한 것들의 조합에 의해 덮일 수 있고, 외면은 부분적으로 또는 완전히, 예를 들면, 진피 세포에 의해 덮일 수 있다. 특정 태양에서, 상기 방법은 또한 하나 이상의 추가 성분들(예를 들면, 가교결합제)의 침착을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 프린팅은 3-차원적으로 수행된다.
특정 태양에서, 본원에는 간을 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및 ECM을 침착시키는 것을 포함하는, 간을 생성하는 방법이 제공되며, 이때 상기 표면은 간 조직을 포함한다. 특정 태양에서, 간 조직은 생성된 간이 이식될 예정인 대상으로부터 수득된다. 또 다른 특정 태양에서, 간 조직은 생성된 간이 이식될 예정인 대상으로부터 수득되지 않는다(예를 들면, 간 조직은 살아있거나 시신인 공여자로부터 수득된다). 또 다른 특정 태양에서, 침착되는 상기 세포는 간의 세포(예를 들면, 간세포)이다. 특정 태양에서, 상기 방법은 또한 하나 이상의 추가 성분(예를 들면, 가교결합제)의 침착을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 프린팅은 3-차원적으로 수행된다.
특정 태양에서, 본원에는 피부를 제조하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 표면 위에 세포 및 ECM을 침착시키는 것을 포함하는, 피부를 생성하는 방법이 제공되며, 이때 상기 표면은 피부 조직을 포함한다. 특정 태양에서, 피부 조직은 생성된 피부가 이식될 예정인 대상으로부터 수득된다. 또 다른 특정 태양에서, 피부 조직은 생성된 피부가 이식될 예정인 대상으로부터 수득되지 않는다(예를 들면, 피부 조직은 살아있거나 시신인 공여자로부터 수득된다). 또 다른 특정 태양에서, 침착되는 상기 세포는 피부 세포(예를 들면, 표피 세포)이다. 특정 태양에서, 상기 방법은 또한 하나 이상의 추가 성분(예를 들면, 가교결합제)의 침착을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 프린팅은 3-차원적으로 수행된다.
1 바이오프린팅
본원에서 사용된 바와 같이, "바이오프린팅"은 일반적으로 표준 또는 변형된 프린팅 기술, 예를 들어, 잉크젯 프린팅 기술을 이용하여 표면 위에 살아있는 세포들뿐 아니라 다른 성분들(예를 들면, 유동성 ECM; 합성 기질)을 침착시키는 것을 말한다. 하이드로겔과 함께 세포를 포함하여, 세포를 표면 위에 침착시키고, 세포를 바이오프린팅하는 기본 방법은 와렌(Warren) 등의 미국 특허 제 6,986,739 호, 볼란드(Boland) 등의 미국 특허 제 7,051,654 호, 유(Yoo) 등의 미국 특허공개 제 2009/0208466 호 및 수(Xu) 등의 미국 특허공개 제 2009/0208577 호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 전체 내용이 본원에 참고로서 인용된다. 또한, 본원에 제공된 조직 및 기관의 생성에 적합한 바이오프린터는, 예를 들면, 엔비젼텍(Envisiontec) GmbH(독일 글라트베크)에서 3D-바이오플로터(3D-Bioplotter, 상표)로서; 및 올가노보(Organovo)(미국 캘리포니아주 샌디에이고)에서 노보겐 MMX 바이오프린터(NovoGen MMX Bioprinter, 상표)로서 상업적으로 시판한다.
본원에 기술된 방법에 사용되는 바이오프린터는, 예를 들면, 프린터 드라이버 소프트웨어 및/또는 프린터의 물리적 구조의 변형에 의해 온도, 습도, 전단력, 프린팅 속도 및/또는 발화 빈도의 제어를 가능하게 하는 메카니즘 및/또는 소프트웨어를 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 바이오프린터 소프트웨어 및/또는 하드웨어는 바람직하게는 프린팅동안 약 37 ℃의 세포 온도를 유지하도록 구성되고/되거나 설정될 수 있다.
특정 태양에서, 잉크젯 프린팅 장치는 2-차원 또는 3-차원 프린터를 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 바이오프린터는 DC 솔레노이드 잉크젯 밸브, 예를 들면, 잉크젯 밸브에 연결된, 프린팅 전에 하나 이상의 유형의 세포, 예를 들면, 유동성 조성물 중의 세포, 및/또는 ECM(예를 들면, 유동성 ECM)을 함유하기 위한 하나 이상의 저기관(reservoir)을 포함한다. 바이오프린터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 저기관, 예를 들면, 본원에 기술된 조직 및 기관을 구성하기 위해 사용되는 각각의 세포 유형 또는 ECM 당 하나의 저기관을 가질 수 있다. 세포는 기압, 기계적 압력에 의해, 또는 다른 수단에 의해 저기관으로부터 잉크젯 밸브로 전달될 수 있다. 전형적으로, 바이오프린터, 예를 들면, 바이오프린터 중의 프린트 헤드는, 하나 이상의 세포 유형 및 상기 ECM이 사전결정된 패턴으로 침착되도록 컴퓨터-제어된다. 상기 사전결정된 패턴은, 그로부터 세포가 유도되거나 수득되는 기관 또는 조직 중에 상기 하나 이상의 유형의 세포의 자연적인 배열을 재현하거나 반복하는 패턴, 또는 상기 하나 이상의 유형의 세포의 자연적 배열과 상이한 패턴일 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 제공된 방법에 사용되는 바이오프린터는 서멀 버블(thermal bubble) 잉크젯 프린터(예를 들면, 니클라센(Niklasen) 등의 미국 특허 제 6,537,567 호 참조), 또는, 예를 들면, 30 kHz 이하의 주파수 및 12 내지 100 와트 범위의 전력원을 사용하는 압전 결정체 진동 프린트 헤드일 수 있다. 일부 태양에서, 바이오프린터 프린트 헤드 노즐은 각각 독립적으로 직경이 0.05 내지 200 ㎛, 또는 직경이 0.5 내지 100 ㎛, 또는 직경이 10 내지 70 ㎛, 또는 직경이 20 내지 60 ㎛이다. 다른 태양에서, 상기 노즐은 각각 독립적으로 직경이 약 40 또는 50 ㎛이다. 같거나 다른 직경을 갖는 다중 노즐을 사용할 수 있다. 일부 태양에서, 노즐은 원형 개구부를 가지며; 다른 태양에서는, 본 발명의 진의에서 벗어나지 않고, 다른 적합한 형태, 예를 들면, 타원형, 사각형, 직사각형 등을 사용할 수 있다.
특정 태양에서, 바이오프린팅될 조직 또는 기관의 해부학적 영상은 소프트웨어, 예를 들면, 컴퓨터-이용 설계(CAD) 소프트웨어 프로그램을 사용하여 구성될 수 있다. 상기 태양에 따르면, 프린팅될 조직 또는 기관의 구조를 나타내는 3-차원 표면상에 3-차원 프린팅을 가능하게 하는 프로그램이 제작될 수 있다. 예를 들면, 뼈를 프린팅하는 것이 필요한 경우, 뼈의 해부학적 영상이 구성될 수 있고, 바이오프린터의 프린터 헤드가 프린팅 동안 3-차원 뼈 표면 주위로 회전하도록 유도하는 프로그램이 제작될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 제공된 바이오프린팅 방법은 표면 위에 세포(예를 들면, 단일 세포를 포함하는 조성물 또는 다중 세포를 포함하는 조성물) 및 유동성 세포외 기질(ECM)의 개개 소적의 전달/침착을 포함한다.
특정 태양에서, 본원에 제공된 바이오프린팅 방법은 표면 위에 단일 세포 유형 및 유동성 ECM의 침착을 포함한다. 상기 방법에 따라 사용될 수 있는 대표적인 세포 유형은 하기 단락 1.1에 제공되어 있다. 유동성 ECM을 포함하여, ECM은 하기 단락 1.3에 기술되어 있다.
다른 태양에서, 본원에 제공된 바이오프린팅 방법은 표면 위에 다중(예를 들면, 2, 3, 4, 5개 이상) 세포 유형 및 유동성 ECM의 침착을 포함한다. 특정 태양에서, 다중 세포 유형은 동일한 조성물의 일부로서 침착되고, 즉, 세포의 공급원이 다중 세포 유형을 포함하는 단일 조성물이다. 또 다른 특정 태양에서, 다중 세포 유형은 상이한 조성물의 일부로서 침착되고, 즉, 세포의 공급원이 다중 세포 유형을 포함하는 별개의 조성물이다. 또 다른 특정 태양에서, 다중 세포 유형의 일부가 한 조성물의 일부로서 침착되고(예를 들면, 2개 이상의 세포 유형이 단일 조성물에 존재), 다중 유형의 또 다른 부분은 상이한 조성물로서 침착된다(예를 들면, 하나 이상의 세포 유형이 단일 조성물에 존재). 상기 방법에 따라 사용될 수 있는 대표적인 세포 유형은 하기 단락 1.2에 제공되어 있다.
특정 태양에서, 침착될 세포 및 유동성 ECM은 동일한 조성물의 일부로서 함께(예를 들면, 동시에) 표면 위에 침착된다. 또 다른 특정 태양에서, 침착될 세포 및 유동성 ECM은 상이한 조성물의 일부로서 함께 표면 위에 침착된다. 또 다른 특정 태양에서, 침착될 세포 및 유동성 ECM은 별개로(예를 들면, 상이한 시간에) 표면 위에 침착된다.
특정 태양에서, 세포 및 유동성 ECM은 하나 이상의 추가 성분과 함께 표면 위에 침착된다. 한 태양에서, 하나 이상의 추가 성분은 세포와 동일한 조성물 중에 배합된다. 또 다른 태양에서, 하나 이상의 추가 성분은 ECM과 동일한 조성물에 배합된다. 또 다른 태양에서, 하나 이상의 추가 성분은 세포 및 ECM과 동일한 조성물에 배합된다(즉, 단일 조성물이 세포, 유동성 ECM 및 하나 이상의 추가 성분을 포함한다). 또 다른 태양에서, 하나 이상의 추가 성분은 세포 및/또는 ECM을 포함하는 조성물과 별개의 조성물에 배합되고, 표면 위에 세포 및/또는 ECM의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 침착된다. 특정 태양에서, 하나 이상의 추가 성분은 세포(들)의 생존, 분화, 증식 등을 촉진한다. 또 다른 특정 태양에서, 하나 이상의 추가 성분은 가교결합제를 포함한다(단락 1.3.2 참조). 또 다른 특정 태양에서, 하나 이상의 추가 성분은 하이드로겔을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 하나 이상의 추가 성분은 합성 중합체를 포함한다.
당해 분야에 기술을 가진 자라면, 본원에 기술된 방법에 따라서 사용되는 세포 및 유동성 ECM 뿐 아니라, 임의의 추가의 성분이, 형성되는 특정 조직 또는 기관에 따라서, 프린터의 별개의 노즐들로부터, 또는 프린터의 동일한 노즐을 통해 공통 조성물로 프린팅될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 당해 분야에 기술을 가진 자라면, 프린팅이 동시에 또는 순차적으로, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어질 수 있으며, 성분들(예를 들면, 세포, 유동성 ECM 또는 가교결합제) 중 일부는 제 1 패턴 형태로 프린팅될 수 있고, 성분들의 일부는 제 2 패턴 형태 등으로 프린팅될 수 있음을 인지할 것이다. 프린팅의 특별한 조합 및 방식은 프린팅되는 특정 조직 또는 기관에 따라 달라질 것이다.
특정 태양에서, 세포, ECM 및/또는 임의의 다른 물질(예를 들면, 합성 기질, 예를 들어, PCL)은 목적하는 결과를 제공하기 위해 특정 패턴으로 바이오프린팅될 수 있다. 예를 들면, 바이오프린팅된 물질(예를 들면, 세포, ECM, 기질 및 본원에 기술된 다른 성분들)은, 특정 기공 크기를 갖는 3-차원 구조와 같은 특정한 바람직한 패턴을 생성하기 위해 다양한 각도에서 층으로 바이오프린팅되거나 그렇지않으면 침착될 수 있다. 특정 태양에서, 바이오프린팅된 물질(예를 들면, 세포, ECM, 기질 및 본원에 기술된 다른 성분들)은 박스-형으로 보이는 목적하는 크기의 기공을 갖는 바이오프린팅된 구조를 생성하기 위해 십자 방식으로 프린팅되거나 그렇지않으면 침착된다. 또 다른 특정 태양에서, 바이오프린팅된 물질(예를 들면, 세포, ECM, 기질 및 본원에 기술된 다른 성분들)은 삼각형 또는 다이아몬드-형으로 보이는 목적하는 크기의 기공을 생성하기 위해 각으로 프린팅되거나 그렇지않으면 침착된다. 예를 들면, 바이오프린팅된 물질(예를 들어, 세포, ECM, 기질 및 본원에 기술된 다른 성분들)은 목적하는 패턴을 생성하기 위해 특정 각도, 예를 들어, 30도 각, 45도 각, 60도 각으로 프린팅되거나 그렇지않으면 침착될 수 있다. 상기 방법에 따르면, 바람직한 성질, 예를 들면, 세포 성장 및 증식을 촉진하는 능력을 갖는 구조물을 제작할 수 있다(하기 실시예 1 참조). 특정 태양에서, 기질, 예를 들면, 합성 기질은 상기 바이오프린팅된 기질 위에서 세포의 성장 및 증식을 증진시키기에 적합한 특정 패턴으로 바이오프린팅된다. 특정 태양에서, 합성 기질은 PCL이다.
1.1 세포
진핵 세포를 포함하여, 당해 분야에 공지된 임의 유형의 세포를 본원에 기술된 방법에 따라 사용할 수 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 동계(syngeneic)(즉, 조직 이식 거부를 최소화하기 위해, 수용 대상의 세포와 유전적으로 동일하거나 밀접하게 관련된), 동종이계(allogeneic)(즉, 수용 대상의 동일한 종의 비-유전적으로 동일한 구성원으로부터), 또는 이종(xenogeneic)(즉, 수용 대상과 상이한 종의 구성원으로부터)일 수 있다. 동계 세포는 자가발생적(즉, 수용 대상으로부터의) 및 동종(즉, 유전적으로 동일하지만 다른 대상으로부터, 예를 들면, 일란성 쌍생아로부터의)인 세포들을 포함한다. 세포는, 예를 들면, 공여체(살아있거나 시신)로부터 수득되거나 확립된 세포 균주 또는 세포주로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 세포는 당해 분야에 공지된 표준 생검 기술을 이용하여 공여자(예를 들면, 잠재적 수용자)로부터 수집될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라서 사용되는 세포는 유동성의 생리학적으로 허용되는 조성물, 예를 들면, 물, 완충액(예, 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액 등), 액체 매질(예, 0.9 N 식염수 용액, 크렙(Kreb) 용액, 변형된 크렙 용액, 이글(Eagle) 배지, 변형된 이글 배지(MEM), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), 행크 균형 염(Hank's Balanced Slats) 용액 등) 등에 함유된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 하나 이상의 당해 분야에 공지된 프로테아제, 예를 들면, 콜라게나제, 디스파제, 트립신, 리버라제(LIBERASE) 등을 사용하여 조직 또는 기관으로부터 단리된 1차 세포를 포함할 수 있다. 기관 조직은 프로테아제로 조직을 처리하기 전에, 처리하는 동안 또는 처리 후에, 예를 들면, 다이싱(dicing), 냉침, 여과 등에 의해 물리적으로 분산될 수 있다. 세포는, 예를 들면, 균질하거나 실질적으로 균질한 세포 집단을 생성하거나, 특정 세포 유형을 선택하거나 하기 위해, 본원에 기술된 방법에 세포를 사용하기 전에 당해 분야에 공지된 표준 세포 배양 기술을 사용하여 배양될 수 있다.
한 태양에서, 본원에 기술된 방법에 사용되는 세포 유형(들)은 줄기 세포를 포함한다. 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 줄기 세포의 비-제한 목록으로는 다음이 포함된다: 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 골수-유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC), 조직 플라스틱-부착성 태반 줄기 세포(PDAC), 제대 줄기 세포, 양수 줄기 세포, 양막 유래 부착 세포(AMDAC), 골원성 태반 부착 세포(OPAC), 지방 줄기 세포, 윤부 줄기 세포, 치수 줄기 세포, 근아세포, 내피 전구세포, 신경 줄기 세포, 탈락 치아 유래 줄기 세포, 모낭 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 단위생식 유도 줄기 세포, 역분화(reprogrammed) 줄기 세포, 양막 유래 부착 세포 또는 측면 집단(side population) 줄기 세포.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 태반 줄기 세포(예를 들면, 미국 특허 제 7,468,276 호 및 미국 특허 제 8,057,788 호에 기술된 태반 줄기 세포)의 사용을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 태반 줄기 세포는 PDAC(등록상표)이다. 한 태양에서, 상기 PDAC는 CD34-, CD10+, CD105+, 및 CD200+이다. 또 다른 태양에서, 상기 PDAC는 CD34-, CD10+, CD105+, 및 CD200+이며, 또한 CD45-, CD80-, CD86-, 및/또는 CD90+이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 AMDAC(예를 들면, 국제 특허출원 제 WO10/059828 호에 기술된 AMDAC)의 사용을 포함한다. 한 태양에서, 상기 AMDAC는 Oct4-이다. 또 다른 태양에서, 상기 AMDAC는 CD49f+이다. 또 다른 태양에서, 상기 AMDAC는 Oct4- 및 CD49f+이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 PDAC 및 AMDAC의 사용을 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 BM-MSC의 사용을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본원에 기술된 방법에 사용되는 세포 유형(들)은 분화된 세포를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 내피 세포, 상피 세포, 피부 세포, 내배엽 세포, 중배엽 세포, 섬유아세포, 골세포, 연골세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 간세포, 췌장 세포 및/또는 기질 세포를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 세포는 인슐린-생성 세포, 예를 들면, 췌장 세포(예, 섬세포) 또는 인슐린-생성 세포주, 예를 들면, β-TC-6 세포이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 타액선 점액 세포, 타액선 장액 세포, 폰에브너선(von Ebner's gland) 세포, 유선 세포, 누선 세포, 이도선 세포, 에크린 한선 암세포(dark cell), 에크린 한선 클리어 세포, 아포크린 한선 세포, 몰선(gland of Moll) 세포, 피지선 세포, 보우만선(Bowman's gland) 세포, 브루너선(Brunner's gland) 세포, 정낭 세포, 전립선 세포, 요도구선 세포, 바르톨린선(Bartholin's gland) 세포, 리트레선(gland of Littre) 세포, 자궁 내막 세포, 단리된 배상 세포, 위벽 점액 세포, 위선 효소원 세포, 위선 산분비 세포, 췌장 선포 세포, 파네스 세포, 제 2 형 폐포세포 및/또는 클라라 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 소마토트로프, 락토트로프, 티로트로프, 고나도트로프, 코르티코트로프, 뇌하수체 중엽 세포, 거대세포성 신경분비 세포, 장 세포, 기도 세포, 갑상선 상피 세포, 부여포 세포, 부갑상선 세포, 부갑상선 주세포, 호산성 세포, 부신 세포, 크롬친화성 세포, 라이디히(Leydig) 세포, 내난포막 세포, 황체 세포, 과립층 황체 세포, 난포막 황체 세포, 방사구체 세포, 치밀반 세포, 극주위(peripolar) 세포 및/또는 혈관간막 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 혈관 및 림프 혈관 내피 유창 세포, 혈관 및 림프 혈관 내피 무한증식 세포, 혈관 및 림프 혈관 내피 비장 세포, 활막 세포, 장막 세포(표층 복막, 늑막, 및 위심강), 편평 세포, 원통 세포, 암세포(dark cell), 전정막 세포(귀의 표층 내림프 공간), 혈관조 기저 세포, 혈관조 변연 세포(귀의 표층 내림프 공간), 클라우디우스 세포(cell of Claudius), 보에처 세포(cell of Boettcher), 맥락총 세포, 연질뇌척수막 편평 세포, 색소성 모양체 상피 세포, 비색소성 모양체 상피 세포, 각막 내피 세포, peg 세포, 기도 섬모 세포, 수란관 섬모 세포, 자궁내막 섬모 세포, 정소망 섬모 세포, 원심성 신경관 섬모 세포 및/또는 섬모 상의 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 표피 각질세포, 표피 기저 세포, 손톱 및 발톱의 각질세포, 조상 기저 세포, 수질 모간세포, 피질 모간세포, 각피 모간세포, 각피 모근초 세포, 헉슬리층(Huxley's layer)의 모근초 세포, 헨레층(Henle's layer)의 모근초 세포, 외부 모근초 세포, 모기질 세포, 중층 편평 상피의 표면 상피 세포, 상피의 기저 세포, 및/또는 비뇨기 상피 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 코르티 기관(organ of Corti)의 청각 내유모 세포, 코르티 기관의 청각 외유모 세포, 코르티 기관의 내주 세포, 코르티 기관의 외주 세포, 코르티 기관의 내부 지골 세포, 코르티 기관의 외부 지골 세포, 코르티 기관의 경계 세포, 코르티 기관의 헨센(Hensen) 세포, 전정 기관 지지 세포, 미뢰 지지 세포, 후각 상피 지지 세포, 슈반(Schwann) 세포, 위성 세포, 장 신경교세포, 후각 상피의 기저 세포, 저온-민감성 1차 감각 뉴런, 열-민감성 1차 감각 뉴런, 표피의 메르켈(Merkel) 세포, 후각 수용체 뉴런, 통증-민감성 1차 감각 뉴런, 광수용체 간상 세포, 광수용체 청색-민감성 원추 세포, 광수용체 녹색-민감성 원추 세포, 광수용체 적색-민감성 원추 세포, 자기수용 1차 감각 뉴런, 접촉-민감성 1차 감각 뉴런, 제 1 형 경동맥체 세포, 제 2 형 경동맥체 세포(혈액 pH 센서), 귀의 전정 기관의 제 1 형 모세포(가속 및 중력), 귀의 전정 기관의 제 2 형 모세포, 제 1 형 미뢰 세포, 콜린성 신경 세포, 아드레날린성 신경 세포, 및/또는 펩티드성 신경 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 성상 세포, 뉴런, 희돌기교세포, 방추 뉴런, 전방 수정체 상피 세포, 결정질-함유 수정체 섬유 세포, 간세포, 지방세포, 백색 지방세포, 갈색 지방세포, 간 지방세포, 신장 사구체 벽세포, 신장 사구체 족세포, 신장 근위 세뇨관 브러시 보더 세포, 헨레 고리(loop of Henle) 박편 세포, 신장 원위 세뇨관 세포, 신장 집뇨관 세포, 제 1 형 폐포세포, 췌장관 세포, 비줄무늬 관세포, 관세포, 장 브러시 보더 세포, 외분비선 줄무늬 관세포, 담낭 상피 세포, 원심성 신경관 비섬모 세포, 정소상체 주세포, 및/또는 정소상체 기저 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 에나멜아세포 상피 세포, 편평 반월골 상피 세포, 코르티 기관 치간 상피 세포, 소성 결합 조직 섬유아세포, 각막간질세포, 건 섬유아세포, 골수 세망조직 섬유아세포, 비상피 섬유아세포, 주피세포, 수핵 세포, 시멘트아세포/시멘트질세포, 상아모세포, 상아세포, 초자 연골 연골세포, 섬유연골 연골세포, 탄성 연골 연골세포, 조골세포, 골세포, 파골세포, 골전구세포, 초자체세포, 성상 세포(귀), 간 성상 세포(Ito 세포), 췌장 성상 세포, 적색 골격근 세포, 백색 골격근 세포, 중간 골격근 세포, 근방추의 핵낭 세포, 근방추의 핵사슬 세포, 위성 세포, 보통 심근 세포, 결절 심근 세포, 푸르키네(Purkinje) 섬유 세포, 평활근 세포, 홍채의 근상피 세포, 및/또는 외분비선의 근상피 세포를 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 분화된 세포(들)는 망상적혈구, 거핵세포, 단핵구, 결합 조직 대식세포, 표피 랑게르한스(Langerhans) 세포, 수지상 세포, 미세아교 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 헬퍼 T 세포, 억제 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 멜라닌세포, 망막 색소 상피 세포, 난원세포/난모세포, 정세포, 정모세포, 정원세포, 정자, 난포 세포, 세르톨리(Sertoli) 세포, 흉선 상피 세포, 및/또는 간질 신장 세포를 포함한다.
본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 조성물 중에 배합될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 단일 세포 유형만을 포함하는 조성물 중에 배합되고, 즉, 조성물 중에 세포 집단은 동종이다. 다른 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 하나보다 많은 세포 유형을 포함하는 조성물 중에 배합되고, 즉, 조성물 중에 세포 집단은 이종이다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 유동성 ECM(단락 1.3 참조)을 추가로 포함하는 조성물 중에 배합된다. 또는, 상기 유동성 ECM은 상기 세포의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에, 본원에 기술된 방법에 따라 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 하나 이상의 합성 단량체 또는 중합체를 추가로 포함하는 조성물 중에 배합된다. 또는, 상기 합성 단량체 또는 중합체는 상기 세포의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에, 본원에 기술된 방법에 따라 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 유동성 ECM 및 하나 이상의 합성 단량체 또는 중합체를 추가로 포함하는 조성물 중에 배합된다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 가교결합제를 추가로 포함하는 조성물 중에 배합된다. 또는, 상기 가교결합제는 상기 세포의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에, 본원에 기술된 방법에 따라 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 하나 이상의 추가의 성분, 예를 들면, 세포(들)의 생존, 분화, 증식 등을 촉진하는 성분들을 추가로 포함하는 조성물 중에 배합된다. 상기 성분들은, 제한하지 않고, 영양소, 염, 당, 생존 인자 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 대표적인 성장 인자로는, 제한하지 않고, 인슐린-유사 성장 인자(예를 들면, IGF-1), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타), 골형성 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 기저 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자(FGF)(1, 2 및 3번), 오스테오폰틴, 골형성 단백질-2, 성장 호르몬, 예를 들면, 소마토트로핀, 세포 유인물질 및 부착 물질 등, 및 이의 혼합물이 포함된다. 또는, 세포(들)의 생존, 분화, 증식 등을 촉진하는 상기 하나 이상의 추가 성분은 상기 세포의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 본원에 기술된 방법에 따라 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 중합성 단량체(들)를 추가로 포함하는 조성물 중에 배합된다. 또는, 상기 중합성 단량체는 상기 세포의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 본원에 기술된 방법에 따라 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다. 상기 태양에서, 예를 들면, 일단 세포가 프린팅되면, 단량체가 중합되어 세포를 포획하고/하거나 물리적으로 지지하는 겔을 형성하도록, 중합 촉매가 바이오프린팅 직전에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 세포를 포함하는 조성물은 아크릴아미드 단량체를 포함할 수 있으며, 이때 TEMED 및 암모늄 퍼설페이트 또는 리보플라빈이 바이오프린팅 직전에 조성물에 첨가된다. 표면 위에 조성물 중 세포의 침착시, 아크릴아미드가 중합되어 세포를 격리시키고 지지한다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 추가로 접착제를 포함하는 조성물 중에 배합된다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는, 제한없이, 시아노아크릴레이트 에스터, 피브린 실란트, 및/또는 젤라틴-레조르시놀-포름알데하이드 아교를 포함하여 연조직 접착제를 추가로 포함하는 조성물 중에 배합된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 추가로 아르기닌-글리신-아스파트산(RGD) 리간드, 세포외 단백질 및/또는 세포외 단백질 유사체를 포함하는 조성물 중에 배합된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는, 세포가 표면 위에 단일 세포로서 침착될 수 있도록(즉, 세포들은 한번에 1개 세포가 침착된다) 조성물 중에 배합된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는, 세포가 표면 위에 다중 세포를 포함하는 응집체로서 침착될 수 있도록 조성물 중에 배합된다. 상기 응집체는 단일 유형의 세포를 포함할 수 있거나, 다중 세포 유형, 예를 들면, 2, 3, 4, 5개 이상의 세포 유형을 포함할 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는, 세포가 조성물의 일부로서 조직을 형성하도록 조성물 중에 배합되며, 이때 상기 조직은 본원에 기술된 방법을 이용하여 표면 위에 침착될 수 있다. 상기 조직은 단일 유형의 세포를 포함할 수 있거나, 다중 세포 유형, 예를 들면, 2, 3, 4, 5개 이상의 세포 유형을 포함할 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 세포는 표면 위에, 세포들의 개별적 소적 및/또는 소부피, 예를 들면, 소적당 0.5 내지 500 피코리터를 갖는 조성물로서 침착된다. 다양한 태양에서, 세포, 또는 세포를 포함하는 조성물의 부피는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 20, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 피코리터, 또는 약 1 내지 90 피코리터, 약 5 내지 85 피코리터, 약 10 내지 75 피코리터, 약 15 내지 70 피코리터, 약 20 내지 약 65 피코리터, 또는 약 25 내지 약 60 피코리터이다.
1.2 조직 및 기관
본원에는 본원에 제공된 방법들 중 하나 이상을 이용하여 조작/생성된 조직 및 기관이 제공된다.
당해 분야에 공지되어 있는 임의 유형의 조직이 본원에 기술된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 단일 세포 유형을 포함한다. 다른 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 다중 세포 유형을 포함한다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 하나 보다 많은 유형의 조직을 포함한다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 표면 위에 세포의 침착을 포함하며, 이때 상기 표면은 대상으로부터의 조직을 포함하고, 예를 들면, 조직은 공여자로부터, 수용 대상으로부터, 시신으로부터, 또는 또 다른 공급원으로부터 수득된다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 표면 위에 세포의 침착을 포함하며, 이때 상기 표면은 대상으로부터 수득되지 않은 조직을 포함하고, 예를 들면, 조직은 합성되었다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 결합 조직이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 근육 조직이다. 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 근육 조직은 내장근(평활근) 조직, 골격근 조직 또는 심근 조직을 포함할 수 있다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 신경 조직이다. 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 신경 조직은 중추 신경계 조직(예를 들면, 뇌 조직 또는 척수 조직) 또는 말초 신경계 조직(예를 들면, 뇌 신경 또는 척수 신경)을 포함할 수 있다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 내피를 포함한 상피 조직이다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 기관을 조작하기 위해 사용될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직은 기관의 일부를 조작하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 조작되는 조직 및 기관은 알려져 있는 포유동물 기관계, 즉, 소화기계, 순환계, 내분비계, 배설계, 면역계, 외피계, 근육계, 신경계, 생식계, 호흡기계 및/또는 골격계 중 어느 하나와 관련될 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따라 생성되거나 제조될 수 있는 대표적인 기관으로는, 제한없이, 폐, 간, 심장, 뇌, 신장, 피부, 뼈, 위, 췌장, 방광, 담낭, 소장, 대장, 전립선, 고환, 난소, 척수, 인두, 후두, 기관, 기관지, 횡격막, 수뇨관, 요도, 식도, 결장, 흉선 및 비장이 포함된다. 특정 태양에서, 췌장이 본원에 기술된 방법에 따라 생성되거나 제조된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 뼈를 조작하기 위해 이용된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 폐 조직, 또는 폐 또는 이의 일부를 조작하기 위해 이용된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 간 조직, 또는 간 또는 이의 일부를 조작하기 위해 이용된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 신경 조직, 또는 신경 또는 이의 일부를 조작하기 위해 이용된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 또는 기관은 상기 조직 또는 기관의 기능에 유리한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 또는 기관은 또한 신경 유도관, 즉, 축삭 재성장을 유도하는 인공적 수단을 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 신경 유도관은 폴리무수물, 예를 들면, 폴리(o-카복시페녹시)-p-자일렌) 또는 폴리(락티드-무수물)로 제조된다. 특정 태양에서, 신경 유도관은 조직 또는 기관의 프린팅과 동시에 침착될 수 있고, 즉, 신경 유도관은 조직 또는 기관와 함께 프린팅된다. 다른 태양에서, 신경 유도관은 상기 조직 또는 기관의 프린팅 전에 제조되고, 상기 조직 또는 기관이 프린팅될 때 조직 또는 기관 내에 배치(예를 들면, 수동으로 배치)될 수 있다. 다른 태양에서, 신경 유도관은 상기 조직 또는 기관의 프린팅 전에 제조되고, 상기 조직 또는 기관이 프린팅된 후에 조직 또는 기관 내에 배치(예를 들면, 수동으로 배치)될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 또는 기관은 또한 혈관, 예를 들면, 대상(예를 들어, 공여자, 수용 대상 또는 시신)으로부터 수득된 혈관 또는 본원에 기술된 방법을 이용하여 조작된 혈관을 포함할 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및 기관은 이의 자연 상태에서, 예를 들면, 인체에서 나타나는 바와 같은 조직 또는 기관의 형태이다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 폐는 인체에서 보이는 바와 같은 인간 폐와 유사할 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및 기관은 이의 자연 상태에서 보이는 바와 같은 조직 또는 기관의 형태가 아니지만, 상기 기관와 동일한 방식으로 또는 유사한 방식으로 작용한다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 폐는 인체에서 보이는 바와 같은 인간 폐와 유사하지 않을 수 있지만, 인간 폐의 기능중 일부 또는 전부를 유지할 수 있다. 상기 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및 기관은, 제한하지 않고, 구, 원통, 막대형 또는 직육면체형(즉, 정육면체)을 포함하여 다양한 형태를 가질 수 있다.
1.3 세포외 기질(ECM)
본원에 기술된 방법은 표면 위에 세포(예를 들면, 단일 세포를 포함하는 조성물 및/또는 다중 세포를 포함하는 조성물), 및 유동성 ECM을 포함한 세포외 기질(ECM)의 침착을 포함한다. ECM은 임의의 공지되어 있는 ECM 공급원으로부터 유도될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 유동성이 될 수 있다. 특정 태양에서, ECM은 유동성 ECM을 포함한다. ECM은, 예를 들면, 하기 단락 1.3.1에 기술된 방법을 이용하여 유동성이 될 수 있다. 특정 태양에서, ECM은, 예를 들면, 하기 단락 1.3.2에 기술된 방법을 이용하여 가교결합될 수 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM(예를 들면, 유동성 ECM)은 본원에 제공된 방법에 따라 사용하기 위한 조성물의 일부로서 배합될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은 포유동물 ECM, 식물 ECM, 연체동물 ECM 및/또는 물고기 ECM을 포함한다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은 포유동물 ECM을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은 포유동물 ECM을 포함하며, 이때 상기 포유동물 ECM은 태반(예를 들면, 인간 태반)으로부터 유도된다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 태반-유래 ECM은 텔로펩티드(telopeptide) 콜라겐을 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 상기 태반-유래 ECM은, 화학적으로 변형되거나 프로테아제와 접촉되지 않은, 염기-처리되고/되거나 계면활성제 처리된 제 1 형 텔로펩티드 태반 콜라겐을 포함하며, 이때 상기 ECM은 5 중량% 미만의 피브로넥틴 또는 5 중량% 미만의 라미닌; 25 내지 92 중량%의 제 1 형 콜라겐; 및 2 내지 50 중량%의 제 3 형 콜라겐 또는 2 내지 50 중량%의 제 4 형 콜라겐을 포함한다.
또 다른 특정 태양에서, 상기 태반-유래 ECM은, 화학적으로 변형되거나 프로테아제와 접촉되지 않은, 염기-처리되고 계면활성제 처리된 제 1 형 텔로펩티드 태반 콜라겐을 포함하며, 이때 상기 ECM은 1 중량% 미만의 피브로넥틴 또는 1 중량% 미만의 라미닌; 74 내지 92 중량%의 제 1 형 콜라겐; 및 4 내지 6 중량%의 제 3 형 콜라겐 또는 2 내지 15 중량%의 제 4 형 콜라겐을 포함한다.
본원에 기술된 방법에 따라 사용되는, 태반 ECM, 예를 들면, 태반 텔로펩티드 콜라겐을 포함하는 ECM은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있거나, 다음과 같이 제조될 수 있다. 먼저, 태반 조직(전체 태반이거나 이의 일부이거나)을 표준 방법에 의해, 예를 들면, 제왕 절개 또는 정상 분만 후 실행가능한 대로, 예를 들면, 무균적으로 수집함으로써 수득된다. 태반 조직은 양막(가용성이든 불용성이든 또는 둘 다이든), 장막, 탯줄을 포함하여 태반의 임의의 부분으로부터, 또는 전체 태반으로부터 수득될 수 있다. 특정 태양에서, 콜라겐 조성물은 탯줄을 제외한 전체 인간 태반으로부터 제조된다. 태반은 추가의 처리까지 실온에서, 또는 약 2 내지 8 ℃의 온도에서 저장될 수 있다. 태반은 바람직하게는 방혈되고, 즉, 분만후 남은 태반혈 및 제대혈을 완전히 배출시킨다. 특정 태양에서, 임산부는 분만 전에, 예를 들면, HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV, 및 태반 조직을 오염시키는 것으로 알려진 다른 바이러스 병원균에 대해 검진한다.
태반 조직은 ECM의 생성 전에 세포제거될 수 있다. 태반 조직은 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들면, 전체 내용이 본원에 참고로서 인용된 미국 특허공개 제 2004/0048796 호 및 제 2003/0187515 호에 상세히 기술된 방법들에 따라 세포제거될 수 있다.
태반 조직은 삼투압 충격에 적용될 수 있다. 삼투압 충격은 임의의 정화 단계에 추가될 수 있거나, 당해 분야에 기술을 가진 자의 판단에 따라 유일한 정화 단계일 수 있다. 삼투압 충격은 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 삼투압 충격 조건에서 수행될 수 있다. 상기 조건은 높은 삼투 퍼텐셜을 갖는 용액, 또는 낮은 삼투 퍼텐셜을 갖는 용액, 또는 높고 낮은 삼투 퍼텐셜이 교대되는 용액 중에서 조직을 배양하는 것을 포함한다. 높은 삼투 퍼텐셜 용액은 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 높은 삼투 퍼텐셜 용액, 예를 들면, NaCl(예를 들면, 0.2 내지 1.0 M 또는 0.2 내지 2.0 M), KCl(예를 들면, 0.2 내지 1.0 M 또는 0.2 내지 2.0 M), 암모늄 설페이트, 모노사카라이드, 다이사카라이드(예를 들면, 20% 슈크로스), 친수성 중합체(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜), 글리세롤 등 중 1종 이상을 포함하는 용액일 수 있다. 특정 태양에서, 높은 삼투 퍼텐셜 용액은 염화나트륨 용액, 예를 들면, 적어도 0.25 M, 0.5 M, 0.75 M, 11.0 M, 1.25 M, 1.5 M, 1.75 M, 2 M 또는 2.5 M NaCl이다. 일부 태양에서, 염화나트륨 용액은 약 0.25 내지 5 M, 약 0.5 내지 4 M, 약 0.75 내지 3 M, 또는 약 1.0 내지 2.0 M NaCl이다. 낮은 삼투 퍼텐셜 용액은, 물, 예를 들면, 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 방법에 따라 탈이온화된 물과 같은 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 낮은 삼투 퍼턴셀 용액일 수 있다. 일부 태양에서, 삼투압 충격 용액은 50 mM NaCl 미만의 삼투 충격 퍼텐셜을 갖는 물을 포함한다. 특정 태양에서, 삼투압 충격은 염화나트륨 용액에 이어 수용액 중에서 이루어진다. 특정 태양에서, 1 또는 2회의 NaCl 용액 처리 후에 물 세척이 이어진다.
특정 태양에서, 삼투압 충격으로부터 수득된 조성물은 이어서 계면활성제와 함께 배양될 수 있다. 계면활성제는, 세포막 또는 준세포막을 파괴할 수 있는, 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 계면활성제, 예를 들면, 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 데옥시콜레이트, 나트륨 도데실설페이트, 트리톤 X 100, 트윈(TWEEN) 등일 수 있다. 계면활성제 처리는 약 0 내지 약 30 ℃, 약 5 내지 약 25 ℃, 약 5 내지 약 20 ℃, 약 5 내지 약 15 ℃, 약 0 ℃, 약 5 ℃, 약 10 ℃, 약 15 ℃, 약 20 ℃, 약 25 ℃ 또는 약 30 ℃에서 수행될 수 있다. 계면활성제 처리는, 예를 들면, 약 1 내지 24 시간, 약 2 내지 20 시간, 약 5 내지 15 시간, 약 8 내지 12 시간, 또는 약 2 내지 5 시간 동안 수행될 수 있다.
특정 태양에서, 계면활성제 처리로부터 수득된 조성물은 이어서 염기성 조건하에서 배양될 수 있다. 염기 처리를 위한 특정 염기는, 예를 들면, 0.2 내지 1.0 M의 농도에서 생체적합성 염기, 휘발성 염기, 또는 임의의 유기 또는 무기 염기를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 염기는 NH4OH, KOH 및 NaOH, 예를 들면, 0.1 M NaOH, 0.25 M NaOH, 0.5 M NaOH, 또는 1 M NaOH로 이루어진 군에서 선택된다. 염기 처리는, 예를 들면, 0 내지 30 ℃, 5 내지 25 ℃, 5 내지 20 ℃, 5 내지 15 ℃, 약 0 ℃, 약 5 ℃, 약 10 ℃, 약 15 ℃, 약 20 ℃, 약 25 ℃ 또는 약 30 ℃에서, 예를 들면, 약 1 내지 24 시간, 약 2 내지 20 시간, 약 5 내지 15 시간, 약 8 내지 12 시간, 또는 약 2 내지 5 시간 동안 수행될 수 있다.
ECM은 염기에 의한 처리 없이 생성될 수 있으며; 염기 처리 단계의 생략은 전형적으로, 염기 처리를 포함시켜 생성된 ECM 조성물보다 비교적 더 많은 양의 엘라스틴, 피브로넥틴 및/또는 라미닌을 포함하는 ECM 조성물을 제공한다.
전형적으로, 인간 태반 조직에 대해 전술한 공정은 화학적으로 변형되거나 프로테아제와 접촉하지 않은, 염기-처리되고/되거나 계면활성제 처리된 제 1 형 텔로펩티드 태반 콜라겐을 포함하는 태반 ECM을 생성시키며, 이때 상기 ECM은 5 중량% 미만의 피브로넥틴 또는 5 중량% 미만의 라미닌; 25 내지 92 중량%의 제 1 형 콜라겐; 2 내지 50 중량%의 제 3 형 콜라겐; 2 내지 50 중량%의 제 4 형 콜라겐; 및/또는 40 중량% 미만의 엘라스틴을 포함한다. 보다 특정한 태양에서, 상기 공정은 화학적으로 변형되거나 프로테아제와 접촉하지 않은, 염기-처리되고 계면활성제 처리된 제 1 형 텔로펩티드 태반 콜라겐을 생성시키며, 이때 상기 조성물은 1 중량% 미만의 피브로넥틴; 1 중량% 미만의 라미닌; 74 내지 92 중량%의 제 1 형 콜라겐; 4 내지 6 중량%의 제 3 형 콜라겐; 2 내지 15 중량%의 제 4 형 콜라겐; 및/또는 12 중량% 미만의 엘라스틴을 포함한다.
특정 태양에서, 유동성 ECM을 포함하는 본원에 제공된 조성물은 또한 다른 성분들을 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 유동성 ECM을 포함하는 본원에 제공된 조성물은 또한 하나 이상의 세포 유형, 예를 들면, 상기 단락 1.1에서 상술한 세포 유형들 중 1종 이상을 포함한다. 또는, 상기 세포는 상기 ECM의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 본원에 기술된 방법에 따라서 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다.
특정 태양에서, 유동성 ECM을 포함하는 본원에 제공된 조성물은 또한 하이드로겔(예를 들면, 열민감성 하이드로겔 및/또는 광민감성 하이드로겔)을 포함한다. 또는, 하이드로겔은 상기 ECM의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 본원에 기술된 방법에 따라서 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다.
특정 태양에서, 유동성 ECM을 포함하는 본원에 제공된 조성물은 하나 이상의 세포 유형, 예를 들면, 상기 단락 1.1에서 상술한 세포 유형중 하나 이상, 및 하이드로겔을 추가로 포함한다. 특정 태양에서, 유동성 ECM 및 하이드로겔(예를 들면, 열민감성 하이드로겔 및/또는 광민감성 하이드로겔)을 포함하는 본원에 제공된 조성물은, ECM:하이드로겔의 비가 중량 기준으로 약 10:1 내지 약 1:10의 범위가 되도록 배합된다.
대표적인 하이드로겔은 공유성, 이온성 또는 수소 결합에 의해 가교결합되어 물분자를 포획하여 겔을 형성하는 3-차원 개방-격자 구조를 생성할 수 있는 유기 중합체(천연 또는 합성)를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 적합한 하이드로겔은 자가-조립 펩티드, 예를 들면, RAD16을 포함한다. 하이드로겔-형성 물질로는 폴리사카라이드, 예를 들면, 알기네이트 및 이의 염, 펩티드, 폴리포스파진, 및 이온성으로 가교결합되는 폴리아크릴레이트, 또는 블록 중합체, 예를 들면, 온도 또는 pH 각각에 의해 가교결합되는 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체가 포함된다.
특정 태양에서, 유동성 ECM을 포함하는 본원에 제공된 조성물은 또한 합성 중합체를 포함한다. 특정 태양에서, 합성 중합체는 폴리아크릴아미드, 폴리비닐리딘 클로라이드, 폴리(o-카복시페녹시)-p-자일렌)(폴리(o-CPX)), 폴리(락티드-무수물)(PLAA), n-이소프로필 아크릴아미드, 펜트 에리트리톨 다이아크릴레이트, 폴리메틸 아크릴레이트, 카복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)을 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 합성 중합체는 열가소성, 예를 들면, 폴리카프로락톤(PCL), 폴리락트산, 폴리부틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌, 폴리에스터, 폴리비닐 아세테이트, 및/또는 폴리비닐 클로라이드를 포함한다. 또는, 하나 이상의 합성 중합체는 상기 ECM의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 본원에 기술된 방법에 따라 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다. 특정 태양에서, 합성 중합체는 PCL이다.
특정 태양에서, 유동성 ECM을 포함하는 본원에 제공된 조성물은 피브로넥틴과 상호작용하는 것으로 알려진 인간 단백질인 테나신 C, 또는 이의 단편을 포함한다. 또는, 테나신 C는 상기 ECM의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 본원에 기술된 방법에 따라 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다.
특정 태양에서, 유동성 ECM을 포함하는 본원에 제공된 조성물은 또한 티타늄-알루미늄-바나듐(Ti6Al4V)을 포함한다. 또는, Ti6Al4V는 상기 ECM의 침착과 동시에, 그 전에 또는 그 후에 본원에 기술된 방법에 따라 별개 조성물의 일부로서 침착될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물 중 ECM 및/또는 조성물의 추가 성분, 예를 들면, 합성 중합체는 유도체화 될 수 있다. ECM 및 합성 중합체의 유도체화 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 제한없이, 세포 부착 펩티드(예를 들면, 하나 이상의 RGD 모티프를 포함하는 펩티드)를 이용한 유도체화, 세포 부착 단백질을 이용한 유도체화, 사이토카인(예를 들면, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 또는 골형성 단백질(BMP))을 이용한 유도체화, 및 글리코스아미노글리칸을 이용한 유도체화가 포함된다.
1.3.1 유동성 ECM의 생성 방법
본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기술된 방법을 이용하여 유동성으로 될 수 있다.
한 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은, ECM을 산 또는 염기, 예를 들면, 상기 ECM을 가용화시키기에 충분한 양의 상기 산 또는 염기를 포함하는 산성 또는 염기성 용액과 접촉시킴으로써 유동성이 된다. 일단 ECM이 유동성이 되었으면, 필요한 경우, ECM 함유 조성물은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 중성이 되게 하거나 목적하는 pH로 만들 수 있다.
또 다른 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은 효소, 또는 효소들, 예를 들어, 트립신, 키모트립신, 펩신, 파파인 및/또는 엘라스타제와 같은 프로테아제의 혼합물과 접촉시킴으로써 유동성이 된다. 일단 ECM이 유동성이 되었으면, 필요한 경우, 효소는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 불활성화시킬 수 있다.
또 다른 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은 물리적 접근방법을 이용하여 유동성으로 만든다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은, ECM을 밀링시킴으로써, 즉 내부 결합력을 약화시키도록 ECM을 분쇄함으로써 유동성이 된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은, ECM을, 예를 들어, 블렌더 또는 다른 도구로 전단시킴으로써 유동성이 된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은 ECM을 절단함으로써 유동성이 된다. 특정 태양에서, ECM이 물리적 접근방법을 이용하여 더 유동성이 되는 경우, ECM은 냉동 상태에서 조작될 수 있다(예를 들면, ECM은 동결-건조되거나 액체 질소 중에서 냉동된다).
1.3.2 ECM의 가교결합 방법
본원에 기술된 방법에 따라 사용되는 ECM은 당해 분야에 공지되어 있고 본원에 기술된 방법을 이용하여 가교결합될 수 있다.
특정 태양에서, ECM은 표면에 적용되기 전에 가교결합되고, 즉, ECM은 프린팅 전에 가교결합될 수 있다. 상기 태양에 따라서, 가교결합제가 ECM을 포함하는 조성물에 포함될 수 있으며, 필요한 경우, ECM 및 가교결합제를 포함하는 조성물은 ECM의 프린팅 전에 ECM의 가교결합을 야기하는 조건하에서 처리될 수 있다.
다른 태양에서, ECM은 표면에 적용된 후에 가교결합되고, 즉, ECM은 프린팅 후에 가교결합될 수 있다. 한 태양에서, ECM은, 먼저 ECM을 표면 위에 프린팅한 후, 상기 표면에 가교결합제를 프린팅함으로써(즉, ECM 및 가교결합제는 별개의 조성물로서 프린팅된다) 상기 표면에 적용된 후에 가교결합된다. 상기 태양에 따라서, 필요한 경우, ECM은 이어서, ECM의 가교결합을 야기하는 조건하에서 ECM 및 가교결합제를 처리함으로써 가교결합될 수 있다.
또 다른 태양에서, ECM은, ECM 및 가교결합제 둘 다를 포함하는 조성물을 표면 위에 프린팅하고, 상기 프린팅 후에 ECM 및 가교결합제를 ECM의 가교결합을 야기하는 조건하에서 처리함으로써, 표면에 적용된 후에 가교결합된다.
특정 태양에서, ECM은, ECM 성분인 히알루론산의 화학적 가교결합에 의해 가교결합된다. 히알루론산을 화학적으로 가교결합시키는 대표적인 방법으로는, 제한하지 않고, 다이비닐설폰 가교결합, 비스-에폭시드 가교결합, 벤질 에스터 가교결합, 부탄디올 다이글리시딜 에터(BDDE) 가교결합, 티올 변형을 통한 다이설파이드 가교결합, HA의 할로아세테이트 변형, HA의 다이하이드라지드 변형, HA의 티라민 변형, 및 휘스겐(Huisgen) 부가환화(즉, "클릭 화학(Click Chemistry)")의 이용이 포함된다. 상기 방법들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌 [Burdick and Prestwich, 2011, Adv. Mater. 23:H41-H56]에 더 기술되어 있다.
또 다른 특정 태양에서, ECM은 ECM 단백질의 화학적 가교결합에 의해 가교결합된다. ECM 단백질을 가교결합시킬 수 있는 대표적인 화학물질로는, 제한하지 않고, 글루타르알데하이드, 헥사메틸렌 다이이소시아네이트(HDMI), 제니핀, 카보디이미드, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조일 퍼옥사이드, 바이오글루(BioGlue)(글루타르알데하이드계 가교결합제; 크리오라이프 인코포레이티드(Cryolife Inc.)), 폴리포스포에스터 및 가수분해성 폴리로탁산이 포함된다.
또 다른 특정 태양에서, ECM은, 예를 들면, 메타크릴산 무수물 및/또는 글리시딜 메타크릴레이트를 사용하여 히알루론산을 광중합시킴으로써 가교결합된다(예를 들면, 문헌 [Burdick and Prestwich, 2011, Adv. Mater. 23:H41-H56] 참조).
또 다른 특정 태양에서, ECM은 효소를 사용하여 가교결합된다. ECM의 가교결합에 적합한 효소로는, 제한하지 않고, 라이실 옥시다제(예를 들면, 문헌 [Levental et al., 2009, Cell 139:891-906] 참조) 및 조직형 트랜스글루타미나제(예를 들면, 문헌 [Griffin et al., 2002, J. Biochem. 368:377-96] 참조)가 포함된다.
당해 분야에 기술을 가진 자라면 가교결합제가 바이오프린팅된 제품의 의도한 용도를 기준으로 선택되어야 함을 인지할 것이다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법이 대상에게 투여될 조직 또는 기관을 생성하기 위해 사용되는 경우, 생체적합성인, 즉, 상기 대상에게 해롭지 않을 가교결합제를 선택하고 사용하도록 주의해야 한다. 또는, 본원에 기술된 방법이 대상에게 투여되지 않을 조직 또는 기관, 예를 들면, 진단 분석에 사용될 조직 또는 기관을 생성하기 위해 사용되는 경우, 상기 방법의 전문가는 가교결합제의 선택에 주의하지 않아도 될 수 있다.
1.4 표면
임의의 적합한 표면이, 본원에 기술된 방법에 따라서 생성되는 조직 및 기관을 제공하기 위해 그 위에 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분이 침착(예를 들면, 프린팅)될 수 있는 표면으로 사용될 수 있다. 상기 표면은 2-차원(예를 들면, 편평한 평면상 표면)일 수 있거나, 3-차원일 수 있다.
한 태양에서, 그 위에 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분이 침착되는 표면은 인공 표면, 즉 인공적으로 제조된 표면을 포함한다. 특정 태양에서, 상기 인공 표면은 인공기관이다. 특정 태양에서, 상기 인공 표면은 대상, 예를 들면, 인간 대상에서의 투여 및/또는 이식에 대한 이의 적합성을 기준으로 선택된다. 예를 들면, 인공 표면 위에 침착될 조직 또는 기관이 대상에서 이식될 의도하에 제조된 경우, 면역원성이 아닌 것으로 알려진 인공 표면(즉, 숙주 면역 반응을 유도하지 않는 표면)이 사용하기 위해 선택될 수 있다. 특정 태양에서, 인공 표면은 대상, 예를 들면, 인간 대상에서의 투여 및/또는 이식에 적합하게 되도록 처리될 수 있다.
한 태양에서, 그 위에 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분이 침착되는 표면은 플라스틱 표면을 포함한다. 그 위에 상기 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 플라스틱 표면의 대표적인 유형으로는, 제한하지 않고, 폴리에스터, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리아미드, 폴리카보네이트 및 폴리우레탄이 포함된다.
한 태양에서, 그 위에 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분이 침착되는 표면은 금속 표면을 포함한다. 그 위에 상기 세포, ECM 및/또는 추가 성분이 침착될 수 있는 금속 표면의 대표적인 유형으로는, 제한하지 않고, 알루미늄, 크로뮴, 코발트, 구리, 금, 철, 납, 마그네슘, 망간, 수은, 니켈, 백금, 은, 주석, 티타늄, 텅스텐 및 아연이 포함된다.
특정 태양에서, 그 위에 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분이 침착되는 인공 표면은 특별한 형태를 형성하도록 조작된다. 예를 들면, 인공 표면은 뼈(예를 들면, 귀의 뼈)의 형태이도록 조작될 수 있으며, 대상에서 이식에 적합한 뼈를 생성하기 위해 적절한 세포(예를 들면, 골세포, 조골세포, 파골세포 및 다른 뼈-관련 세포), 유동성 ECM, 및/또는 임의의 추가 성분이 상기 표면 위에 및/또는 상기 표면 내에 침착될 수 있다.
또 다른 태양에서, 상기 표면은 대상(예를 들면, 인간 대상)의 조직 또는 기관, 또는 대상의 세포로부터 유도된 조직 또는 기관을 포함한다. 특정 태양에서, 대상으로부터의 상기 조직 또는 기관의 표면은 세포제거될 수 있고, 예를 들면, 조직 또는 기관의 표면의 전부 또는 일부로부터 세포를 제거하도록 처리될 수 있다. 특정 태양에서, 그로부터 표면 조직 또는 표면 기관이 수득되는 대상은 본원에 기술된 방법에 따라 생성될 조직 또는 기관의 의도된 수용자인 대상이다. 또 다른 특정 태양에서, 그로부터 표면 조직 또는 표면 기관이 수득되는 대상은 본원에 기술된 방법에 따라 생성될 조직 또는 기관의 의도된 수용자인 대상이 아니다(예를 들면, 그 위에 프린팅될 표면 조직 또는 표면 기관을 제공하는 대상은 공여자 또는 시신 대상이다).
본원에 기술된 방법에 따라서, 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분은 대상으로부터의 임의의 적합한 조직 또는 기관 위에 침착(예를 들면, 프린팅)될 수 있다. 특정 태양에서, 프린팅 표면을 제공하는 조직은 결합 조직(뼈 포함), 근육 조직(내장근(평활근) 조직, 골격근 조직 및 심근 조직 포함), 신경 조직(중추신경계 조직(예, 뇌조직 또는 척수조직) 또는 말초 신경계 조직(예, 뇌신경 및 척수 신경) 포함) 또는 상피 조직(내피 포함)이다. 또 다른 특정 태양에서, 프린팅 표면을 제공하는 기관은 소화기계, 순환계, 내분비계, 배설계, 면역계, 외피계, 근육계, 신경계, 생식계, 호흡기계 및/또는 골격계를 포함하여, 임의의 공지되어 있는 포유동물 기관계로부터 수득된다. 또 다른 특정 태양에서, 프린팅 표면을 제공하는 기관은 폐, 간, 심장, 뇌, 신장, 피부, 뼈, 위, 췌장, 방광, 담낭, 소장, 대장, 전립선, 고환, 난소, 척수, 인두, 후두, 기관, 기관지, 횡격막, 수뇨관, 요도, 식도, 결장, 흉선 및 비장의 전부 또는 일부이다. 또 다른 특정 태양에서, 프린팅 표면을 제공하는 기관은 췌장 또는 이의 일부이다.
특정 태양에서, 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분은, 뼈를 포함하거나 뼈로 이루어진 표면 위에 침착(예를 들면, 프린팅)된다. 그 위에 프린팅될 수 있는 대표적인 뼈로는 장골, 단골, 편평골, 불규칙골 및 종자골이 포함된다. 그 위에 프린팅될 수 있는 특정한 뼈로는, 제한하지 않고, 뇌두개골, 안면골, 귀 뼈, 지골뼈, 팔뼈, 다리뼈, 늑골, 손 및 손가락 뼈, 발 및 발가락 뼈, 복사뼈, 손목뼈, 흉추(예를 들면, 흉골) 등이 포함된다.
특정 태양에서, 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분의 침착(예를 들면, 바이오프린팅 또는 다른 방법에 의한 침착)을 위한 스캐폴드로 작용하는, 본원에 기술된 표면은 바이오프린팅되지 않았던 표면이다. 특정 태양에서, 세포, 유동성 ECM 및/또는 임의의 추가 성분의 침착(예를 들면, 바이오프린팅 또는 다른 방법에 의한 침착)을 위한 스캐폴드로 작용하는, 본원에 기술된 표면은 바이오프린팅된, 예를 들면, 본원에 기술된 방법에 따라 바이오프린팅된 표면이다. 특정 태양에서, 바이오프린팅된 표면은 합성 물질을 포함한다. 특정 태양에서, 합성 물질은 PCL이다.
2 조성물
본원에는, 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 조성물이 제공된다. 한 태양에서, 본원에는, 본원에 기술된 방법에 따라 사용하기에 적합한 세포(예를 들면, 상기 단락 1.1에서 기술한 세포)를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 태양에서, 본원에는, 본원에 기술된 방법에 따라 사용하기에 적합한 유동성 ECM(예를 들면, 상기 단락 1.3에서 기술한 유동성 ECM)을 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 사용하기에 적합한 하나 이상의 가교결합제(예를 들면, 상기 단락 1.3.2에서 기술한 가교결합제)를 포함하는 조성물이 제공된다.
한 태양에서, 본원에는 세포(예를 들면, 상기 단락 1.1에서 기술한 세포) 및 유동성 ECM(예를 들면, 상기 단락 1.3에서 기술한 유동성 ECM)을 포함하는 조성물이 제공된다. 특정 태양에서, 상기 세포는 줄기 세포, 예를 들면, 골수-유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC), 조직 플라스틱-부착성 태반 줄기 세포(PDAC) 및/또는 양막 유래 부착성 세포(AMDAC)를 포함한다. 또 다른 특정 태양에서, 유동성 ECM은 태반(예를 들면, 인간 태반)으로부터 유도된다.
또 다른 태양에서, 본원에는 유동성 ECM(예를 들면, 상기 단락 1.3에서 기술한 유동성 ECM) 및 하나 이상의 가교결합제(예를 들면, 상기 단락 1.3.2에서 기술한 가교결합제)를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 태양에서, 본원에는 세포(예를 들면, 상기 단락 1.1에서 기술한 세포) 및 하나 이상의 가교결합제(예를 들면, 상기 단락 1.3.2에서 기술한 가교결합제)를 포함하는 조성물이 제공된다.
또 다른 태양에서, 본원에는 세포(예를 들면, 상기 단락 1.1에서 기술한 세포), 유동성 ECM(예를 들면, 상기 단락 1.3에서 기술한 유동성 ECM) 및 하나 이상의 가교결합제(예를 들면, 상기 단락 1.3.2에서 기술한 가교결합제)를 포함하는 조성물이 제공된다.
특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포 및 유동성 ECM을 포함하며, 이때 상기 줄기 세포는 PDAC이고, 상기 유동성 ECM은 태반으로부터 유도된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포 및 가교결합제를 포함하고, 이때 상기 줄기 세포는 PDAC이다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포, 유동성 ECM 및 가교결합제를 포함하고, 이때 상기 줄기 세포는 PDAC이고 상기 유동성 ECM은 태반으로부터 유도된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포 및 유동성 ECM을 포함하고, 이때 상기 줄기 세포는 AMDAC이고 상기 유동성 ECM은 태반으로부터 유도된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포 및 가교결합제를 포함하고, 이때 상기 줄기 세포는 AMDAC이다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포, 유동성 ECM 및 가교결합제를 포함하고, 이때 상기 줄기 세포는 AMDAC이고 상기 유동성 ECM은 태반으로부터 유도된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포 및 유동성 ECM을 포함하며, 이때 상기 줄기 세포는 BM-MSC이고 상기 유동성 ECM은 태반으로부터 유도된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포 및 가교결합제를 포함하며, 이때 상기 줄기 세포는 BM-MSC이다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 줄기 세포, 유동성 ECM 및 가교결합제를 포함하며, 이때 상기 줄기 세포는 BM-MSC이고 상기 유동성 ECM은 태반으로부터 유도된다.
본원에 제공된 조성물은, 세포(예를 들면, 상기 단락 1.1에서 기술한 세포) 및/또는 유동성 ECM(예를 들면, 상기 단락 1.3에서 기술한 유동성 ECM) 및/또는 하나 이상의 가교결합제(예를 들면, 상기 단락 1.3.2에서 기술한 가교결합제)를 포함하는 것 이외에, 추가로 다른 성분들을 포함할 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 추가로 하이드로겔(예를 들면, 열민감성 하이드로겔 및/또는 광민감성 하이드로겔)을 포함한다. 또는, 하이드로겔은 본원에 제공된 세포 및 ECM 포함 조성물과 별개의 조성물 중에 배합될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 추가로 합성 중합체, 예를 들면, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐리딘 클로라이드, 폴리(o-카복시페녹시)-p-자일렌)(폴리(o-CPX)), 폴리(락티드-무수물)(PLAA), n-이소프로필 아크릴아미드, 펜트 에리트리톨 다이아크릴레이트, 폴리메틸 아크릴레이트, 카복시메틸셀룰로스, 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 및/또는 열가소성 중합체(예를 들면, 폴리카프로락톤, 폴리락트산, 폴리부틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌, 폴리에스터, 폴리비닐 아세테이트, 및/또는 폴리비닐 클로라이드)를 포함한다. 또는, 합성 중합체는 본원에 제공된 세포 및 ECM 포함 조성물과 별개의 조성물 중에 배합될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 테나신 C 또는 이의 단편을 포함한다. 또는, 테나신 C 또는 이의 단편은 본원에 제공된 세포 및 ECM 포함 조성물과 별개의 조성물 중에 배합될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 티타늄-알루미늄-바나듐(Ti6Al4V)을 포함한다. 또는, Ti6Al4V는 본원에 제공된 세포 및 ECM 포함 조성물과 별개의 조성물 중에 배합될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 약물(예를 들면, 소분자 약물)을 포함한다. 또는, 약물은 본원에 제공된 세포 및 ECM 포함 조성물과 별개 조성물 중에 배합될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 항체(예를 들면, 치료 항체)를 포함한다. 또는, 항체는 본원에 제공된 세포 및 ECM 포함 조성물과 별개 조성물 중에 배합될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 제공된 조성물은 또한, 조성물에 사용되는 세포(들)의 생존, 분화, 증식 등을 촉진하는 하나 이상의 추가 성분을 포함한다. 상기 성분들로는, 제한하지 않고, 영양소, 염, 당, 생존 인자 및 성장 인자가 포함될 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있는 대표적인 성장 인자로는, 제한하지 않고, 인슐린-유사 성장 인자(예를 들면, IGF-1), 형질전환 성장 인자-베타(TGF-베타), 골형성 단백질, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 기저 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자(FGF)(1, 2 및 3번), 오스테오폰틴, 골형성 단백질-2, 성장 호르몬, 예를 들면, 소마토트로핀, 세포 유인물질 및 부착 물질 등, 및 이의 혼합물이 포함된다. 또는, 세포(들)의 생존, 분화, 증식 등을 촉진하는 하나 이상의 추가 성분은 본원에 제공된 세포 및 ECM 포함 조성물과 별개의 조성물 중에 배합될 수 있다.
3 용도
본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및 기관은 임의의 적합한 목적에 사용될 수 있다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및 기관은 치료 목적으로 사용되고, 예를 들면, 상기 조직 및/또는 기관은 이식체에 사용된다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 기관은, 예를 들면, 상기 조직 또는 기관에 대한 하나 이상의 화합물 및/또는 수술적 절차의 영향을 평가하기 위한 실험 목적에 사용된다.
3.1 치료 용도
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 이식을 필요로 하는 대상에게 이식된다. 개인에서 이식될 수 있는 대표적인 조직 및 기관은 단락 1.2에 기술되어 있다. 이식(grafting)(예, 피부 이식) 및 수술적 이식 절차를 포함한 이식 방법은 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지되어 있다.
특정 태양에서, 그로부터 이식 조직 및/또는 기관이 유도되는 세포 및/또는 ECM은 이식 수혜자로부터 수득된다. 다른 태양에서, 그로부터 이식 조직 및/또는 기관이 유도되는 세포 및/또는 ECM은 이식 수혜자로부터 수득되지 않고, 또 다른 대상, 예를 들면, 공여자, 시신 등으로부터 수득된다.
특정 태양에서, 그로부터 이식 조직 및/또는 기관이 유도되는 세포는 이식 수혜자로부터 수득되고, 그로부터 이식 조직 및/또는 기관이 유도되는 ECM은 이식 수혜자로부터 수득되지 않고 또 다른 공급원으로부터 수득된다. 특정 태양에서, 그로부터 이식 조직 및/또는 기관이 유도되는 ECM은 태반(예를 들면, 인간 태반)으로부터 유도된다.
특정 태양에서, 그로부터 이식 조직 및/또는 기관이 유도되는 ECM은 이식 수혜자로부터 수득되고, 그로부터 이식 조직 및/또는 기관이 유도되는 세포는 이식 수혜자로부터 수득되지 않고 또 다른 공급원으로부터 수득된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 이식에 적합한 피부를 생성하기 위해 사용되며, 상기 피부는 상기 이식을 필요로 하는 대상(예를 들면, 화상 피해자)에서 이식(즉, 그라프팅)된다. 특정 태양에서, 상기 대상은 인간이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 이식에 적합한 뼈를 생성하기 위해 사용되며, 상기 뼈는 이식을 필요로 하는 대상(예를 들면, 골다공증 또는 뼈암을 앓고 있는 누군가)에서 이식(예를 들면, 외과적으로 이식)된다. 특정 태양에서, 상기 대상은 인간이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 이식에 적합한 간 또는 이의 일부를 생성하기 위해 사용되며, 상기 간 또는 이의 일부는 이식을 필요로 하는 대상(예를 들면, 간 경변, 간염 또는 간암을 앓고 있는 누군가)에서 이식(예를 들면, 외과적으로 이식)된다. 특정 태양에서, 상기 대상은 인간이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 이식에 적합한 폐 또는 이의 일부를 생성하기 위해 사용되며, 상기 폐 또는 이의 일부는 이식을 필요로 하는 대상(예를 들면, 폐암을 앓고 있는 누군가)에서 이식(예를 들면, 외과적으로 이식)된다. 특정 태양에서, 상기 대상은 인간이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 이식에 적합한 신경 조직(예를 들면, 뇌 조직 또는 척수 조직)을 생성하기 위해 사용되며, 상기 신경 조직은 이식을 필요로 하는 대상에서 이식(예를 들면, 외과적으로 이식)된다. 특정 태양에서, 상기 대상은 신경 질환(즉, 중추 또는 말초 신경계의 질환)으로 진단되었다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 대상은 대상의 중추 또는 말초 신경계를 손상시킨 외상을 앓아왔고, 예를 들면, 상기 대상은 외상성 뇌손상(TBI) 또는 척수 손상(SCI)을 앓아왔다. 또 다른 특정 태양에서, 상기 대상은 인간이다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법은 이식에 적합한 순환계 조직(예를 들면, 심장 조직, 동맥 또는 정맥)을 생성하기 위해 사용되며, 상기 순환계 조직은 이식을 필요로 하는 대상에서 이식(예를 들면, 외과적으로 이식)된다. 특정 태양에서, 상기 대상은 인간이다.
3.1.1 환자 집단
본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 다양한 환자 집단에게 이익을 주기 위해 사용될 수 있다. 한 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및 기관은 조직 및/또는 기관 이식을 필요로 하는 대상에서 사용된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직(들) 및/또는 기관(들)은 암으로 진단된 대상에서, 즉, 암에 걸린 상기 대상의 기관/조직 중 하나 이상의 전부 또는 일부를 대신하기 위해 이식된다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직(들) 및/또는 기관(들)은 뼈 또는 결합 조직 육종, 뇌암, 유방암, 난소암, 신장암, 췌장암, 식도암, 위암, 간암, 폐암(예를 들면, 소세포 폐암(SCLC), 비-소세포 폐암(NSCLC), 인후암 및 중피종), 및/또는 전립선암으로 진단된 대상에서 이식된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 폐 조직(들) 및/또는 기관(들)은 호흡기 질환으로 진단된 대상, 예를 들면, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 폐기종, 폐렴, 결핵, 폐암 및/또는 낭포성 섬유증으로 진단된 대상에서 이식된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 간 조직(들) 및/또는 기관(들)은 간 질환으로 진단된 대상, 예를 들면, 간염(예, A, B 또는 C형 간염), 간암, 혈색소증 또는 간경변으로 진단된 대상에서 이식된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 뼈 조직(들) 및/또는 기관(들)은 골질환으로 진단된 대상, 예를 들면, 뼈암(예, 골육종), 골괴사증, 대사성 골질환, 진행성 골화성 섬유이형성증 또는 골다공증으로 진단된 대상에서 이식된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 신경 조직(들) 및/또는 기관(들)은 신경 질환(즉, 중추 또는 말초 신경계의 질환)으로 진단된 대상, 예를 들면, 뇌암, 뇌염, 뇌수막염, 알츠하이머(Alzheimer)병, 파킨슨(Parkinson)병, 뇌졸중 또는 다발성 경화증으로 진단된 대상에서 이식된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 표피(예를 들면, 피부) 조직(들)은 피부 질환(즉, 피부에 발생하는 질환)으로 진단된 대상, 예를 들면, 피부암, 습진, 여드름, 건선, 대상포진, 각화증으로 진단된 대상에서 이식되거나; 상기 대상은 흉터를 갖는다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 신경 조직(들) 및/또는 기관(들)은 대상의 중추 또는 말초 신경계를 손상시킨 외상을 입은 대상, 예를 들면, 외상성 뇌손상(TBI) 또는 척수 손상(SCI)을 앓아온 대상에서 이식된다.
또 다른 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 순환계 조직(들) 및/또는 기관(들)은 순환계 질환으로 진단된 대상, 예를 들면, 관상동맥 심장 질환, 심근증(예를 들면, 내인성 또는 외인성 심근증), 심장마비, 뇌졸중, 염증성 심장 질환, 고혈압성 심장 질환 또는 심장 판막 질환으로 진단된 대상에서 이식된다.
일부 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 조직 또는 기관이 이식되는 대상은 동물이다. 특정 태양에서, 상기 동물은 새이다. 특정 태양에서, 상기 동물은 개이다. 특정 태양에서, 상기 동물은 고양이이다. 특정 태양에서, 상기 동물은 말이다. 특정 태양에서, 상기 동물은 소이다. 특정 태양에서, 상기 동물은 포유동물, 예를 들면, 말, 돼지, 마우스 또는 영장류, 바람직하게는 인간이다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 조직 또는 기관이 이식되는 대상은 인간이다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 조직 또는 기관이 이식되는 대상은 성인 인간이다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 조직 또는 기관이 이식되는 대상은 유아이다. 특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 조직 또는 기관이 이식되는 대상은 아동이다.
3.2 실험적 용도
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 실험 목적에 사용된다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 상기 조직 및/또는 기관에 대한 약물의 영향을 검사하기 위해 사용된다. 상기 방법에 따르면, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 해당 약물(예를 들면, 평가될 약물) 및 대조군(예를 들면, 약물을 포함하지 않는 조성물)에 노출될 수 있으며, 조직 또는 기관에 대한 약물의 영향은 당해 분야에 기술을 가진 자에게 공지된 방법을 이용하여(예를 들면, 대조군과 비교한 약물의 독성; 대조군과 비교한 특정 결과를 야기하는 약물의 효능 등을 평가함으로써) 평가될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 비-인간 동물에서 이식될 수 있으며, 비-인간 동물에서 상기 조직 또는 기관에 대한 약물의 영향은, 상기 이식을 받은 제 1 비-인간 동물에게 약물을 투여하고 상기 이식을 받은 제 2 비-인간 동물에게 대조군(예를 들면, 약물을 포함하지 않는 조성물)을 투여하고, 결과를 비교함으로써 평가될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 비-인간 동물에서 이식될 수 있으며, 비-인간 동물에서 상기 조직 또는 기관에 대한 수술 절차의 영향은, 상기 이식을 받은 제 1 비-인간 동물의 이식된 조직/기관에 수술 절차를 수행하고, 상기 이식을 받은 제 2의 비-인간 동물에게 수술 절차를 수행하지 않고, 결과를 비교함으로써 평가될 수 있다.
특정 태양에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 체외 목적에 사용된다. 예를 들면, 본원에 기술된 방법에 따라 생성되는 조직 및/또는 기관은 대상의 신체 외부에 위치되지만, 대상이 이익을 얻는 기능을 수행하고, 예를 들면, 조직 또는 기관은 대상의 신체 내부에 위치되는 조직 또는 기관에 의해 정상적으로 수행되는 기능을 수행한다.
4 키트
본원에는 본원에 기술된 조성물의 하나 이상의 성분들로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학 팩 또는 키트가 제공된다. 선택적으로, 상기 용기(들)에는 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 고지가 첨부될 수 있으며, 상기 고지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 상기 기관에 의한 승인을 나타낸다.
특정 태양에서, 본원에 제공된 키트는 본원에 기술된 세포 및 본원에 기술된 유동성 ECM을 포함하는 조성물을 포함한다. 상기 키트는 선택적으로 하나 이상의 추가 성분(예를 들면, 가교결합제)을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 또 다른 특정 태양에서, 본원에 제공된 키트는 본원에 기술된 세포, 본원에 기술된 유동성 ECM 및 본원에 기술된 하나 이상의 가교결합제를 포함하는 조성물을 포함한다. 본원에 포함된 키트는 본원에 기술된 방법에 따라 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 바이오프린팅된 스캐폴드는 태반 줄기 세포의 부착 및 성장을 증진시킨다
본 실시예는 제어된 섬유 직경 및 기공 크기를 갖는 스캐폴드를 생성하기 위해 합성 물질이 바이오프린팅될 수 있으며 상기 스캐폴드가 세포외 기질(ECM)을 적용하기에 적합한 기재를 제공함을 입증한다. 본 실시예는 또한 바이오프린팅된 합성 물질 및 ECM을 포함하는 스캐폴드(하이브리드 스캐폴드)가 태반 세포, 예를 들면, 태반 줄기 세포를 포함한 세포의 부착 및 성장에 적합한 기재를 나타냄을 입증한다.
방법
합성 물질 및 ECM을 포함하는 하이브리드 스캐폴드를 제작하기 위해, 폴리카프로락톤(PCL)(Mn 45,000, 시그마(Sigma))을 먼저 바이오프린터(엔비젼텍, 독일 글라트베크)를 사용하여 스캐폴드(54 x 54 x 0.64 mm)에 프린팅하였다. 프린팅 조건은 다음과 같았다: 적절한 크기의 바늘을 사용하여, 온도 90 ℃, 프린팅 압력 3 내지 5.5 바, 프린팅 속도 2 내지 6 mm/s. ECM은 이전에 기술된 바와 같이 인간 태반으로부터 분리하였다(예를 들면, [Bhatia MB, Wounds 20, 29, 2008] 참조). PCL 및 ECM을 포함하는 하이브리드 스캐폴드를 생성하기 위해, 단리된 ECM을 바이오프린팅된 PCL 스캐폴드의 양쪽 측면에 적용하고 건조(탈수)시켰다. 생성된 하이브리드 PCL-ECM 스캐폴드를 10 mm 직경의 디스크로 펀칭하고, 밤새 배지로 미리습윤시키고, 본원에 기술된 방법(예를 들면, 단락 1.1 참조)에 따라 제조된 태반 줄기 세포로 12,500개 세포/cm2로 접종하였다. 세포를 8 일의 기간동안 배양하였다. 칼세인 염색 및 MTS 증식 분석을 상이한 시점에서(n=3) 표준 프로토콜에 따라 수행하여 세포 생존율 및 증식을 측정하였다.
결과
프린팅 조건을 최적화함으로써, 상이한 섬유 크기, 기공 크기 및 기공 구조를 갖는 PCL 스캐폴드가 생성되었다(도 1). 프린팅된 섬유는 PCL 및 ECM을 포함하는 하이브리드 스캐폴드의 생성을 위한 안정한 망상조직을 형성하였다. 또한, 다양한 섬유 크기 및 기공 구조의 프린팅은 다양한 성질을 갖는 하이브리드 스캐폴드를 제조하는 것을 가능하게 하였다.
바이오프린팅된 PCL 스캐폴드의 양쪽 측면상의 ECM의 탈수는 하이브리드 스캐폴드의 생성을 야기하였다. PCL과 ECM 사이에 우수한 통합이 보였으며; 재수화를 포함한 스캐폴드의 가공 또는 배양에 의해 하이브리드 스캐폴드를 조작했을 때 PCL과 ECM 사이에 분리가 나타나지 않았다(도 2).
태반 줄기 세포는 시간경과에 따라 하이브리드 스캐폴드의 표면 위로 퍼져나갔으며, 6 일의 배양에 의해 하이브리드 스캐폴드의 표면의 대부분을 덮었다. MTS 세포 증식 분석은 세포수가 시간경과에 따라 상당히 증가되었음을 입증하였다(도 3). 또한, 하이브리드 스캐폴드에 접종된 태반 줄기 세포는 칼세인 염색에 의해 나타나듯이, 8 일의 배양 기간동안 우수한 생존율을 나타내었다(도 4). 함께, 상기 데이터는 PCL-ECM 하이브리드 스캐폴드가 세포 부착, 생존 및 성장을 증진시킴을 시사한다.
결론
본 실시예는 ECM 및 합성 물질(PCL)을 포함하는 하이브리드 스캐폴드가 바이오프린팅을 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있으며, 세포가 상기 스캐폴드에 부착할 뿐 아니라 상기 스캐폴드 상에서 배양될 때 생존하고 증식됨을 입증한다.
실시예 2: 바이오프린팅된 스캐폴드는 태반 줄기 세포의 부착 및 성장을 증진시킨다
본 실시예는 합성 물질, 및 태반 세포, 예를 들면, 태반 줄기 세포와 같은 세포를 포함하는 ECM이 동시에 바이오프린팅되어 하이브리드 스캐폴드를 생성할 수 있음을 입증한다. 본 실시예에 의해 입증되듯이, 바이오프린팅된 세포는 바이오프린팅 공정에서 생존할 뿐 아니라, 하이브리드 스캐폴드를 사용한 배양시 시간경과에 따라 증식한다.
방법
ECM을 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하고, 100만개/ml 태반 줄기 세포를 함유하는 0.5% 알기네이트 하이드로겔과 혼합하였다. 다음으로, PCL 및 세포-함유 ECM을 층으로 바이오프린팅하여 PCL 및 ECM을 포함하는 하이브리드 스캐폴드를 생성하였다. 스캐폴드의 각 층에서, PCL이 먼저 프린팅되었고, 이어서 ECM/세포 성분이 프린팅되어 PCL 선들 사이의 간극을 채웠다. 2 또는 5개의 상기 층들을 프린팅하고 CaCl2 용액으로 가교결합시켜 하이브리드 스캐폴드를 생성하였다. 바이오프린팅된, 세포-함유 스캐폴드(세포/ECM/PCL)를 7 일동안 배양하고, 다양한 시점에서 칼세인 염색 및 MTS 세포 증식 분석에 의해 세포 증식 및 생존율을 평가하였다.
결과
바이오프린팅된 스캐폴드는 세포 배양 기간 내내 온전한 구조를 유지시켰다(도 5). PCL은 ECM 하이드로겔에 대해 우수한 구조적 지지를 제공하여, 3-차원 구조물의 생성을 가능하게 하였다. 바이오프린팅 후 및 배양 전체에 걸쳐, 세포는 3-차원 구조물 전체에 잘-분포되었으며; 세포들은 배양동안 스캐폴드의 깊이 전체에 걸쳐 발견되었다(도 6).
태반 줄기 세포는 바이오프린팅 과정에서 생존하였으며, 칼세인 염색에 의해 입증되듯이, 배양 전체에 걸쳐 3-차원 바이오프린팅된 하이브리드 스캐폴드에서 계속 증식하였다(도 7). 도 8에서 보이듯이, 세포의 대부분이 하이브리드 스캐폴드중의 ECM 전체에 확산된 것으로 나타나, ECM이 세포 부착 및 ECM 하이드로겔에서의 확산을 증진시켰음을 시사한다. 이것은 알기네이트만에서의 세포의 위치를 스캐폴드내에서의 세포의 위치와 비교함으로써 확인되었다. 또한, 도 9에서 보이듯이, MET 세포 증식 분석은 2-층 및 5-층 스캐폴드 둘 다에 대해 세포수의 증가를 나타내어, 상기 하이브리드 스캐폴드가 세포 성장을 증진시켰음을 시사하였다.
결론
본 실시예는 ECM 및 PCL의 동시 바이오프린팅을 포함하는 방법에 의해 ECM 및 합성 물질(PCL)을 포함하는 하이브리드 스캐폴드가 생성될 수 있음을 입증한다. 또한 본 실시예에 의해 세포가 하이브리드 스캐폴드의 성분들(ECM 및 PCL)과 함께 바이오프린팅될 수 있으며 세포가 바이오프린팅 과정에서 생존한다는 사실이 입증된다. 또한, 하이브리드 스캐폴드의 성분들과 함께 바이오프린팅된 세포는 상기 스캐폴드상에서 배양될 때 증식하며, 세포 기질(알기네이트) 단독 중에서 배양되었을 때보다 더 잘 스캐폴드 전체에 산재된다.
실시예 3: 기능성 바이오프린팅된 스캐폴드
본 실시예는 합성 물질, 및 세포를 포함하는 ECM이 바이오프린팅되어 기능성 스캐폴드를 생성할 수 있음을 입증한다.
인슐린-생성 세포주인 β-TC-6을 인간 태반 유래 세포외 기질(ECM)과 함께 바이오프린팅된 스캐폴드에 바이오프린팅하였다. 스캐폴드는 치수가 15 x 15 x 2.5 mm이었으며 5개 층을 함유하였다. 각 층에서, 폴리카프로락톤(PCL)을 먼저 프린팅한 후, PCL 선들 사이에 알기네이트-ECM 하이드로겔(1% 알기네이트 및 12% ECM)중에 1500만개 세포/ml로 혼합된 β-TC-6 세포를 프린팅하였다. 전체 스캐폴드를 1% 염화칼슘 용액에 20 분동안 침지시켜 가교결합시켰다. 이어서, 스캐폴드를 6웰 플레이트(웰당 3 내지 5 ml의 배지)에서 세포 배양 배양기에서 15% 송아지 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였다. 상이한 시점에서, 칼세인 염색 및 MTS 증식 분석을 위해 스캐폴드를 수거하여 세포 생존율 및 세포 증식을 각각 특성화하였다. 도 10은 바이오-프린팅된 스캐폴드의 구조를 나타낸다.
칼세인 염색은 β-TC-6 세포가 프린팅 과정에서 생존하였으며 배양동안 생존되어 유지되었음을 입증하였다. 스캐폴드의 횡단면도는 세포가 스캐폴드 전체에 고르게 분포되고 각 층에서 생존하여 유지되었음을 보여주었다(도 10 참조). MTS 분석에 의해 인슐린 생성 β-TC-6 세포가, 전체 생존 세포수가 일정하게 유지되면서, 3 주까지동안 생존하여 유지되었음이 확인되었다(도 11 참조).
β-TC-6 세포가 바이오프린팅된 스캐폴드에서 기능할 수 있는지를 측정하기 위해, 세포에 의한 인슐린 생성을 측정하였다. 인슐린 생성을 측정하기 위해, 바이오프린팅된 스캐폴드를 새로운 성장 배지(6-웰 플레이트에서 3 ml/웰)에 2 시간동안 노출시키고, 각 스캐폴드로부터의 상등액의 분취량을 마우스 인슐린 ELISA 키트(밀리포어(Millipore))를 사용하여 인슐린 농도에 대해 측정하였다. 생성된 인슐린의 최고 수준은 제 0 일에 검출되었다(도 12 참조). 분비된 인슐린 수준은 그후 배양(제 3 일 및 제 6 일)에서 감소되었지만, 배양중 제 3 일부터 제 6 일까지 안정하게 유지되었다(도 12 참조). 따라서, β-TC-6 세포는 바이오프린팅된 후에 인슐린을 생성하고 분비하는 능력을 유지하였다.
췌장에서 인슐린 생성 세포의 핵심 기능은 증가된 혈당 수준에 반응하여 인슐린을 생성하는 것이다. 따라서, 스캐폴드를 당 부하 검사에 노출시켜, PCL, ECM 및 β-TC-6 세포를 포함하는 바이오프린팅된 스캐폴드가 상기 기능을 유지하였는지 여부를 조사하였다(도 13). 1개의 스캐폴드(도 13의 "A")를 글루코스 결핍 조건(글루코스, 10% FCS를 함유하지 않는 IMDM 배지)에 2 일동안 노출시킨 후, 인슐린 생성 조건(50 mM 글루코스/1 mM IBMX)으로 시험하였다. 대조군으로, 바이오프린팅된 스캐폴드를 고정된 글루코스 수준을 갖는 정상 배양 배지에서 유지시켰다(도 13의 "B" 및 "C"). 대조군에서는, 인슐린 생성 조건에 의한 시험이 시험 스캐폴드(즉, 도 13의 A)에 대해 수행됨과 동시에 배지를 교환하였다. 각 배양(A, B 및 C)으로부터 수득된 상등액을 30 분마다 샘플링하고 각 상등액으로부터의 인슐린 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 도 13은 상이한 시점에서 각각의 배양으로부터의 인슐린 생성 수준을 보여주며, 글루코스 결핍 조건에 노출된 후 인슐린 생성 조건에 의해 시험된 바이오프린팅된 스캐폴드(즉, 도 13의 A)가 시험 0.5 시간 후에 이의 인슐린 생성 수준에 비해 시험 3 시간 후에 80배 더 많은 인슐린을 생성한 반면, 대조군(즉, 도 13의 B 및 C)은 훨씬 적은 인슐린(배지 교환 0.5 시간 후에 이의 인슐린 생성 수준에 비해 배지 교환 3 시간 후 단지 약 2배 더 많은 인슐린)을 생성하였음을 입증한다.
본 실시예는 합성 물질, 세포 및 ECM을 포함하는 바이오프린팅된 스캐폴드가 생성될 수 있으며 바이오프린팅된 스캐폴드의 세포는 생존가능하고 기능성으로 유지됨을 입증한다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 본원에 기술된 특정 태양들에 의해 범위에 제한받지 않는다. 사실상, 상기 설명 및 첨부한 도면들로부터, 기술된 것들 이외에 조성물 및 방법의 다양한 변형이 당해 분야에 기술을 가진 자에게 명백해질 것이다. 상기 변형은 첨부된 청구항들의 범위내에 속하는 것이다.
다양한 공개공보, 특허 및 특허출원이 본원에 인용되며, 이들은 전체로서 참고로 인용된다.

Claims (75)

  1. 세포를 포함하는 하나 이상의 세포 조성물 및 세포외 기질(ECM)을 표면 위에 침착시키는 것을 포함하는, 3-차원 조직 또는 기관을 형성하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    ECM이 유동성 ECM을 포함하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    세포 조성물 및 ECM이 표면 위에 프린팅되는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    침착이 잉크젯 프린팅에 의해 달성되는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면이 인공 표면인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면이 세포제거된 조직 또는 세포제거된 기관인 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ECM이 포유동물 ECM, 연체동물 ECM, 물고기 ECM 및/또는 식물 ECM을 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    포유동물 ECM이 태반 ECM인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    ECM이 텔로펩티드 태반 콜라겐을 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    텔로펩티드 태반 콜라겐이 염기-처리되고 계면활성제 처리된 제 1 형 텔로펩티드 태반 콜라겐을 포함하는 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    콜라겐이 화학적으로 변형되거나 프로테아제와 접촉되지 않은 방법.
  12. 제 8 항에 있어서,
    태반 ECM이, 화학적으로 변형되거나 프로테아제와 접촉되지 않은, 염기-처리되고/되거나 계면활성제 처리된 제 1 형 텔로펩티드 태반 콜라겐을 포함하고, 상기 ECM이 5 중량% 미만의 피브로넥틴 또는 5 중량% 미만의 라미닌; 25 내지 92 중량%의 제 1 형 콜라겐; 및 2 내지 50 중량%의 제 3 형 콜라겐 또는 2 내지 50 중량%의 제 4 형 콜라겐을 포함하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서,
    태반 ECM이, 화학적으로 변형되거나 프로테아제와 접촉되지 않은, 염기-처리되고 계면활성제 처리된 제 1 형 텔로펩티드 태반 콜라겐을 포함하고, 상기 ECM이 1 중량% 미만의 피브로넥틴 또는 1 중량% 미만의 라미닌; 74 내지 92 중량%의 제 1 형 콜라겐; 및 4 내지 6 중량%의 제 3 형 콜라겐 또는 2 내지 15 중량%의 제 4 형 콜라겐을 포함하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ECM이 침착 전에 유도체화되는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    ECM이 세포 부착 펩티드, 세포 부착 단백질, 사이토카인 또는 글리코스아미노글리칸 중 1종 이상으로 유도체화되는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 부착 펩티드, 세포 부착 단백질, 사이토카인 또는 글리코스아미노글리칸의 침착을 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    사이토카인이 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 또는 골형성 단백질(BMP)인 방법.
  18. 제 16 항에 있어서,
    세포 부착 펩티드가 하나 이상의 아르기닌-글리신-아스파트산(RGD) 모티프를 포함하는 펩티드인 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    합성 중합체의 침착을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    합성 중합체가 열민감성인 방법.
  21. 제 19 항에 있어서,
    합성 중합체가 광민감성인 방법.
  22. 제 19 항에 있어서,
    합성 중합체가 열가소체를 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서,
    합성 중합체가 폴리(L-락티드-코-글리콜리드)(PLGA)인 방법.
  24. 제 22 항에 있어서,
    열가소체가 폴리카프로락톤, 폴리락트산, 폴리부틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌, 폴리에스터, 폴리비닐 아세테이트 또는 폴리비닐 클로라이드인 방법.
  25. 제 19 항에 있어서,
    합성 중합체가 폴리아크릴아미드, 폴리비닐리딘 클로라이드, 폴리(o-카복시페녹시)-p-자일렌)(폴리(o-CPX)), 폴리(락티드-무수물)(PLAA), n-이소프로필 아크릴아미드, 펜트 에리트리톨 다이아크릴레이트, 폴리메틸 아크릴레이트, 카복시메틸셀룰로스 또는 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA)인 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    테나신 C 또는 이의 단편의 침착을 추가로 포함하는 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    티타늄-알루미늄-바나듐(Ti6Al4V) 조성물의 침착을 추가로 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    티타늄-알루미늄-바나듐 조성물이 섬유의 상호연결된 다공성 망상조직 형태로 침착되는 방법.
  29. 제 1 항에 있어서,
    조직 또는 기관이 세포 조성물의 하나 이상의 층 및 ECM의 하나 이상의 층을 포함하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서,
    조직 또는 기관의 적어도 일부분이 교대 층으로 프린팅된 세포 조성물의 하나 이상의 층 및 ECM의 하나 이상의 층을 포함하는 방법.
  31. 제 19 항에 있어서,
    조직 또는 기관을 생성할 때, 합성 중합체의 적어도 일부분이 실질적으로 서로 평행한 다수의 섬유의 형태로 프린팅되는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    다수의 섬유가 실질적으로 서로 평행하게 침착되고 서로 물리적으로 접촉하지 않도록 프린팅되는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    합성 중합체가 수회 침착되는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서,
    섬유가, 수회 침착될 때, 횟수중 2회 이상에서 상이한 배향으로 프린팅되는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서,
    섬유가, 수회 침착될 때, 횟수 각각에서 상이한 배향으로 침착되는 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직이 ECM의 2개 이상의 층을 포함하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서,
    기질의 2개 이상의 층의 적어도 일부분이 세포 조성물에 의해 서로 분리되는 방법.
  38. 제 3 항에 있어서,
    프린팅이 기질의 2개 층 사이에 접착제를 프린팅하는 것을 포함하는 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ECM 및 세포 조성물이 표면 위에 별개로 침착되는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ECM의 적어도 일부분이 세포 조성물을 프린팅하기 전에 표면 위에 침착되는 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 조성물 및 ECM이 침착 전에 혼합되는 방법.
  42. 제 3 항에 있어서,
    세포 조성물이 프린팅 동안 ECM 위에 프린팅되는 방법.
  43. 제 3 항에 있어서,
    세포 조성물이 ECM의 프린팅이 완료된 후에 상기 ECM 위에 프린팅되는 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서,
    ECM이 침착 동안 3-차원 구조로 형성되는 방법.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    뼈 대체물의 침착을 추가로 포함하는 방법.
  46. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
    표면이 뼈이거나 뼈를 포함하는 방법.
  47. 제 45 항에 있어서,
    뼈 대체물이 조직의 의도된 수용자의 뼈에 상응하게 프린팅되는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서,
    조직의 의도된 수용자의 뼈의 3-차원 지도를 제작하는 것을 추가로 포함하고, 이때 뼈 대체물이 상기 3-차원 지도에 상응하게 프린팅되는 방법.
  49. 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서,
    뼈가 뇌두개골 또는 안면골인 방법.
  50. 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서,
    뼈가 귀 뼈 또는 지골 뼈인 방법.
  51. 제 47 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 조성물이 적어도 부분적으로 뼈 또는 뼈 대체물의 표면을 덮도록 상기 세포 조성물이 상기 뼈 또는 뼈 대체물 위에 프린팅되는 방법.
  52. 제 1 항에 있어서,
    조직이 (a) 내면 및 외면을 갖는 뼈로 이루어지는 표면, 및 (b) 2개의 세포 조성물을 포함하고, 이때 제 1 세포 조성물이 상기 내면 위에 프린팅되는 제 1 유형의 세포, 및 상기 외면 위에 프린팅되는 제 2 유형의 세포를 포함하는 방법.
  53. 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
    침착이 3-차원적으로 수행되는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서,
    조직이 3-차원 표면 위에 프린팅되는 방법.
  55. 제 4 항에 있어서,
    잉크젯 프린팅이 다수의 프린트 헤드 또는 다수의 프린트 젯을 갖는 프린터를 사용하여 수행되는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서,
    프린트 헤드 또는 프린트 젯 각각이 별개로 제어가능한 방법.
  57. 제 56 항에 있어서,
    프린트 헤드 또는 프린트 젯 각각이 나머지 프린트 헤드 또는 프린트 젯과 독립적으로 작동하는 방법.
  58. 제 55 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
    다수의 프린트 헤드 또는 프린트 젯 중 1종 이상이 세포 조성물을 프린팅하고, 상기 다수의 프린트 헤드 또는 프린트 젯 중 다른 1종 이상이 ECM을 프린팅하는 방법.
  59. 제 1 항에 있어서,
    세포 조성물 및 ECM이 프린팅 전에 혼합되는 방법.
  60. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 조성물이 골수-유래 중간엽 줄기 세포(BM-MSC)를 포함하는 방법.
  61. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 조성물이 조직 배양 플라스틱-부착성 CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ 태반 줄기 세포를 포함하는 방법.
  62. 제 61 항에 있어서,
    태반 줄기 세포가 또한 CD45-, CD80-, CD86- 또는 CD90+ 중 1종 이상인 방법.
  63. 제 61 항 또는 제 62 항에 있어서,
    태반 줄기 세포가 수용자에서 면역 반응을 억제하는 방법.
  64. 제 63 항에 있어서,
    태반 줄기 세포가 수용자에서 국소적으로 면역 반응을 억제하는 방법.
  65. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 조성물이 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 유도 만능 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 골수-유래 중간엽 줄기 세포, 골수-유래 중간엽 기질 세포, 조직 플라스틱-부착성 태반 줄기 세포(PDAC), 제대 줄기 세포, 양수 줄기 세포, 양막 유래 부착 세포(AMDAC), 골원성 태반 부착 세포(OPAC), 지방 줄기 세포, 윤부 줄기 세포, 치수 줄기 세포, 근아세포, 내피 전구세포, 신경 줄기 세포, 탈락 치아 유래 줄기 세포, 모낭 줄기 세포, 진피 줄기 세포, 단위생식 유도 줄기 세포, 역분화 줄기 세포, 양막 유래 부착 세포 또는 측면 집단 줄기 세포를 포함하는 방법.
  66. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 조성물이 분화된 세포를 포함하는 방법.
  67. 제 66 항에 있어서,
    분화된 세포가 내피 세포, 상피 세포, 진피 세포, 내배엽 세포, 중배엽 세포, 섬유아세포, 골세포, 연골세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 간세포, 췌장 세포 또는 기질 세포를 포함하는 방법.
  68. 제 66 항에 있어서,
    분화된 세포가 타액선 점액 세포, 타액선 장액 세포, 폰에브너선 세포, 유선 세포, 누선 세포, 이도선 세포, 에크린 한선 암세포(dark cell), 에크린 한선 클리어 세포, 아포크린 한선 세포, 몰선 세포, 피지선 세포, 보우만선 세포, 브루너선 세포, 정낭 세포, 전립선 세포, 요도구선 세포, 바르톨린선 세포, 리트레선 세포, 자궁내막 세포, 단리된 배상 세포, 위벽 점액 세포, 위선 효소원 세포, 위선 산분비 세포, 췌장 선포 세포, 파네스 세포, 제 2 형 폐포세포, 클라라 세포, 소마토트로프, 락토트로프, 티로트로프, 고나도트로프, 코르티코트로프, 뇌하수체 중엽 세포, 거대세포성 신경분비 세포, 장 세포, 기도 세포, 갑상선 상피 세포, 부여포 세포, 부갑상선 세포, 부갑상선 주세포, 호산성 세포, 부신 세포, 크롬친화성 세포, 라이디히 세포, 내난포막 세포, 황체 세포, 과립층 황체 세포, 난포막 황체 세포, 방사구체 세포, 치밀반 세포, 극주위 세포, 혈관간막 세포, 혈관 또는 림프 혈관 내피 유창 세포, 혈관 또는 림프 혈관 내피 무한증식 세포, 혈관 또는 림프 혈관 내피 비장 세포, 활막 세포; 표층 복막, 늑막 또는 위심강의 장막 세포; 편평 세포, 원통 세포, 암세포(dark cell); 귀 표층 내림프 공간의 전정막 세포; 혈관조 기저 세포; 귀 표층 내림프 공간의 혈관조 변연 세포; 클라우디우스 세포, 보에처 세포, 맥락총 세포, 연질뇌척수막 편평 세포, 색소성 모양체 상피 세포, 비색소성 모양체 상피 세포, 각막 내피 세포, peg 세포, 기도 섬모 세포, 수란관 섬모 세포, 자궁내막 섬모 세포, 정소망 섬모 세포, 원심성 신경관 섬모 세포, 섬모 상의 세포, 표피 각질세포, 표피 기저 세포, 손톱 또는 발톱의 각질세포, 조상 기저 세포, 수질 모간세포, 피질 모간세포, 각피 모간세포, 각피 모근초 세포, 헉슬리층의 모근초 세포, 헨레층의 모근초 세포, 외부 모근초 세포, 모기질 세포, 중층 편평 상피의 표면 상피 세포, 상피의 기저 세포, 비뇨기 상피 세포, 코르티 기관의 청각 내유모 세포, 코르티 기관의 청각 외유모 세포, 후각 상피의 기저 세포, 저온-민감성 1차 감각 뉴런, 열-민감성 1차 감각 뉴런, 표피의 메르켈 세포, 후각 수용체 뉴런, 통증-민감성 1차 감각 뉴런, 광수용체 간상 세포, 광수용체 청색-민감성 원추 세포, 광수용체 녹색-민감성 원추 세포, 광수용체 적색-민감성 원추 세포, 자기수용 1차 감각 뉴런, 접촉-민감성 1차 감각 뉴런, 제 1 형 경동맥체 세포; 혈액 pH 센서인 제 2 형 경동맥체 세포; 가속 또는 중력에 관한 귀의 전정 기관의 제 1 형 모세포; 귀의 전정 기관의 제 2 형 모세포, 제 1 형 미뢰 세포, 콜린성 신경 세포, 아드레날린성 신경 세포, 펩티드성 신경 세포, 코르티 기관의 내주 세포, 코르티 기관의 외주 세포, 코르티 기관의 내부 지골 세포, 코르티 기관의 외부 지골 세포, 코르티 기관의 경계 세포, 코르티 기관의 헨센 세포, 전정 기관 지지 세포, 미뢰 지지 세포, 후각 상피 지지 세포, 슈반 세포, 위성 세포, 장 신경교세포, 성상 세포, 뉴런, 희돌기교세포, 방추 뉴런, 전방 수정체 상피 세포, 결정질-함유 수정체 섬유 세포, 간세포, 지방세포, 백색 지방세포, 갈색 지방세포, 간 지방세포, 신장 사구체 벽세포, 신장 사구체 족세포, 신장 근위 세뇨관 브러시 보더 세포, 헨레 고리 박편 세포, 신장 원위 세뇨관 세포, 신장 집뇨관 세포, 제 1 형 폐포세포, 췌장관 세포, 비줄무늬 관세포, 관세포, 장 브러시 보더 세포, 외분비선 줄무늬 관세포, 담낭 상피 세포, 원심성 신경관 비섬모 세포, 정소상체 주세포, 정소상체 기저 세포, 에나멜아세포 상피 세포, 편평 반월골 상피 세포, 코르티 기관 치간 상피 세포, 소성 결합 조직 섬유아세포, 각막간질세포, 건 섬유아세포, 골수 세망조직 섬유아세포, 비상피 섬유아세포, 주피세포, 수핵 세포, 시멘트아세포/시멘트질세포, 상아모세포, 상아세포, 초자 연골 연골세포, 섬유연골 연골세포, 탄성 연골 연골세포, 조골세포, 골세포, 파골세포, 골전구세포, 초자체세포; 귀의 성상 세포; 간 성상 세포(Ito 세포), 췌장 성상 세포, 적색 골격근 세포, 백색 골격근 세포, 중간 골격근 세포, 근방추의 핵낭 세포, 근방추의 핵사슬 세포, 위성 세포, 보통 심근 세포, 결절 심근 세포, 푸르키네 섬유 세포, 평활근 세포, 홍채의 근상피 세포, 외분비선의 근상피 세포, 망상적혈구, 거핵세포, 단핵구, 결합 조직 대식세포, 표피 랑게르한스 세포, 수지상 세포, 미세아교 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 헬퍼 T 세포, 억제 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연 살해 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 멜라닌세포, 망막 색소 상피 세포, 난원세포/난모세포, 정세포, 정모세포, 정원세포, 정자, 난포 세포, 세르톨리 세포, 흉선 상피 세포 및/또는 간질 신장 세포를 포함하는 방법.
  69. 제 1 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직이 신경 유도관을 포함하는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서,
    신경 유도관이 폴리무수물로 제조되는 방법.
  71. 제 70 항에 있어서,
    폴리무수물이 폴리(o-카복시페녹시)-p-자일렌) 또는 폴리(락티드-무수물)인 방법.
  72. 제 69 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경 유도관이 폴리무수물을 사용하여 잉크젯 프린팅에 의해 조직내에 침착되는 방법.
  73. 제 69 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
    신경 유도관이 프린팅 전에 제조되고, 조직의 프린팅 동안 상기 조직내에 배치되는 방법.
  74. 제 72 항 또는 제 73 항에 있어서,
    신경 유도관을 포함하는 조직이 중추 신경계(CNS)의 손상 부위에 이식되기에 적합한 방법.
  75. 제 74 항에 있어서,
    CNS의 부위가 척수인 방법.
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