CN111032687A - 三维打印的器官、设备和基质 - Google Patents

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梅兰妮·P·马修
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Prius Biological Products Co Ltd
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Abstract

本文提供了用于生物打印三维器官和类器官的方法和系统。本文还提供了生物打印的三维器官和类器官用于生成和/或评估免疫学产物和/或免疫应答的用途。本文还提供了用于生物打印三维基质的方法和系统。

Description

三维打印的器官、设备和基质
交叉引用
本申请要求于2017年5月25日提交的美国临时专利申请号62/511,205、于2017年5月25日提交的美国临时专利申请号62/511,275、于2017年9月8日提交的美国临时专利申请号62/556,242的优先权，其中每个申请均通过引用整体并入本文。
背景技术
迄今为止，尽管在细胞生物学、微流体、工程学和三维打印领域取得了显著进展，但常规方法未能再造供给并支撑构建人体器官所必需的厚组织的功能性毛细血管。迄今为止，组织工程学中的这些方法依赖于血管向组织工程化设备中的内向生长，以实现持久的脉管形成。该策略适用于一些非常薄的组织(如膀胱壁置换)或不需要脉管系统工作的组织(如骨置换)。然而，当前的组织工程化技术在产生复杂组织如大型重要器官(包括肝、肾、厚皮和心脏)方面达不到要求。较大的组织也可以看作是较小的组织亚单位的组织；例如，肾由数十万个肾单位组成，肺的功能单位(即肺泡腔)的总表面积为70至80平方米(m2)，但其仅为1个细胞壁，厚度为5至10微米(μm)。当前的组织打印方法不仅不能再造支撑厚度大于300微米(μm)的组织所必需的精细微脉管系统，而且不能将细胞组织成器官功能所必需的结构取向和小生境。
抗体是在免疫应答期间由B细胞产生和分泌的蛋白质。抗体可对潜在的感染因子具有高的结合特异性和亲和力，因此可用于结合并隔离、中和其他蛋白质、病毒、细菌、化学制品-蛋白质组合或碳水化合物分子或者改变其作用。这使抗体在保护免受病原体侵害以及隔离或中和感染性或其他病理因子或蛋白质方面成为有价值的蛋白质。另外，通过借助于破坏或增强其他蛋白质-蛋白质相互作用的调节，通过吞噬的调理素作用，抗体可用于重定向免疫应答，实质上增加了免疫识别和破坏病原体或病理因子的可能性。
为了使B细胞产生高亲和力或高亲抗原性抗体，需要称为亲和力成熟的多步骤过程。在亲和力成熟过程中，B细胞受体(BCR)发生了遗传变化。在这些遗传变化之后，发生了猜测和检验的类似进化的过程。这是一个竞争性过程，其中高结合强度导致与提供阳性存活信号的佐细胞更多接触。佐细胞包括但不限于：T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞等。无效的BCR重排会终止亲和力成熟过程，并且不再接收来自呈递抗原的佐细胞或可以提供额外阳性反馈的自身BCR交联的存活信号。因此，较高亲和力的BCR重排和随机突变给予B细胞阳性反馈、促进B细胞分裂、更多的受体重排和更多的随机突变，而较低亲和力的BCR重排可导致细胞死亡或无反应性。在这种猜测和检验顺序中进行了几轮选择后，高亲和力B细胞差异地存活并转变为浆细胞。浆细胞在血流中循环并分泌大量抗体以辅助免疫应答。亲和力成熟多发生在淋巴结器官中，持续数天时间。
淋巴结由网状网络内的大量免疫细胞组成，主要是B细胞、T细胞和滤泡树突细胞(FDC)。淋巴结通过增加细胞彼此之间的接近度而实现全面免疫应答所需的广泛的细胞间相互作用。来自佐细胞的第二存活信号支持B细胞受体重排。这些基于接近度的细胞相互作用需要在淋巴结内发现的免疫细胞进行特定的三维(3D)时空排列，或者通过该特定三维时空排列显著改善。
细胞的三维细胞移动和时空排列对于几种基于细胞的过程至关重要，这些过程包括细胞分化和细胞对外部或内部刺激的反应。在B细胞的亲和力成熟过程中，所涉及的免疫细胞在淋巴结中物理区室化为含有分裂的B细胞的区域(即暗区)、含有非分裂的B细胞的区域(即亮区)和含有支持性佐细胞的区域，如图16所示。免疫细胞的区室化和随后在活化期间的重排指示高亲和力抗体的适当发育依赖于该组织。当B细胞经历亲和力成熟时，它们在淋巴结的各区室之间移动，蠕动穿过其他细胞和胶原网络，如图17所示。本公开内容描述了毫米、微米或亚微米分辨率的含细胞胶原网络的无毒打印过程，使得可以产生具有有限细胞区室化的包含其他细胞类型的淋巴器官或类器官，其目的包括但不限于抗体生成。
在类器官的抗原攻击或疫苗接种后在合成组织中从头形成抗原特异性抗体指示了功能性细胞-细胞相互作用和功能性应答组织，该组织可在数天、数周至数月的过程中支持复杂的细胞-细胞相互作用。
由于抗体在靶向、中和以及/或者调理与包括癌症、自身免疫病和感染性疾病在内的许多疾病状态有关的生物因子中的高功效和多功能性，因此已经将其用于治疗目的。但是，发现和生产抗体用于治疗或研究用途的当前方法既费时又昂贵。抗体产生的标准方法需要使用动物，通常是小鼠或其他啮齿动物、兔、鸡、马或非人类灵长类动物，向它们注射抗原并在表现出免疫应答后放血以收集B细胞。通过该方法产生的旨在用于对抗人类靶标的抗体(例如，用于治疗目的)的抗体需要额外的费力的人源化步骤，该步骤可能会改变靶标的结合亲和力，同时不能保证在人类中的安全性或效率。其他方法如噬菌体展示使用预定义的抗体文库或序列集，结合一些选择感兴趣的蛋白质的方法。通常，这些文库不产生独特的或高亲和力的序列。此外，作为预定义的蛋白质组，它们可能无法产生对新型感染因子的应答能力。我们的技术解决了两个问题：(a)依赖动物模型进行抗体发现；(b)无法使用衍生自人类的高通量模型来产生高亲和力的独特抗体。
所描述的方法涉及光源的使用，该光源包括但不限于白光、蓝光、绿光和任何波长的单光子或多光子激光源。光可以以二维或三维进行投影。
通过使用数字微镜器件(DMD)或空间光调制器(SLM)对单个轴向平面进行二维(2D)投影来实现二维投影，该数字微镜器件(DMD)或空间光调制器(SLM)仅将光放置在期望材料聚合的特定区域中。
如果使用三维投影，则可以通过使用串联的两个光调制系统通过光的全息投影来实现，如在共同发明的题为MULTI-PHOTON TISSUE PRINTING的美国临时专利申请号62/469,948中所公开的，该申请通过引用并入本文。已经描述并实现了生物材料的聚合，以用于细胞支架材料的生物打印。本文所述的方法涉及将光源投影到包含可聚合材料的浴液中以在发生聚合时封装细胞。相比之下，替代的介质内基于聚合的组织工程方法使用光投影来产生3D支架，细胞可随后植入其中。在聚合过程中封装细胞而不是植入细胞增加了细胞可放置的精度；通过使用双光子光源而不是标准的单光子光源进一步提高了在聚合空间内能够实现的分辨率。使用双光子光源引发聚合消除或显著降低了光对细胞的毒性，并且加快了打印速度，从而改善细胞活力和生长。就可获得的分辨率以及可打印大型或复杂结构的速度而言，多光子和单光子激光方法优于挤出打印。或者，可以使用波长更长的光子来减少对细胞的损害，并且/或者可以使用强度较低的光或较短的曝光时间。另外，以期望聚合图案通过光源的全息投影以三维方式同时进行打印大大减少了打印时间，还减少了由于曝光或温育器外的时间而对细胞的压力。
用于包括骨骼和皮肤等组织的伤口闭合、伤口修补，如使用支架、骨愈合或融合的最常用医疗设备由生物惰性材料制成。这些材料中的许多可随着时间的流逝而溶解，但许多在手术后的多年仍会保持持久性特征，并可能引起并发症或阻碍愈合过程。
用于外科手术伤口闭合或组织修复的一些更先进的材料和医疗设备采用三维挤出打印后接种细胞的做法，以引入干细胞或其他可能对伤口愈合或闭合有益的细胞类型。然而，将细胞接种到生物惰性材料中对于细胞而言具有低活力和低存活特性，因此有益细胞的递送不完全。
用于促进组织愈合或功能改善的组织植入物通常处于细胞悬液注射剂或小型设备的形式，其不违反氧气、营养物和废物的200-300微米的扩散极限，或者大部分无细胞。此外，组织植入物不包含在适当位置打印的可能会重塑打印材料并在打印材料中生长的细胞，这严重阻碍了可并入植入物环境中的功能性组织插入物的发展。
包含能够在植入的设备内重塑和生长的细胞的医疗设备的工程化受到打印分辨率、可用于挤出打印的结构弹性生物材料的缺乏、高分辨率挤出打印的细胞毒性和在打印后将细胞引入3D打印的医疗设备的技术的限制。此外，高度复杂设备的3维挤出打印很慢，通常花费数小时或数天来完成一个打印周期。这使得难以实现所需含细胞的设备的生产和扩大规模。
本公开内容描述了通过全息光投影而实现的三维光刻的开发和使用，该全息光投影使用被称为光波前整形的技术，用于生物打印含细胞结构和材料。含细胞结构和材料经过特别设计，以维持结构特性，例如抗张强度、抗剪切力和抗压缩力、可压缩性或其他特性，这些特性允许与手术技术、规格以及天然组织和器官结构相容，同时具有完全的生物相容性。生物材料的硬化或聚合可以通过在三维空间中的特定点处由光或激光与打印材料相互作用来驱动。打印材料包括单体生物材料以及无细胞毒性但对光或特定波长的光有反应性的掺杂剂或驱动剂。包含嵌入或捕获的细胞的打印的生物相容性设备或结构允许对植入的设备进行重塑和分解或再吸收，该植入的设备用于将细胞递送至期望部位，目的是但不限于愈合、增强或替换组织功能。
发明内容
在一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，所述3D淋巴类器官包括(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及(c)使所述3D淋巴类器官的至少一部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的至少一部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(d)从所述3D淋巴类器官的至少一部分提取一种或多种免疫蛋白。在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯(Langerhans)树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的至少一部分的聚合物形成网络。在一些实施方案中，所述网络是网状的(reticular)、无定形的或是网(net)。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
在另一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括(i)打印包含含有多个细胞的基质的三维(3D)淋巴类器官，和(ii)处理所述3D淋巴类器官，以产生所述一种或多种免疫蛋白。
在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
在另一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：(a)提供包含第一介质的介质室，其中所述第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的第一介质，以使所述介质室中的第一介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的第一部分；(c)在介质室中提供第二介质，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；(d)根据所述计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的第二介质，以使所述介质室中的第二介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的第二部分；以及(e)使所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分暴露于抗原，以便刺激一种或多种免疫蛋白的产生。在一些实施方案中，该方法进一步包括：(f)从所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分提取一种或多种免疫蛋白。在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的至少一部分的聚合物形成网络。在一些实施方案中，所述网络是网状的、无定形的或是网。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
在另一方面，本公开内容提供了产生一种或多种免疫蛋白的方法，其包括(i)打印包含基质的三维(3D)淋巴类器官，所述基质包含第一多个细胞和第二多个细胞，和(ii)处理所述3D淋巴类器官，以产生所述一种或多种免疫蛋白。在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
在另一方面，本公开内容提供了用于使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括：(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印所述三维(3D)含细胞医疗设备的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的介质，以形成所述3D含细胞基质的至少一部分，所述3D含细胞基质包含(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及(c)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
在一些实施方案中，所述多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。在一些实施方案中，所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
在另一方面，本公开内容提供了使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括(i)打印包含多个细胞的所述3D含细胞基质，和(ii)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
在一些实施方案中，所述多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。在一些实施方案中，所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
在另一方面，本公开内容提供了用于使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括：(a)提供包含第一介质的介质室，其中所述第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印所述3D含细胞基质的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述介质室中的所述第一介质的至少一部分形成所述3D含细胞基质的第一部分；(c)在所述介质室中提供第二介质，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；(d)根据所述计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D含细胞基质的第二部分；以及(e)将所述3D含细胞基质的所述第一部分和所述第二部分定位在受试者体内。
在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。在一些实施方案中，所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
在另一方面，本公开内容提供了使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括(i)打印包含第一多个细胞和第二多个细胞的3D含细胞基质，其中第一多个细胞与第二多个细胞不同，和(ii)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。在一些实施方案中，所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
在另一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的系统，包括：(a)被配置成含有介质的介质室，所述介质包含多个细胞以及一种或多种聚合物前体；(b)被配置用于将至少一个能量束引导至所述介质室的至少一个能量源；以及(c)可操作地耦合到所述至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令；(ii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以使所述聚合物前体的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，和(iii)使所述3D淋巴类器官的至少一部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，所述足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件包括将所述3D淋巴类器官的至少一部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。
在另一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的系统，包括：(a)被配置成含有第一介质的介质室，所述第一介质包含第一多个细胞和第一多个聚合物前体；(b)被配置用于将至少一个能量束引导至所述介质室的至少一个能量源；以及(c)可操作地耦合到所述至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令；(ii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述第一聚合物前体的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少一部分；(iii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少第二部分，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二多个聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；和(iv)使所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件包括将所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。
在另一方面，本公开内容提供了产生人免疫蛋白群的方法，包括：使用多光子激光生物打印系统生物打印三维淋巴类器官；将所述三维淋巴类器官暴露于抗原，以便刺激人免疫蛋白群的产生；以及从所述三维淋巴类器官提取所述人免疫蛋白群。
在另一方面，本公开内容提供了产生人免疫蛋白群的方法，包括：(a)提供介质，所述介质包含：(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；(b)将至少一层所述介质沉积到衬底上；(c)使所述至少一层介质经历能量源以形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，所述3D淋巴类器官包括(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的生物凝胶；以及(d)使所述3D淋巴类器官的至少一部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的至少一部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(d)从所述3D淋巴类器官的至少一部分提取一种或多种免疫蛋白。在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。在一些实施方案中，所述介质包含光引发剂、交联剂、胶原蛋白、透明质酸和其他糖胺聚糖、聚-dl-乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚-l-乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、藻酸盐、明胶、琼脂或其任何组合。在一些实施方案中，所述能量源是激光器、热源、光源或其任何组合。
本公开内容提供了用于使用多光子激发源的空间光调制快速生成含细胞的结构的方法和系统。在一些实施方案中，所述含细胞的结构可以是多层脉管化组织、含细胞的设备或含细胞的材料。使用该方法，通过将具有嵌入式机械和/或生物元件(如微脉管系统)的细胞大小特异性的网分层来提供用于快速产生含细胞的结构的方法。基于三维(全息)投影、二维投影和/或在任何平面轴(如x,y、x,z或y,z)上，胶原网或者其他生物相容性或惰性材料网中包含的细胞的沉积是快速的迭代的过程，可以与多光子激光激发的扫描进行结合。可以以各种组合同时使用三维扫描、二维扫描和光栅扫描，以实现快速产生完整结构。激光投影模式之间的动态转变允许在大视场中快速生成复杂的结构，同时维持微米至纳米级的精细分辨率。所述方法允许快速产生较大(例如，至多约5厘米(cm))多层脉管系统和较小脉管系统(例如，1-10微米(μm))单细胞层的脉管系统。
本公开内容允许在二维和/或三维上对多种细胞类型进行分层，使得可以以不受多种细胞类型、大小或复杂性限制的方式构建组织。在一些情况下，这通过使用多光子(例如，双光子)激发光来实现，如可由例如激光器所提供的。
本公开内容的另一方面提供了包括机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，所述机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文其他各处的任何方法。
本公开内容的另一方面提供了包括一个或多个计算机处理器以及与其耦合的计算机存储器的系统。所述计算存储器包括机器可执行代码，所述机器可执行代码在由所述一个或多个计算机处理器执行时实现上文或本文其他各处的任何方法。
本公开内容的另一方面提供了通过光刻法生成淋巴器官和类器官，其使用投影到二维顺序平面或三维全息图中的白光、单光子激发或多光子激光激发。可以由胶原蛋白或其他生物相容性材料打印淋巴结器官和类器官。通过本文公开的方法可以产生活性的应答性合成人免疫组织。通过本文公开的方法可产生免疫应答组织。通过本文公开的方法产生的合成免疫应答组织可用于开发新产品并检查活体个体的免疫应答。使用该方法，通过将淋巴器官暴露于选择的抗原并允许发生抗体克隆选择和扩充的生理过程，提供了用于快速生成新抗体的方法。通过本文公开的方法产生的合成免疫应答组织可用于从单次献血产生新的抗体，从而在一组96孔板中代替用于产生抗体的数百个动物或人类替代物。通过本文公开的方法产生的合成免疫应答组织以高通量的方式生成抗体文库或检查免疫系统应答。通过本文公开的方法生产的合成类器官可在药学上测试生物和/或非生物药物化合物或药物组合。
本公开内容的另一方面提供了产生用于医学目的的一系列含细胞的设备或材料的方法，所述含细胞的设备或材料以多光子和/或单光子或白光光刻进行三维打印，所述医学目的包括但不限于手术伤口闭合和组织修复。设备和材料可包括缝合线、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销、螺钉以及意在用于活体受试者的类似结构。这样的设备和材料允许将包括干细胞在内的细胞递送到活体受试者体内，潜在地加速伤口愈合和/或组织修复或者以一些期望的方式在使用部位改变细胞组成。
本公开内容的另一方面提供了用于植入具有包括复制天然器官和类器官的功能等期望生理功能的多光子3维打印的含细胞的设备或结构的方法，以补充活体受试者体内自然存在的功能。在该迭代中，所述设备并非旨在递送细胞或者再生自然结构或功能的，而是概括组织自身的自然功能，其结合自然功能以增强或协助功能或者代替自然组织功能独立操作。
通过以下在其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案的详细描述，本公开内容的其他方面和优点将会对本领域技术人员而言变得显而易见。如将认识到的，本公开内容能够具有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些均不脱离本公开内容。因此，附图和说明书在本质上将被视为是说明性而非限制性的。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1图示了用于期望组织的快速多光子打印的系统的实施方案。
图2A-图2D图示了在介质室内生成期望组织的示例性阶段。图2A图示了包含含有第一细胞组的介质的介质室。图2B图示了包含含有第二细胞组的介质的介质室。图2C图示了多光子激光束的脉冲向介质的递送。图2D图示了其中沿包含介质的介质室的底部打印含细胞的支架的实施方案。
图3A-图3C图示了激光系统的各个实施方案。图3A图示了具有单个多光子激光源的激光系统的实施方案。图3B图示了具有多条激光线的激光系统的实施方案。图3C图示了包含多条激光线、光电倍增管(PMT)和物镜的激光系统的实施方案。
图4A-图4C图示了打印系统的各个实施方案。图4A图示了这样的打印系统的实施方案，其包含光束扩展器、光学聚焦透镜、另外的激光聚焦透镜，并且没有轴棱锥透镜或TAG透镜。图4B图示了这样的打印系统的实施方案，其包含光束扩展器、光学聚焦透镜、另外的激光聚焦透镜，以及轴棱锥透镜或TAG透镜。图4C图示了Z步长投影打印设置，其包含用于2D的x,y片状或全息投影的单个SLM或DMD，用于在以给定Z步长打印的细胞和所得结构周围的打印。
图5A-图5B图示了多光子组织打印头的各个实施方案。图5A图示了包括单个竖直物镜的多光子组织打印头的实施方案。图5B图示了具有用于对结构进行成像的倒置光学器件的多光子组织打印头的实施方案。
图6A-图6B图示了可移除和可附接的纤维光缆附件的实施方案。图6A图示了纤维光缆附件和纤维光缆。图6B图示了用于打印期望的复杂组织结构的纤维光缆附件。
图7图示了其中打印头光学器件包括至少三个物镜的实施方案，其中每个物镜包括引导进入单个介质室的纤维光缆附件。
图8图示了其中打印头光学器件包括至少六个物镜的实施方案，其中每个物镜包括引导进入单独的介质室如多孔板中的单独的孔的纤维光缆附件。
图9图示了具有充当打印头的物镜阵列的打印头光学器件的实施方案。
图10图示了被编程用于在X和Y方向上在多孔板上方移动以将激光束投影递送到每个孔中的物镜。
图11示出了被编程或以其他方式配置用于实现本文提供的方法的计算机控制系统。
图12图示了没有时间聚焦的打印系统的实施方案的光学组件和光路。
图13图示了具有时间聚焦的打印系统的另外的实施方案的光学组件和光路。
图14图示了没有时间聚焦的打印系统的又一实施方案的光学组件和光路。
图15图示了光检测系统。
图16图示了淋巴结中几种类型的淋巴细胞的区室化和组织，另外在横截面中的描绘标记了主要结构和细胞类型。
图17图示了B细胞生发中心，其包括其中B细胞增殖的暗区以及其中B细胞与抗原呈递细胞和佐细胞相互作用的亮区。
图18A-图18B图示了B细胞生发中心和胸腺样发育小生境。图18A图示了对抗原作出应答的B细胞生发中心，其中B细胞在被称为暗区和亮区的区室化区域之间移动，作为用于产生高亲和力抗体的成熟和选择过程的一部分。图18B图示了胸腺样发育小生境，其中当T细胞从皮质样胸腺组织移动到髓质样胸腺组织时，它们在一系列顺序步骤中经历选择和成熟。
图19图示了淋巴结类器官的各种结构实例，其被设计用于促进在免疫应答期间发生的细胞小生境形成和相关的细胞-细胞相互作用的目的。
图20图示了可以以不对称的泪滴状形状打印的淋巴结类器官或含淋巴细胞的器官。
图21图示了为了构建淋巴结类器官的目的而沉积包含淋巴细胞的生物凝胶层的顺序过程。
图22示出了在打印的淋巴类器官中的寨卡抗体生成研究的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果。
图23示出了通过本文公开的方法产生的三维打印的淋巴结类器官的显微镜图像。T细胞区指示包含T细胞和支持性佐细胞混合物的组织区域。B细胞区指示包含B细胞和支持性佐细胞混合物的组织区域。
图24图示了包含用于溶解和并入组织或促进组织愈合的细胞的钉、缝合线、支架和夹子的实例。
图25图示了可包含细胞的3D打印的骨可再吸收螺钉、销和移植物的实例。
图26图示了功能性组织植入物的实例，其借助与最接近植入的细胞部位的细胞和细胞系统的相互作用而起到功能增强的作用。
图27图示了打印在格子结构上的细胞。
图28A-图28E示出了通过全息打印封装的人多能干细胞衍生的胰岛素产生细胞的簇。图28A示出了表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)的封装细胞的簇的图像。图28B示出了对应于由封装细胞产生的人C肽的量的图表。图28C示出了在封装后五天表达eGFP的封装细胞的第一图像。图28D示出了在封装后五天表达eGFP的封装细胞的第二图像。图28E图示了封装结构的图像。
图29A-图29C示出了通过全息打印生成的生物相容性微支架结构。图29A示出了微支架的代表性计算机生成的渲染。图29B示出了打印的微支架的侧视图的图像。图29C示出了打印的微支架的横截面图的图像。
图30A-图30B示出了全息打印的微支架的可压缩性和回弹性测试的图像。图30A示出了展示微支架抵靠固体表面重复压缩的一系列图像。图30B示出了展示微支架的回弹性的一系列图像。
图31A-图31E示出了三维全息打印的微网格网络。图31A示出了微网格网络的计算机生成的图像。图31B示出了微网格网络的图像。图31C示出了微网格网络的特写图像。图31D示出了经历横向压缩的微网格网络的一系列图像。图31E示出了在用镊子处理期间的微网格网络的一系列图像。
图32A-图32H示出了打印的淋巴结类器官(LNO)的图像及其功能的表征。图32A示出了包含B细胞、T细胞和抗原呈递细胞(APC)的打印的胶原蛋白基质的图像。图32B示出了表示打印的胶原蛋白基质中B细胞、T细胞和APC的混合细胞群的图像。图32C示出了在组织培养孔中而不是在打印的胶原蛋白基质中的B细胞、T细胞和APC的群体的图像。图32D示出了在添加抗原后24小时的LNO和细胞簇的图像。图32E示出了在添加抗原脉冲后72小时的打印的淋巴结类器官和细胞簇的图像。图32F示出了在添加抗原后120小时的打印的LNO和细胞簇的图像。图32G示出了表示由LNO产生白介素4(IL-4)的图表。图32H示出了表示由LNO产生IL-2的图表。
图33A-图33C示出了从打印的LNO纯化的人免疫球蛋白(IgG)。图33A示出了表示LNO样品中蛋白质浓度的图。图33B示出了包含从打印的LNO介质分离的纯化的人IgG的SDS-PAGE凝胶的图像。图33C示出了包含从打印的LNO介质分离的未纯化的人IgG的SDS-PAGE凝胶的图像。
图34A-图34B示出了用抗原攻击中使用的抗原测试人IgG反应性的打印的LNO培养基等分试样。图34A示出了表示使用ELISA测试的样品在450纳米(nm)和570nm处的吸光度的图表。图34B示出了表示亚克隆的独特杂交瘤的两个图表，进一步测定该杂交瘤的特异性抗原反应性人IgG的存在。
具体实施方式
尽管本文中已经示出并描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员容易理解的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下可想到多种变化、改变和替代。应当理解，可采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。
定义
本文使用的术语仅为了描述具体情况，而不意在限制。如本文所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”也意在包括复数形式。此外，在术语“包括”、“具有”或其变化形式用于具体实施方式和/或权利要求的情况下，这样的术语意为包含性的，类似于术语“包含”。
术语“约”或“大约”是指接近所述量约10％、5％或1％的量，包括其中的增量。例如，“约”或“大约”可意指包括该特定值以及从低于该特定值10％跨越到高于该特定值的10％的范围。
如本文所用，术语“生物材料”通常是指可以发挥化学或生物功能的任何材料。生物材料可以是生物功能性组织或功能性组织，其可以是能够发挥或发挥生物力学或生物功能的生物结构。生物功能性组织可以包括在彼此扩散距离以内的细胞，包括至少一种细胞类型，其中每个细胞都在毛细管或脉管网络组分的扩散距离以内，促进和/或抑制蛋白质功能的实现，或其任何组合。生物功能性组织可以是组织或诸如重要器官的器官的至少一部分。在一些实例中，生物材料可以推进药物开发，例如，通过用不同的治疗剂筛选多种细胞或组织。
生物材料可包括基质如聚合物基质、生物凝胶、水凝胶或聚合物支架，其包括一种或多种其他类型的材料如细胞。生物材料可包括淋巴器官和类器官。生物材料可衍生自人类或动物来源的原代细胞、细胞系、干细胞、干细胞系、分化的干细胞、转分化的干细胞、自体细胞、同种异体细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞或其任何组合。生物材料可以具有多种形状、大小或配置。在一些情况下，诸如肉或肉类材料的生物材料可以由受试者(例如，动物)消耗。
如本文所用，术语“三维打印”(也称为“3D打印”)通常是指用于生成3D部件(或物体)的过程或方法。此类过程可用于形成3D部件(或物体)，诸如3D生物材料。
如本文所用，术语“能量束”通常是指能量的束。能量束可以是电磁能束或电磁辐射束。能量束可以是粒子束。能量束可以是光束(例如，伽马波、X射线、紫外线、可见光、红外光、微波或无线电波)。光束可以是相干光束，如可由通过辐射的受激发射(“激光”)的光放大所提供的。在一些实例中，光束由激光二极管或多二极管激光器生成。
如本文所用，术语“同种异体”是指从遗传上不相同的供体获得的多个细胞。例如，从供体中提取同种异体细胞，并将其返回给不同的遗传上不相同的接受者。
如本文所用，术语“自体的”是指从遗传上相同的供体获得的多个细胞。例如，从患者中提取自体细胞，并将其返回给同一个遗传上相同的个体(例如，供体)。
如本文所用，术语“多能干细胞”(PSC)是指能够在适当的条件下产生衍生自所有三个胚层(即内胚层，中胚层和外胚层)的不同细胞类型的细胞。多能干细胞的定义包括各种类型的胚胎干细胞，包括人胚胎干(hES)细胞、人胚胎生殖干(hEG)细胞；非人类胚胎干细胞，诸如来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，如猕猴干细胞、狨猴干细胞；鼠干细胞；通过核移植技术产生的干细胞，以及诱导多能干细胞(iPSC)。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”(ESC)是指衍生自在细胞实质上分化为三个胚层(即内胚层、中胚层和外胚层)之前的囊胚的多能干细胞。ESC包括任何市售或成熟的ESC细胞系，诸如H9、H1、H7或SA002。
如本文所用，术语“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指已经被重编程为类似于胚胎干细胞的多能状态的体细胞。iPSC的定义包括各种类型的iPSC，包括人iPSC和非人iPSC，诸如衍生自灵长类动物体细胞或鼠体细胞这些体细胞的iPSC。
如本文所用，术语“能量源”是指激光器，诸如光纤激光器、短脉冲激光器或飞秒脉冲激光器；热源，诸如热板、灯、烤箱、热水浴、细胞培养温育器、加热室、炉或干燥箱；光源，诸如白光、红外光、紫外(UV)光、近红外(NIR)光、可见光或发光二极管(LED)；声能量源，诸如超声探头、超声仪或超声浴；电磁辐射源，诸如微波源；或其任何组合。
如本文所用，术语“生物凝胶”是指水凝胶，生物相容性水凝胶，聚合物水凝胶，水凝胶珠，水凝胶纳米颗粒，水凝胶微滴，当在25摄氏度(℃)下测量时粘度为至少约10x10-4帕斯卡·秒(Pa·s)至100Pa·s或更高的溶液，包含非水凝胶珠、纳米颗粒、微粒、纳米棒、纳米壳、脂质体、纳米线、纳米管或其组合的水凝胶；其中的液体组分为水的凝胶；可降解的水凝胶；不可降解的水凝胶；可再吸收的水凝胶；包含天然来源的聚合物的水凝胶；或其任何组合。
本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的方法和系统。在一方面，用于打印3D生物材料的方法包括提供包含介质的介质室，该介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体。随后，根据计算机存储器中用于打印3D生物材料的计算机指令，可以沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质。这可以形成该3D生物材料的至少一部分，该3D生物材料包括(i)多个细胞的至少亚群，该多个细胞的至少亚群包含至少两种不同类型的细胞，和(ii)由一种或多种聚合物前体形成的聚合物。
本公开内容的方法和系统可以用于同时打印3D物体如3D生物材料的多个层。这样的3D物体可以由聚合物材料、金属、金属合金、复合材料或其任何组合形成。在一些实例中，3D物体由聚合物材料形成，在一些情况下该聚合物材料包括生物材料(例如，一个或多个细胞或细胞组件)。在一些情况下，可以通过将能量束(例如，激光)作为3D投影(例如，全息图)引导至聚合物材料的一种或多种前体以诱导聚合和/或交联从而形成3D物体的至少一部分来形成3D物体。这可以用于同时形成3D物体的多个层。
作为替代，3D物体可以由金属或金属合金形成，诸如例如，金、银、铂、钨、钛或其任何组合。在这样的情况下，可以通过烧结或熔化金属颗粒来形成3D物体，如可由例如通过将能量束(例如，激光束)引导至包含金属或金属合金的颗粒的粉末床所实现的。在一些情况下，可以通过将这样的能量束作为3D投影(例如，全息图)引导至粉末床中以促进颗粒的烧结或熔化来形成3D物体。这可以用于同时形成3D物体的多个层。3D物体可以由有机材料如石墨烯形成。3D物体可以由无机材料如聚硅氧烷形成。在这样的情况下，可以通过烧结或熔化有机和/或无机颗粒来形成3D物体，如可由例如通过将能量束(例如，激光束)引导至包含有机和/或无机材料的颗粒的粉末床所实现的。在一些情况下，可以通过将这样的能量束作为3D投影(例如，全息图)引导至粉末床中以促进有机和/或无机颗粒的烧结或熔化来形成3D物体。
能量束穿透的深度可以由束波长与给定金属、金属合金、无机材料和/或有机材料的电子场的相互作用来决定。有机材料可以是石墨烯。无机材料可以是聚硅氧烷。可以对这些颗粒进行功能化或组合，以允许与给定的能量束更大的相互作用或更小的相互作用。
在一些实例中，至少一个能量束是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100个或更多个能量束。至少一个能量束可以是或包括相干光。在一些情况下，至少一个能量束是激光束。
至少一个能量束可以作为图像或图像集合来引导。图像可以固定或随时间改变。至少一个能量束可以作为视频来引导。
计算机指令可以对应于3D生物材料的计算机模型或表示。计算机指令可以是计算机模型的一部分。计算机指令可以包括对应于3D生物材料的图像的集合。
至少一个能量束可以作为全息图像或视频来引导。这可以使介质中的不同点同时暴露于至少一个能量束，以例如同时在多个层诱导聚合物基质的形成(例如，通过聚合)。在一些情况下，可以使用例如空间光调制器(SLM)在不同的焦点处将3D图像或视频投影到介质中。
计算机指令可以包括和/或引导根据3D生物材料形成期间的时间的至少一个能量束的一个或多个参数的调整，诸如例如，向至少一个能量束的来源施加功率(例如，开/关激光)。可以根据与3D生物材料相对应的图像或视频(例如，全息图像或视频)进行这样的调整。替代地或附加地，计算机指令可以包括和/或引导3D生物材料形成于其上的台的位置的调整。
在一些情况下，在3D生物材料形成期间或之后，可以使多个细胞的至少亚群的至少一部分经历分化以形成至少两种不同类型的细胞。例如，可以通过使细胞暴露于药剂或使细胞经历诱导分化的条件来采用。替代地或附加地，可以使细胞经历去分化或细胞静止的诱导。
本公开内容的另一方面提供了用于打印3D生物材料的方法，该方法提供了包含第一介质的介质室。第一介质可以包含第一多个细胞和第一聚合物前体。可以根据用于打印3D生物材料的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第一介质，以使介质室中的第一介质的至少一部分形成3D生物材料的第一部分。随后，可以在介质室中提供第二介质。第二介质可以包含第二多个细胞和第二聚合物前体。第二多个细胞可以是与第一多个细胞不同的类型。随后，可以根据计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分。
在本公开内容的另一方面，用于打印3D生物材料的系统包括：被配置成含有介质的介质室，该介质包含含有至少两种不同类型的细胞的多个细胞以及一种或多种聚合物前体；被配置用于将至少一个能量束引导至该介质室的至少一个能量源；以及可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中该一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印3D生物材料的计算机指令；和(ii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分。
在另一方面，用于打印3D生物材料的系统包括：被配置成含有介质的介质室，该介质包含多个细胞以及多种聚合物前体；被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源；以及可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中该一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印3D生物材料的计算机指令；(ii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分；和(iii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分，其中第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中第二多个细胞是与第一多个细胞不同的类型。
在本公开内容的另一方面，用于打印三维(3D)物体的方法可以包括：将至少一个能量束引导至包含一种或多种前体的介质中，以生成包含由一种或多种前体形成的材料的3D物体，其中该至少一个能量束作为对应于3D物体的3D投影被引导至介质中。
在另一方面，用于打印三维(3D)生物材料的方法可以包括将至少一个能量束引导至：1)包含第一多个细胞和第一聚合物前体的第一介质，以及2)包含第二多个细胞和第二聚合物前体的第二介质，以生成3D生物材料的第一部分和3D生物材料的第二部分。
在另一方面，本公开内容提供了产生人免疫蛋白群体的方法，包括：(a)提供包含以下的介质：(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；(b)将至少一层介质沉积到衬底上；(c)使介质的至少一个层经历能量源以形成3D淋巴类器官的至少一部分，该3D淋巴类器官包括(i)多个细胞的至少亚群，和(ii)由一种或多种聚合物前体形成的生物凝胶；以及(d)使3D淋巴类器官的至少一部分经历足以刺激一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
参考图1，图示了用于期望组织的快速多光子打印的系统100的实施方案。此处，系统100包括由实体模型计算机辅助设计(CAD)建模系统112驱动的激光打印系统110。在该实施方案中，CAD建模系统112包括计算机114，计算机114基于期望组织的CAD模型和附加参数来控制激光打印系统110。激光打印系统110包括与多光子组织打印打印头118通信的激光系统116，多光子组织打印打印头118将多光子激光束120的波形投影到介质室122中以完整地或在特定部分中匹配期望的结构。多光子组织打印头118包括至少一个物镜124，物镜124在介质室122的横向和轴向平面中递送多光子激光束120，以在介质室122内提供CAD建模的组织的二维和/或三维和因此全息的投影。物镜124可以是水浸没式物镜、空气物镜或油浸没式物镜。可以同时生成二维和三维全息投影，并通过透镜控制将其投影到不同的区域。介质室122含有由细胞、可聚合材料和培养基组成的介质。可聚合材料可以包含生物相容的、可溶解的并且在一些情况下是生物惰性的可聚合单体单元。单体单元(或亚单元)可以响应于多光子激光束120而聚合、交联或反应，从而产生针对于待生成的组织的含细胞的结构，诸如细胞基质和基底膜结构。单体单元可以聚合和/或交联以形成基质。在一些情况下，可聚合单体单元可以包含胶原与其他细胞外基质组分的混合物，该其他细胞外基质组分包括但不限于弹性蛋白和透明质酸，其百分比取决于期望的组织基质而变化。
用于产生含细胞结构的细胞外基质组分的非限制性实例可以包括蛋白聚糖如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角质素，非蛋白聚糖多糖如透明质酸，胶原蛋白，以及弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白，或其任何组合。这些细胞外基质组分可用丙烯酸酯、二丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、肉桂酰、香豆素、胸腺嘧啶或者其他侧基或化学反应性部分进行官能化，以促进由多光子激发直接诱导或由一种或多种化学掺杂剂的多光子激发诱导的交联。在一些情况下，可以将可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体与细胞外基质组分结合使用以产生含细胞结构。可光聚合的大分子单体的非限制性实例可以包括聚乙二醇(PEG)丙烯酸酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物和聚乙烯醇(PVA)衍生物。在一些情况下，用于产生含细胞结构的胶原可以是纤维状胶原如I型、II型、III型、V型和XI型胶原，facit胶原如IX型、XII型和XIV型胶原，短链胶原如VIII型和X型胶原，基底膜胶原如IV型胶原，VI型胶原，VII型胶原，XIII型胶原或其任何组合。
可以产生单体单元的特定混合物以改变聚合的生物凝胶的最终性质。该基础打印混合物可以包含合成的并且不是哺乳动物组织天然的其他可聚合单体，包括生物材料和合成材料的混合物。示例混合物可以包括约0.4％w/v的胶原甲基丙烯酸酯加上添加约50％w/v的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。引导聚合的光引发剂可以在紫外线(UV)、红外线(IR)或可见光范围内是反应性的。两种这样的光引发剂的实例是曙红Y(EY)和三乙醇胺(TEA)，它们在组合时可以响应于暴露于可见光(例如，约390至700纳米的波长)而聚合。光引发剂的非限制性实例可以包括偶氮二异丁腈(AIBN)、苯偶姻衍生物、苯并酮缩醇(benziketal)、羟烷基苯酮、苯乙酮衍生物、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)、丙烯酰氯、过氧化苯甲酰、樟脑醌、二苯甲酮、噻吨酮和2-羟基-1-[4]-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮。羟烷基苯酮可以包括4-(2-羟基乙基乙氧基)-苯基-(2-羟基-2-甲基丙基)酮(
Figure BDA0002378391280000291
295)、1-羟基环己基-1-苯甲酮(
Figure BDA0002378391280000292
184)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(
Figure BDA0002378391280000293
651)。苯乙酮衍生物可以包括2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)。噻吨酮可以包括异丙基噻吨酮。
可以产生生物材料的单体单元的特定混合物以改变聚合的生物凝胶的最终性质，示例性混合物可以包含约1mg/mL I型胶原-甲基丙烯酸酯、约0.5mg/mL III型胶原、约0.2mg/mL甲基丙烯酸酯化透明质酸、约0.1％曙红Y和约0.1％三乙醇胺。
在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含至少约0.01％的光引发剂。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约10％的光引发剂或更多。在一些情况下，聚合的生物凝胶包含约0.1％的光引发剂。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约0.01％至约0.05％、约0.01％至约0.1％、约0.01％至约0.2％、约0.01％至约0.3％、约0.01％至约0.4％、约0.01％至约0.5％、约0.01％至约0.6％、约0.7％至约0.8％、约0.9％至约1％、约0.01％至约2％、约0.01％至约3％、约0.01％至约4％、约0.01％至约5％、约0.01％至约6％、约0.01％至约7％、约0.01％至约8％、约0.01％至约9％或约0.01％至约10％的光引发剂。
聚合的生物凝胶可以包含约0.05％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含0.1％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.2％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.3％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.4％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.6％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.7％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.8％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约0.9％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.1％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.2％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.3％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.4％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.6％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.7％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.8％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约1.9％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约2％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约2.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约3％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约3.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约4％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约4.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约5.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约6％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约6.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约7％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约7.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约8％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约8.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约9％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约9.5％的光引发剂。聚合的生物凝胶可以包含约10％的光引发剂。
在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含至少约10％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约99％或更多的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约50％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。在一些情况下，聚合的生物凝胶可以包含约10％至约15％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约30％、约10％至约35％、约10％至约40％、约10％至约45％、约10％至约50％、约10％至约55％、约10％至约60％、约10％至约65％、约10％至约70％、约10％至约75％、约10％至约80％、约10％至约85％、约10％至约90％、约10％至约95％或约10％至约99％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。
聚合的生物凝胶可以包含约10％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约15％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约20％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约25％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约30％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约35％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约40％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约45％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约50％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约55％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约60％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约65％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约70％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约75％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约80％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约85％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约90％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约95％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约96％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约97％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约98％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。聚合的生物凝胶可以包含约99％的可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体。
双光子吸收是非线性的，并且无法基于化学物质的单光子吸收特性准确地预测或计算。光反应性化学物质可以在单光子吸收的两倍处或附近具有双光子吸收的峰值，或者在吸收光谱中轻微红移。因此，通过激发聚合反应的催化剂例如EY或TEA的混合物，可以使用900纳米或约900纳米至约1400纳米的波长进行单体材料的聚合。单波长聚合可能足以产生所有结构元件，但是为了进一步加速打印过程，可以通过同一打印设备并进入同一打印室同时采用多个波长。
可聚合单体单元与包含不同吸收带的催化剂的预混合或预反应可允许在不同的波长下进行打印，从而在介质室122内同时形成不同的基于底物的结构元件。因此，可以通过将激光器的激发波长调谐到特定波长来生成某些结构元件，然后可以通过将另一或同一激光器调谐到可以与以更高的效率引发一种材料基底的聚合的不同光引发剂相互作用的不同激发波长来在现有元件周围生成其他结构元件。类似地，不同的波长可以用于不同的结构元件，其中在一些位置期望增加的刚度，而在其他位置期望柔软或弹性的结构。由于可聚合材料的不同物理性质，这可以允许通过简单地以电子方式调谐激光的激发波长、通过在不同激光器之间切换或通过同时投影两个不同的波长来在相同的打印步骤中使用相同的细胞产生潜在的更具刚性、更柔软或更具弹性的结构。
图2A-图2C图示了在介质室122内生成期望的组织的示例性阶段。图2A图示了含有介质126的介质室122，介质126由第一细胞组、可聚合材料和培养基组成。在该实施方案中，可以根据对应于期望组织的脉管结构和微脉管系统的CAD模型，将多光子激光束120的脉冲递送至介质126。在一些情况下，第一细胞组可以包含脉管和/或微脉管细胞，其包括但不限于内皮细胞、微脉管内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮祖细胞、干细胞或其任何组合。因此，介质126的部分可以聚合、交联或反应以形成含细胞的支架128，含细胞的支架128表示期望组织的脉管系统和微脉管系统。在该实施方案中，然后可以通过第一端口130a、第二端口130b、第三端口130c、第四端口130d和第五端口130e排出介质126，以去除第一细胞组和相关联的介质。在一些情况下，介质室122可以包含至少一个端口。在一些情况下，介质室122可以包含至少一个端口至至多100个端口的多个端口。介质室122可以包含至少两个端口。介质室122可以包含至少三个端口。介质室122可以包含至少四个端口。介质室122可以包含至少五个端口。
参考图2B，介质室122可以通过端口130填充有包含第二细胞组、可聚合材料和培养基的介质126。该第二细胞组可以用于在现有的含细胞的支架128周围生成组织结构。在一些情况下，含细胞的支架128可以是脉管支架。打印的脉管支架可以包括内皮细胞、脉管内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮祖细胞、干细胞或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括内皮细胞、微脉管内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮祖细胞、淋巴细胞、T细胞如辅助T细胞和细胞毒性T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、网状细胞、肝细胞或其任何组合。第一细胞组和/或第二细胞组可以包括外分泌的分泌性上皮细胞、激素分泌细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞、肾细胞、胰腺细胞、肺细胞、细胞外基质细胞、肌细胞、血细胞、免疫细胞、生殖细胞、间质细胞或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括外分泌的分泌性上皮细胞，其包括但不限于唾液腺粘液细胞、乳腺细胞、汗腺细胞如外泌汗腺细胞和顶泌汗腺细胞、皮脂腺细胞、II型肺泡细胞或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括激素分泌细胞，其包括但不限于垂体前叶细胞、垂体中叶细胞、大细胞神经分泌细胞、肠道细胞、呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、莱迪希(Leydig)细胞、卵泡膜内层细胞、黄体细胞、肾小球旁细胞、致密斑细胞、极周细胞、系膜细胞、胰岛细胞(如α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞和ε细胞)或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括上皮细胞，其包括但不限于角化上皮细胞如角质形成细胞、基底细胞和毛干细胞、复层屏障上皮细胞(如复层鳞状上皮的表面上皮细胞、上皮的基底细胞和尿道上皮细胞)或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括神经细胞或神经元，其包括但不限于感觉换能器细胞、自主神经元细胞、周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元如中间神经元、纺锤体神经元、锥体细胞、星状细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、神经胶质细胞或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括肾细胞，其包括但不限于壁细胞、足细胞、系膜细胞、远端小管细胞、近端小管细胞、亨利袢细段细胞、集合管细胞、间质肾细胞或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括肺细胞，其包括但不限于I型肺泡细胞、肺泡细胞、毛细血管内皮细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮细胞、支气管平滑肌细胞、气管上皮细胞、小气道上皮细胞细胞或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括细胞外基质细胞，其包括但不限于上皮细胞、成纤维细胞、周细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、骨原细胞、星状细胞、肝星状细胞或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括肌细胞，其包括但不限于骨骼肌细胞、心肌细胞、浦肯野纤维细胞、平滑肌细胞、肌上皮细胞或其任何组合。
第一细胞组和/或第二细胞组可以包括血细胞和/或免疫细胞，其包括但不限于红细胞、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞、破骨细胞、树突细胞、小胶质细胞、嗜中性粒细胞、嗜伊红细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤性T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、网织红细胞或其任何组合。
图2C图示了根据剩余组织的CAD模型，将多光子激光束120的脉冲递送至介质126。因此，介质126的另外的部分可以聚合、交联或反应以在现有的含细胞的支架128(不再可见)周围形成含细胞的结构132，而不损坏或影响现有的脉管支架128。排出介质126、重新填充新介质126以及递送激光能量的步骤可以重复任何次数，以产生期望的复杂组织。
图2D图示了其中可以沿包含介质126的介质室122的底部打印含细胞的支架128的实施方案。因此，支架128可能不是自由静止的或自由漂浮的。多通道输入可以减少与来自一个方向的整体流动相关的剪切力、精细结构的不均匀洗涤(因为整体流动可能无法从小的特征洗涤不需要的细胞)以及新的含细胞介质的不均匀分布(因为其循环进入组织打印室)。多重输入可以同时来自顶部、底部、侧面或所有这三者。多重输入对于组织打印是特别期望的，因为含细胞结构相对脆弱，并且潜在地会被施加与通过室进行的介质交换相关的流体力破坏。图2D示出了，组织可以打印在介质室的底板上方。在一些实施方案中，细胞和组织可以抵靠介质室的底部平齐地打印。另外，该设计可以允许打印的组织易于运输并在激光打印头(聚焦物镜)下定位，并且是可以允许在不暴露于室内空气的情况下进行介质交换和打印的封闭系统。这可能是期望的，因为暴露于室内空气会将感染剂引入细胞培养基中，这可能破坏或完全摧毁有用组织的发育。
激光打印系统
在一方面，本公开内容提供了用于打印三维(3D)生物材料的系统。x、y和z维度可以由本文提供的系统同时访问。用于打印3D生物材料的系统可以包括被配置成含有介质的介质室，该介质包含含有细胞的多个细胞以及一种或多种聚合物前体。该多个细胞可以包括至少一种类型的细胞。该多个细胞可以包括至少两种不同类型的细胞。该系统可以包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源。该系统可以包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室和/或含细胞的室的至少一个能量源。该系统可以包括可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中该一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于：从计算机存储器接收用于打印3D生物材料的计算机指令；以及引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分。
在另一方面，本公开内容提供了用于打印3D生物材料的另外的系统，其包括被配置成含有介质的介质室，该介质包含多个细胞和多种聚合物前体。该系统可以包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源。另外，该系统可以包括可以可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于：(i)从计算机存储器接收用于打印3D生物材料的计算机指令；(ii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分；以及(iii)引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分，其中该第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中该第二多个细胞是与第一多个细胞不同的类型。
一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于在计算机存储器中生成3D生物材料的点云表示或基于线的表示，并且使用该点云表示或基于线的表示来生成计算机存储器中用于打印3D生物材料的计算机指令。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于引导至少一个能量源，以沿着一个或多个另外的能量束路径引导至少一个能量束，从而形成3D生物材料的至少另一部分。
该系统可以包括可操作地耦合到至少一个能量源和/或至少一个光图案化元件的一个或多个计算机处理器。计算机模型的点云表示或基于线的表示可以是全息点云表示或全息基于线的表示。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程以使用光图案化元件重新投影由至少一个能量源照亮的全息图像。
在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于将点云表示或基于线的表示转换为图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于以全息方式投影图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于将图像投影为全息图。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于将图像投影为部分全息图。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于经由算法变换将完整图像集合的点云表示或基于线的表示转换为一系列全息图像。然后，可以通过光图案化元件如空间光调制器(SLM)或数字镜器件(DMD)，通过该系统依次投影该经变换的图像集合，从而利用以2D和/或3D同时分布的投影光在打印室内重新产生投影图像。可以将扩展或加宽的激光束投影到用作全息图像的投影系统的SLM和/或DMD上。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于以全息方式投影图像。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于一次投影全部图像，或者作为视频连续播放，从而以全息方式形成更大的3D结构。
全息照相术是投影多维(例如，2D和/或3D)全息图像或全息图的技术。当能够使介质光聚合的激光被投影为全息图时，激光可以沿着投影的激光路径使介质光聚合、固化、交联、结合、硬化和/或改变介质的物理特性；因此，激光可以允许打印3D结构。全息照相术可能需要光源如激光或相干光源来产生全息图像。全息图像可以随时间恒定或随时间变化(例如，全息视频)。此外，全息照相术可能需要快门以打开或移动激光路径，分束器以将激光分裂成分开的路径，反射镜以引导激光路径，发散透镜以扩展光束，以及附加的图案化或光引导元件。
可以通过用发散透镜扩展激光束并将扩展后的激光束引导至全息图和/或至少一个图案形成元件(诸如例如，空间光调制器或称SLM)上来产生物体的全息图像。图案形成元件可以将包括全息图像的图案编码为激光束路径。图案形成元件可以将包括部分全息图的图案编码为激光束路径。随后，可以将图案引导向并聚焦在包含打印材料(即，包含多个细胞和聚合物前体的介质)的介质室中，在该介质室中可以激发在打印材料中(即，在介质中)发现的光反应性光引发剂。随后，光反应性光引发剂的激发可以导致基于聚合物的打印材料的光聚合，并以期望的图案(即，全息图像)形成结构。在一些情况下，一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于通过沿不同的能量束路径引导能量源来投影全息图像。
在一些情况下，至少一个能量源可以是多个能量源。多个能量源可以引导多个至少一个能量束。能量源可以是激光器。在一些实例中，激光器可以是纤维激光器。例如，纤维激光器可以是具有活性增益介质的激光器，该活性增益介质包括掺杂有稀土元素诸如例如，铒、镱、钕、镝、镨、铥和/或钬的光纤。能量源可以是短脉冲激光器。能量源可以是飞秒脉冲激光器。飞秒脉冲激光器可以具有小于或等于约500飞秒(fs)、250fs、240fs、230fs、220fs、210fs、200fs、150fs、100fs、50fs、40fs、30fs、20fs、10fs、9fs、8fs、7fs、6fs、5fs、4fs、3fs、2fs、1fs或更小的脉冲宽度。飞秒脉冲激光器可以是例如钛:蓝宝石(Ti:Sa)激光器。至少一个能量源可以衍生自相干光源。
相干光源可以提供具有约300纳米(nm)至约5毫米(mm)的波长的光。相干光源可以包括约350nm至约1800nm或约1800nm至约5mm的波长。相干光源可以提供具有至少约300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1mm、1.1mm、1.2、mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、3mm、4mm、5mm或更大的波长的光。
计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于引导至少一个能量源，以沿着一个或多个另外的能量束路径引导至少一个能量束，从而形成3D生物材料的至少另一部分。一个或多个另外的能量束路径可以沿着x轴、x和y平面或者x、y和z平面。一个或多个另外的能量束路径可以沿着x轴。一个或多个另外的能量束路径可以沿着y轴。一个或多个另外的能量束路径可以沿着z轴。能量束路径可以在同一轴上与一个或多个其他束会聚。一个或多个另外的能量束路径可以在x和y平面中。一个或多个另外的能量束路径可以在x和z平面中。一个或多个另外的能量束路径可以在y和z平面中。一个或多个另外的能量束路径可以在x、y和z平面中。
该系统还可以包括至少一个物镜，用于将至少一个能量束引导至介质室中的介质。在一些情况下，至少一个物镜可以包括水浸没式物镜。在一些情况下，至少一个物镜可以包括水浸没式物镜。在一些情况下，至少一个物镜可以包括水浸渍式物镜。在一些情况下，至少一个物镜可以包括油浸没式物镜。在一些情况下，至少一个物镜可以包括消色差物镜、半复消色差物镜、plan物镜、浸没式物镜、惠更斯物镜、拉姆斯登物镜、periplan物镜、补偿物镜、宽场物镜、超场物镜、聚光镜物镜或其任何组合。聚光镜物镜的非限制性示例可以包括阿贝聚光镜、消色差聚光镜和通用聚光镜。
一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于接收3D生物材料的边缘的图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于接收3D生物材料的外表面的图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于接收3D生物材料的内表面的图像。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于接收3D生物材料的内部的图像。
一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于引导3D生物材料与其他组织的连接，该连接可以根据计算机指令。一个或多个计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于将3D打印材料与已打印的结构直接连接、合并、结合或焊接，该连接根据计算机模型。在一些情况下，将3D生物材料与其他组织连接可能涉及化学交联、机械连接和/或粘结耦合。
在另一方面，该系统可以包括被配置成含有介质的介质室，该介质包含多个细胞和多种聚合物前体。该系统可以包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源。该系统可以包括可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中该一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于：在计算机存储器中接收3D生物材料的计算机模型；在计算机存储器中生成3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示；引导至少一个能量源，以根据3D生物材料的计算机模型沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D生物材料的至少一部分；以及引导至少一个能量源，以根据3D生物材料的计算机模型沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D生物材料的至少第二部分，其中该第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中该第二多个细胞是与第一多个细胞不同的类型。
在细胞结构的激光打印中，使用最低毒性的激光激发快速生成三维结构对于维持细胞活力至关重要，并且在功能性组织打印的情况下，对于大幅面、高分辨率的多细胞组织生成必不可少。双光子打印的其他方法可以依赖于在二维平面(x,y)中对双光子激发进行光栅扫描(例如，选择性激光烧结)，同时在z方向上移动显微镜或台以产生三维结构。该技术对于大幅面多细胞组织打印可能会过慢，使得不太可能在复杂结构的打印期间维持细胞活力。某些具有高聚合速率的水凝胶也可以用于组织片的二维投影，该组织片是定时的使得每一步都在x、y或z平面上投影结构的一个切片。附加地，还可以利用表示片或包括正交切片的混合平面角。在快速聚合水凝胶的情况下，这些投影可以在与组织打印相容的时间尺度上起作用，而激光烧结或光栅扫描(例如，逐层沉积)对于构建复杂结构可能会过慢。
本公开内容的激光打印系统110可以配备有物镜124，物镜124可以允许在横向和轴向平面上聚焦三维或二维全息投影，以快速产生含细胞的结构。物镜124可以是水浸没式物镜、空气物镜或油浸没式物镜。在一些情况下，激光打印系统110可以包括具有多条激光线的激光系统116，并且可以能够经由全息投影到含细胞的介质中来进行图像的三维全息投影用于光刻。
图3A图示了具有第一多光子激光源140a的激光系统116的实施方案。此处，多光子激光束激光线一可以通过空间光调制器(SLM)以视频速率或更快的刷新速率反射以进行图像投影，从而允许所投影的三维结构中的快速变化。
在一些情况下，空间光调制器(SLM)可以用于打印3D生物材料。在一些情况下，本文提出的方法可包括在计算机存储器中接收3D生物材料的计算机模型，并进一步处理计算机模型，以便将计算机模型“切片”为层，从而产生每层的二维(2D)图像。该计算机模型可以是计算机辅助设计(CAD)模型。本文公开的系统可以包括至少一个计算机处理器，该计算机处理器可以被单独地或共同地编程用于基于确定待打印3D生物材料的边界轮廓和/或填充顺序的“经切片的”计算机模型来计算激光扫描路径。全息3D打印可以与本文所述的一种或多种聚合物前体一起使用。SLM可以与本文所述的两种或多种聚合物前体一起使用。
空间光调制器(SLM)是电可编程器件，其可以根据固定的空间(即，像素)图案在空间和时间上调制光波的幅度、相位、偏振、传播方向、强度或其任何组合。SLM可以是基于半透明的，例如液晶显示器(LCD)微型显示器。SLM可以是基于反射的，例如硅上液晶(LCOS)微型显示器。SLM可以是微通道空间光调制器(MSLM)、平行对准的向列液晶空间光调制器(PAL-SLM)、可编程相位调制器(PPM)、相位空间光调制器(LCOS-SLM)或其任何组合。LCOS-SLM可以包括芯片，该芯片包括布置在硅衬底顶部上的液晶层。可以通过使用半导体技术在芯片的硅衬底上建立电路。LCOS-SLM芯片的顶层可以包含能够独立控制其电势的铝电极。可以在保持由液晶材料填充的恒定间隙的同时将玻璃衬底放置在硅衬底上。液晶分子可以通过硅和玻璃衬底中提供的对准控制技术平行对准。可以逐像素地控制跨该液晶层的电场。可以通过控制电场来调制光的相位；电场的变化可能导致液晶分子相应地倾斜。当液晶分子倾斜时，液晶折射率可能改变，从而进一步改变光路长度，导致相位差。
可以使用SLM打印3D生物材料。可以使用硅上液晶(LCOS)-SLM打印3D生物材料。可以使用液晶SLM打印3D生物材料。可以使用SLM投影3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示。本文公开的方法可以包括将点云表示或基于线的表示转换为全息图像。可以使用SLM投影3D生物材料的计算机模型的全息图像。可以使用SLM调制3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示的光的相位。可以使用SLM调制3D生物材料的计算机模型的全息图像的光的相位。
还可以通过单独使用双数字微镜器件(DMD)系统或与空间光调制器(SLM)组合使用来实现三维的多光子激发的投影。可以使用本文所述的方法将一对DMD与一对SLM一起使用，来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用至少一个SLM和至少一个DMD来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用一对SLM来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用一对DMD来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用至少一个SLM来打印3D材料。可以使用本文所述的方法使用至少一个DMD来打印3D材料。DMD是电输入、光输出的微电子机械系统(MEMS)，其允许高速、高效和可靠的空间光调制。DMD可以包括以矩形阵列布置的多个微镜(通常为数十万或数百万的数量级)。DMD中的每个微镜可以对应于待显示的图像的像素，并且可以旋转约例如10-12°至“开启”或“关闭”状态。在“开启”状态下，来自投影仪灯泡的光可以反射到微镜中，从而使其对应的像素在屏幕上显得明亮。在“关闭”状态下，可以将光引导引导至其他位置(通常引导至散热器上)，从而使微镜的对应像素显得黑暗。DMD中的微镜可以由高反射率的铝组成，并且其横向长度为大约16微米(μm)。每个微镜可以建立在相关联的半导体存储单元的顶部上并且安装在轭架上，该轭架转而经由扭转铰链连接到一对支柱。每个微镜的运动角度可以通过向每个下方的半导体存储单元加载“1”或“0”来控制。随后施加电压，这可以使每个微镜经由静电吸引而围绕扭转铰链静电偏转到相关联的+/-角度状态。
参考图3A-图3C，可以添加可选的光束扩展器，然后添加贝塞尔光束发生透镜，该透镜是固定的轴棱锥透镜或可调的声梯度(TAG)透镜，以改变激光器的性质从而实现更高的分辨率和更大的组织打印深度，特别是在混浊溶液中。利用快速切换反射镜将可包括可选的光束扩展器和/或贝塞尔光束发生透镜的激光线引导至不同的投影系统，这些投影系统在形成与组织打印相关联的特定结构方面具有材料优势。在一些情况下，与两个SLM系统能够达到的分辨率相比，高分辨率DMD反射镜结合SLM系统可以达到更高的轴向分辨率。最后，可以将激光线与单个DMD或SLM系统结合反射镜一起使用，以允许在任何轴面中对二维图像进行无扫描投影。还可以通过扫描镜在较大的视场上对3D投影图案进行光栅扫描，其中在激光发射图案中，控制波长和/或功率以匹配光栅扫描速度，使得可以沉积粘结且复杂的结构。在包含多于一条激光线的系统中，配置可以是双SLM、双DMD、单SLM、单DMD或简单平面扫描的任何组合。
在一些情况下，如图3A-图3C所示光路的一个或多个光路可以独立地使用或协同使用。在光路内聚焦和分布光束或能量束的透镜、光栅和反射镜可以放置在主要的波前整形元件之间，以分布通过关键元件的光或调制入射光(在光栅的情况下)，如图3A中所述。用于聚焦、分布或削波输入激光的目的，可以将至少一个光栅或反射镜放置在波前整形元件“F”之间(即，在SLM、DMD和/或TAG透镜之间)。光波前整形器件F可以包括SLM、LCOS-SLM、DMD、TAG透镜或其任何组合。
在一些情况下，可以使用DMD打印3D生物材料。可以使用DMD投影3D生物材料的计算机模型的点云表示或基于线的表示。本文公开的方法可以包括将该点云表示或基于线的表示转换为全息图像。可以使用DMD投影3D生物材料的计算机模型的全息图像。可以使用DMD打印3D生物材料。
在一些情况下，在本文公开的方法中可以使用至少一个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。至少一个SLM和至少一个DMD的组合可以串联地布置。至少一个SLM和至少一个DMD的组合可以并联地布置。当用于打印3D生物材料时，可以串联地布置任何数目的SLM和任何数目的DMD。当用于打印3D生物材料时，可以并联地布置任何数目的SLM和任何数目的DMD。
可以使用至少两个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少三个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少四个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少五个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少十个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少二十个SLM和至少一个DMD的组合来打印3D生物材料。
可以使用至少一个SLM和至少两个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少三个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少四个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少五个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少十个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少一个SLM和至少二十个DMD的组合来打印3D生物材料。
可以使用至少两个SLM和至少两个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少三个SLM和至少三个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少四个SLM和至少四个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少五个SLM和至少五个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少十个SLM和至少十个DMD的组合来打印3D生物材料。可以使用至少二十个SLM和至少二十个DMD的组合来打印3D生物材料。
可以使用液晶SLM来打印3D生物材料。可以使用多个SLM来打印3D生物材料。多个SLM可以串联地布置。多个SLM可以并联地布置。可以使用至少一个或多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少两个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少三个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少四个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少五个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少二十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约五十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约二十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约十五个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约十个或更多个SLM来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约五个或更多个SLM来打印3D生物材料。
可以使用多个DMD来打印3D生物材料。多个DMD可以串联地布置。多个DMD可以并联地布置。可以使用至少一个或多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少两个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少三个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少四个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少五个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少二十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约五十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约二十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约十五个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约十个或更多个DMD来打印3D生物材料。可以使用至少一个至约五个或更多个DMD来打印3D生物材料。
在该设计中，SLM可以指液晶SLM，并且DMD的功能可以类似于SLM。这些激光可以由一个或多个计算机输入控制，以解决多条激光线的位置和打印时序的问题。图3A中图示了包括可选的串联激发路径的光路的示例性总体设计，并且元件的进一步描述提供于表1中。由于双光子激发光的包之间的脉冲宽度较大，因此这些激光线的任何组合(可以是无干扰的)可同时用于打印和具有同时成像的打印。这可以允许光束之间的干涉非常低，使得光束不相交。因此，如图3B-图3C所示，使用具有最小干扰至无干扰的多条激光线是可能的，并且元件的进一步描述也提供于表1中。该配置中的群延迟色散光学元件可以用于使双光子包色散，使得如果要在某些配置中使用，则峰值功率输出不会损坏纤维光缆。另外，群延迟色散可以将光子集中到较短的脉冲宽度中，使得在焦点处或投影的图像中给予更多的能量，从而允许更快的打印。
可以在时间上控制双光子激发脉冲，使得在单个点处的激发以长度为飞秒至纳秒范围内的脉冲(取决于激光调谐)发生，同时这些光子包之间的时序比脉冲宽度长三到六个数量级。当使用串联的多条激光线时，这可以允许最小的激光激发交叉路径干扰，从而使用多个激光器进行同时打印。用于结构沉积的目的，在三个不同的理论波长下的多激光投影的实例在图3B中示出。多光子激光器是可调的；因此，它们可以允许选择一系列波长。这在组织打印中是有利的，其中可以组合或串联地使用响应于不同波长的用于聚合的不同光引发剂，以防止剩余材料的不需要的聚合。因此，这些激光线中的每一条可以被调谐到不同的多光子输出波长，可以具有不同的峰值功率输出，并且可以投影包括组织结构的CAD图像的不同元件。
表1.图3A-图3C的元件描述
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Figure BDA0002378391280000471
Figure BDA0002378391280000481
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图4A-图4B示出了在轴棱锥或可调声梯度(TAG)透镜之前的可选的光束扩展器的放置。这可以允许产生贝塞尔光束，目的是在打印期间增加组织和混浊介质中的深度穿透，而不损失聚焦保真度。该特征可以提高通过混浊介质或已形成的组织的打印深度，而不损失功率。
在双重SLM或DMD组合之后，可以使用透镜来加宽或预聚焦激光。此外，可以在聚焦光学器件之前添加计算机控制的激光衰减器件或滤光轮，以控制在打印位点处输出的激光功率。
图4C图示了将激光束投影到光束收集器B上的激光源A。在离开光束收集器B后，激光束可以被引导至光学TAG或轴棱锥C，并进一步引导至可移动的单个SLM或DMD D，以进行2D的x,y片状投影以供在以给定的Z步长打印的细胞和所得结构周围进行胶原网打印。可以将激光束从SLM或DMD D引导至反射镜G中，然后反射到打印头光学器件H上。在该实例中，可以使用单个SLM产生二维(2D)投影，其具有与投影的帧速率匹配的z马达步进移动。Z堆栈切片的二维视频投影可以通过单个DMD或单个SLM(具有定时的z移动)来实现，使得每个步骤从上向下投影打印2D图像的不同图像。在另一实施方案中，可以使用多光子或替代性激光激发源从侧面、自下而上或不同的接合处并且逐个切片地、2D投影地和打印地投影复杂的结构。CAD图像F的来源可以从计算机E引导至系统中。该系统可以包括可以匹配步进率(毫秒至秒)和Z投影的步长大小的电动台I。步长大小可以在微米至纳米的数量级。在图4C中，1、2和3图示了平面投影构建步骤的实例。
图12图示了三维打印系统的实施方案的光学组件和光路。图12中所示的光学组件和光路可以提供可以不使用时间聚焦的三维打印系统。该三维打印系统可以包括能量源1000。能量源1000可以是相干光源。能量源1000可以是激光。能量源1000可以是飞秒脉冲激光器光源。能量源1000可以是第一激光源140a、第二激光源140b或第三激光源140c。能量源1000可以是多光子激光束120。能量源1000可以是双光子激光束。能量源1000可以由计算机系统1101控制。能量源1000可以由计算机系统1101调谐。计算机系统1101可以在打印过程之前或期间控制和/或设置能量源1000的能量波长。计算机系统1101可以通过设置能量源1000的波长来产生不同的激发波长。
能量源1000可以是脉冲的。能量源1000可以以约500千赫兹(kHz)的速率进行脉冲。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少10微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至20μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少40微焦耳(μJ)至80μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少120微焦耳(μJ)至160μJ或更大的脉冲能量(每包)。
能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约10μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约30μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约40μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约50μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约60μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约70μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约80μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约90μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约110μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约120μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约130μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约140μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约150μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约160μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约170μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约180μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约190μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约200μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约1,000,000μJ的脉冲能量(每包)。
能量源1000(例如，激光)可以提供具有约至少300nm至约5mm或更大的波长的能量束(例如，光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约至少600nm至约1500nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约至少350nm至约1800nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约至少1800nm至约5mm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1100nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1500nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约1900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约2000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约3000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约4000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1000(例如，激光)可以提供具有约5000nm的波长的能量(例如，激光束)。
如图12所示，能量源1000可以通过快门1004投影激光束1002。一旦激光束1002离开快门1004，就可以将激光束1002引导通过旋转半波片1006。旋转半波片可以是具有特定双折射量的透明片，其可以主要用于操纵光束的偏振状态。旋转半波片可以具有慢轴和快轴(即，两个偏振方向)，其可以均垂直于激光束1002的方向。旋转半波片1006可以改变激光束1002的偏振状态，使得两个线性偏振方向之间的相位延迟的差异为π。相位延迟的差异可以对应于在λ/2的距离上的传播相移。其他类型的波片可以与本文公开的系统一起使用；例如，可以使用旋转四分之一波片。旋转半波片1006可以是真零级波片、低级波片或多级波片。旋转半波片1006可以由晶体石英(SiO2)、方解石(CaCO3)、氟化镁(MgF2)、蓝宝石(Al2O3)、云母或双折射聚合物组成。
激光束1002可以离开旋转半波片1006，并且可以被引导通过偏振分束器1008。偏振分束器1008可以将激光束1002分成第一激光束1002a和第二激光束1002b。第一激光束1002a可以被引导至光束收集器1010。光束收集器1010是可以用于吸收激光束的杂散部分的光学元件。光束收集器1010可以吸收第一激光束1002a。第一激光束1002a可以是杂散激光束。光束收集器1010可以吸收第二激光束1002b。第二激光束1002b可以是杂散激光束。激光束1002可以整体上被引导至束流收集器1010中，因此可以用作打印系统的默认“关闭”状态。第二激光束1002b可以被引导至光束扩展器1012。光束扩展器1012可以扩展激光束1002b的大小。光束扩展器1012可以将输入的第二激光束1002b的直径增加到输出的扩展的激光束1054的较大直径。光束扩展器1012可以是棱柱形光束扩展器。光束扩展器1012可以是伸缩式光束扩展器。光束扩展器1012可以是多棱镜光束扩展器。光束扩展器1012可以是伽利略光束扩展器。光束扩展器1012可以提供约2X、3X、5X、10X、20X或40X的光束扩展器能力。光束扩展器1012可以提供约2X至约5X的光束扩展器能力。光束扩展器1012可以提供约2X至约5X的连续光束扩展。光束扩展器1012可以提供约5X至约10X的光束扩展器能力。光束扩展器1012可以提供约5X至约10X的连续光束扩展。扩展的激光束1054可以在离开光束扩展器1012时被准直。
在离开光束扩展器1012之后，可以将扩展的激光束1054引导至第一反射镜1014a，该第一反射镜1014a可以将扩展的激光束1054重引导至空间光调制器(SLM)1016。SLM 1016可以由计算机系统1101控制。SLM 1016可以被引导以使用本文公开的方法和系统来投影待打印的材料的特定图像或图像的特定部分。待打印的材料可以是生物材料。生物材料可以是三维生物材料。特定图像或图像的特定部分可以是一维、二维和/或三维的。SLM 1016可以被引导以在不同波长的光中同时投影至少一个图像。SLM 1016可以被引导以通过使用反射镜而不是使用计算机系统1101来投影待打印的材料的不同方面。在一些情况下，可以使用至少一个反射镜来重引导或者“关闭”或“开启”特定的光路或激光束，以便打印待打印材料的不同方面或部分。
在离开SLM 1016后，可以将扩展的激光束1054引导至f1透镜1018。f1透镜1018可以是聚焦透镜。在离开f1透镜1018后，可以将扩展的激光束1054引导至阻挡元件1020。阻挡元件1020可以是不可移动的。阻挡元件1020可以抑制来自零级斑的照明。零级可以是来自扩展的激光束1054的能量的一部分，其未发生衍射，并且行为遵循反射和折射的定律。在离开阻挡元件1020后，可以将扩展的激光束1054引导通过f2透镜1022。f2透镜可以是聚焦透镜。
在离开f2透镜1022后，可以将扩展的激光束1054引导至第二反射镜1014b上并且可以随后引导至第三反射镜1014c上。第三反射镜1014c可以将扩展的激光束1054重引导通过长通二向色镜1024。第一反射镜1014a、第二反射镜1014b和/或第三反射镜1014c可以包括红外(IR)涂层以改善反射率。第一反射镜1014a、第二反射镜1014b和/或第三反射镜1014c可以不包括红外(IR)涂层。IR涂层的非限制性实例包括基于保护的金的涂层和基于保护的银的涂层。第一反射镜1014a、第二反射镜1014b和/或第三反射镜1014c可以用计算机系统1101控制。计算机系统1101可以将第一反射镜1014a、第二反射镜1014b和/或第三反射镜1014c“开启”或“关闭”，以便根据需要重引导扩展的激光束1054。
二向色镜可以是短通二向色镜。长通二向色镜1024可以将扩展的激光束1054反射到聚焦物镜1032中。在一些情况下，可以使用光束组合器将扩展的激光束1054重引导至聚焦物镜1032中，而不是使用长通二向色镜1024。可以用计算机系统1101控制长通二向色镜1024以将扩展的激光束1054重引导至聚焦物镜1032中。聚焦物镜1032可以在扩展的激光束1054投影到打印室1034中时使其集中。打印室1034可以是介质室122。打印室1034可以包括含细胞的介质、多个细胞、细胞成分(例如，细胞器)和/或至少一种聚合物前体。
可以使用发光二极管(LED)准直器1040作为准直的LED光1056的来源。LED准直器1040可以包括准直透镜和LED发射器。LED可以是无机LED、高亮度LED、量子点LED或有机LED。LED可以是单色LED、双色LED或三色LED。LED可以是蓝光LED、紫外光LED、白光LED、红外光LED、红光LED、橙光LED、黄光LED、绿光LED、蓝紫光LED、粉红光LED或紫光LED。LED准直器1040可以将准直的LED光1056的光束投影通过f4透镜1038。f4透镜1038可以是聚焦透镜。一旦准直的LED光1056透射通过f4透镜1038，就可以将准直的LED光1056引导至聚光物镜1036中。聚光物镜1036可以将准直的LED光1056聚焦到打印室1034中。聚光物镜1036可以将准直的LED光1056聚焦到样品介质中。聚光物镜1036可以将准直的LED光1056聚焦到含细胞的介质中。准直的LED光1056可以透射通过打印室1034并进入聚焦物镜1032。一旦准直的LED光1056离开聚焦物镜1032，就可以将准直的LED光1056引导至长通二向色镜1024上。从长通二向色镜1024反射离开的准直的LED光1056可以是样品发射1026。长通二向色镜1024可以将样品发射1026重引导至f3透镜1028中。f3透镜1028可以是聚焦透镜。一旦样品发射1026透射通过f3透镜1028，则检测系统1030检测和/或收集样品发射1026以供成像。检测系统1030可以包括至少一个光电倍增管(PMT)。检测系统1030可以包括至少一个相机。相机可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机、科学级CMOS相机、电荷耦合器件(CCD)相机或电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)。检测系统1030可以包括至少一个基于阵列的检测器。
图13图示了三维打印系统的又一实施方案的光学组件和光路。图13中所示的光学组件和光路提供可以使用时间聚焦的三维打印系统。三维打印系统可以包括能量源1100。能量源1100可以是相干光源。能量源1100可以是激光。能量源1100可以是飞秒脉冲激光器光源。能量源1100可以是第一激光源140a、第二激光源140b或第三激光源140c。能量源1100可以是多光子激光束120。能量源1100可以是双光子激光束。能量源1100可以由计算机系统1101控制。能量源1100可以由计算机系统1101调谐。计算机系统1101可以在打印过程之前或期间控制和/或设置能量源1100的能量波长。计算机系统1101可以通过设置能量源1100的波长来产生不同的激发波长。
能量源1100可以是脉冲的。能量源1100可以以约500千赫兹(kHz)的速率进行脉冲。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少10微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至20μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少40微焦耳(μJ)至80μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少120微焦耳(μJ)至160μJ或更大的脉冲能量(每包)。
能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约10μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约30μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约40μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约50μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约60μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约70μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约80μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约90μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约110μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约120μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约130μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约140μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约150μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约160μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约170μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约180μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约190μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约200μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有脉冲能量(每包)。
能量源1100(例如，激光)可以提供具有约300nm至5mm、600nm至1500nm、350nm至1800nm或1800nm至5mm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1100(例如，激光)可以提供具有至少约300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1mm、1.1mm、1.2、mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、3mm、4mm、5mm或更大的波长的能量(例如，激光束)。
如图13所示，能量源1100可以通过快门1104投影激光束1102。一旦激光束1102离开快门1104，就可以将激光束1102引导通过旋转半波片1106。旋转半波片1106可以改变激光束1102的偏振状态，使得两个线性偏振方向之间的相位延迟的差异为π。相位延迟的差异可以对应于在λ/2的距离上的传播相移。其他类型的波片可以与本文公开的系统一起使用；例如，可以使用旋转四分之一波片。旋转半波片1106可以是真零级波片、低级波片或多级波片。旋转半波片1106可以由晶体石英(SiO2)、方解石(CaCO3)、氟化镁(MgF2)、蓝宝石(Al2O3)、云母或双折射聚合物组成。
激光束1102可以离开旋转半波片1106，并且可以被引导通过偏振分束器1108。偏振分束器1108可以将激光束1102分成第一激光束1102a和第二激光束1102b。第一激光束1102a可以被引导至光束收集器1110。光束收集器1110是可以用于吸收激光束的杂散部分的光学元件。光束收集器1110可以吸收第一激光束1102a。第一激光束1102a可以是杂散激光束。光束收集器1110可以吸收第二激光束1102b。第二激光束1102b可以是杂散激光束。激光束1102可以整体上被引导至束流收集器1110中，因此可以用作打印系统的默认“关闭”状态。第二激光束1102b可以被引导至光束扩展器1112。光束扩展器1112可以扩展第二激光束1102b的大小。光束扩展器1112可以将输入的第二激光束1102b的直径增加到输出的扩展的激光束1154的较大直径。光束扩展器1112可以是棱柱形光束扩展器。光束扩展器1112可以是伸缩式光束扩展器。光束扩展器1112可以是多棱镜光束扩展器。光束扩展器1112可以是伽利略光束扩展器。光束扩展器1112可以提供约2X、3X、5X、10X、20X或40X的光束扩展器能力。光束扩展器1112可以提供约2X至约5X的光束扩展器能力。光束扩展器1112可以提供约2X至约5X的连续光束扩展。光束扩展器1112可以提供约5X至约10X的光束扩展器能力。光束扩展器1112可以提供约5X至约10X的连续光束扩展。扩展的激光束1154可以在离开光束扩展器1112时被准直。
在离开光束扩展器1112之后，可以将扩展的激光束1154引导至第一反射镜1114a，第一反射镜1114a可以将扩展的激光束1154重引导至第一空间光调制器(SLM)1116a。在离开第一SLM 1116后，可以将扩展的激光束1154引导至f1透镜1118。f1透镜1118可以是聚焦透镜。在离开f1透镜后，可以将扩展的激光束1154引导至光栅1142。光栅1142可以是衍射激光分束器。光栅1142可以是全息光栅。光栅1142可以是刻划光栅。光栅1142可以是亚波长光栅。光栅1142可以将扩展的激光束1154分裂和/或衍射成多个扩展的激光束(在图13中未示出)。光栅1142可以充当色散元件。一旦扩展的激光束1154被光栅1142分裂、衍射和/或分散，则扩展的激光束1154可以透射通过f2透镜1122。f2透镜1122可以是聚焦透镜。在离开f2透镜1122后，可以将扩展的激光束1154引导至第二SLM 1116b。SLM(即，第一SLM 1116a和第二SLM 1116b)可以由计算机系统1101控制。如上所述的SLM可以执行图12中所示的SLM1016的所有功能。
在离开第二SLM 1116b后，可以将扩展的激光束1154引导至f3透镜1128。f3透镜1128可以是聚焦透镜。在离开f3透镜后，可以将扩展的激光束1154引导至阻挡元件1120。阻挡元件1120可以是不可移动的。阻挡元件1120可以用于抑制来自零级斑的照明。在离开阻挡元件1120后，可以将扩展的激光束1154引导通过f4透镜1138。f4透镜1138可以是聚焦透镜。在离开f4透镜1138后，可以将扩展的激光束1154引导至第二反射镜1114b上并且可以随后引导至第三反射镜1114c上。第三反射镜1114c可以将扩展的激光束1154重引导通过长通二向色镜1124。第一反射镜1114a、第二反射镜1114b和/或第三反射镜1114c可以用计算机系统1101控制。计算机系统1101可以将第一反射镜1114a、第二反射镜1114b和/或第三反射镜1114c“开启”或“关闭”，以便根据需要重引导扩展的激光束1154。二向色镜可以是短通二向色镜。长通二向色镜1124可以将扩展的激光束1154反射到聚焦物镜1132中。在一些情况下，可以使用光束组合器将扩展的激光束1154重引导至聚焦物镜1132中，而不是使用长通二向色镜1124。可以用计算机系统1101控制长通二向色镜1124以将扩展的激光束1154重引导至聚焦物镜1132中。聚焦物镜1132可以在扩展的激光束1154投影到打印室1134中时使其集中。打印室1134可以是介质室122。打印室1134可以包括含细胞的介质、多个细胞、细胞成分(例如，细胞器)和/或至少一种聚合物前体。
打印室1134可以安装在可移动台1146上。可移动台1146可以是xy台、z台和/或xyz台。可移动台1146可以手动定位。可移动台1146可以自动定位。可移动台1146可以是机动台。可移动台1146可以由计算机系统1101控制。计算机系统1101可以控制可移动台1146在x、y和/或z方向上的移动。计算机系统1101可以将可移动台1146自动定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约3μm的位置精度将可移动台1146定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约2μm的位置精度将可移动台1146定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约1μm的位置精度将可移动台1146定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以在三维打印之前或期间自动调整可移动台1146的位置。计算机系统1101可以包括压电式(压电)控制器，以提供计算机控制的z轴(即，垂直方向)定位和有源位置反馈。计算机系统1101可以包括操纵杆控制台，以使用户能够控制可移动台1146的位置。操纵杆控制台可以是z轴控制台和/或x轴和y轴控制台。可移动台1146可以包括打印室保持器。打印室保持器可以是托架、夹子和/或凹陷的样品保持器。可移动台1146可以包括多载玻片保持器、载玻片保持器和/或彼得里皿保持器。可移动台1146可以包括传感器以提供位置反馈。传感器可以是电容传感器。传感器可以是压阻传感器。可移动台1146可以包括移动(或定位)可移动台1146的至少一个致动器(例如，压电致动器)。
可以使用发光二极管(LED)准直器1140作为准直的LED光1156的来源。LED准直器1140可以包括准直透镜和LED发射器。LED可以是无机LED、高亮度LED、量子点LED或有机LED。LED可以是单色LED、双色LED或三色LED。LED可以是蓝光LED、紫外光LED、白光LED、红外光LED、红光LED、橙光LED、黄光LED、绿光LED、蓝紫光LED、粉红光LED或紫光LED。LED准直器1140可以将准直的LED光1156的光束投影通过f6透镜1148。f6透镜1148可以是聚焦透镜。一旦准直的LED光1156透射通过f6透镜1148，就可以将准直的LED光1156引导至聚光物镜1136中。聚光物镜1136可以将准直的LED光1156聚焦到打印室1134中。聚光物镜1136可以将准直的LED光1156聚焦到样品介质中。聚光物镜1136可以将准直的LED光1156聚焦到含细胞的介质中。准直的LED光1156可以透射通过打印室1134并进入聚焦物镜1132。一旦准直的LED光1156离开聚焦物镜1132，就可以将准直的LED光1156引导至长通二向色镜1124上。从长通二向色镜1124反射离开的准直的LED光1156可以是样品发射1126。长通二向色镜1124可以将样品发射1126重引导至f5透镜1144中。f5透镜1144可以是聚焦透镜。一旦样品发射1126透射通过f5透镜1144，则检测系统1130检测和/或收集样品发射1126以供成像。检测系统1130可以包括至少一个光电倍增管(PMT)。检测系统1130可以包括至少一个相机。相机可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机、科学级CMOS相机、电荷耦合器件(CCD)相机或电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)。检测系统1130可以包括至少一个基于阵列的检测器。
图14图示了三维打印系统的另外的实施方案的光学组件和光路。图14中所示的光学组件和光路提供可以不使用时间聚焦的三维打印系统。该三维打印系统可以包括能量源1200。能量源1200可以是相干光源。能量源1200可以是激光。能量源1200可以是飞秒脉冲激光器光源。能量源1200可以是第一激光源140a、第二激光源140b或第三激光源140c。能量源1200可以是多光子激光束120。能量源1200可以由计算机系统1101控制。能量源1200可以由计算机系统1101调谐。计算机系统1101可以在打印过程之前或期间控制和/或设置能量源1200的能量波长。计算机系统1101可以通过设置能量源1200的波长来产生不同的激发波长。
能量源1200可以是脉冲的。能量源1200可以以约500千赫兹(kHz)的速率进行脉冲。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至1,000μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少10微焦耳(μJ)至100μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至20μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少1微焦耳(μJ)至50μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少40微焦耳(μJ)至80μJ或更大的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约至少120微焦耳(μJ)至160μJ或更大的脉冲能量(每包)。
能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约10μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约30μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约40μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约50μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约60μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约70μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约80μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约90μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约110μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约120μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约130μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约140μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约150μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约160μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约170μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约180μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约190μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约200μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约20,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有约100,000μJ的脉冲能量(每包)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有能量包的能量(例如，激光束)，该能量包具有脉冲能量(每包)。
能量源1200(例如，激光)可以提供具有例如约至少300nm至约5mm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约至少600nm至约1500nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约至少350nm至约1800nm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约至少1800nm至约5mm或更大的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1200nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1300nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1400nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1500nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1600nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1700nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1800nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约1900nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约2000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约3000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约4000nm的波长的能量(例如，激光束)。能量源1200(例如，激光)可以提供具有约5000nm的波长的能量(例如，激光束)。
如图14所示，能量源1200可以通过快门1104投影激光束1202。一旦激光束1202离开快门1204，就可以将激光束1202引导通过旋转半波片1206。旋转半波片1206可以改变激光束1202的偏振状态，使得两个线性偏振方向之间的相位延迟的差异为π。相位延迟的差异可以对应于在λ/2的距离上的传播相移。其他类型的波片可以与本文公开的系统一起使用；例如，可以使用旋转四分之一波片。旋转半波片1206可以是真零级波片、低级波片或多级波片。旋转半波片1206可以由晶体石英(SiO2)、方解石(CaCO3)、氟化镁(MgF2)、蓝宝石(Al2O3)、云母或双折射聚合物组成。
激光束1202可以离开旋转半波片1206，并且可以被引导通过偏振分束器1208。偏振分束器1208可以将激光束1202分成第一激光束1202a和第二激光束1202b。第一激光束1202a可以被引导至光束收集器1210。光束收集器1210是可以用于吸收激光束的杂散部分的光学元件。光束收集器1210可以吸收第一激光束1202a。第一激光束1202a可以是杂散激光束。光束收集器1210可以吸收第二激光束1202b。第二激光束1202b可以是杂散激光束。激光束1202可以整体上被引导至束流收集器1210中，因此可以用作打印系统的默认“关闭”状态。第二激光束1202b可以被引导至光束扩展器1212。光束扩展器1212可以扩展第二激光束1202b的大小。光束扩展器1212可以将输入的第二激光束1202b的直径增加到输出的扩展的激光束1254的较大直径。光束扩展器1212可以是棱柱形光束扩展器。光束扩展器1212可以是伸缩式光束扩展器。光束扩展器1212可以是多棱镜光束扩展器。光束扩展器1212可以是伽利略光束扩展器。光束扩展器1212可以提供约2X、3X、5X、10X、20X或40X的光束扩展器能力。光束扩展器1212可以提供约2X至约5X的光束扩展器能力。光束扩展器1212可以提供约2X至约5X的连续光束扩展。光束扩展器1212可以提供约5X至约10X的光束扩展器能力。光束扩展器1212可以提供约5X至约10X的连续光束扩展。扩展的激光束1254可以在离开光束扩展器1212时被准直。
在离开光束扩展器1212之后，可以将扩展的激光束1254引导至第一反射镜1214a，第一反射镜1214a可以将扩展的激光束1254重引导至第一空间光调制器(SLM)1216a。在离开第一SLM 1216后，可以将扩展的激光束1254引导至f1透镜1218。f1透镜1218可以是聚焦透镜。在离开f1透镜后，可以将扩展的激光束1254引导至具有阻挡元件的反射镜1250。具有阻挡元件的反射镜1250可以用于抑制来自零级斑的照明。
一旦扩展的激光束1254被具有阻挡元件的反射镜1250反射，则扩展的激光束1254可以透射通过f2透镜1222。f2透镜1222可以是聚焦透镜。在离开f2透镜1222后，可以将扩展的激光束1254引导至第二SLM 1216b。SLM(即，第一SLM 1216a和第二SLM 1216b)可以由计算机系统1101控制。如上所述的SLM可以执行图44和图45中分别所示的SLM 1016和SLM1116的所有功能。
在离开第二SLM 1216b后，可以将扩展的激光束1254引导至f3透镜1228。在离开f3透镜后，可以将扩展的激光束1254引导至阻挡元件1220。阻挡元件1220可以是不可移动的。阻挡元件1220可以用于抑制来自零级斑的照明。在离开阻挡元件1220后，可以将扩展的激光束1254引导通过f4透镜1238。f4透镜1238可以是聚焦透镜。在离开f4透镜1238后，可以将扩展的激光束1254引导至第二反射镜1214b上并且可以随后引导至第三反射镜1214c上。第三反射镜1214c可以将扩展的激光束1254重引导通过长通二向色镜1224。第一反射镜1214a、第二反射镜1214b和/或第三反射镜1214c可以用计算机系统1101控制。计算机系统1101可以将第一反射镜1214a、第二反射镜1214b和/或第三反射镜1214c“开启”或“关闭”，以便根据需要重引导扩展的激光束1254。二向色镜可以是短通二向色镜。长通二向色镜1224可以将扩展的激光束1254反射到聚焦物镜1232中。在一些情况下，可以使用光束组合器将扩展的激光束1254重引导至聚焦物镜1232中，而不是使用长通二向色镜1224。可以用计算机系统1101控制长通二向色镜1224以将扩展的激光束1254重引导至聚焦物镜1232中。聚焦物镜1232可以在扩展的激光束1254投影到打印室1234中时使其集中。打印室1234可以是介质室122。打印室1234可以包括含细胞的介质、多个细胞、细胞成分(例如，细胞器)和/或至少一种聚合物前体。
打印室1234可以安装在可移动台1246上。可移动台1246可以是xy台、z台和/或xyz台。可移动台1246可以手动定位。可移动台1246可以自动定位。可移动台1246可以是机动台。可移动台1246可以由计算机系统1101控制。计算机系统1101可以控制可移动台1246在x、y和/或z方向上的移动。计算机系统1101可以将可移动台1246自动定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约3μm的位置精度将可移动台1246定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约2μm的位置精度将可移动台1246定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以以至多约1μm的位置精度将可移动台1246定位在期望的x、y和/或z位置。计算机系统1101可以在三维打印之前或期间自动调整可移动台1246的位置。计算机系统1101可以包括压电控制器，以提供计算机控制的z轴(即，垂直方向)定位和有源位置反馈。计算机系统1101可以包括操纵杆控制台，以使用户能够控制可移动台1246的位置。操纵杆控制台可以是z轴控制台和/或x轴和y轴控制台。可移动台1246可以包括打印室保持器。打印室保持器可以是托架、夹子和/或凹陷的样品保持器。可移动台1246可以包括多载玻片保持器、载玻片保持器和/或彼得里皿保持器。可移动台1246可以包括传感器以提供位置反馈。传感器可以是电容传感器。传感器可以是压阻传感器。可移动台1246可以包括移动(或定位)可移动台1246的至少一个致动器(例如，压电致动器)。
可以使用发光二极管(LED)准直器1240作为准直的LED光1256的来源。LED准直器1240可以包括准直透镜和LED发射器。LED可以是无机LED、高亮度LED、量子点LED或有机LED。LED可以是单色LED、双色LED或三色LED。LED可以是蓝光LED、紫外光LED、白光LED、红外光LED、红光LED、橙光LED、黄光LED、绿光LED、蓝紫光LED、粉红光LED或紫光LED。LED准直器1240可以将准直的LED光1256的光束投影通过f6透镜1248。f6透镜1248可以是聚焦透镜。一旦准直的LED光1256透射通过f6透镜1248，就可以将准直的LED光1156引导至聚光物镜1236中。聚光物镜1236可以将准直的LED光1256聚焦到打印室1234中。聚光物镜1236可以将准直的LED光1256聚焦到样品介质中。聚光物镜1236可以将准直的LED光1256聚焦到含细胞的介质中。准直的LED光1256可以透射通过打印室1234并进入聚焦物镜1232。一旦准直的LED光1256离开聚焦物镜1232，就可以将准直的LED光1256引导至长通二向色镜1224上。从长通二向色镜1224反射离开的准直的LED光1256可以是样品发射1226。长通二向色镜1224可以将样品发射1226重引导至f5透镜1244中。f5透镜可以是聚焦透镜。一旦样品发射1226透射通过f5透镜1244，则检测系统1230检测和/或收集样品发射1226以供成像。检测系统1230可以包括至少一个光电倍增管(PMT)。检测系统1230可以包括至少一个相机。相机可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机、科学级CMOS相机、电荷耦合器件(CCD)相机或电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)。检测系统1230可以包括至少一个基于阵列的检测器。
图15图示了光检测系统1330。光检测系统1330可以包括多个串联布置的长通二向色镜。光检测系统1330可以包括多个并联布置的长通二向色镜。光检测系统1330可以包括多个串联和并联布置的长通二向色镜。如图44-图46所示，光路可以包括LED准直器，其将准直的LED光1356的光束投影到聚焦物镜上。一旦从第一长通二向色镜1324a反射了准直的LED光1356，就可以将准直的LED光1356转换为样品发射1326。可以将样品发射1326引导通过f5透镜1344。f5透镜1344可以是聚焦透镜。在样品发射1326离开f5透镜1344之后，可以将样品发射1326引导至一系列长通二向色镜，包括第二长通二向色镜1324b、第三长通二向色镜1324c、第四长通二向色镜1324d和第五长通二向色镜1324e，如图15所示。样品发射1326可以被反射离开第二长通二向色镜1324b并反射到第一光检测器1352a上。样品发射1326可以被反射离开第三长通二向色镜1324c并反射到第二光检测器1352b上。样品发射1326可以被反射离开第四长通二向色镜1324d并反射到第三光检测器1352c上。样品发射1326可以被反射离开第五长通二向色镜1324e并反射到第四光检测器1352d上。样品发射1326可以被反射离开第五长通二向色镜1324e并反射到第五光检测器1352e上。光检测器可以是光电倍增管(PMT)。光检测器可以是相机。光检测器可以是互补金属氧化物半导体(CMOS)相机、科学级CMOS相机、电荷耦合器件(CCD)相机或电子倍增电荷耦合器件(EM-CCD)。光检测器可以是基于阵列的检测器。光检测系统1330可以包括具有逐渐红移的截止波长的多个长通二向色镜。在一些情况下，第二长通二向色镜1324b可以具有约460nm的截止波长，第三长通二向色镜1324c可以具有约500nm的截止波长，第四长通二向色镜1324d可以具有约540nm的截止波长，第五长通二向色镜1324e可以具有约570nm的截止波长。
光检测系统1330可以由计算机系统1101控制。计算机系统1101可以收集和/或处理由第一光检测器1352a、第二光检测器1352b、第三光检测器1352c和第四光检测器1352d获得的信号。计算机系统1101可以基于光检测系统1330的光检测器信号向三维打印系统提供控制反馈，该信号可以由计算机系统1101收集和/或处理。计算机系统1101可以具有对图44-图46中描述的光路的任何光学组件和/或硬件的控制反馈。计算机系统1101可以具有对图15中所示的光检测系统1330的任何光学组件和/或硬件的控制反馈。计算机系统1101可以响应于来自光检测系统1330的信号控制例如SLM、快门、可移动台、反射镜、透镜、聚焦物镜、光束扩展器、LED准直器、光栅和/或阻挡元件。
图5A图示了多光子组织打印头118的实施方案。多光子打印头118可以接收来自激光系统116的多光子激光束120(包括一种或多种波长)，并且可以将光束120聚焦通过由最终光学器件组成的最终光路，该最终光学器件由可选的扫描头、用于收集和记录反向散射光的长通镜和聚焦物镜200组成，从而将光束120投影到介质室122中。可以通过与用于打印的同一物镜收集光，然后将其经由长通镜分流到单个或一排PMT或者CCD相机。
在一些设计中，光学器件可以发送激光通过纤维光缆，以更容易地控制光在组织打印器皿中的沉积位置。
本文公开的系统可以利用一定范围的聚焦物镜，例如，放大倍数逐渐降低；视场可能会逐渐增大。在一些情况下，视场可以是在单个投影区域中显微镜能够使用的打印区域。在一些情况下，可以采用5x、10x或20x的物镜。在一些情况下，可以采用具有在至少约0.6至约1.2之间或更大的高数值孔径的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数在例如约1x至约100x范围内的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约1x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约2x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约3x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约4x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约10x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约20x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约40x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约60x的物镜。本文公开的系统可以使用放大倍数为约100x的物镜。
为了维持打印组织的结构保真度，水浸没式物镜可能是理想的，以便与含细胞的液体生物凝胶介质126内的入射角基本上匹配。校正了折射率变化的水浸没式物镜可以用于在液体介质中进行的打印，该液体介质具有与空气的折射率明显不同的折射率。
图5B图示了包括第一物镜200a和第二物镜200b的打印头118。图5B图示了用于成像结构的倒置光学器件。在该实施方案中，可以通过倒置光学器件收集光并且将其传送至如图5B所示的CCD相机、单个PMT，或一排PMT以创建多色图像。在一些实施方案中，第二物镜头可以被倒置并且可以从组织的底侧收集图像，并且通过PMT借助一系列长通镜或带通镜来读取入射光。
为了使基于多光子的打印机从打印模式切换到成像模式，可以进行x,y光栅扫描，并且可以绕过DMD或SLM路径，或者将器件置于关闭或不活动的位置，或者将它们从光路移除，使得只有单条激光线撞击x,y扫描光学器件。在一些情况下，DMD或SLM路径也可以用于成像。
在打印期间，切换到成像模式可能有多种用途：1)成像可用于监测胶原生成速率，因为胶原经由二次谐波发生而自然产生发射，这是在整个结构上扫描双光子激发时的过程，2)使用成像模式可以找到打印组织的边缘，从而促进沿投影空间边缘的血管和其他组织结构的正确连接，3)可以实时验证打印的组织结构的结构完整性和对投影图像的保真度，以及4)如果使用临时标记的细胞，它们可以位于打印的组织内，以进行过程验证或监视。可以理解，以上实施方案的激光系统116可以具有各种软件控制的点，其包括但不限于：可以通过硬连线到SLM和/或DMD器件的更改进行编程来投影CAD图像；如果使用TAG透镜产生贝塞尔光束，则用于在TAG透镜中诱导可调谐声梯度(TAG)所生成的电流可以受到计算机软件的控制；可以通过计算机软件来控制引导单光束实体中的激光激发并可以充当多激光器设计的关闭/开启开关的反射镜；可以通过软件输入来控制经由衰减轮的激光强度和不同频率的调谐；显微镜台的移动可以由软件控制；显微镜物镜或相关光纤光学的移动可以由软件控制；通过移动或打开/关闭状态对倒置物镜的边缘找寻、照明和控制可以由软件控制；任何成像或光路控制件(反射镜、快门、扫描光学器件、SLM、DMD等)均可以由软件控制。
为了适应快速打印，物镜200可以配备有纤维光缆。图6A图示了可移除和可附接的纤维光缆附件250的实施方案。在该实施方案中，附件250可以包括纤维光缆252和配件(图6A-图6B中未示出)，该配件可附接到多光子组织打印打印头(图6A-图6B中未示出)。如图6B所示，随后可以将纤维光缆252定位在介质室122的介质126内。因此，多光子激光束120可以穿过物镜200和纤维光缆252以将激光能量递送至介质126，从而产生期望的复杂组织结构260。为了在打印期间避免移动打印显微镜物镜或包含精妙组织结构的打印器皿，如果需要打印较大的组织区域，可以移动纤维光缆本身。在一些情况下，附件250可以被消毒或更换，使得直接插入介质126不损害无菌性或交叉污染打印的细胞。
根据输入到纤维光缆的功率，多光子激光器可能能够引起对纤维光缆内芯的不可逆损坏。因此，在一些情况下，可以通过有效分散光子以延长激光脉冲来提供由群延迟色散(GDD)诱导的波长啁啾，以最大程度地减小该潜在损坏。这可用于最大程度地减少对打印介质中细胞的损坏或延长纤维光缆的寿命。在这样的情况下，可以在SLM或DMD之后并在进入打印头光学器件118之前，在激光系统116中提供GDD器件。
在一些情况下，可以用单个物镜200或具有附接的光纤附件250的物镜200来执行期望组织的三维打印，其中一至三个不同的配置，每个配置均与不同的激光线相关联并表示可以通过同一物镜200进行脉冲的组织的不同形状或部分。在这样的情况下，可以安装定时快门系统，使得投影的图像之间没有干扰或干扰最小。因此，可以采用激光复用以允许在利用组织结构的相同CAD模型的同时在多个点处同时生成组织结构的部分。同样，激光复用可以利用不同但相邻的基于CAD的组织模型，从而使较大结构打印所需的移动最少，同时进一步减少总体打印时间。例如，脉管床可以具有内部结构，如防止正常循环中静脉回流的较大血管中的瓣膜。这些瓣膜结构可以与血管壁同时打印。在这样的情况下，与瓣膜结构和/或血管壁相关联的支架可能难以单独打印。
在一轮打印期间，可以在整个打印空间中重复瞬时形成的三维结构。在生物系统中，小单元通常可以在整个结构中重复。因此，在一轮打印中重复生成相同结构可能对生成功能性组织有用。可以产生来自相同细胞打印材料的另外的非重复性的精细特征结构和后续结构，这些结构与所打印的第一个结构对齐或连接。
在一些实施方案中，多光子组织打印打印头118可以包括经由第一激光物镜200a、第二激光物镜200b和第三激光物镜200c的多个打印“头”或多光子激发源，如图7-图8所示。图7图示了实施方案，其中多光子组织打印打印头118可以包括第一激光物镜200a、第二激光物镜200b和第三激光物镜200c，其中第一激光物镜200a可以包括第一纤维光缆附件250a，第二激光物镜200b可以包括第二纤维光缆附件250b，并且第三激光物镜200c可以包括第三纤维光缆附件250c。可以将第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b和第三纤维光缆附件250c引导至单个介质室122中。介质室122可以具有开放的顶部或密封的顶部，其具有由每个附件纤维光缆附件(即，经由第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b和第三纤维光缆附件250c)的端口访问。该布置可以提高大型、快速的组织打印的速度，同时维持对最终组织结构的控制。在一些情况下，第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b和第三纤维光缆附件250c可以递送相同组织结构的投影。在其他情况下，第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b和第三纤维光缆附件250c中的每一个可以分别递送不同组织结构的第一激光束投影120a、第二激光束投影120b和第三激光束投影120c。鉴于多个激光物镜的灵活布置以及将纤维光缆引导至介质室122内的相同区域的能力，可以同时打印组织结构。所得的组织结构可以连接在一起或不连接在一起。借助于运动限制的一些考虑以及待考虑的每个另外的激发源的考虑因素，给定组织结构的打印时间可能与激光传输元件的数目具有反比关系。
图8图示了实施方案，其中多光子组织打印打印头118可以包括第一物镜200a、第二物镜200b、第三物镜200c、第四物镜200d、第五物镜200e和第六物镜200f，其中每个物镜可以分别包括分别被引导至单独的第一介质室122a、第二介质室122b、第三介质室122c、第四介质室122d、第五介质室122e和第六介质室122f的第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b、第三纤维光缆附件250c、第四纤维光缆附件250d、第五纤维光缆附件250e和第六纤维光缆附件250f。多个介质室可以是多孔板，其中多孔板的每个孔是单独的单个介质室。在一些情况下，第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b、第三纤维光缆附件250c、第四纤维光缆附件250d、第五纤维光缆附件250e和第六纤维光缆附件250f可以递送相同组织结构的至少一个投影。这同时提供了组织结构的多个拷贝。在其他情况下，第一纤维光缆附件250a、第二纤维光缆附件250b、第三纤维光缆附件250c、第四纤维光缆附件250d、第五纤维光缆附件250e和第六纤维光缆附件250f可以递送不同组织结构的第一多光子激光束投影120a、第二多光子激光束投影120b和第三多光子激光束投影120c。在一些情况下，由于同时产生多个拷贝的能力，可以大大减少打印时间。
在一些实施方案中，多光子组织打印打印头118可以包括物镜的连续阵列，包括第一物镜200a、第二物镜200b和第三物镜200c，如图9所示。在该实施方案中，每个物镜均可以与单独的介质室对准。例如，第一物镜200a可以与第一介质室122a对准，第二物镜200b可以与第二介质室122b对准，第三物镜200c可以与第三介质室122c对准。在一些情况下，多个介质室可以是多孔板300的孔。在一些实施方案中，第一物镜200a、第二物镜200b和第三物镜200c可以递送相同组织结构的投影。在其他情况下，每个孔的激光束投影可能不同。第一物镜200a、第二物镜200b(图10中未示出)和第三物镜200c(图10中未示出)可以被编程用于在x和y方向上在多孔板300上方移动，如图10所示，以将激光束投影递送到每个孔中。替代地，可以理解，物镜可以在多孔板300在x和y方向上移动的同时保持静止。因此，例如，具有三个物镜的连续阵列可以按照以下两步在六孔板中打印组织：同时打印三个组织结构，然后同时打印另三个组织结构。可以理解，可以使用具有任何数目的孔的板，其包括但不限于至少约96个孔至约394个孔，或更多。多孔板300可以包括至少第一介质室122a。多孔板300可以包括至少1个孔。多孔板300可以包括至少4个孔。多孔板300可以包括至少6个孔。多孔板300可以包括至少8个孔。多孔板300可以包括至少12个孔。多孔板300可以包括至少16个孔。多孔板300可以包括至少24个孔。多孔板300可以包括至少48个孔。多孔板300可以包括至少96个孔。多孔板300可以包括至少384个孔。多孔板300可以包括至少1536个孔。
可以理解，在本文所述的实施方案中，显微镜台可以能够移动，显微镜头可以能够移动，和/或附接到打印物镜的相关联的纤维光缆可以能够移动，以便打印更大的空间。
打印器官和类器官的方法
本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的方法和系统。在一方面，用于产生一种或多种免疫蛋白的方法包括提供包含介质的介质室，所述介质包含：(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体。随后，根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，可沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室内的介质。这可形成3D淋巴类器官的至少一部分，其包括：(i)多个细胞的至少亚群，和(ii)由一种或多种聚合物前体形成的聚合物。随后，用于产生一种或多种免疫蛋白的方法可包括使该3D淋巴类器官的至少一部分经历足以刺激一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在另一方面，用于产生一种或多种免疫蛋白的方法包括：(i)打印包含含有多个细胞的基质的三维(3D)淋巴类器官，和(ii)处理该3D淋巴类器官以产生一种或多种免疫蛋白。
在另一方面，用于产生一种或多种免疫蛋白的方法包括：提供包含第一介质的介质室。第一介质可包含第一多个细胞和第一聚合物前体。随后，根据在计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，可沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第一介质，以使介质室中第一介质的至少一部分形成3D淋巴类器官的第一部分。随后，该方法可在介质室中提供第二介质。第二介质可包括第二多个细胞和第二聚合物前体。该第二多个细胞可以是与第一多个细胞不同的类型。随后，该方法可包括根据计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D淋巴类器官的第二部分。随后，该方法可包括使3D淋巴类器官的第一部分和第二部分经历足以刺激一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在另一方面，产生一种或多种免疫蛋白的方法包括：(i)打印三维(3D)淋巴类器官，该3D淋巴类器官包括含有第一多个细胞和第二多个细胞的基质，和(ii)处理该3D淋巴类器官，以产生一种或多种免疫蛋白。
本公开内容的另一方面提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的系统，包括被配置成含有介质的介质室，所述介质包含多个细胞以及一种或多种聚合物前体。该系统可以包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源。该系统可包括可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器。该一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地编程用于从计算机存储器接收用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令。该一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地编程用于引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以使聚合物前体的至少一部分形成3D淋巴类器官的至少一部分。该一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地编程用于使3D淋巴类器官的至少一部分经历足以刺激一种或多种免疫蛋白的产生的条件。该一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地进一步编程用于从3D淋巴类器官的至少一部分提取一种或多种免疫蛋白。
本公开内容的另一方面提供了产生人免疫蛋白群的方法，包括：使用多光子激光生物打印系统来生物打印三维淋巴类器官。随后，该方法可包括将三维淋巴类器官暴露于抗原，以便刺激人免疫蛋白群的产生。随后，该方法可包括从三维淋巴类器官提取人免疫蛋白群。
足以刺激一种或多种免疫蛋白的产生的条件可包括将3D淋巴类器官的至少一部分暴露于抗原，以便刺激一种或多种免疫蛋白的产生。该抗原可选自全肽、部分肽、糖肽、全蛋白或蛋白质亚基、碳水化合物、核酸、活病毒、热灭活的病毒、病毒颗粒、膜结合或稳定的蛋白质、噬菌体展示的抗原以及全细胞。该抗原可以是外源抗原、内源抗原、自身抗原、新抗原或其组合。新抗原在本文中定义为正常人基因组中不存在的抗原。新抗原可以是肿瘤抗原、病毒抗原、工程化抗原或合成抗原。
本公开内容的方法可进一步包括从3D淋巴类器官的至少一部分提取一种或多种免疫蛋白。该一种或多种免疫蛋白可以是人免疫蛋白。免疫蛋白可选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。抗体可以是免疫球蛋白G(IgG)抗体。IgG抗体可以是人IgG抗体。免疫蛋白可以是IgM、IgA、IgE、IgD抗体或其组合。免疫蛋白可以是抗体片段、抗体结构域、免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链或其组合。抗体片段可以是抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)或其组合。免疫蛋白可以是多价重组抗体。多价重组抗体可以是双抗体(即小重组双特异性抗体)、微抗体(即工程化抗体片段)、三抗体、四抗体或其组合。免疫蛋白可以是工程化免疫蛋白、合成免疫蛋白或其组合。合成免疫蛋白可以是核酸适体、非免疫球蛋白蛋白质支架、非免疫球蛋白肽适体、affimer蛋白或其组合。
多个细胞可来自受试者。多个细胞可以是自体的。多个细胞可以是同种异体的。多个细胞可选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。B细胞可选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。T细胞可选自CD8+和CD4+。
3D淋巴类器官可选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。3D淋巴类器官的形状可选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。3D淋巴类器官的形状可以是泪滴形。
3D淋巴类器官的至少一部分的聚合物可形成网络。该聚合物可以是胶原蛋白、透明质酸和其他糖胺聚糖、聚-dl-乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚-l-乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、藻酸盐、明胶、琼脂或其组合。该聚合物可包括细胞外基质组分。用于产生3D淋巴类器官的细胞外基质组分的非限制性实例可包括蛋白聚糖如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角质素，非蛋白聚糖多糖如透明质酸，胶原蛋白，以及弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白，或其任何组合。这些细胞外基质组分可用丙烯酸酯、二丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、肉桂酰、香豆素、胸腺嘧啶或者其他侧基或化学反应性部分进行官能化，以促进由多光子激发直接诱导或由一种或多种化学掺杂剂的多光子激发诱导的交联。在一些情况下，可以将可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体与细胞外基质组分结合使用以产生含细胞结构。可光聚合的大分子单体的非限制性实例可以包括聚乙二醇(PEG)丙烯酸酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物和聚乙烯醇(PVA)衍生物。在一些情况下，用于产生含细胞结构的胶原可以是纤维状胶原如I型、II型、III型、V型和XI型胶原，facit胶原如IX型、XII型和XIV型胶原，短链胶原如VIII型和X型胶原，基底膜胶原如IV型胶原，VI型胶原，VII型胶原，XIII型胶原或其任何组合。
3D淋巴类器官的至少一部分的聚合物可以包含合成的并且不是哺乳动物组织天然的其他可聚合单体，包括生物材料和合成材料的混合物。示例混合物可以包括约0.4％w/v的胶原甲基丙烯酸酯加上添加约50％w/v的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。引导聚合的光引发剂可以在紫外线(UV)、红外线(IR)或可见光范围内是反应性的。两种这样的光引发剂的实例是曙红Y(EY)和三乙醇胺(TEA)，它们在组合时可以响应于暴露于可见光(例如，约390至700纳米的波长)而聚合。光引发剂的非限制性实例可以包括偶氮二异丁腈(AIBN)、苯偶姻衍生物、苯并酮缩醇(benziketal)、羟烷基苯酮、苯乙酮衍生物、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)、丙烯酰氯、过氧化苯甲酰、樟脑醌、二苯甲酮、噻吨酮和2-羟基-1-[4]-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮。羟烷基苯酮可以包括4-(2-羟基乙基乙氧基)-苯基-(2-羟基-2-甲基丙基)酮(
Figure BDA0002378391280000801
295)、1-羟基环己基-1-苯甲酮(
Figure BDA0002378391280000802
184)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(
Figure BDA0002378391280000803
651)。苯乙酮衍生物可以包括2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)。噻吨酮可以包括异丙基噻吨酮。
由聚合物形成的网络可以是网状的、无定形的或是网。该网可以是组织化网。组织化网可包括重复的图案。该网络可以是结构化网络。该网络可以是非结构化网络。该网络可以是混合网格，其中其包含结构化部分和非结构化部分的混合。该网络可以是二维网络。该网络可以是三维网络。三维网络可以是四面体网络、金字塔网络、六面体网络、多面体网络或其组合。由聚合物形成的网络可以是网格。该网格可以是三角形网格、八边形网格、六边形网格、矩形网格、正方形网格、菱形网格、圆形网格或其组合。网格可具有按照单位面积的每个细胞的变化尺寸。无定形网络可被设计用于促进细胞相互作用。细胞相互作用可以是B细胞与T细胞缀合物形成、B细胞与B细胞相互作用、B细胞与巨噬细胞、T细胞与树突细胞相互作用、基质细胞与T细胞相互作用、基质细胞与B细胞相互作用或者基质细胞与树突细胞相互作用。无定形网络可被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
在一方面，本公开内容提供了打印器官和/或类器官的方法。该方法可包括可光聚合材料通过激光光源的聚合。该器官和/或类器官可以是二维的或三维的。该器官和/或类器官可以是淋巴结。该类器官可以是朗格汉斯岛。该类器官可以是毛囊。该器官和/或类器官可以是肿瘤和/或肿瘤球体。该类器官可以是神经束和支持细胞，诸如但不限于施旺细胞和神经胶质细胞，包括卫星细胞、嗅鞘细胞、肠神经胶质、少突胶质、星形胶质和/或小胶质。该类器官可以是肾单位。该类器官可以是肝脏类器官。该类器官可以是肠隐窝。该器官和/或类器官可以是初级淋巴器官，次级淋巴器官如脾、肝、胰腺、胆囊、阑尾、脑、小肠、大肠、心、肺、膀胱、肾、骨、耳蜗、卵巢、胸腺、气管、角膜、心脏瓣膜、皮肤、韧带、腱、肌肉、甲状腺、神经和/或血管。
本文公开的通过打印过程对器官或类器官的组织可能需要或通过顺序沉积至少约1、10、50、100、200、300、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、1000000或更多层细胞来实现。通过打印过程对淋巴器官的组织可能需要或通过顺序沉积1至100层细胞来实现。细胞层的大小可以取决于组织。细胞层的大小可包括较大的三维结构，该三维结构可以是一层细胞或可包含多层细胞。细胞层可包括约至少10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010或更多个细胞。如果需要将每种细胞类型相对于另一种精确放置，则应以顺序步骤打印细胞，在其间伴有清洗步骤以去除先前使用的介质。或者，可使用两种不同聚合波长和孔径的可光聚合材料同时打印不同大小的两种或更多种细胞类型，使得较大的细胞类型可封装在大小较大的孔中，而较小的细胞类型可封装在大小较小的孔中。细胞根据其细胞核的大小被封装在孔中，因为细胞骨架能够根据可用空间进行重塑。
激光光源可使用高能量的绿色、蓝色、白色或较低频率的紫外光来诱导可光聚合材料的聚合，或者可使用任何波长的高分辨率多光子光源。高分辨率、无毒的多光子投影技术特别适合于打印细节的生发中心，从而允许生成概括自然B细胞亲和力成熟的明暗区域。该方法可与脉管系统(无论是淋巴的还是循环的)的微流体操纵结合使用，以产生功能性的基于胶原的器官和/或类器官，诸如淋巴结类器官。替代地，可使用可见光和紫外光的无毒波长打印含细胞结构或待接种细胞的生物凝胶。
本公开内容包括通过来自能量源1000(即，激光，尤其是高分辨率多光子激光束，但还包括其他可能的光源)的激光束1002的二维或三维投影来打印淋巴器官或类器官。激光束1002旨在以预定的图案诱导含细胞的介质126的聚合，以产生在结构或功能上类似于天然的最终产物，特别是人淋巴器官或类器官。淋巴器官在本文被定义为小型的、功能齐全的、包含免疫细胞的结构，该结构能够发起并执行功能性且完全的免疫应答，该免疫应答被定义为抗体、化学物质(例如细胞因子)的产生或针对抗原的细胞应答。淋巴类器官在此被定义为能够在细胞水平上展现任何类型的免疫活性的部分完整的淋巴器官。免疫活性包括但不限于：(a)细胞活性，定义为细胞表面蛋白的上调或下调；(b)有丝分裂细胞分裂；(c)细胞移动的变化；(d)打印的结构内的功能性细胞移动；(e)通过蛋白质产生(诸如抗体、细胞因子或趋化因子)的变化测量的免疫应答的发生；以及(f)通过与活化相关的突变如B细胞典型的体细胞高变的新的蛋白质的发生。
淋巴结类器官或含有淋巴细胞的结构被设计用于概括基本的淋巴结功能并提供细胞小生境和微结构，以支持淋巴细胞相互作用和功能性免疫应答的发生；诸如在多个步骤中以单个单元打印的B细胞生发中心(GC；图18A)和胸腺样发育小生境(图18B)的形成。淋巴类器官可以是免疫细胞的任何半功能性聚集体，包括图18A和图18B中所描绘的那些的部分结构。
参考图18A，B细胞生发中心105可在功能上分离成B细胞密集的暗区106，其中B细胞107增殖并经历体细胞高变，以及亮区108，其中B细胞与携带全抗原的细胞和/或包括但不限于树突细胞、单核细胞、其他B细胞103的佐支持细胞109和/或T细胞111相互作用以接受阳性信号，该信号包括但不限于功能性受体突变或重排后的可溶性因子和基于配体的细胞表面相互作用112。一旦接收到阳性信号112，B细胞107返回暗区106并继续增殖和受体突变的过程。该过程重复进行，直到一个或多个优势B细胞克隆被选择并成为血浆B细胞113，即秘密的成熟的、类别转换的高度特异性抗体114。亮区与暗区之间的移动通过佐细胞和/或生物打印基质115中包括的材料设定的内源性趋化因子梯度指导的单个细胞移动而发生。
图18B描绘了胸腺样发育小生境。打印的结构可模拟胸腺中T细胞的顺序发育，随着它们的增殖和成熟，它们从胸腺类器官中的皮质组织向髓质组织迁移。该迁移的方向由图18B中的箭头230表示。这些移动由感测由局部细胞群建立的局部趋化因子梯度的细胞和将试剂引入细胞打印基质中以辅助建立细胞小生境来指导。包括但不限于皮质上皮细胞216、髓质上皮细胞117、树突细胞218和巨噬细胞119的佐细胞混合物的分布确保T细胞可紧邻该T细胞发育的阶段最重要的佐细胞。该结构由胸腺囊220、皮质区域121和髓质区域123组成。未成熟的胸腺细胞、双阴性T细胞和巨噬细胞(图18B中未示出)可散布在整个皮质中以清除凋亡的胸腺细胞。在胸腺更深处，髓质上皮细胞、更高丰度的巨噬细胞和骨髓来源的树突细胞与成熟的胸腺细胞紧密联系并促进进一步的发育。在发育过程中，双阴性未成熟胸腺细胞125穿过皮质结构131和佐细胞216朝向髓质123移动，分化为单阳性胸腺细胞135，进入髓质区域成为CD4或CD8阳性的成熟胸腺细胞137。在该过程中，某些细胞经历细胞死亡，并可能变成凋亡细胞133。
如图19所示，这些打印结构的形状可以是球形、椭圆形、卵圆形或卵形，其可具有平坦或圆环状的底部并且可包含中空的或凹进的中心以允许变化的表面积构造134；正方形、矩形、立方形或任何多边形135；自由形式，特别是在自由形式设计旨在促进多细胞小生境不对称球体136形成的情况下；或呈泪滴状形状137，具有来自任何方向的长尾。
可如图20所示以泪滴状形状137打印淋巴器官和类器官，使得B细胞138丛集在结构的较大端139处的球形或半球形结构中，而佐细胞143向一侧或两侧逐渐减少。在亲和力成熟过程中，B细胞可响应局部趋化因子梯度独立运动通过组织化细胞小生境。附图被图示为单尾141和双尾142的非对称泪滴状形状的俯视图的3D结构的横截面。
可如图23所示打印淋巴器官和类器官。图23示出了通过本文公开的方法产生的三维打印的淋巴结类器官的显微镜图像。显示T细胞和B细胞在物理上分隔到淋巴结类器官的单独区域中。T细胞区指示包含T细胞和支持佐细胞的混合物的组织区域。B细胞区指示包含B细胞和支持佐细胞的混合物的组织区域。
趋化因子梯度可由作为封装的细胞网络的一部分的细胞建立，或者趋化因子梯度可作为打印过程的一部分沉积。
B细胞、T细胞、滤泡树突细胞和其他细胞类型可打印在悬浮液中、粘附在培养皿/孔板的底部或侧面，或者打印在胶原蛋白或另一生物、生物相容性或生物惰性材料的网络中。
当细胞被打印在网络内时，该网络可被布置成网状、无定形或组织化的网。组织化的网是具有重复的几何或其他图案的任何网，包括六边形、正方形/矩形、菱形、圆形、半圆形、球形、半球形或其中的形状的任何组合。产生网状或无定形网而不过多考虑几何图案，其主要目的是快速产生并且能够封装和容纳细胞。另外，一些网对未经训练的观察者可能看起来是无定形的，但实际上具有特定的形状或设计，被设计用于促进在小生境之间或之内的细胞相互作用或移动。
可从成像数据获得原生架构，并将其渲染为具有界定的边缘和/或灰度区域的二维或三维图像，这些边缘和/或灰度区域是未精确定义而是落在指定范围内的某处的边缘，以便投影到可聚合的水凝胶。这样的成像数据可提供足够的细节，以使得能够精确地再造在免疫应答期间支持细胞-细胞相互作用的多细胞小生境。在免疫系统中，基于对外来病原体或物质的受体识别，为单一的B细胞或T细胞选择发育出多细胞小生境。受体的高反应性或免疫应答期间的高亲和力识别导致对该B或T细胞的选择和进一步的细胞分裂以及表达高反应性受体的细胞数目的扩充。在这些多细胞小生境中，由高反应性的受体传递的生存信号的竞争导致最具反应性的B或T细胞的阳性选择。原生淋巴结架构可支持该选择过程的发生，该过程取决于支持高反应性细胞的选择和增殖的一系列特定细胞-细胞相互作用。因此，允许细胞-细胞相互作用和独立细胞移动的三维原生架构是B细胞和T细胞克隆选择过程的关键组分。因此，该架构是打印的淋巴结和特别地通过在打印过程中使用多光子激光提供的重要组分，尽管在不在该分辨率水平上打印的情况下通过波前整形多光子激光的投影实现来实现功能也是有可能的。
可能在多细胞小生境内发生的细胞-细胞相互作用包括但不限于：B细胞-T细胞缀合物形成、B细胞-B细胞相互作用、B细胞-巨噬细胞、T细胞-树突细胞相互作用，以及基质细胞与T细胞、B细胞和树突细胞的相互作用。相互作用不是明显成对的相互作用，并且在免疫反应期间经常形成各种类型的细胞簇或团块，特别是在已建立的细胞小生境或组织样结构中。
如本文所用，T细胞可指任何形式的T细胞，包括但不限于CD8+或CD4+T细胞。B细胞可指处于任何发育期的B细胞，包括但不限于幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞或B2 B细胞。
图17描绘了淋巴器官的一般细节，因为它们的结构在目前被了解，并且不一定包括可从成像数据获得的每个结构细节，最终产品也不一定包括每个所描绘的结构细节；淋巴器官和类器官在本文由它们的功能最终定义。
可在单个结构内打印多个类器官单元，以产生更大的器官，直至并包括大小完整的器官。多个淋巴单元可打印在单个结构内，以产生更大的免疫器官，直至并包括大小完整的淋巴结或胸腺。大小的限制因素是脉管化，由于大多数气体和营养物的扩散限制，脉管化对于宽度大于200微米的组织必不可少。完整的淋巴器官或类器官在没有脉管化的情况下的厚度可在50微米至200微米之间。如果具有脉管化，则组织可以是50微米至10厘米厚，可以是任何形状或大小，并且可包含循环脉管系统和淋巴脉管系统。脉管系统可包含瓣膜和/或括约肌。在一些实施方案中，可通过在旨在与天然微脉管系统非常相似的网500中打印内皮细胞或其前体来获得脉管系统，该天然微脉管系统的结构从高分辨率成像数据获得。毛细血管床可从较大的小动脉和动脉分支，并根据相关解剖学分支成小静脉和静脉。
在一方面，本公开内容提供了产生人免疫蛋白群的方法。该方法可包括提供介质。该介质可包含多个细胞以及一种或多种聚合物前体。聚合物前体可以是生物凝胶前体。该方法可包括将至少一层介质沉积到衬底上。衬底可以是介质室。衬底可以是组织培养板或孔。衬底可以是微流体室。衬底可以是微流体芯片。衬底可以是聚合物支架。
该方法可包括使至少一层介质经历能量源以形成包含多个细胞的至少亚群和由一种或多种聚合物前体形成的生物凝胶的3D淋巴类器官。该方法可包括根据三维(3D)投影图案化的介质的逐层沉积。3D投影可根据计算机存储器中用于打印3D淋巴类器官的计算机指令。根据三维(3D)投影图案化的介质的逐层沉积和生物凝胶的形成可通过使介质经历能量源(例如，激光)来完成。例如，可根据3D投影沿着光路来投影激光，以便在介质中使聚合物前体聚合并形成包括多个细胞和生物凝胶的3D淋巴类器官的至少一部分。在另一方面，该方法可包括使用移液管或毛细管手动逐层沉积介质以将介质的至少一个微滴沉积在衬底上。在该实例中，包括要打印的图案的3D投影可能不是必要的，相反，介质的微滴一旦沉积就可经历能量源(例如，热或光源)，以便形成包括生物凝胶和多个细胞的3D淋巴类器官的至少一部分。在又一方面，该方法可包括通过使用微流体设备的介质的逐层沉积。微流体设备可控制以逐层方式沉积在衬底上的介质的微滴的总体积。微流体设备可控制以逐层方式沉积在衬底上的介质的每个微滴的细胞总数。在又一方面，该方法可包括通过使用打印机对介质进行逐层沉积。打印机可以是激光打印机、逐层喷墨打印机(例如，热喷墨打印机或压电喷墨打印机)、逐层挤出3D打印机(例如，气动挤出生物打印机或机械挤出生物打印机)或其任何组合。介质的微滴可与其他微滴结合，使得细胞可组织成功能性的多细胞组织小生境。
层状的微滴可使用能量源或通过化学品(例如，交联剂或光引发剂)顺序地或一次性干固、熔融、固化、胶凝、交联、聚合或光聚合。能量源可以是能量束、热源或光源。能量源可以是激光器，诸如光纤激光器、短脉冲激光器或飞秒脉冲激光器。能量源可以是热源，诸如热板、灯、烤箱、热水浴、细胞培养温育器、加热室、炉、干燥箱或其任何组合。能量源可以是光源，诸如白光、红外光、紫外(UV)光、近红外(NIR)光、可见光、发光二极管(LED)或其任何组合。能量源可以是声能量源，诸如超声探头、超声仪、超声浴或其任何组合。能量源可以是电磁辐射源，诸如微波源或其任何组合。
介质可物理聚合以形成生物凝胶。介质可通过热源聚合以形成生物凝胶。介质可化学聚合以形成生物凝胶；例如，通过使用交联剂。交联剂的非限制性实例包括1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)、戊二醛和1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺(EDAC)。介质可包含光引发剂、交联剂、胶原蛋白、透明质酸和其他糖胺聚糖、聚-dl-乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚-l-乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、藻酸盐、明胶、琼脂或其任何组合。生物凝胶可包含光引发剂、交联剂、胶原蛋白、透明质酸和其他糖胺聚糖、聚-dl-乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚-l-乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、藻酸盐、明胶、琼脂或其任何组合。聚合物前体可以是胶原蛋白、透明质酸和其他糖胺聚糖、聚-dl-乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚-l-乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、藻酸盐、明胶、琼脂或其任何组合。
生物凝胶可以是水凝胶。生物凝胶可以是生物相容性水凝胶。生物凝胶可以是聚合物水凝胶。生物凝胶可以是水凝胶珠。生物凝胶可以是水凝胶纳米颗粒。生物凝胶可以是水凝胶液滴。生物凝胶可以是水凝胶微滴。
微滴可具有测量为至少约10微米(μm)至约1000μm的直径。微滴可具有测量为至少约10μm的直径。微滴可具有测量为至多约1,000μm的直径。微滴可具有测量为约10μm至约50μm、约10μm至约100μm、约10μm至约200μm、约10μm至约300μm、约10μm至约400μm、约10μm至约500μm、约10μm至约600μm、约10μm至约700μm、约10μm至约800μm、约10μm至约900μm、约10μm至约1,000μm、约50μm至约100μm、约50μm至约200μm、约50μm至约300μm、约50μm至约400μm、约50μm至约500μm、约50μm至约600μm、约50μm至约700μm、约50μm至约800μm、约50μm至约900μm、约50μm至约1,000μm、约100μm至约200μm、约100μm至约300μm、约100μm至约400μm、约100μm至约500μm、约100μm至约600μm、约100μm至约700μm、约100μm至约800μm、约100μm至约900μm、约100μm至约1,000μm、约200μm至约300μm、约200μm至约400μm、约200μm至约500μm、约200μm至约600μm、约200μm至约700μm、约200μm至约800μm、约200μm至约900μm、约200μm至约1,000μm、约300μm至约400μm、约300μm至约500μm、约300μm至约600μm、约300μm至约700μm、约300μm至约800μm、约300μm至约900μm、约300μm至约1,000μm、约400μm至约500μm、约400μm至约600μm、约400μm至约700μm、约400μm至约800μm、约400μm至约900μm、约400μm至约1,000μm、约500μm至约600μm、约500μm至约700μm、约500μm至约800μm、约500μm至约900μm、约500μm至约1,000μm、约600μm至约700μm、约600μm至约800μm、约600μm至约900μm、约600μm至约1,000μm、约700μm至约800μm、约700μm至约900μm、约700μm至约1,000μm、约800μm至约900μm、约800μm至约1,000μm或约900μm至约1,000μm的直径。微滴可具有测量为约10μm、约50μm、约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约700μm、约800μm、约900μm或约1,000μm的直径。
微滴可具有约1微升(μl)至约500μl的体积。微滴可具有至少约1μl的体积。微滴可具有至多约500μl的体积。微滴可具有约1μl至约2μl、约1μl至约3μl、约1μl至约4μl、约1μl至约5μl、约1μl至约10μl、约1μl至约20μl、约1μl至约25μl、约1μl至约50μl、约1μl至约75μl、约1μl至约100μl、约1μl至约500μl、约2μl至约3μl、约2μl至约4μl、约2μl至约5μl、约2μl至约10μl、约2μl至约20μl、约2μl至约25μl、约2μl至约50μl、约2μl至约75μl、约2μl至约100μl、约2μl至约500μl、约3μl至约4μl、约3μl至约5μl、约3μl至约10μl、约3μl至约20μl、约3μl至约25μl、约3μl至约50μl、约3μl至约75μl、约3μl至约100μl、约3μl至约500μl、约4μl至约5μl、约4μl至约10μl、约4μl至约20μl、约4μl至约25μl、约4μl至约50μl、约4μl至约75μl、约4μl至约100μl、约4μl至约500μl、约5μl至约10μl、约5μl至约20μl、约5μl至约25μl、约5μl至约50μl、约5μl至约75μl、约5μl至约100μl、约5μl至约500μl、约10μl至约20μl、约10μl至约25μl、约10μl至约50μl、约10μl至约75μl、约10μl至约100μl、约10μl至约500μl、约20μl至约25μl、约20μl至约50μl、约20μl至约75μl、约20μl至约100μl、约20μl至约500μl、约25μl至约50μl、约25μl至约75μl、约25μl至约100μl、约25μl至约500μl、约50μl至约75μl、约50μl至约100μl、约50μl至约500μl、约75μl至约100μl、约75μl至约500μl或约100μl至约500μl的体积。微滴可具有约1μl、约2μl、约3μl、约4μl、约5μl、约10μl、约20μl、约25μl、约50μl、约75μl、约100μl或约500μl的体积。
生物凝胶可以是当在约25摄氏度(℃)下测量时具有至少约1x 10-3帕斯卡秒(Pa·s)至约100,000Pa·s或更高的粘度的溶液。当在约25摄氏度(℃)下测量时，生物凝胶可具有约0.001Pa·s至约100,000Pa·s的粘度。当在约25摄氏度(℃)下测量时，生物凝胶可具有至少约0.001Pa·s的粘度。当在约25摄氏度(℃)下测量时，生物凝胶可具有至多约100,000Pa·s的粘度。当在约25摄氏度(℃)下测量时，生物凝胶可具有约0.001Pa·s至约0.01Pa·s、约0.001Pa·s至约0.1Pa·s、约0.001Pa·s至约1Pa·s、约0.001Pa·s至约10Pa·s、约0.001Pa·s至约100Pa·s、约0.001Pa·s至约1,000Pa·s、约0.001Pa·s至约10,000Pa·s、约0.001Pa·s至约50,000Pa·s、约0.001Pa·s至约100,000Pa·s、约0.01Pa·s至约0.1Pa·s、约0.01Pa·s至约1Pa·s约0.01Pa·s至约10Pa·s、约0.01Pa·s至约100Pa·s、约0.01Pa·s至约1,000Pa·s、约0.01Pa·s至约10,000Pa·s、约0.01Pa·s至约50,000Pa·s、约0.01Pa·s至约100,000Pa·s、约0.1Pa·s至约1Pa·s、约0.1Pa·s至约10Pa·s、约0.1Pa·s至约100Pa·s、约0.1Pa·s至约1,000Pa·s、约0.1Pa·s至约10,000Pa·s、约0.1Pa·s至约50,000Pa·s、约0.1Pa·s至约100,000Pa·s、约1Pa·s至约10Pa·s、约1Pa·s至约100Pa·s、约1Pa·s至约1,000Pa·s、约1Pa·s至约10,000Pa·s、约1Pa·s至约50,000Pa·s、约1Pa·s至约100,000Pa·s、约10Pa·s至约100Pa·s、约10Pa·s至约1,000Pa·s、约10Pa·s至约10,000Pa·s、约10Pa·s至约50,000Pa·s、约10Pa·s至约100,000Pa·s、约100Pa·s至约1,000Pa·s、约100Pa·s至约10,000Pa·s、约100Pa·s至约50,000Pa·s、约100Pa·s至约100,000Pa·s、约1,000Pa·s至约10,000Pa·s、约1,000Pa·s至约50,000Pa·s、约1,000Pa·s至约100,000Pa·s、约10,000Pa·s至约50,000Pa·s、约10,000Pa·s至约100,000Pa·s或约50,000Pa·s至约100,000Pa·s的粘度。当在约25摄氏度(℃)下测量时，生物凝胶可具有约0.001Pa·s、约0.01Pa·s、约0.1Pa·s、约1Pa·s、约10Pa·s、约100Pa·s、约1,000Pa·s、约10,000Pa·s、约50,000Pa·s或约100,000Pa·s的粘度。
生物凝胶可以是包含多个细胞的水凝胶。生物凝胶可以是包含多个非水凝胶珠的水凝胶。所述生物凝胶可以是包含多个非水凝胶纳米颗粒的水凝胶。生物凝胶可以是包含多个非水凝胶微粒的水凝胶。生物凝胶可以是包含多个非水凝胶纳米棒的水凝胶。生物凝胶可以是包含多个非水凝胶纳米壳的水凝胶。生物凝胶可以是包含多个脂质体的水凝胶。生物凝胶可以是包含多个非水凝胶纳米线的水凝胶。生物凝胶可以是包含多个非水凝胶纳米管的水凝胶。生物凝胶可以是其中液体组分为水的凝胶。生物凝胶可以是其中水是分散介质的聚合物链的网络。聚合物链的网络可以是亲水聚合物链的网络。聚合物链的网络可以是疏水聚合物链的网络。生物凝胶可以是可降解的水凝胶。生物凝胶可以是不可降解的水凝胶。生物凝胶可以是可再吸收的水凝胶。生物凝胶可以是包含天然来源的聚合物如胶原的水凝胶。
所述方法可包括使3D淋巴类器官的至少一部分经历足以刺激一种或多种免疫蛋白的产生的条件。足以刺激一种或多种免疫蛋白的产生的条件可包括将3D淋巴类器官的至少一部分暴露于抗原，以便刺激一种或多种免疫蛋白的产生。该方法可进一步包括从3D淋巴类器官的至少一部分提取一种或多种免疫蛋白。免疫蛋白可选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。介质中的多个细胞可来自受试者。多个细胞可以是自体细胞。多个细胞可以是同种异体细胞。多个细胞可以是干细胞。多个细胞可以是诱导多能干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞或其组合。多个细胞可以是可分化为B细胞、T细胞或其组合的干细胞。多个细胞可选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
3D淋巴类器官可选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
图21图示了四步过程，其中生物凝胶通过能量源聚合，该能量源包括但不限于白光、单光子或多光子激光，用于在顺序层中打印淋巴结类器官或含淋巴细胞的器官146。
如图21所示，按顺序的次序打印基底层147、两个细胞层、基础细胞层148和次级细胞层149。生物凝胶层的逐层沉积可使用诸如白光或热等能量源将每个生物凝胶层彼此融合。次级细胞层可包括一个或多个顺序层。次级细胞层149可包含佐细胞、T细胞和抗原的混合物。次级细胞层149可包括保护胶囊150。在图21中，步骤1示出了基底层147。基底层147可包含胶原蛋白或其他生物、生物惰性或生物相容性材料。基底层147可包含细胞。基底层147可不包含细胞。基底层147可由光源1000聚合。在一些实施方案中，生物凝胶可不包括基底层147。基底层147可充当后续层如基础细胞层148和次级细胞层149的锚或链接。
在图21中，步骤2示出了处于其单体形式(即，可光聚合的聚合物前体)的一种或多种新的可光聚合生物聚合物。可光聚合的聚合物前体可包含一种或多种细胞类型。在一些实施方案中，一种或多种细胞类型是淋巴细胞或其他真核来源。可光聚合的生物聚合物可包含生长因子或细胞反应性蛋白的任何组合。可光聚合的生物聚合物可包括可由设备投影的前述能量源中的任一种打印。在该阶段，抗原可包含在打印介质中。在该阶段，抗原可不包含在打印介质中。
步骤3可包括重复步骤2，直到实现期望数目的细胞层/细胞类型。可使用不同的细胞类型、介质条件和/或可光聚合的生物聚合物。在图21中，步骤3示出了产生次级细胞层149的一次迭代。在图21中，步骤4示出，可将淋巴结类器官或含淋巴细胞的器官146封装在包含很少细胞或不包含细胞的网格150中。该结构可意在维持淋巴结类器官或含淋巴细胞器官在培养和发育过程中的完整性。可使用任何生物材料来生成网格150。可将细胞封装在网格150中。封装的细胞可以是任何来源的，包括但不限于抗原呈递细胞、基质细胞或预先暴露于抗原并激活以供抗原呈递的细胞。该最终打印步骤可用于沉积与锚定胶原蛋白或生物材料的第一层相邻的结构，以制成密封和锚定的淋巴器官。
在任何给定步骤之间可能发生使用不含细胞且不是可打印材料的介质的洗涤步骤，以确保完全漂洗和去除先前的细胞和可聚合材料。所有过程的最后步骤可能需要一个或多个洗涤步骤，以去除不需要的生物凝胶并准备组织结构以供培养。
淋巴结器官或类器官的打印中可包括1至100个不同的步骤。淋巴结器官或类器官的打印中可包括至少1、10、50、100、200、300、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、1000000或更多个操作。器官和/或类器官的打印中可包括至少1、10、50、100、200、300、500、600、700、800、900、1000、10000、100000、1000000或更多个操作。
可以以适合于高通量抗体/受体产生和筛选的格式打印淋巴器官和类器官，以包括1、6、12、48、96和384孔板。迄今尚无借助多细胞环境的二维或三维投影打印以高通量形式从人类组织体外从头发育淋巴器官的方法用于B细胞或T细胞的发育和受体筛选。这样的高通量过程的引入具有大幅加速抗体产生和筛选过程的潜力。然而，出于特定目的可能需要更大的结构，或者不一定总是需要高通量方法。因此，本公开内容的范围和效用均不限于高通量格式。
可通过本文公开的方法打印至少10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、10000或更多个可测试的淋巴器官和/或类器官。通过本文公开的方法可打印约200个可测试的淋巴器官和/或类器官。通过本文公开的方法可打印约300至约500个可测试的淋巴器官和/或类器官。通过本文公开的方法可打印约500至约1000个可测试的淋巴器官和/或类器官。从供体分离的淋巴细胞或其他真核来源的一种或多种细胞类型可用于打印淋巴器官和/或类器官。可基于其遗传性状、疾病史、性别和/或种族来选择单个供体。可从单个供体产生至少200、300、400、500、600、700、800、900、10000或更多个可测试的淋巴器官和/或类器官。可从单个供体产生约200个可测试的淋巴器官和/或类器官。可从单个供体产生约300至约500个可测试的淋巴器官和/或类器官。可从单个供体产生约500至约1000个可测试的淋巴器官和/或类器官。
在打印的结构内，细胞最典型地可被封装在生物、生物相容或生物惰性的凝胶形成材料或生物凝胶中或被支架固定在该材料上。材料可以是合成的、部分合成的或天然的。这些材料可以是独立地可光聚合的，可需要光引发剂来聚合，或者可被修饰为在有或没有光引发剂的情况下在激光源的存在下聚合。可作为唯一、初级、次级或其他补充组分掺入生物凝胶的材料包括但不限于：胶原蛋白、透明质酸和其他糖胺聚糖、聚-dl-乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚-l-乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、藻酸盐、明胶和琼脂。
待打印的细胞网的可变的拉伸强度和结构可用于不同的区域，以促进细胞运动性、细胞-细胞相互作用和重组。可参与蠕动和细胞-细胞相互作用行为的细胞可拿起、加工并将抗原递送给应答的免疫细胞。因此，可打印与天然淋巴结架构匹配或采用网格框架的结构，以促进细胞-细胞相互作用和运动性。可打印净孔径直径或股线之间的距离在2微米至50微米之间的结构，以促进细胞-细胞相互作用和运动性。
可包含在打印的结构或周围介质中的细胞类型包括但不限于：基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD8+T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群以及白细胞及其亚群。
这些细胞类型中的每一种都可通过血液或组织捐献从单个供体分离，并通过体外方案扩充至足以打印淋巴样组织的数目。可从给定的供体永生化的这些细胞类型中的一些可被永生化以促进扩充和用于蛋白质产生。在基于动物的实验的情况下，还可从细胞系或动物来源获得细胞。细胞可来源于血液中的循环细胞，来自淋巴结、脾、骨髓或其他组织的活检。细胞可来源于任何脊椎动物，包括伴侣动物、啮齿动物、大型哺乳动物和人类。用于单次高通量测定的细胞可来源于不同的个体供体，以增加可能具有高反应性抗体的可能性。细胞还可来源于具有期望的免疫反应能力的供体，该能力由医学或疾病史、基因型、抗体应答或滴定或者正在进行或诱导的免疫反应来定义，以增加期望的免疫应答的可能性，无论是阳性还是阴性。该细胞可基于供体的年龄、遗传性状、疾病史、性别和/或种族而来源于供体。
可在具有或不具有添加到打印介质的趋化因子、自由漂浮或拴系的细胞信号传导分子、生长因子、细胞因子、蛋白质、生物制剂或非生物制剂(如佐剂或小分子)的情况下打印多个细胞层。这些因子可以是刺激性的或抑制性的。在引入打印介质之前，可通过交联将因子拴系于胶原蛋白或其他生物凝胶单体。将细胞反应性蛋白添加到类器官的特定层或周围介质可用于促进细胞组织、细胞发育、细胞运动和其他期望事件的目的。
可将生长因子、促炎细胞因子、抗炎趋化因子、细胞反应性蛋白、可溶性受体和其他信号传导因子掺入打印介质、打印支架和/或培养/生长介质中。这样的因子包括但不限于：IFN-γ、TNF-α、TGF-β、IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13、IL-21、IL-23、可溶性TNF受体p55、可溶性TNF受体p75、可溶性IL-1受体2型、IL-18结合蛋白、CCL2、CCL1、CCL22、CCL17、CXCR3、CXCL9、CXCL10、CXCL11等。在整个打印和/或培养过程中，可在不同的时间点改变介质条件，以促进特定的免疫事件。
可通过细胞培养基或添加到细胞培养基的组分的改变来诱导免疫事件。诱导性免疫事件的实例包括细胞增殖；特定细胞因子和/或趋化因子的释放；受体和细胞分泌蛋白(包括抗体)的分泌；受体和细胞分泌蛋白(包括抗体)的进化；或细胞改变，包括但不限于细胞健康、细胞形态、表达的蛋白质和细胞发育状态。
打印的淋巴结用于生成或评估抗体、T细胞受体、免疫学产物或免疫应答的用途
淋巴器官和类器官可用于产生新的细胞分泌的和/或膜结合的免疫蛋白，包括抗体和T细胞受体。它们可另外用于生成表达那些蛋白质和/或遗传序列的细胞或细胞系，包括杂交瘤。通过本文所述的方法产生的淋巴器官和/或类器官可用于产生癌症免疫治疗剂。通过本文所述的方法产生的淋巴器官和/或类器官可用于产生T细胞。通过本文所述的方法产生的淋巴器官和/或类器官可用于预测细胞因子的释放。通过本文所述的方法产生的淋巴器官和/或类器官可提供抗体亲和力成熟所需的体内细胞组织。
抗体和其他受体、生成它们的细胞或细胞系以及/或者编码它们的遗传序列可通过抗原攻击产生。抗体和其他受体可从单个献血样品生成。抗体和其他受体可从多个献血样品生成。通过本文公开的方法产生的抗体或受体可在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周内生成。通过本文公开的方法产生的抗体或受体可在约六周内生成。通过本文公开的方法产生的抗体或受体可在约十周内生成。通过本文公开的方法产生的抗体或受体可在约四周至约十二周内生成。通过本文公开的方法产生的抗体或受体可在没有动物和/或人类替代物的情况下生成。通过本文公开的方法产生的抗体可以是完全人IgG抗体。通过本文公开的方法产生的抗体可对基于蛋白质的靶抗原具有反应性。通过本文公开的方法产生的抗体可对靶抗原具有至少0.01pM、0.1pM、1pM、10pM、100pM、1nM、10nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM或更高的亲和力。通过本文公开的方法产生的抗体可对靶抗原具有约500nM的亲和力。抗原可在打印过程期间的任何阶段被引入细胞介质和/或打印的支架中；可与待打印的一种或多种细胞类型(包括抗原呈递细胞，诸如滤泡树突细胞)进行预温育；或可在淋巴结构发育期间的任何点引入打印的淋巴结构中。
可在淋巴结构的打印和发育过程中的多个时间点和/或阶段引入相同的抗原。此外，可在淋巴结构的打印和发育过程中的相同或不同的时间点和/或阶段将多种不同的抗原引入相同的淋巴结构。
抗原可通过多种方法引入，包括但不限于：注射、与抗原一起培养的细胞的递送、贴片中的抗原在淋巴结类器官表面上的沉积、通过淋巴或循环微脉管系统(如果存在)引入抗原、或在淋巴结周围的介质中引入可溶性抗原。
可引入的抗原包括但不限于天然的或工程化的：全肽、部分肽、糖肽、全蛋白质或蛋白质亚基、碳水化合物、核酸、活病毒、热灭活的病毒、病毒颗粒、膜结合或稳定的蛋白质、噬菌体展示的抗原以及全细胞。抗原可以是理论上无害的刺激物(例如，在变态反应的情况下)，也可以是自身抗原(例如，在自身免疫病或癌症的情况下)。抗体文库的生成可与噬菌体展示、核糖体展示、酵母展示、细菌展示、mRNA展示和其他抗体定向进化技术相容。
旨在促进、延长、加速或引发免疫应答的生物和/或非生物免疫佐剂可在抗原引入的同时、之前或之后引入。可能的佐剂包括但不限于明矾和Toll样受体(TLR)刺激性化合物。佐剂可通过与抗原相同或不同的引入方式引入。
旨在减弱、延迟、减慢或停止免疫应答的生物和/或非生物制剂可在抗原引入的同时、之前或之后引入。佐剂可在这样的抑制剂的同时、之前或之后引入，或者可不与抑制剂联合引入。这样的药剂可包括促凋亡剂和/或受体抑制剂，包括小分子、封闭性抗体和其他抑制剂。
可在免疫应答完成或部分完成后收集抗体、分泌的受体、部分细胞或全细胞。提取方法可能会导致打印的淋巴结构破坏或使淋巴结构保持完整以备将来使用或分析。提取期望产物的方法可包括但不限于：基于流式细胞术的细胞分选(FACS)、从培养物进行单细胞稀释、基于表面抗体表达的选择以及基于微流体方法和通道的选择。可通过介质收集来收集分泌产物。
打印的淋巴器官和/或类器官可替代地或附加地用于评估免疫事件、细胞相互作用、细胞变化和其他可测量或可感知的事件，其目的包括但不限于：疫苗开发；疫苗评价，包括对免疫系统造成损害的潜在性(例如，安全性测试)和评估在引入或不引入疫苗旨在针对其发挥作用的抗原的情况下的免疫应答(例如，功效评价)；生物和/或非生物药物化合物或药物组合的药物测试，包括对免疫系统造成损害的潜在性(例如，安全性测试)和评价药物对免疫系统的影响，无论是有意的(例如，功效评价)还是无意的(例如，副作用测试)；筛选意在用于治疗或其他用途的具有潜在免疫作用的生物和非生物剂，尤其是在使用高通量打印设计的情况下；在各种实验室诱导的或自然发生的条件下的免疫应答和细胞相互作用的基础研究；以及诊断评价，包括但不限于混合供体淋巴细胞反应；例如，用于评价移植相容性和对外源或自身来源的试剂或抗原的反应；癌症免疫疗法预测筛选测定；T细胞胸腺选择测定；来自天然库的T细胞克隆选择测定；和/或细胞因子风暴预测测定。用于移植评价和患者免疫系统反应性的抗原可包括与变态反应、自身免疫病、癌症、有益微生物和病毒以及/或者有害或潜在有害微生物和病毒相关的抗原。
为此目的可测量或观察到的免疫事件包括但不限于：淋巴细胞行为、激活状态、表型、增殖率、细胞相互作用、细胞相互作用的变化和/或细胞活化的内部和外部标志物的表达。
根据用于评估免疫事件的现有或尚不存在的方案，可用于评估此类免疫事件而进行的测量包括但不限于：抗体类别转换；基于细胞因子的应答；细胞分化；对用于疫苗接种的佐剂的应答；对疫苗的应答；细胞增殖；细胞杀伤；细胞表型；细胞表型的变化，无论是诱导的还是作为自然发育过程的一部分；记忆细胞发育；记忆细胞回忆；供体内源的记忆细胞群的评估；任何预测性测量，包括药物测试的免疫应答或变态反应反应的评价；等等。
通过本文所述的方法产生的打印的淋巴器官和类器官可用于预测细胞因子释放。细胞因子风暴预测测定可预测由治疗剂诱导的细胞因子释放。风暴预测测定可预测由基于抗体的治疗剂、小分子治疗剂、基于细胞的治疗剂、肽、核酸或其任何组合诱导的细胞因子释放。细胞因子风暴预测测定可预测人、灵长类动物和/或啮齿动物中的细胞因子释放。细胞因子风暴预测测定可测量炎性介质如细胞因子、氧自由基和凝血因子的水平。细胞因子风暴预测测定可测量由于细胞因子风暴而释放的促炎细胞因子、抗炎细胞因子、集落刺激因子、干扰素、白介素和/或肿瘤坏死因子。通过细胞因子风暴预测测定所测量的细胞因子可以是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-α、IL-1β、IL-1受体拮抗剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、CXCR3、CXCL9、CXCL10和/或CXCL11。
免疫应答的测量可通过包括但不限于以下的方法来进行：使用全细胞；基于其细胞表型分选或分离细胞，该表型可包括形态和/或受体表达谱；以及收集血清或介质，用于包括评价分泌率或特定分泌分子的目的。
可用于评估细胞状态或细胞状态变化的方法包括遗传和表型评价，其包括但不限于：酶联免疫吸附测定(ELISA)、部分基因测序或特定基因组位点测序、全基因组测序、蛋白质或核酸的凝胶电泳、聚合酶链反应(PCR)、定量PCR、逆转录PCR、Western印迹、分析细胞表型或激活状态的流式细胞术、抗体选择、质谱，等等。
打印含细胞结构的方法
本公开内容提供了打印和使用三维含细胞基质的方法和系统。在一方面，使用三维(3D)含细胞基质的方法包括：提供包含介质的介质室，该介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体。随后，该方法可包括根据计算机存储器中用于打印三维(3D)含细胞医疗设备的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的介质，以形成3D含细胞基质的至少一部分，该3D含细胞基质包含(i)多个细胞的至少亚群，和(ii)由一种或多种聚合物前体形成的聚合物。随后，该方法可包括将3D含细胞基质定位在受试者体内。
在另一方面，使用三维(3D)含细胞基质的方法包括(i)打印包含多个细胞的3D含细胞基质，和(ii)将3D含细胞基质定位在受试者体内。
在另一方面，使用三维(3D)含细胞基质的方法包括提供包含第一介质的介质室。第一介质可包含第一多个细胞和第一聚合物前体。随后，该方法可以包括根据计算机存储器中用于打印3D含细胞基质的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第一介质，以使介质室中的第一介质的至少一部分形成3D含细胞基质的第一部分。随后，该方法可以包括在介质室中提供第二介质。该第二介质可包含第二多个细胞和第二聚合物前体。该第二多个细胞可以是与第一多个细胞不同的类型。随后，该方法可以包括根据计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D含细胞基质的第二部分。随后，该方法可包括将3D含细胞基质的第一和第二部分定位在受试者体内。
在另一方面，使用三维(3D)含细胞基质的方法包括(i)打印包含第一多个细胞和第二多个细胞的3D含细胞基质。第一多个细胞可与第二多个细胞不同。随后，该方法可包括(ii)将3D含细胞基质定位在受试者体内。
多个细胞可来自受试者。所述方法的多个细胞可选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。B细胞可选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。T细胞可选自CD8+和CD4+。3D含细胞基质可形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。移植物可选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。
3D含细胞基质可为约1微米(μm)至约10厘米(cm)。3D含细胞基质可为至少约5μm至约10cm或更大。3D含细胞基质可为至少约10μm至约10cm或更大。3D含细胞基质可为至少约100μm至约10cm或更大。3D含细胞基质可为至少约500μm至约10cm或更大。3D含细胞基质可为至少约1000μm至约10cm或更大。3D含细胞基质可为至少约1cm至约10cm或更大。3D含细胞基质可为约至少5至约10cm或更大。
3D含细胞基质可为约1μm至约1,000μm。3D含细胞基质可为至少约1μm。3D含细胞基质可为至多约1,000μm。3D含细胞基质可为约1μm至约5μm、约1μm至约10μm、约1μm至约100μm、约1μm至约1,000μm、约5μm至约10μm、约5μm至约100μm、约5μm至约1,000μm、约10μm至约100μm、约10μm至约1,000μm或约100μm至约1,000μm。3D含细胞基质可为约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或约1,000μm。
3D含细胞基质可为约0.5cm至约10cm。3D含细胞基质可为至少约0.5cm。3D含细胞基质可为至多约10cm。3D含细胞基质可为约0.5cm至约1cm、约0.5cm至约2cm、约0.5cm至约3cm、约0.5cm至约4cm、约0.5cm至约5cm、约0.5cm至约6cm、约0.5cm至约7cm、约0.5cm至约8cm、约0.5cm至约9cm、约0.5cm至约10cm、约1cm至约2cm、约1cm至约3cm、约1cm至约4cm、约1cm至约5cm、约1cm至约6cm、约1cm至约7cm、约1cm至约8cm、约1cm至约9cm、约1cm至约10cm、约2cm至约3cm、约2cm至约4cm、约2cm至约5cm、约2cm至约6cm、约2cm至约7cm、约2cm至约8cm、约2cm至约9cm、约2cm至约10cm、约3cm至约4cm、约3cm至约5cm、约3cm至约6cm、约3cm至约7cm、约3cm至约8cm、约3cm至约9cm、约3cm至约10cm、约4cm至约5cm、约4cm至约6cm、约4cm至约7cm、约4cm至约8cm、约4cm至约9cm、约4cm至约10cm、约5cm至约6cm、约5cm至约7cm、约5cm至约8cm、约5cm至约9cm、约5cm至约10cm、约6cm至约7cm、约6cm至约8cm、约6cm至约9cm、约6cm至约10cm、约7cm至约8cm、约7cm至约9cm、约7cm至约10cm、约8cm至约9cm、约8cm至约10cm或约9cm至约10cm。3D含细胞基质可为约0.5cm、约1cm、约2cm、约3cm、约4cm、约5cm、约6cm、约7cm、约8cm、约9cm或约10cm。
3D含细胞基质可为至少约1μm或更大。3D含细胞基质可为至少约5μm或更大。3D含细胞基质可为至少约10μm或更大。3D含细胞基质可为至少约50μm或更大。3D含细胞基质可为至少约100μm或更大。3D含细胞基质可为至少约1000μm或更大。3D含细胞基质可为至少约0.5cm或更大。3D含细胞基质可为至少约1cm或更大。3D含细胞基质可为至少约5cm或更大。3D含细胞基质可为至少约10cm或更大。
3D含细胞基质可包含促进脉管系统或神经生长的试剂。该试剂可选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
本公开内容的另一方面提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的系统，包括被配置成含有第一介质的介质室，该第一介质包含第一多个细胞和第一多个聚合物前体。该系统可包括被配置用于将至少一个能量束引导至介质室的至少一个能量源。该系统可包括可操作地耦合到至少一个能量源的一个或多个计算机处理器。一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地编程用于从计算机存储器接收用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令。一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地编程用于引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第一介质，以使第一聚合物前体的至少一部分形成3D淋巴类器官的至少一部分。一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地编程用于引导至少一个能量源，以根据计算机指令沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至介质室中的第二介质，以使介质室中的第二介质的至少一部分形成3D淋巴类器官的至少第二部分。第二介质可包含第二多个细胞和第二多个聚合物前体。第二多个细胞可以是与第一多个细胞不同的类型。一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地编程用于使3D淋巴类器官的第一和第二部分经历足以刺激一种或多种免疫蛋白的产生的条件。一个或多个计算机处理器可被单独地或共同地进一步编程用于从3D淋巴类器官的第一和第二部分提取一种或多种免疫蛋白。
图24图示了设备和材料，其可包括嵌入在构成设备的材料内的细胞400。可用于打印3D含细胞基质或设备的材料包括可降解聚合物、不可降解聚合物、生物相容性聚合物、细胞外基质组分、可生物吸收的聚合物、水凝胶或其任何组合。可生物吸收的聚合物的非限制性实例包括聚酯、聚氨基酸、聚酸酐、聚原酸酯、聚氨酯和聚碳酸酯。生物相容性聚合物的非限制性实例包括胶原蛋白、透明质酸和其他糖胺聚糖、聚-dl-乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚-1-乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、藻酸盐、明胶、琼脂或其组合。生物相容性聚合物可含有细胞外基质组分。细胞外基质组分的非限制性实例可包括蛋白聚糖如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素和硫酸角质素，非蛋白聚糖多糖如透明质酸，胶原蛋白，以及弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白，或其任何组合。这些细胞外基质组分可用丙烯酸酯、二丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、肉桂酰、香豆素、胸腺嘧啶或者其他侧基或化学反应性部分进行官能化，以促进由多光子激发直接诱导或由一种或多种化学掺杂剂的多光子激发诱导的交联。在一些情况下，可以将可光聚合的大分子单体和/或可光聚合的单体与细胞外基质组分结合使用以产生含细胞结构。可光聚合的大分子单体的非限制性实例可以包括聚乙二醇(PEG)丙烯酸酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物和聚乙烯醇(PVA)衍生物。在一些情况下，用于产生含细胞结构的胶原可以是纤维状胶原如I型、II型、III型、V型和XI型胶原，facit胶原如IX型、XII型和XIV型胶原，短链胶原如VIII型和X型胶原，基底膜胶原如IV型胶原，VI型胶原，VII型胶原，XIII型胶原或其任何组合。
生物相容性聚合物可包含合成的并且不是哺乳动物组织天然的其他可聚合单体，包括生物材料和合成材料的混合物。生物相容性聚合物可包含光引发剂。光引发剂的非限制性实例可包括偶氮二异丁腈(AIBN)、苯偶姻衍生物、苯并酮缩醇(benziketal)、羟烷基苯酮、苯乙酮衍生物、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)、丙烯酰氯、过氧化苯甲酰、樟脑醌、二苯甲酮、噻吨酮和2-羟基-1-[4]-(羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮。羟烷基苯酮可以包括4-(2-羟基乙基乙氧基)-苯基-(2-羟基-2-甲基丙基)酮(
Figure BDA0002378391280001051
295)、1-羟基环己基-1-苯甲酮(
Figure BDA0002378391280001052
184)和2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(
Figure BDA0002378391280001053
651)。苯乙酮衍生物可以包括2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)。噻吨酮可以包括异丙基噻吨酮。
一旦就位，该设备可将两块组织聚集在一起，细胞可在该设备内或外迁移，与其他细胞局部相互作用以促进含细胞的生物可再吸收设备周围或内部的愈合和组织重塑。含细胞的生物可再吸收医疗设备可以是任何长度或宽度的缝合线401、钉402、任何长度或宽度的支架403、可被锁定或压缩的夹子404、任意形状和大小的贴片和移植物405、和/或意在使用于活体受试者中的类似结构。可从多种不同细胞类型产生任意形状和大小的单层或多层贴片和移植物406，以促进组织发育、增强组织功能和/或愈合。贴片和移植物可由多孔或管状结构的打印支架制成，以允许经由灌注为嵌入的细胞递送足够的营养物。可使用网格贴片改善对淋巴管、脉管系统和神经的弹性和结构支撑，从而改善移植组织的功能。移植物可包括但不限于：皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤、视网膜组织或其任何组合。可使用可能是或可能不是模仿天然细胞外基质支架的合成或生物材料来打印设备。材料包括但不限于聚乙二醇二丙烯酸酯、胶原蛋白、明胶层粘连蛋白、纤维蛋白和/或藻酸盐。
图25示出了骨可再吸收的螺钉407、销408和其他大小或形状的移植物，其目的是将组织保持在一起，伤口愈合，同时保持植入体内。图25中示出的实例可包括细胞。全息打印的移植物和/或贴片可包括多种形状，诸如但不限于椭圆形、矩形、卵圆形、任何其他多边形形状，或者修复或加强受伤或疾病部位所需的任何无定形形状。图26图示了第一混合细胞接种、全息打印的贴片410a和第二混合细胞接种、全息打印的贴片410b。如图26所示，第一和第二混合细胞接种、全息打印的贴片(即，分别为410a和410b)可包含心肌细胞411和/或干细胞412。细胞接种的打印的贴片可包含佐细胞，包括但不限于单核细胞、成纤维细胞、各种分化状态的内皮细胞或其任何组合。
为了增强一些设备的结构完整性，三维打印的材料可能更厚或更密，并且可在所有部位包含细胞或可不在所有部位包含细胞。这些细胞在打印时被捕获在任何大小的孔中，以使细胞保持就位，或者允许它们从最初打印它们的位置移动并与其自身层内的其他细胞、随后或先前打印的层中的细胞或与它们最终植入的原生组织中的细胞相互作用。细胞被封装(图27)、嵌入、捕获或包含400在网格网、格子、基质414、框架中，其具有允许细胞在发育过程中通过孔移动或被捕获到位的任何孔径大小413或密度。这构成了更大的结构架构的基础组分。
三维光刻可用于生成功能性局部器官或类器官，其可起到增强或独立的生理功能，而不必依赖于植入部位。这样的三维光刻可通过使用两个串联的光调制系统对光进行全息投影来实现，如共同发明的题为MULTI-PHOTON TISSUE PRINTING的美国临时专利申请号62/469,948中所公开的，该申请通过引用并入本文。
用于增强或替换功能的组织的非限制性实例包括肾或肾组织的生成模型、肺组织或者部分或全部肺叶和其中的生成模型、神经组织、胰腺组织、产生胰岛素的β胰岛和相关组织、甲状腺组织、脾组织、肝组织、皮肤组织和肠道组织。列出的所有组织必定包括赋予功能能力所必需的所有结构组分和佐细胞，包括但不限于大、小脉管系统以及淋巴引流系统和所有相关的中空结构，以及赋予功能能力所必需的神经和/或免疫细胞。
在一些实施方案中，通过本文公开的方法生成打印的肾生成模型。肾的基本结构组分包括但不限于：尿液收集导管、尿液收集导管周围的脉管化和致密的组织以及肾囊，可分成单独的计算机辅助设计(CAD)文件并通过自动计算机控制程序1101顺序地但以任何必要的次序打印。可通过将计算机文件发送给激光打印系统110来实现打印，并且可顺序地但以必要的次序将模仿CAD文件的结构沉积到生物凝胶和介质室122中。
用于植入的三维打印结构的体积可为1微米至数十厘米或更大的数量级。复杂的组织结构(如肺)的表面积占据数平方米，因此较大打印器官的外部大小将必然与功能单元的表面积不同。因此，本文提供的方法和系统可被设计为覆盖功能大小和表面积体积比的生理范围内的所有结构组分。
基于激光的全息图术可用于通过空间光调制器或数字镜设备以从计算机辅助设计(CAD)文件投影的固定模式近乎瞬时地聚合生物基质材料。建立完整的生成模型可能需要多个打印步骤和位置。
细胞可处于遗传或表型分化的任何状态，包括未分化、部分分化、完全分化。分化状态的实例包括但不限于多能干细胞、全能干细胞。细胞可以是自体细胞；来源于匹配的供体、脐带血、细胞和组织库；或已建立的细胞系。可在单个打印层和/或多个迭代打印层内使用处于相同和/或不同分化状态的多种细胞类型。可通过光开关技术、规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术、病毒引入或其他遗传操纵手段在打印过程之前、期间或之后对细胞进行遗传操纵。遗传操纵不仅限于核DNA，并且可包括不意在掺入核DNA中的线粒体DNA或自由漂浮质粒或病毒DNA。
打印的结构可包括高密度或可变性的细胞，包括偏向一侧的细胞密度或受控的细胞密度，以促进设备的特定部位的细胞扩充或小生境发展。可根据组织产物的需要使用高或低细胞密度。低细胞密度可低至每立方厘米打印材料10,000个细胞，而高至每立方厘米打印材料10亿个细胞。细胞可以是一种类型或是混合的，并且可多层执行打印。
生物打印材料可包含旨在促进包括微脉管系统在内的脉管系统和神经生长到打印结构中或周围原生结构中的试剂。另外，打印的生物材料可包含旨在促进干细胞或祖细胞向下分化为特定谱系的试剂。此类试剂包括但不限于：生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类或非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和/或干细胞增殖剂。
计算机系统
本发明提供了被编程用于实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图11示出了计算机系统1101，其被编程或以其他方式配置用于：在计算机存储器中接收3D淋巴类器官和/或3D含细胞基质的计算机模型；在计算机存储器中生成3D淋巴类器官和/或3D含细胞基质的计算机模型的点云表示或基于线的表示；以及引导至少一个能量源，以根据3D淋巴类器官和/或3D含细胞基质的计算机模型沿着至少一个能量束路径将能量束引导至介质室中的介质，并使聚合物前体的至少一部分形成3D淋巴类器官和/或3D含细胞基质的至少一部分。计算机系统1101可以调节本公开内容的计算机模型生成和设计、图像生成、全息投影和光调制的各个方面，诸如例如接收或生成待打印的期望三维(3D)生物材料结构如3D淋巴类器官和/或3D含细胞基质的计算机辅助设计(CAD)模型。计算机系统1101可以将CAD模型或任何其他类型的计算机模型如点云模型或将基于线的模型转换为待打印的期望3D淋巴类器官和/或3D含细胞基质的图像。计算机系统1101可以全息地投影期望的3D淋巴类器官和/或3D含细胞基质的图像。计算机系统1101可以调制光源、能量源或能量束，使得由计算机系统1101产生光路或能量束路径。计算机系统1101可以沿着光路或能量束路径引导光源、能量源或能量束。计算机系统1101可以是用户的电子设备或者是相对于该电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统1101包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1105，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统1101还包括存储器或存储位置1110(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1115(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1120(例如，网络适配器)以及外围设备1125，诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1110、存储单元1115、接口1120和外围设备1125通过通信总线(实线)如主板与CPU 1105相通信。存储单元1115可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统1101可以借助于通信接口1120可操作地耦合至计算机网络(“网络”)1130。网络1130可以是因特网、互联网和/或外联网，或与因特网相通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1130为电信和/或数据网络。网络1130可以包括一个或多个计算机服务器，该计算机服务器可以实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，网络1130可以借助于计算机系统1101实现对等网络，这可以使与计算机系统1101耦合的设备能够起到客户端或服务器的作用。
CPU 1105可以执行一系列机器可读指令，该机器可读指令可以体现在程序或软件中。该指令可以存储在存储位置如存储器1110中。指令可以针对CPU 1105，该指令随后可以编程或以其他方式配置CPU 1105以实现本公开内容的方法。由CPU 1105执行的操作的实例可以包括提取、解码、执行和回写。
CPU 1105可以是电路如集成电路的一部分。系统1101的一个或多个其他组件可以包含在电路中。在一些情况下，该电路为专用集成电路(ASIC)。
存储单元1115可以存储文件，诸如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1115可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1101可以包括一个或多个附加数据存储单元，该附加数据存储单元位于计算机系统1101外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统1101相通信的远程服务器上。
计算机系统1101可以通过网络1130与一个或多个远程计算机系统相通信。例如，计算机系统1101可以与用户的远程计算机系统相通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板型PC(例如，
Figure BDA0002378391280001101
iPad、
Figure BDA0002378391280001102
GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，
Figure BDA0002378391280001103
iPhone、支持Android的设备、
Figure BDA0002378391280001104
)基于云的计算服务(例如，Amazon Web Services)或个人数字助理。用户可以经由网络1130访问计算机系统1101。
如本文所述的方法可以通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现，该机器可执行代码存储在计算机系统1101的电子存储位置上，例如存储器1110或电子存储单元1115上。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，该代码可以由处理器1105执行。在一些情况下，可以从存储单元1115检索该代码并将其存储于存储器1110上以备处理器1105迅速存取。在一些情况下，可以排除电子存储单元1115，而将机器可执行指令存储于存储器1110上。
该代码可以被预编译并被配置用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或可以在运行期间被编译。该代码可以以编程语言提供，可以选择编程语言以使该代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。
本文提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统1101，可以在编程中体现。本技术的各个方面可被认为是“产品”或“制品”，其一般为在一种类型的机器可读介质上携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式。机器可执行代码可以存储在诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘的电子存储单元上。“存储”型介质可以包括计算机的任何或全部有形存储器、处理器等，或其相关联模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。该软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。这样的通信，例如，可以使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的。携载这类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用的，除非限于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，诸如计算机可执行代码等机器可读介质可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可以用于实现如附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴缆线；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些电信号或电磁信号或者声波或光波。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送这样的载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。
计算机系统1101可以包括电子显示器1135或与之通信，电子显示器1135包含用户界面(UI)1140，其用于提供例如打印过程的状态(例如，在完成过程之前显示表示打印的3D组织部分的3D淋巴类器官和/或3D含细胞基质的图示)、能量束的手动控制(例如，控制能量束的开启/关闭状态的紧急停止按钮)和被设计用于例如远程显示介质室内的氧气浓度、二氧化碳浓度、湿度测量和/或温度测量的显示指示器。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
优选实施方案
在一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，所述3D淋巴类器官包含(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及(c)使所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。在一些实施方案中，所述方法的抗原选自全肽、部分肽、糖肽、全蛋白质或蛋白质亚基、碳水化合物、核酸、活病毒、热灭活的病毒、病毒颗粒、膜结合或稳定的蛋白质、噬菌体展示的抗原以及全细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(d)从所述3D淋巴类器官的所述至少一部分提取一种或多种免疫蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫蛋白是人免疫蛋白。在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述IgG抗体是人IgG抗体。在一些实施方案中，所述多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官是泪滴形。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的至少一部分的聚合物形成网络。在一些实施方案中，网络是网状的、无定形的或是网。在一些实施方案中，所述网是组织化网。在一些实施方案中，所述组织化网包括重复图案。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。在一些实施方案中，所述细胞相互作用是B细胞与T细胞缀合物形成、B细胞与B细胞相互作用、B细胞与巨噬细胞、T细胞与树突细胞相互作用、基质细胞与T细胞相互作用、基质细胞与B细胞相互作用或者基质细胞与树突细胞相互作用。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
在另一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括(i)打印包含含有多个细胞的基质的三维(3D)淋巴类器官，和(ii)处理所述3D淋巴类器官，以产生所述一种或多种免疫蛋白。
在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述IgG抗体是人IgG抗体。在一些实施方案中，所述多个细胞来自所述受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
在另一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：(a)提供包含第一介质的介质室，其中所述第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述介质室中的所述第一介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的第一部分；(c)在所述介质室中提供第二介质，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；(d)根据所述计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的第二部分；以及(e)使所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。在一些实施方案中，所述抗原选自全肽、部分肽、糖肽、全蛋白质或蛋白质亚基、碳水化合物、核酸、活病毒、热灭活的病毒、病毒颗粒、膜结合或稳定的蛋白质、噬菌体展示的抗原以及全细胞。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(f)从所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分提取一种或多种免疫蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫蛋白是人免疫蛋白。在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述IgG抗体是人IgG抗体。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状是泪滴形。在一些实施方案中，3D淋巴类器官的所述至少所述部分的聚合物形成网络。在一些实施方案中，所述网络是网状的、无定形的或是网。在一些实施方案中，所述网是组织化网。在一些实施方案中，所述组织化网包括重复图案。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。在一些实施方案中，所述细胞相互作用是B细胞与T细胞缀合物形成、B细胞与B细胞相互作用、B细胞与巨噬细胞、T细胞与树突细胞相互作用、基质细胞与T细胞相互作用、基质细胞与B细胞相互作用或者基质细胞与树突细胞相互作用。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
在另一方面，本公开内容提供了产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括(i)打印包含基质的三维(3D)淋巴类器官，所述基质包含第一多个细胞和第二多个细胞，和(ii)处理所述3D淋巴类器官以产生所述一种或多种免疫蛋白。
在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述IgG抗体是人IgG抗体。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自所述受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
在另一方面，本公开内容提供了用于使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括：(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印所述三维(3D)含细胞医疗设备的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D含细胞基质的至少一部分，所述3D含细胞基质包含(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及(c)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
在一些实施方案中，所述多个细胞来自所述受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。在一些实施方案中，所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
在另一方面，本公开内容提供了使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括(i)打印包含多个细胞的3D含细胞基质，和(ii)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
在一些实施方案中，所述多个细胞来自所述受试者。在一些实施方案中，滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。在一些实施方案中，所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
在另一方面，本公开内容提供了使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括：(a)提供包含第一介质的介质室，其中所述第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体；(b)根据计算机存储器中用于打印所述3D含细胞基质的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述介质室中的所述第一介质的至少一部分形成所述3D含细胞基质的第一部分；(c)在所述介质室中提供第二介质，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；(d)根据所述计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D含细胞基质的第二部分；以及(e)将所述3D含细胞基质的所述第一部分和所述第二部分定位在受试者体内。
在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自所述受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。在一些实施方案中，所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
在一方面，本公开内容提供了使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括(i)打印包含第一多个细胞和第二多个细胞的3D含细胞基质，其中所述第一多个细胞与所述第二多个细胞不同，和(ii)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自所述受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。在一些实施方案中，所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。在一些实施方案中，所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。在一些实施方案中，所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
在另一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的系统，包括：(a)被配置成含有介质的介质室，所述介质包含多个细胞以及一种或多种聚合物前体；(b)被配置用于将至少一个能量束引导至所述介质室的至少一个能量源；以及(c)可操作地耦合到所述至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令；(ii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以使所述聚合物前体的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，和(iii)使所述3D淋巴类器官的所述至少一部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，所述足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件包括将所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。在一些实施方案中，所述抗原选自全肽、部分肽、糖肽、全蛋白质或蛋白质亚基、碳水化合物、核酸、活病毒、热灭活的病毒、病毒颗粒、膜结合或稳定的蛋白质、噬菌体展示的抗原以及全细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地进一步编程用于从所述3D淋巴类器官的所述至少一部分中提取一种或多种免疫蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫蛋白是人免疫蛋白。在一些实施方案中，所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述IgG抗体是人IgG抗体。在一些实施方案中，所述多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状是泪滴形。在一些实施方案中，3D淋巴类器官的所述至少所述部分的聚合物形成网络。在一些实施方案中，所述网络是网状的、无定形的或是网。在一些实施方案中，所述网是组织化网。在一些实施方案中，所述组织化网包括重复图案。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。在一些实施方案中，所述细胞相互作用是B细胞与T细胞缀合物形成、B细胞与B细胞相互作用、B细胞与巨噬细胞、T细胞与树突细胞相互作用、基质细胞与T细胞相互作用、基质细胞与B细胞相互作用或者基质细胞与树突细胞相互作用。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
在另一方面，本公开内容提供了用于产生一种或多种免疫蛋白的系统，包括：(a)被配置成含有第一介质的介质室，所述第一介质包含第一多个细胞和第一多个聚合物前体；(b)被配置用于将至少一个能量束引导至所述介质室的至少一个能量源；以及(c)可操作地耦合到所述至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令；(ii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述第一聚合物前体的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少一部分；(iii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少第二部分，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二多个聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；和(iv)使所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
在一些实施方案中，所述足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件包括将所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。在一些实施方案中，所述抗原选自全肽、部分肽、糖肽、全蛋白质或蛋白质亚基、碳水化合物、核酸、活病毒、热灭活的病毒、病毒颗粒、膜结合或稳定的蛋白质、噬菌体展示的抗原以及全细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地进一步编程用于从所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分提取所述一种或多种免疫蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫蛋白是人免疫蛋白。在一些实施方案中，所述一种或多种免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫疗法。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述IgG抗体是人IgG抗体。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自受试者。在一些实施方案中，所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。在一些实施方案中，所述B细胞选自幼稚B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、B1 B细胞和B2 B细胞。在一些实施方案中，所述T细胞选自CD8+和CD4+。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。在一些实施方案中，所述3D淋巴类器官的形状是泪滴形。在一些实施方案中，3D淋巴类器官的所述至少所述部分的聚合物形成网络。在一些实施方案中，所述网络是网状的、无定形的或是网。在一些实施方案中，所述网是组织化网。在一些实施方案中，所述组织化网包括重复图案。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。在一些实施方案中，所述细胞相互作用是B细胞与T细胞缀合物形成、B细胞与B细胞相互作用、B细胞与巨噬细胞、T细胞与树突细胞相互作用、基质细胞与T细胞相互作用、基质细胞与B细胞相互作用或者基质细胞与树突细胞相互作用。在一些实施方案中，所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
在另一方面，本公开内容提供了产生人免疫蛋白群的方法，包括：使用多光子激光生物打印系统生物打印三维淋巴类器官；将所述三维淋巴类器官暴露于抗原，以便刺激所述人免疫蛋白群的产生；以及从所述三维淋巴类器官提取所述人免疫蛋白群。
在一些实施方案中，所述抗原选自全肽、部分肽、糖肽、全蛋白质或蛋白质亚基、碳水化合物、核酸、活病毒、热灭活的病毒、病毒颗粒、膜结合或稳定的蛋白质、噬菌体展示的抗原以及全细胞。在一些实施方案中，所述人免疫蛋白群选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在一些实施方案中，所述三维淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。在一些实施方案中，所述三维淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。在一些实施方案中，所述三维淋巴类器官的形状是泪滴形。
实施例
提供以下实施例用于说明性目的。这些实施例并非旨在进行限制。
实施例1-打印的淋巴类器官中的寨卡病毒抗体生成
在实施例中，如本文公开的方法所述，进行了体外研究以使用打印的淋巴类器官生成靶向寨卡病毒的抗体。共使用了50个淋巴结类器官来生成寨卡病毒抗体。杂交瘤细胞系在6周内生成。
如图22所示，将24种不同的抗体(样品A1-A6、B1-B6、C1-C6和D1-D6)暴露于ELISA板，并测量其在450nm和680nm波长处的吸光度。样品A1-A6、B1、B2、B6、C6、D1、D3和D4表现出高于阴性对照的吸光度值。样品D3表现出高于阳性对照的吸光度值。该研究证明，通过本文所述方法产生的淋巴结类器官能够成功地高通量生成抗体文库，其绕开了动物在抗体生成中的使用。
实施例2–寨卡病毒抗体的体内研究
在另一个实施例中，进行了鼠体内研究以评估由通过本文公开的方法产生的淋巴结类器官产生的抗体的感染性病毒中和能力。首先，在打印的淋巴结类器官中产生抗体文库。通过ELISA测试选择最佳的抗体候选物(即具有最高吸光度值的样品)。进行最佳抗体候选物的基因测序。此外，通过表面等离子共振(SPR)(BiacoreTM8K，GE Healthcare)确定整个寨卡病毒的抗体亲和力。显示出对寨卡病毒最佳结合亲和力的抗体在感染了寨卡病毒的小鼠中进行测试，并显示出有效的中和活性。
实施例3-封装的人多能干细胞衍生的胰岛素产生细胞簇
在另一个实施例中，用本文所述的全息打印方法封装人衍生的胰岛素产生细胞簇。人衍生的胰岛素产生细胞的3D打印簇可用于内分泌细胞递送或用于植入的目的。图28A示出了约1,500个人多能干细胞(PSC)衍生的胰岛素产生细胞的簇，所述细胞在胰岛素启动子下表达增强的绿色荧光蛋白(eGFP)。使用提供的三维全息打印方法和系统封装并回收人PSC衍生的胰岛素产生细胞。图28A左图的明视野显微镜图像中示出了封装的细胞。图28A右图的荧光显微镜图像(绿色通道荧光)中示出了封装的细胞，结构和细胞都发出一些荧光，表明封装。细胞在成像前5天被封装，并显示出稳健的eGFP荧光。如图28B所示，在包含平均10个被封装的胰岛素产生元件的介质中测量封装后五天的封装细胞中人C肽的量(以纳摩尔/毫升为单位)。C肽通常与胰岛素一起由β细胞产生。图28C和图28D示出了封装后五天的封装细胞的荧光显微图像。封装细胞在胰岛素启动子下表达eGFP荧光，表明封装在5天后仍完整。图28E示出了用于递送和维持细胞的封装结构的高分辨率荧光显微图像。比例尺为200μm。
实施例4–3D全息打印的生物相容性微支架
在另一个实施例中，使用本文所述的方法和系统打印生物相容性微支架。图29A示出了可用于打印各种长度的小生物相容性支架结构的可堆叠的支架结构的代表性3D渲染。图29B示出了使用本文提供的方法和系统打印的1毫米(mm)长、柔性和多孔的支架结构的侧视图的显微镜图像。比例尺为500μm。图29C是示出了柔性支架结构的横截面的显微镜图像，证明了圆形完整性和中空设计。通过支架结构的中空内部的中心观察而拍摄图像。比例尺为500μm。
实施例5–3D全息打印的微支架可压缩性和回弹性测试
在另一个实施例中，测试了使用本文所述的方法和系统打印的生物相容性微支架的可压缩性和回弹性。图30A示出了来自视频的一系列五个静止图像，描述将500微米(μm)直径的支架抵靠固体表面反复压缩。比例尺为200μm。图30A示出了来自图30A的相同系列的五个静止图像；但是，在图像中添加了条，以显示支架的压缩程度和回弹性。支架被压缩到至少约200微米的不同程度。如图30A和图30B所示，在压缩后支架结构恢复到其原始尺寸(即直径)，没有观察到结构缺陷。比例尺为200微米(μm)。
实施例6–3D全息打印的微网
在另一个实施例中，使用本文所述的方法和系统打印微网。图31A示出了将被全息打印的微网网络的计算机生成图像。图31B示出了全息打印的网格网络。比例尺为500μm。图31C示出了图31B中所示的网格网络的特写图像。比例尺为250μm。图31D示出了来自视频的一系列静止图像，其中对微网进行了横向压缩。图31D因此展示了微网的柔性和回弹性。图31E示出了来自视频的一系列静止图像，示出了用镊子处理时的微网。图31E展示了微网的柔性和回弹性。
实施例7–区室化的抗原应答性人免疫组织：淋巴结类器官
在另一个实施例中，评估使用本文提供的方法和系统的淋巴结类器官及其功能。图32A示出了在聚合的1.5mg/mL胶原蛋白基质中处于每毫升2000万个细胞的密度的隔离的免疫细胞的荧光显微镜图像。抗原呈递细胞(APC)和T细胞的混合物以与打印的包含来自相同供体的B细胞的胶原蛋白基质相接的方式进行打印。图32B示出了荧光显微镜图像，其表示打印的胶原蛋白基质中的混合细胞群。混合细胞群包含B细胞和T细胞，并且胶原蛋白基质以1.5mg/mL的胶原蛋白浓度打印。图32C示出了组织培养孔中混合细胞群的荧光显微图像。该混合细胞群未打印在胶原蛋白基质或其他材料中；因此，显示出较低的细胞浓度和混合分布。图32D示出了在将抗原添加至淋巴结类器官后24小时的淋巴结类器官和细胞簇的荧光显微镜图像。形成以不同的颜色表示的来自T细胞区和B细胞区两者的细胞簇，表明在淋巴结类器官内发生相互作用和直接的细胞-细胞接触(细胞簇在图32D中圈出)。图32E示出了在单个抗原脉冲后72小时的打印的淋巴结类器官和细胞簇的荧光显微镜图像。图32F示出了在单个抗原脉冲后120小时的打印的淋巴结类器官和细胞簇的荧光显微镜图像。在抗原添加后72小时和120小时之后，细胞簇保持形成并移动位置，指示类器官内有动态和游动的细胞(细胞簇在图32E-图32F中圈出)。图32G示出了表示通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的以皮克/毫升(pg/mL)为单位的白介素4(IL-4)的产生的图。在抗原攻击后五天，在类器官周围的介质中测量细胞因子IL-4。IL-4可由B细胞、T细胞和树突细胞在其增殖期间和对抗原应答的过程中产生。单独用于培养类器官的介质为空白的对照读数。在图32G和图32H两者中，样品名称4A3、4C1、1A4、3B4、1B2、1B3、2A1和2A2是指不同的采样位置(即组织培养板的不同孔)。图32H示出了表示在抗原攻击后五天类器官周围的介质中以pg/mL为单位的IL-2的产生的图。在抗原攻击的第0天，使用补充有IL-2的细胞培养基来培养打印的淋巴结类器官。结果显示变化的每孔的IL-2量。IL-2量的变化可代表抗原应答过程期间IL-2的消耗和IL-2的产生。在抗原攻击后的五天期间(即，当测量IL-4和IL-2的产生时)，介质没有改变或添加到打印的淋巴结类器官。
实施例8-人淋巴结类器官响应于抗原攻击的人IgG产生
在另一个实施例中，打印淋巴结类器官并在体外培养。从淋巴结类器官介质纯化人免疫球蛋白(IgG)并测试蛋白质的存在。图33A示出了表示代表对照(即空白和标准品)和各种样品的以微克/毫升(μg/mL)为单位的蛋白质浓度的图。高蛋白质量指示存在分泌的人IgG抗体；因此指示功能性免疫应答。从打印的淋巴结类器官介质分离的纯化的(图33B)和未纯化的(图33C)人IgG的实例在聚丙烯酰胺凝胶上运行，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白质分离。图33B和图33C示出了含有从打印的淋巴结类器官介质分离的纯化的人IgG(图33B)和纯化的人IgG(图33C)的凝胶的图像。图像在人IgG轻链的约25千道尔顿(kDa)的预期分子量和人IgG重链的约55kDa的预期分子量处显示清晰的条带。
实施例9-人IgG的抗原特异性结合的验证
在另一个实施例中，测试打印的淋巴结类器官培养基等分试样的人IgG与实施例7中描述的抗原攻击中使用的抗原的反应性。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测对用于攻击淋巴结类器官的特定抗原具有反应性的类别转换的人IgG。图34A示出了表示使用ELISA测试的样品在450纳米(nm)和570nm处的吸光度(即，光密度)的图。高吸光度指示含有人IgG的样品对抗原攻击中使用的特定抗原具有高反应性。用对照和样品运行ELISA，该样品是在初始抗原攻击后21天获得的打印的淋巴结类器官介质的直接等分试样。然后从含有阳性抗体的孔选择类器官以产生杂交瘤。虚线表示商业试剂盒指示的抗体阳性读数的截止值。在图34A中，加号(+)表示独特的抗原特异性阳性孔。图34B示出了表示亚克隆的独特杂交瘤的两个图，该杂交瘤被进一步测定特异性抗原反应性人IgG的存在。鉴别了几个阳性克隆，例如亚克隆集2、亚克隆集6和亚克隆集7。虚线表示使用的商业试剂盒指示的阳性抗体读数的截止值。在图34B中，加号(+)表示独特的抗原特异性IgG阳性亚克隆杂交瘤。
实施例10–改善工程化皮肤移植物的打印的含细胞网格贴片
在另一个实施例中，使用打印的贴片的网格网络来支撑高度分层和多层的皮肤组织，包括无血管的分层的表皮层和脉管化的真皮层。含细胞胶原蛋白(1型)网格网络的层被用于使真皮层工程化。植入网格网络的细胞包括但不限于成纤维细胞、角质形成细胞和表皮细胞。网格网络包括多孔和管状结构，其允许经由灌注将营养物递送至真皮层。将结构合并到支撑血管系统、神经束和淋巴管的网格网络中，从而允许生成支撑分层的表皮层的功能性且有活力的真皮。在最上层，合并结构以便支撑充斥着表皮干细胞的毛囊和皮脂腺微生境。将角质形成细胞培养在真皮网格贴片的顶部，并通过既定方案诱导增殖。通过添加外源因子诱导角质形成细胞的增殖，这些外源因子包括但不限于钙、血清和佛波酯。角质形成细胞在气液界面生长，以诱导完全分层的表皮分化，该完全分层的表皮包括含有毛囊和皮脂腺微生境的基底层、棘层、颗粒层和角化皮肤层。将细胞外基质组分、生长因子和上皮细胞以高度可复制的方式(例如，通过3D全息图案化和打印)放置在打印的网格贴片内或上方的期望位置。附加地，在网格贴片内打印血管网络。包含打印的血管网络改善了皮肤移植物的长期生存。
尽管本文已经示出并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员容易理解的是，这样的实施方案仅以示例的方式提供。并非旨在通过说明书中提供的具体实例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但对本文实施方案的描述和说明并不意味着以限制性的意义来解释。本领域技术人员在不偏离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文阐述的具体描述、配置或相对比例，其取决于多个条件和变量。应当理解，本文所述的本发明实施方案的各种替代方案均可用于实践本发明。因此，可以设想，本发明还应当涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同项。旨在以下述权利要求限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。

Claims (80)

1.一种产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：
(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；
(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径，将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，所述3D淋巴类器官包括(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及
(c)使所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
2.如权利要求1所述的方法，其中在(c)中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(d)从所述3D淋巴类器官的所述至少部分提取一种或多种免疫蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述多个细胞来自受试者。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。
9.如权利要求1所述的方法，其中3D淋巴类器官的所述至少所述部分的所述聚合物形成网络。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述网络是网状的、无定形的或是网。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
13.一种用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：(i)打印包含含有多个细胞的基质的三维(3D)淋巴类器官，和(ii)处理所述3D淋巴类器官，以产生所述一种或多种免疫蛋白。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述多个细胞来自所述受试者。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
18.一种用于产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：
(a)提供包含第一介质的介质室，其中所述第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体；
(b)根据计算机存储器中用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述介质室中的所述第一介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的第一部分；
(c)在所述介质室中提供第二介质，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；
(d)根据所述计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的第二部分；以及
(e)使所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
19.如权利要求18所述的方法，其中在(e)中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(f)从所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分提取一种或多种免疫蛋白。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自受试者。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
24.如权利要求18所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
25.如权利要求18所述的方法，其中所述3D淋巴类器官的形状选自球形、椭圆形、卵圆形、卵形、正方形、矩形、立方形、任何多边形形状、自由形式和泪滴形。
26.如权利要求18所述的方法，其中3D淋巴类器官的所述至少所述部分的所述聚合物形成网络。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述网络是网状的、无定形的或是网。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述无定形网络被设计用于促进细胞相互作用。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述无定形网络被设计用于促进在细胞小生境之间或之内的移动。
30.一种产生一种或多种免疫蛋白的方法，包括：(i)打印包含基质的三维(3D)淋巴类器官，所述基质包含第一多个细胞和第二多个细胞，和(ii)处理所述3D淋巴类器官，以产生所述一种或多种免疫蛋白。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自所述受试者。
33.如权利要求30所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
34.如权利要求30所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
35.一种用于使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括：
(a)提供包含介质的介质室，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；
(b)根据计算机存储器中用于打印所述三维(3D)含细胞医疗设备的计算机指令，沿着被图案化为3D投影的至少一个能量束路径，将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以形成所述3D含细胞基质的至少一部分，所述3D含细胞基质包含(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的聚合物；以及
(c)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述多个细胞来自所述受试者。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。
40.如权利要求35所述的方法，其中所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。
41.如权利要求35所述的方法，其中所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
43.一种使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括(i)打印包含多个细胞的所述3D含细胞基质，和(ii)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述多个细胞来自所述受试者。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。
48.如权利要求43所述的方法，其中所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。
49.如权利要求43所述的方法，其中所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
51.一种用于使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括：
(a)提供包含第一介质的介质室，其中所述第一介质包含第一多个细胞和第一聚合物前体；
(b)根据计算机存储器中用于打印所述3D含细胞基质的计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述介质室中的所述第一介质的至少一部分形成所述3D含细胞基质的第一部分；
(c)在所述介质室中提供第二介质，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；
(d)根据所述计算机指令，沿着至少一个能量束路径将至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D含细胞基质的第二部分；以及
(e)将所述3D含细胞基质的所述第一部分和所述第二部分定位在受试者体内。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自所述受试者。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
54.如权利要求51所述的方法，其中所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。
56.如权利要求51所述的方法，其中所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。
57.如权利要求51所述的方法，其中所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
59.一种使用三维(3D)含细胞基质的方法，包括：(i)打印包含第一多个细胞和第二多个细胞的所述3D含细胞基质，其中所述第一多个细胞与所述第二多个细胞不同，和(ii)将所述3D含细胞基质定位在受试者体内。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞来自所述受试者。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述第一多个细胞和所述第二多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
62.如权利要求59所述的方法，其中所述3D含细胞基质形成缝合线、支架、钉、夹子、股线、贴片、移植物、片、管、销或螺钉。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述移植物选自皮肤植入物、子宫内膜、神经组织植入物、膀胱壁、肠组织、食管内膜、胃内膜、毛囊嵌入的皮肤和视网膜组织。
64.如权利要求59所述的方法，其中所述3D含细胞基质为约1μm至约10cm。
65.如权利要求59所述的方法，其中所述3D含细胞基质进一步包含促进脉管系统或神经生长的试剂。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述试剂选自生长因子、细胞因子、趋化因子、抗生素、抗凝剂、抗炎剂、阿片类镇痛剂、非阿片类镇痛剂、免疫抑制剂、免疫诱导剂、单克隆抗体和干细胞增殖剂。
67.一种用于产生一种或多种免疫蛋白的系统，包括：
(a)介质室，该介质室被配置成含有介质，所述介质包含多个细胞以及一种或多种聚合物前体；
(b)至少一个能量源，该至少一个能量源被配置用于将至少一个能量束引导至所述介质室；以及
(c)可操作地耦合到所述至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令；(ii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述介质，以使所述聚合物前体的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，和(iii)使所述3D淋巴类器官的所述至少一部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
68.如权利要求67所述的系统，其中所述足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件包括将所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。
69.一种用于产生一种或多种免疫蛋白的系统，包括：
(a)介质室，该介质室被配置成含有第一介质，所述第一介质包含第一多个细胞和第一多个聚合物前体；
(b)至少一个能量源，该至少一个能量源被配置用于将至少一个能量束引导至所述介质室；以及
(c)可操作地耦合到所述至少一个能量源的一个或多个计算机处理器，其中所述一个或多个计算机处理器被单独地或共同地编程用于(i)从计算机存储器接收用于打印三维(3D)淋巴类器官的计算机指令，(ii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的所述第一介质，以使所述第一聚合物前体的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少一部分；(iii)引导所述至少一个能量源，以根据所述计算机指令沿着至少一个能量束路径将所述至少一个能量束引导至所述介质室中的第二介质，以使所述介质室中的所述第二介质的至少一部分形成所述3D淋巴类器官的至少第二部分，其中所述第二介质包含第二多个细胞和第二多个聚合物前体，其中所述第二多个细胞是与所述第一多个细胞不同的类型；和(iv)使所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
70.如权利要求69所述的系统，其中所述足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件包括将所述3D淋巴类器官的所述第一部分和所述第二部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。
71.一种产生人免疫蛋白群的方法，包括：
(a)使用多光子激光生物打印系统来生物打印三维淋巴类器官；
(b)将所述三维淋巴类器官暴露于抗原，以便刺激所述人免疫蛋白群的产生；以及
(c)从所述三维淋巴类器官提取所述人免疫蛋白群。
72.一种产生人免疫蛋白群的方法，包括：
(a)提供介质，所述介质包含(i)多个细胞和(ii)一种或多种聚合物前体；
(b)将至少一层所述介质沉积到一衬底上；
(c)使所述至少一层所述介质经历能量源，以形成所述3D淋巴类器官的至少一部分，所述3D淋巴类器官包括(i)所述多个细胞的至少亚群，和(ii)由所述一种或多种聚合物前体形成的生物凝胶；以及
(d)使所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分经历足以刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生的条件。
73.如权利要求72所述的方法，其中在(c)中，所述条件包括将所述3D淋巴类器官的所述至少所述部分暴露于抗原，以便刺激所述一种或多种免疫蛋白的产生。
74.如权利要求72所述的方法，其中所述方法进一步包括：
(d)从所述3D淋巴类器官的所述至少一部分提取一种或多种免疫蛋白。
75.如权利要求72所述的方法，其中所述免疫蛋白选自抗体、T细胞受体和癌症免疫治疗剂。
76.如权利要求72所述的方法，其中所述多个细胞来自受试者。
77.如权利要求72所述的方法，其中所述多个细胞选自基质内皮细胞、内皮细胞、滤泡网状细胞或其前体、幼稚B细胞或其他未成熟B细胞、记忆B细胞、血浆B细胞、辅助T细胞及其亚群、效应T细胞及其亚群、CD+8T细胞、CD4+T细胞、调节T细胞、自然杀伤T细胞、幼稚T细胞或其他未成熟T细胞、树突细胞及其亚群、滤泡树突细胞、朗格汉斯树突细胞、真皮衍生的树突细胞、树突细胞前体、单核细胞衍生的树突细胞、单核细胞及其亚群、巨噬细胞及其亚群、白细胞及其亚群。
78.如权利要求72所述的方法，其中所述3D淋巴类器官选自B细胞生发中心、胸腺样发育小生境、淋巴结、朗格汉斯岛、毛囊、肿瘤、肿瘤球体、神经束或支持细胞、肾单位、肝类器官、肠隐窝、初级淋巴器官和次级淋巴器官。
79.如权利要求72所述的方法，其中所述介质包含光引发剂、交联剂、胶原蛋白、透明质酸和其他糖胺聚糖、聚-dl-乳酸-共-羟基乙酸(PLGA)、聚-l-乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)、藻酸盐、明胶、琼脂或其任何组合。
80.如权利要求72所述的方法，其中所述能量源是激光器、热源、光源或其任何组合。
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