JP5795699B2 - 人工免疫システム：作製および使用方法 - Google Patents

人工免疫システム：作製および使用方法 Download PDF

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Description

本出願は、２００４年４月２８日出願の米国仮出願第６０／５６５，８４６号、および２００５年１月１３日出願の米国仮出願第６０／６４３，１７５号からの優先権を主張する。この仮出願の全体が参照によって本明細書に援用される。
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、統合された人工的なヒト組織を構築するための方法、そして詳細には、ワクチン、アジュバント、免疫療法候補物、化粧品、薬物、生物製剤および他の化合物のインビトロ試験のための統合されたヒト免疫系の構築に関する。この人工的な免疫系は、免疫系との物質の相互作用を評価するために有用であり、従って、ワクチン、薬物、生物製剤、免疫療法、化粧品、および化合物の開発を加速し、かつ正確性3092改善するために用いられ得る。
（技術の背景）
ヒトのワクチンの開発および生物学的試験は伝統的に、マウスおよびウサギのモデルのような小動物モデル、ついで非ヒト霊長類モデルに依拠してきた。しかし、このような小動物モデルは、高価であって、非ヒト霊長類モデルは高価かつ希少である。
哺乳動物の免疫系は、環境的な病原に対して身体を保護するために２つの一般的な適応機構を用いる。病原体由来分子に遭遇するとき、免疫応答は、その病原性の生物体に対する防御を確保するように高度に活性化される。
第一の機構は、非特異的（すなわち先天性の）炎症性応答である。先天性の免疫系は、病原体には存在するが身体自体にはない特定の分子を認識すると考えられる。
第二の機構は、特異的または後天的な（すなわち適応的）免疫応答である。先天性の応答は基本的に各々の傷害または感染に対して同じである。対照的に、後天的な応答は、該当の病原体に対してあつらえて仕立てられる。この後天性免疫系は、抗原と呼ばれる病原体に存在する多くの種々の分子に対する、特定の免疫グロブリン（抗体）応答を包含する。さらに、Ｔ細胞レセプターの大きいレパートリーを、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原呈示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩおよびＩＩに対して結合した、プロセシングされた形態の抗原に対してこれらのＴ細胞レセプターが結合する能力についてサンプリングする。
免疫系は、自己のタンパク質と非自己のタンパク質との間の構造的な相違を認識して応答する。免疫系が非自己として認識するタンパク質は、抗原と呼ばれる。病原体は代表的には、多数の高度に複雑な抗原を発現する。後天性の免疫は、抗原構造に関して特定の記憶を有し；同じ抗原に対する反復曝露は、特定の病原体に対して誘導された保護のレベルを増大する応答を増大する。
後天性の免疫は、Ｂリンパ球およびＴリンパ球（または単にＢ細胞およびＴ細胞）と呼ばれる専門化された免疫細胞によって媒介される。Ｂ細胞は、抗体の作用を通じてそれらの機能を生じて、媒介する。Ｂ細胞依存性免疫応答は、抗体が体液中で検出されるので、「体液性免疫（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」と呼ばれる。Ｔ細胞依存性免疫応答は、エフェクターの活性が、エフェクターＴ細胞の局所作用によって直接媒介されるので、「細胞媒介性免疫（ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」と呼ばれる。エフェクターＴ細胞の局所作用は、Ｔ細胞と二次エフェクター細胞、例えば活性化されたマクロファージとの間の相乗作用的な相互作用を通じて増幅される。この結果として、病原体は殺傷されて、疾患の発生が防がれる。
病原体と同様に、先天性の免疫応答をワクチン接種部位で開始すること、ならびに二次的なリンパ組織における長期記憶細胞に対して惹起され得る抗原特異的なＴ細胞およびＢ細胞を活性化することによって、ワクチンは機能する。ワクチンと細胞とのワクチン接種部位での、そしてリンパ組織のＴ細胞およびＢ細胞との正確な相互作用は、このワクチンの最終的な成功にとって重要である。
生物体に感染するほぼ全てのワクチンは、ワクチン自体として弱毒化されるかまたは不活性化された病原体を生成するという古典的なアプローチを通じて開発されることが続いてきた。しかし、このアプローチは、免疫系に対する我々の機構的な理解における最近の飛躍を利用できていない。そうではなく、このアプローチは、種々の病原体を作製する工程と、非ヒト動物モデルにおける有効性についてそれらを試験する工程という経験的なアプローチのままである。
さらに洗練されたワクチンの設計、作製および試験における進歩は、いくつかの理由のために失速している。第一に、明らかに、実験的なワクチンに曝された健常な小児における有害な副作用について耐容性がほとんどないために、ヒトで試験できるワクチンはごく少数しかない。ガンのワクチントライアルを除いて、このせいで、ヒトの臨床トライアルの現実の世界で可能な革新は極めて限定される。第二に、イムノドミナントなＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘導のため、そしてＢ細胞応答を中和するためにどのエピトープが最適であるかを予測することは未だに困難である。第三に、小動物の試験と、その後の霊長類でのトライアルは、ワクチン開発の頼みの綱であり；このようなアプローチは、ヒトと非ヒト種との間の本質的な相違、ならびに非ヒト霊長類の使用を制限する倫理上および費用の懸念によって制限される。結果として、基本的な知識の臨床への移行は遅く、ただし同等に重要な、インビボでのヒト免疫の理解においては進歩が遅い。
ヒトのトライアルにおいて多数の新規なワクチンを試験することができないということに取り組むために、本発明の人工的免疫系（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＩＳ）は、ヒトの組織および細胞用いるを代わりに用いられ得る。このＡＩＳによって、ヒト免疫のインビトロモデルにおいて迅速なワクチン評価が可能になる。このＡＩＳによって、現在用いられている動物モデルに加えて、ワクチンを試験するためのさらなるモデルが提供される。
免疫系を調節するのにおける試みが行われている。例えば、米国特許第６，８３５，５５０号Ｂ１（特許文献１）、米国特許第５，００８，１１６号（特許文献２）、Ｓｕｅｍａｔｓｕら［Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２，１５３９〜１５４５，（２００４）（非特許文献１）］および米国特許公開第２００３／０１０９０４２号（特許文献３）を参照のこと。それにもかかわらず、これらの刊行物では、ワクチン部位（ＶＳ）、リンパ組織等価物（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）（ＬＴＥ）、リンパ管および血管の網目状構造等価物を含むＡＩＳ、ならびに物質と免疫系との相互作用を評価するためのＡＩＳの使用は記載も示唆もされていない。
米国特許第６，８３５，５５０号明細書 米国特許第５，００８，１１６号明細書 米国特許公開第２００３／０１０９０４２号明細書 Ｓｕｅｍａｔｓｕら、Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，（２００４），２２，１５３９〜１５４５
（発明の要旨）
本発明は、インビトロでワクチン、アジュバント、薬物、生物製剤、化粧品および他の化合物を試験するための、機能的に等価なヒト組織の統合型のシステムを提供する。本発明の１局面は、形態的に等価な構築物を製造するのではなく設計する青写真を用いて、機能的に等価な組織を構築するための方法に関する。ヒト免疫系に対する機能的な等価性は、モジュールの小型化された免疫バイオリアクター系に収容された、３つの操作された組織構築物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）（ＥＴＣ）を構築することによって達成される。
本発明の別の局面は、人工的な免疫系を構築する方法に関する。この方法は：（１）ヒト免疫系についての基礎を形成する３つの機能的に等価な免疫学的な操作された組織（ワクチン接種部位、リンパ組織等価物およびリンパ／脈管のハイウェイ）を設計して青写真をとる工程と；（２）操作された免疫学的構築物の間にリアルタイムの連絡経路を提供する工程と；（３）モジュールの免疫バイオリアクターに、この操作された組織および免疫学的構築物を組み込んで、迅速なワクチン評価のためのインビトロＡＩＳの基礎を形成する工程と；を包含する。
人工的な免疫系の構築のためのアプローチは、樹状細胞（ＤＣ）に対して特に集中した、再生可能な細胞供給源が多い、操作された免疫学的組織の構築を包含する。直接的な自己アセンブリプロセスを介した細胞と、生体分子と、足場との間の空間的な並列および一時的な関係を最適化する能力は、既存の二次元（２Ｄ）ペトリ皿細胞培養物をはるかに超えて、インビトロの状況に対してさらにかなり近い、再生可能な三次元（３Ｄ）の異種の生物学的に生存可能な構築物に動く。
本発明の人工的免疫系はさらに、（１）種々の感染性疾患および病原体を排除するために被験体において免疫系を調節すること、（２）ワクチンまたは免疫治療処方物の迅速な比較；（３）さらなる開発に集中するために「律速段階（ｒａｔｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｓｔｅｐｓ）」を特定するためのワクチンまたは免疫療法作用の合理的な解析；そして（４）さらに迅速かつ長期に続く防御を促進するより良好なワクチンを作製するための最適の処方物の体系的な決定のためにＡＩＳを用いる方法に関する。
このような操作された組織構築物等価な免疫系の予測の価値は、現在のヒト免疫のインビトロモデルよりも優れている。
（発明の詳細な説明）
本発明の主な目的は、インビトロにおいて、ワクチン、免疫療法剤、アジュバント、薬物、生物製剤、化粧品および他の化合物を試験するために、組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）ヒト組織、組み込まれたヒト免疫系を提供することである。本発明の１局面は、適切なインビトロの細胞および組織構築物またはそれらの等価物を用いてヒトにおいてワクチンと相互作用する正常な組織を模倣する工程を包含する、組み込まれたヒト免疫系モデルを構築する方法に関する。ヒト組織のこのような組み込まれたプラットフォームによって、ワクチン開発ストラテジーの加速および免疫系と相互作用する薬物の試験が可能になる。さらに、動物試験の減少が可能になり、そして候補ワクチンを、動物研究およびヒトのトライアルの費用の一部で再操作して再試験することが可能になる。
組織操作は、細胞および組織と特異的な相互作用をし得る合成物質またはデバイスの開発を包含する。この構築物は、これらの物質と生きている細胞とを組み合わせて機能的な組織等価物を生じる。組織操作は、多数の種々の分野、例えば、医用材料操作、薬物送達、組み換えＤＮＡ技術、生分解性ポリマー、バイオリアクター、幹細胞単離、細胞カプセル化および固定、ならびに細胞の２Ｄおよび３Ｄの足場の生成に関与する。多孔性の生分解性医用材料足場が、組織操作構築物を形成するための細胞の３Ｄの増殖に必要である。足場についての多孔性を得るためには、線維結合、溶媒流延／粒子浸出（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｌｅａｃｈｉｎｇ）、発泡（ｇａｓ ｆｏａｍｉｎｇ）／粒子浸出、および液相間分離を含む、いくつかの技術が存在する。これらは大きい内部接続された細孔を生じて細胞の播種および遊走を促進する。本明細書において用いる場合、「組織操作された構築物（ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」または「操作された組織構築物（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」（「ＥＴＣ」）という用語は、構築物に対して構造的な完全性を与える天然または合成の足場とともに、天然に由来するかまたは合成的に増殖された組織または細胞の任意の組み合わせを包含する。
３Ｄの生物学は、適切な機能の免疫学的ＥＴＣを誘導するのに重要であることが公知である（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ＆Ｋｅｅｆｅｒ，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９２：１〜６（２００５）を参照のこと）。細胞の過程を研究するための主なアプローチは、インビトロにおいて細胞を培養することである。歴史的には、これは、プラスチックまたはガラスの支持体上に細胞をプレートする工程を包含している。固体またはフィルターの支持体上で増殖された細胞は、２次元（２Ｄ）培養物と呼ばれる。多孔性の支持体上のこのような２Ｄ培養物は、生物学の多くの局面を研究するために極めて有用であった。しかし、かなりの多くのインビボ様条件が現在、３Ｄ培養物で実現できる。例えば、多くの上皮細胞が初代培養および樹立された株の両方とも、３ＤのＥＣＭにおいて増殖された場合複雑な上皮構造を形成する。
近年では、リンパ節では、３Ｄの腸組織マトリックスはＡＰＣに向かうＴ細胞遊走を容易にするだけでなく、細胞間の相互作用に対する運動性も支持するということが示されている。３Ｄのコラーゲンマトリックス環境は、その空間的な構築のおかげで、リンパ球のクローリング（ｃｒａｗｌｉｎｇ）の牽引となり、リンパ節皮質のいくつかの構造的な特徴を模倣する。これによってインビトロの免疫系を含む構築物中の３Ｄ環境の重要性についての実験的正当化が得られる。
２Ｄと３Ｄの微小環境の間の相違としては：
（１）２Ｄ培養物においては、細胞は、人工的な支持体から天然ではない異方性の外部の合図を受けるが、３Ｄ培養物では、細胞はＥＣＭ上で全ての次元に遊走できる；
（２）２Ｄ培養物においては、支持体（例えば、プラスチック、ガラス）は、天然に存在するＥＣＭよりもかなり剛直である；
（３）３Ｄ培養物で増殖した細胞は、アポトーシスに対してかなり耐性である、そして
（４）細胞に分泌されたタンパク質は、ＥＣＭ周囲の３Ｄ培養物とさらに良好に相互作用し、かつそれによって組織化され得、そして細胞の挙動に影響し得る、
ということが挙げられる。
本発明の実施は、他に示さない限り、免疫学、組織学、微生物学、細胞および組織培養物、ならびに当該分野の技術の範囲内の分子生物学の従来の方法を使用する。このような技術は、本明細書中で詳細に説明される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参照によって援用される。
本発明のインビトロの人工的免疫系（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＩＳ）のデザインは：
１．３つの基本的な、機能的な免疫学的組織：
ａ．皮膚および／または粘膜の等価物（ワクチン接種部位）、
ｂ．リンパ組織等価物（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）（ＬＴＥ（リンパ節））、および
ｃ．他の２つの組織を接続するリンパ管および血管の網目状構造等価物、
２．再生可能かつ反復可能な試験のための細胞供給源、ならびに
３．免疫学的組織を収容しかつ組み込み、そしてワクチンの有効性を評価しかつ試験するためのバイオリアクター、
を含む。
本発明のＡＩＳはさらに：
（ａ）血中単球および非単球樹状細胞（ＤＣ）前駆体の輸送を容易にして、人工的な皮膚３Ｄ組織操作された構築物内の成熟抗原提示細胞への自然な変換を支持するインビトロの皮膚および／または粘膜等価足場（ワクチン接種部位、ＶＳ）と；
（ｂ）このワクチン接種部位から、成熟ＤＣ遊走のためのリンパ組織等価物（ＬＴＥ）へのリンパ管様経路、およびワクチン接種部位（ＶＳ）への単球遊走のための血管様経路と；
（ｃ）リンパ節の幾何学を模倣し、かつ適切なリンパ節細胞タイプを含む構造を有する組織操作された足場におけるリンパ節組織等価物と；
（ｄ）内因性の組織に対して匹敵する特性を示す機能的に等価な組織構築物である上記の構築物と；
（ｅ）モジュールのバイオリアクター系におけるこれらの免疫学的組織構築物の組み込みと；を含む。
インビトロのワクチン接種部位（ＶＳ）のための３Ｄの灌流メッシュ、膜またはゲル様構築物の設計および構築は、本発明の重要な特徴である。ＶＳは、ワクチンの作用のモデルの重要な一部を提供する。ワクチン研究のための独立型のシステムとして、種々のワクチン、アジュバント、薬物、生物製剤、化粧品および免疫療法候補物の間の機序の相違の分析が可能になり、従って、これらの物質の精練および改善が助けられる。
インビトロのＶＳへの単球遊走のための血管内皮経路の設計および構築も重要である。成熟ＤＣの遊走のためのインビトロのＶＳからＬＴＥへのリンパ系内皮経路が提供される。インビボでの分化を繰り返し、ワクチン接種部位（例えば、皮膚等価物）に遊走性に機能する様式で単球および他のＤＣ前駆体の経内皮輸送を支持する、血管およびリンパの内皮細胞からなる３Ｄモデルは、化粧品、抗酸化剤、可能性のある皮膚刺激薬および他の化合物を試験するために用いられ得る。
ＡＩＳは、Ｔ細胞およびＢ細胞の刺激の定量的測定を：
（ａ）ワクチンまたは免疫療法が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＢ細胞の応答を誘導するように最適のレベルのヘルパーＴ細胞（ＴＨ１またはＴＨ２）を促進するか否かを試験するために、同一平面上でＤＣ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋ＴおよびＢ細胞が出会うＬＴＥ中での場所を通じて；
（ｂ）細胞外マトリックスを有する３Ｄ環境においてＤＣ、Ｔ、およびＢ細胞が出会い、３つの細胞タイプが相互作用し得るリンパ節の環境を模倣する細胞を支持することを可能にする工程；
（ｃ）補充および遊出の間に単球およびＤＣが内皮細胞と相互作用し得るような内皮の包含；
（ｄ）内皮を横切って遊走しかつ局所組織シグナルへの応答が異なり得る（例えば、複数のＤＣサブタイプに対して示差的に発現される場合、ＴＬＲ９（トール様レセプター９）リガンド対ＴＬＲ−４リガンドの効果を識別する）細胞のさらに代表的な集団、およびそのような細胞の存在；
を通じて可能である。
本発明はさらに、以下を包含する：
１．新規な生体分子の徐放性ストラテジー（例えば、徐放性のマイクロスフェア、直接注射ナノシリンジ、二重機能性ナノゲル、指向性分解速度）の使用；
２．例えば、ＶＳ（成熟ＤＣ）からＬＴＥ（成熟ＤＣ、Ｔ細胞およびＢ細胞）への経内皮遊走（ＶＳ（単球）への細胞遊走経路を組織化する）に対する走化性または剪断力の影響を用いる、ＥＴＣから脈管ハイウェイへまたは脈管ハイウェイからの指向された細胞遊走の使用；
３．磁気マイクロビーズアプローチを用いるＥＴＣから脈管ハイウェイへまたは脈管ハイウェイからの指向された細胞遊走（磁気マイクロビーズおよび電磁場はまた、ＡＩＳの区画間で細胞を動かすためにも用いられ得る）；
４．リンパ節の幾何形状を模倣し、かつ適切なリンパ節細胞タイプ、サイトカインおよびケモカインを含む構造を有する３Ｄの足場におけるリンパ節様構造（ＬＴＥ）の設計および構築；
５．ＬＴＥのデザインにおけるリンパ節のＴゾーンのモデルを介する免疫応答の開始を研究するための、調節可能な微小環境を作製するためのアプローチの促進（逆オパール構造に類似の規則的な多孔性のヒドロゲル足場に対して、Ｔゾーンの細網線維芽細胞（ＦＲＣ、Ｔゾーンの間質細胞）を移植する工程、ならびに合成および天然の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）物質の使用であって、リンパ球、および二次リンパ組織においてリンパ球によって期待される生化学的な合図（例えば、接着モチーフおよびケモカイン勾配）を含む、リンパ節の「オープンな（ｏｐｅｎ）」細網の網目状構造を模倣する物理的構造を提供する３Ｄ構造を達成するための使用を包含する）；
６．ＬＴＥでは、Ｂ細胞抗体生成のためのヘルパーＴ細胞のリンパ節様機能を提供すること（例えば、ＬＴＥ内の別個のＴ細胞およびＢ細胞の領域は、デジタル印刷の組み合わせ作用（別個のゾーン内のＴ細胞およびＢ細胞の直接アセンブリ）によって、および徐放性の技術（例えば、それぞれ、Ｔ細胞およびＢ細胞の領域を維持するためにＴ細胞およびＢ細胞の誘引物質を遊離するマイクロスフェアを用いる）によって設計され得る）；
７．ＬＴＥ、ＢＬＣ（Ｂリンパ球化学誘引物質、ＭＶ１０ｋＤａ）、ＭＩＰ−３β（マクロファージ炎症性タンパク質−３β、ＣＣＬ１９）およびＳＬＣ（二次リンパ組織ケモカイン）、ＬＴＥマトリックスでの徐放性のためのケモカインマイクロスフェアの自己組織化を補助すること；さらに、マイクロスフェアは、ＬＴＥ足場（別の実施形態では、マイクロスフェアは、「Ｌｉｎｃｏｌｎ ｌｏｇ」にかなり近い十字パターンで重合化の間にヒドロゲルマトリックスの「支柱（ｓｔｒｕｔｓ）」内に（例えば、ポリカプロラクトンを用いて）直接カプセル化され得る）にＴ細胞およびＢ細胞と同時に印刷されてもよい（さらに別の実施形態では、足場内への間質細胞ガイドＴ細胞局在化を仮定すれば、ＦＲＣ移植Ｔ細胞領域が用いられてもよい）；
８．特に３Ｄ構築物を作製するための微細な容積測定コントロールを備える、３ＤのＥＴＣを正確に製造し得るデジタル印刷ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｔｏｏｌ（ＢＡＴ）の使用；
９．複数の免疫学的ＥＴＣを維持し得、かつヒト免疫系を模倣するために用いられ得る、操作された、細胞の微小流体の環境バイオリアクターの使用；
１０．栄養付加された液体が免疫学的細胞を「給餌する（ｆｅｅｄ）」ためにそれを通してポンピングされる内部チャネルを有するミニチュアの３Ｄハウジングの使用。これらのチャネルの壁は、内皮細胞接着を可能にするように改変され、人工的な内皮を作製するか、または細胞の挙動を変えない生物学的に適合する物質から製造される。この構築物内の細胞は、一定の流速に依拠し、単に栄養についてだけでなく、全てが十分であってケモカインを介してそれらの機能を継続すべきであるシグナルとして依存する。栄養の流体は、種々の細胞が注入される前にこの系をプライムする（最初はシリンジを介する）；次いで完全なＡＩＳは、栄養／酸素溶液について血流をシミュレーションするポンプに機能的に接続される。好ましい実施形態では、脈動ポンプ機構を用いて血管中でみられる状況をさらによく模倣する。ミニチュアサイズおよび透明な構造の実施形態で、顕微鏡下でインサイチュにおける組織構築成分の可視化が可能になる；
１１．Ｔ細胞およびＢ細胞の適切なレパートリーを有するエキソビボ免疫系における高速のワクチンおよび免疫調節物質のスクリーニングのために、ワクチンアジュバント、ワクチン処方物および免疫療法剤のインビトロでの有効性を試験するためのＡＩＳの使用；
１２．ＬＴＥにおいてＢ細胞を活性化することによるＡＩＳにおけるモノクローナル抗体の製造。
ＬＴＥの別の実施形態では、隣接するＴ細胞およびＢ細胞のゾーンを作製し、これによって実際のリンパ節におけるＢおよびＴ細胞のゾーンの自然な分離を模倣する。この実施形態では、ＬＴＥのＴおよびＢのゾーンは、マイクロキャリアを用いて作製される。マイクロキャリア上での細胞の培養に関しては現在かなり公知である；これらは代表的には、直径が約１００〜５０００μｍで、表面が粗いか多孔性の、細胞外マトリックスの必要な成分でコーティングされた粒子であり、その上には種々の種々のアンカーに依存する細胞が成長して増殖し得る。このモデル系は箱の中の粒子に類似している。マイクロキャリアのためのマトリックス物質としては、リンパ組織粒子ＥＣＭ物質、プロタサン、コラーゲン、プロタサン／コラーゲン混合物、ＰＬＧＡ（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド））、および他の足場材料が挙げられ得る。このようなＬＴＥを作製するための一般的アプローチは以下を包含する：
１．Ｔ細胞およびＢ細胞の接着のための適切な接着リガンド、例えばケモカインでマイクロキャリアをローディングする工程；このマイクロキャリアは、天然であっても合成であっても、高密度であっても多孔性であっても、そして所望の充填密度次第で種々のサイズであってもよい；
２．マイクロキャリア上のＴ細胞およびＢ細胞の培養；Ｔ細胞およびＢ細胞は、一緒に培養されてもよく（図１Ａ）、またはそれぞれのマイクロキャリア上で別々に培養されてもよい（図１Ｂおよび１Ｃ）；
３．一緒にＴ細胞およびＢ細胞の集中したマイクロキャリアを多孔性容器中で接触させる工程（「テニスボールのかご（ｔｅｎｎｉｓ ｂａｌｌ ｂａｓｋｅｔ）」に類似）；そして
４．このマイクロキャリアを、充填密度が細胞浸透を可能にするように「知的に（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｌｙ）」充填させる工程。
図１Ｄは、接着リガンドとしてＣＸＣ１３リガンドを有するマイクロキャリアに対してＴ細胞およびＢ細胞を結合させる工程を示す模式図である。図１Ｅに示されるとおり、マイクロキャリア粒子のサイズは、多孔性およびマイクロキャリアの間の開口に影響する。さらに、マイクロキャリアの形状（例えば、球形、不規則形状など）も、最適の充填密度に影響する。
Ｔ細胞が培地中で「遊離（ｆｒｅｅ）」であり得るが、Ｂ細胞は主にマイクロキャリア上に位置しているか、あるいはこの趣旨の他のバリエーションとしてＢ細胞が培地中で「遊離」であり得るが、Ｔ細胞は主にマイクロキャリア上に位置しているということも想定される。
インビトロの免疫系の開発には以下が必要である：
１．３つの基本的な機能的な生物学的組織、詳細には免疫学的組織、例えば：
ａ．皮膚および／または粘膜（ワクチン接種部位、ＶＳ）、
ｂ．リンパ節（リンパ組織等価物、ＬＴＥ）および
ｃ．リンパ管および血管の網目状構造等価物
の形成を可能にする３Ｄ足場および細胞分化のカスケードの操作と、
２．再現可能でかつ反復可能な試験のための細胞供給源と、
３．免疫学的組織を収容しかつ組み込むための微小流体バイオリアクター。
このような系がどのように機能するかは、図２に模式的に図示される。
哺乳動物におけるワクチンに対する免疫応答の生成には連続的な工程が存在する。第一にワクチンは、細胞を活性化するためにワクチン接種部位の皮膚、腸または粘膜部位で免疫細胞に対して作用する。第二に、ワクチンでの免疫後、樹状細胞（ＤＣ）は、この部位から、リンパハイウェイを介して流入領域リンパ節へと遊出する。第三に、流入領域リンパ節における樹状細胞（または他の二次リンパ節組織）は、Ｔ細胞およびＢ細胞と相互作用して、抗原特異的なリンパ球を活性化し、このリンパ球は、さらなる免疫応答を活性化し、多用なエフェクター機構を通じて病原体を排出し、そして抗原の長期記憶を有する記憶細胞に変換され得る。
この三工程の過程は、本発明のＡＩＳにおいて機能的にかつ構造的に模倣される。第一に、抗原／病原体は、インビトロのワクチン接種部位（ＶＳ、例えば、皮膚等価物または粘膜組織等価物）で免疫細胞に作用して、抗原提示細胞を活性化して、成熟過程を開始する。第二に、サイトカイン、ケモカインおよび化合物がワクチン接種部位で生成されるので、樹状細胞は、リンパ管を介してリンパ組織等価物（ＬＴＥ）へとこの部位を遊出して、それらの成熟過程を終える。第三にＬＴＥ中の樹状細胞は、Ｔ細胞およびＢ細胞と相互作用して、抗原特異的なリンパ球を活性化し、このリンパ球は、さらなる免疫応答を活性化し、多様なエフェクター機構を通じて病原体を排出し、そして抗原の長期記憶を有する記憶細胞に変換され得る。
このＡＩＳは、ワクチンまたは免疫療法作用における３つの基本的な工程に相当する３つの免疫学的組織構築物を含む。これらの３つの工程を機能的に再現するために、ＡＩＳは、以下の３つの組織操作された構築物を含む：
血中の単球および非単球性の樹状細胞前駆体の輸送を促進し、それらの人工的皮膚３Ｄ構築物内の成熟抗原呈示樹状細胞への自然な変換を支持する、インビトロのＶＳ足場と、
このワクチン接種部位（皮膚等価物）から樹状細胞遊走のためのリンパ組織等価物へのリンパ血管様経路と；同様に、ワクチン接種部位（皮膚等価物および／または粘膜等価物）への単球遊走のための血管壁様経路と、
リンパ節の幾何形状を模倣し、適切なリンパ節細胞タイプを含む構造を有する足場におけるリンパ組織等価物（ＬＴＥ）と。
これらの機能的に等価な組織構築物は、内因性の組織に匹敵する特性を示す。これらの機能的に等価な組織構築物は、モジュールのバイオリアクターに組み込まれる。ＡＩＳは、バイオリアクターシステム内で適切なレパートリーのＴ細胞およびＢ細胞を提供するエキソビボ免疫系において、高速のワクチンおよび免疫調節物質のスクリーニングを行うように設計される。
（ワクチン接種部位（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ＶＳ））
ワクチンの有効性は、ワクチン接種の部位での細胞との最初の相互作用の質をかなりの程度まで繁栄する（図３）。結果として、ワクチン接種の有用なモデルを作製するためには、インビトロにおいて人工的なワクチン接種部位を構築することが重要である。このようなワクチン接種部位は、皮膚、腸または粘膜と等価な組織として機能し、そして皮膚構築物（または粘膜組織、例えば、肺）を、血管およびリンパ節内皮および血液由来の造血細胞と一緒に包含する。この皮膚構築物は、インビトロの系への組み込みのために最適化された、複雑な供給源、例えば、死体のヒト皮膚、複雑さの低い供給源、例えば、市販の皮膚様生成物（ＥｐｉＤｅｒｍ，Ｅｐｉｓｋｉｎ）または単純な皮膚様構造（ＥＣＭの多くの異なる調製物、ならびに皮膚線維芽細胞およびケラチノサイトの供給源を用いる）を含む多くの供給源に由来し得る。
血球（単球を含む）は、血管内皮にそって位置してもよい（または流れてもよい）。このような細胞は天然には、遊走し、樹状細胞および他の細胞に変換し、そして皮膚に残留する。
樹状細胞が正確なサブタイプで、かつ静止期の皮膚のための成熟の状態で存在するならば、ワクチン接種部位は試験のためのワクチン候補物を受容するように準備される。ワクチン接種の際、ワクチンは、皮膚残留細胞と相互作用して、皮膚への単球および他の細胞のさらなる遊走、ならびにマクロファージおよび樹状細胞を含む、さらに多い抗原呈示細胞（ＡＰＣ）へのそれらの引き続く分化を誘導する。樹状細胞（ＤＣ）および他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ワクチン抗原を拾い上げ、そして、リンパ内皮を横切って遊走してリンパ節組織等価物中に排出するように誘導される。ＬＴＥ中に到達するＤＣは、Ｔ細胞およびＢ細胞と相互作用して、適応的免疫応答を開始し、そしてＤＣの成熟状態に依存して、それらは種々の程度までＴ細胞およびＢ細胞を活性化する。
まとめると、ＬＴＥ（以下に記載される）と一緒になって、ワクチン接種部位は、ワクチン、化合物、アジュバント、薬物または生物学的作用の重要なモデルを提供する。しかし、ＬＴＥがなくても、ワクチン接種部位は、ワクチン研究のための重要な自立したモデルであり、種々のワクチンまたは化学候補物の間の機構における相違の分析を可能にし、これによってワクチンの精密化および改善を補助する。これは、化粧品、芳香、抗酸化剤、可能性のある皮膚刺激薬および他の化合物を試験するための重要な自立したモデルである。
（インビトロのリンパ組織等価物（ＬＴＥ））
ワクチンの最終的なアウトプットはリンパ組織に生じ、ここで抗原特異的なＴ細胞およびＢ細胞は、活性化されて、部分的に記憶細胞に変換され、これは周知のとおりインビトロでは検出することが困難である。インビトロで天然の免疫応答を模倣するためには、従って、リンパ組織等価物（図４）を構築すること、そしてこれを、リンパ管を介してワクチン接種部位と接続することが必須である。インビボでは、ワクチン由来抗原は、リンパ管に沿ったリンパ節細胞への拡散によって、または抗原を内部移行している成熟ＤＣの流入領域リンパ節への遊走によって、リンパ節に輸送される。リンパ節では、ＤＣは抗原特異的Ｔ細胞を活性化し、そしてヘルパーＴ細胞と組み合わされて、抗原特異的Ｂ細胞を活性化することを補助して免疫応答を誘発する。
Ｔ細胞およびＢ細胞の応答の強度および質は、由来する抗原の量に、そしてワクチン由来の抗原を担持するＤＣ（ＡＰＣ）のサブタイプおよび成熟部位に依存する。重要な細胞（樹状細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞）の間の２方向および３方向性の相互作用は、リンパ節の空間的に隔離された領域において引き続く順序の事象で生じる。このプロセスをシュミレーションするために、人工的なリンパ組織またはリンパ組織等価物（図４）は、組織操作、材料化学および生物学的研究の組み合わせを用いて、インビトロでリンパ節様の幾何形状および空間的組織化で構築されてもよい。例えば、免疫細胞はケモカインの勾配に対して高度に反応性であり、従って、これらのシグナル伝達分子の組織化された勾配を含む足場のデザインによって、合成のリンパ節組織が、天然の組織と同様の様式で自己組織化することが可能になる。天然の組織の形成はまた、さらなる分子を覆わず、インビトロで組織化された組織中での形成を助けるために平行して研究されてもよい。このような複雑な合成構造はまた、デジタル印刷ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｔｏｏｌ（ＢＡＴ）を用いて製造されてもよい。
本発明の実施形態では、一旦ＬＴＥがアセンブルされれば、これを、種々の所望の生体分子（例えば、サイトカイン、タンパク質、抗体）を生合成する「バイオファクトリー（ｂｉｏｆａｃｔｏｒｙ）」として使用することも可能になる。例えば、抗原がＢ細胞に提示される場合、それらはＬＴＥにおける抗体を作製し得る。潜在的に、この作製された抗体はまた、Ｂ細胞のレパートリー、およびペプチドがこのＢ細胞にどのように提示されるかに依存して、モノクローナル抗体であってもよい。
（インビトロのリンパ管および血管のハイウェイ）
本発明は、ＶＳおよびＬＴＥへ、そしてＶＳおよびＬＴＥからの、そしてＶＳとＬＴＥとの間の細胞の遊走および遊出を促進する内皮の経路のためのデザイン（例えば、種々のマトリックス処方物、内皮細胞の供給源、および増殖条件を用いる）を提供する。インビトロの人工的免疫系集合体の模式図は、図５に示される。この人工的免疫系は、天然の免疫系とは機構的に異なるが機能に関しては同様である、一般的なバイオリアクターデザインを有し得る。好ましい実施形態では、３つの免疫学的ＥＴＣが、微小な操作された細胞環境のバイオリアクターに組み込まれる。このデザインは、２つの機能的に等価な膜を連続的な順序で使用し、機能的なＶＳおよび粒子上のまたは粒子周囲のＴ細胞およびＢ細胞の局所的な集積を行って、ＬＴＥとして機能する。重要なデザインの考慮は、生物学的機能を模倣すること、ゾーンの間の培地容積を最小化して細胞輸送の効率を増大させること、そして抗原性応答を評価する手段を提供することである。培地容積を組み込むことおよび最小化することによって、免疫学的ＥＴＣ内のおよびＥＴＣの間の細胞遊走についての可能性は劇的に増強され、そして増大された免疫学的応答が提供され得る。
しかし、組み込まれたバイオリアクターにＶＳおよびＬＴＥを有する必要はない。別の実施形態では、ＶＳ由来の成熟ＤＣは、ＬＴＥに物理的に位置されてもよい。これらの成熟ＤＣは、Ｔ細胞ゾーン内のＴ細胞、およびＬＴＥのＢ細胞ゾーン内のＢ細胞を活性化する。従って、ＶＳおよびＬＴＥの両方、ならびにＶＳ由来の成熟ＤＣとＬＴＥにおけるＴ細胞との間の相互作用を非組み込み方式で試験して特徴付けることが可能になる。
ＡＩＳ操作のための事象の一般的な基本的なカスケードは以下のとおりである：
単球および他の血液由来細胞（ＰＢＭＣ）が血管ハイウェイへ注入される；
ケモカイン（ＶＳに対して天然であるかまたは意図的に加えられるか）が、単球がＶＳに入ることを誘引する；
単球が未成熟のＤＣ（ｉＤＣ）に分化する；
ｉＤＣがＶＳにおけるワクチン接種に応答して成熟する；
ケモカインは成熟ＤＣをリンパのハイウェイへ誘引する；
ケモカイン（ＬＴＥに対して天然であるかまたは意図的に加えられるか）が、成熟ＤＣがＬＴＥに入ることを誘引する；そして
ＬＴＥ中の成熟ＤＣが、Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化する。
単球および樹状細胞は天然に相互作用して、血管内皮およびリンパ内皮を横切って遊走する。他の実施形態ではケモカインは、磁気マイクロビーズができるとおり、細胞の遊走を試行するように用いられ得る。小型化された電磁石と一緒になった磁気ビーズは、バイオリアクター中の細胞の操作のための便利な機構である。例えば、適切な表面マーカー（レセプター、エピトープ）を有する細胞は、ビーズを用いて選択されてもよいし、そして選択された細胞は、ある局所的な環境から別の環境へ輸送されてもよく、これによって細胞が、例えば、所望の表面、環境、または他の細胞と接触させられる（実施例を参照のこと）。
（普遍的な細胞供給源）
インビトロのＡＩＳデバイスは、Ｔ細胞、Ｂ細胞および抗原呈示細胞を最小限に有するべきであるが、好ましくは他の細胞成分、例えば、内皮を作製するための内皮細胞、ワクチン由来シグナルに応答するための好中球および肥満細胞、皮膚への特異的な病原体の最初の進入を媒介する線維芽細胞、または問題の感染における病原体である標的器官（例えば、肺）由来の細胞を含む。Ｔ細胞およびＢ細胞は主にＬＴＥに局在し、血管およびワクチン接種部位中の単球／ＤＣ前駆体、ならびに血液およびリンパの内皮細胞は、それぞれ血液およびリンパのハイウェイにある。
ある実施形態では、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）由来の免疫細胞は、この系で用いた内皮およびＶＳマトリックス細胞にＨＬＡ（ヒトリンパ球抗原）が適合している個体由来である。末梢血単核球は、骨髄における多能性造血幹細胞から生じる免疫細胞の異種集団（Ｔ細胞、Ｂ細胞および種々の顆粒球）に相当する（Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏ．Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９），Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）。別の実施形態では、幹細胞を用いて、この系に必要な全ての細胞タイプを得ることが可能になり得る。さらに別の実施形態では、前駆細胞の発達と平行して、ヒト化したマウス節由来の細胞を用いて、種々の組織構築物を最初に住み付かせることができる。
（バイオリアクター）
組み込まれたＡＩＳバイオリアクターでは、免疫学的細胞を「給餌する（ｆｅｅｄ）」ために、３Ｄハウジング中の内部チャネルを通じて栄養富化液をポンピングする。これらのチャネルの壁は、内皮細胞接着を可能にするように改変され、内皮を形成するか、または細胞挙動を変更しない生物学的に適合する物質から製造される。
ＡＩＳバイオリアクターを開発するのにおける障壁を克服するために、１実施形態では、超短パルスレーザーを備えるレーザーマイクロマシニングを用いて、液体がよく流れるようにチャネルを設計して製造してもよい。他の実施形態では、マイクロスタンピング、積層または標準的なＣＮＣおよび他の粉砕プロセスを用いてもよい。
構築物内の細胞は一定の流速に依拠し、単に栄養についてだけでなく、全てが十分であってケモカインを介してそれらの機能を継続すべきであるシグナルとして依存する。栄養の流体は、種々の細胞が最初はシリンジを介して、または記載された細胞ソーティングシステムを用いて注入される前に、この系をプライムする。
次いで完全な人工的免疫系を、栄養／酸素溶液について血流をシミュレーションするポンプに接続する。好ましい実施形態では、ポンプ機構を脈動させて、血管をさらによく模倣してもよい。次いで、温度、湿度ならびに酸素および二酸化炭素の濃度を調節して天然のインビボ環境を最もよくシミュレートするインキュベーターに、全体的なアセンブリを挿入してもよい。
好ましい実施形態では、このバイオリアクターシステムは、全体の大きさが２〜３インチの大きさであるように構築され得、これによってインビトロの免疫系バイオリアクター装置は、他の衛生的でかつ携行可能な分析装置に可能性として構築できる。小型化したサイズでかつ光学的に透明な実施形態によって、顕微鏡を用いてインサイチュにおける組織構築成分の可視化が可能になる。
ＡＩＳを用いて、ワクチンおよび他の物質に対する免疫応答を迅速に試験して評価することが可能である。この組織を組織化して、ワクチンを投与するのに適切に活性化させるためには、いくつかの概念がある。１実施形態では、組み込まれた操作された組織構築物は、走化性および放出を操作された微小粒子を組み込み、組織および細胞の集合およびプログラミングのための種々の生体分子の一時的、空間的および用量のパラメーターの制御を可能にする。別の実施形態では、細胞間、細胞−マトリックス、構造的および細胞自体を作製する内因性の増殖因子の合図を通じて得られた連絡を介する天然状の組織へと、間質および実質が自己アセンブルすることを可能にする環境が構築物によって得られる；内因性の増殖因子は、所定の表現型を誘導する必要はなくてもよい。
（実施例１：徐放性の微小粒子を用いるｉＤＣおよび単球の両方の走化性のインビトロおよびインビボでの制御）
ＰＬＧＡ（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド））マイクロスフェアは、カプセル化されたケモカインの定常的な制御された放出を提供する。図６Ａは、蛍光色素標識したｆＭＬＰケモカイン（単球および未成熟のＤＣの化学誘引物質）をカプセル化するマイクロスフェアの顕微鏡写真の例を示す。図６Ｂは、低分子量のペプチドケモカインおよび１０ｋＤａの化学誘引物質であるＭＩＰ−３β（マクロファージ炎症性タンパク質−３β）の両方についての放出の反応速度論を示す。図７Ａ〜７Ｄに示されるように、ヒト単球および樹状細胞は、インビトロの設定において、化学誘引物質ｆＭＬＰ（Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン）を放出するマイクロスフェアに向かって動く。図８は、移植された細胞外マトリックス足場においてケモカインＭＩＰ−３βに対して誘引された単球についてのインビボのマウス免疫組織学的染色を示す。合成の逆オパール（ｉｎｖｅｒｓｅ ｏｐａｌ）ヒドロゲル足場を合成し、この足場は、Ｔ細胞遊走およびＢ細胞との相互作用を支持し（図８Ａ）、そして高い細胞密度の接着および増殖を支持し、このことはリンパ節の微小環境を模倣するのにおける重要な特徴である（図８Ｂ）。
（実施例２：デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）足場構造）
デザイナー足場構造は、細胞の生存度、細胞の移動度およびバイオリアクターのための栄養流を試験するように構築されて、コラーゲンゲルのための構築物安定性の関数として細胞の運動性を研究している。図６４は、ナイロンメッシュ上のプロタサン／コラーゲンマトリックス上で増殖するＨＵＶＥＣ細胞を示す。ナイロン膜の高倍率のＳＥＭおよび分散されたプロタサン／コラーゲンマトリックス物質は上の画像に示される。ＨＵＶＥＣ細胞の初代の層の播種は、反転した膜上で達成され（左、１側）、次いで２４時間後に、右の上側の位置にされて（右側、２側）、ここに第二の層が加えられた。ＨＵＶＥＣ細胞の各々の平面の位相差画像は、真ん中の２つの下の画像に示され、ここでは左が第一の層であって、右が加えられた第二の層である。
（実施例３：デジタル印刷技術）
予備的なハードウェアおよびソフトウェアのＥＴＣ異種デジタル印刷の原型が開発されている。図９は、デジタル印刷されたリンパ節のモデルおよび血管の細網像を示す。このモデルのリンパ節は、６つの生体適合性ヒドロゲル層、４つの種々のパターンおよび３つの物質を含む。脈管画像は、１００〜３，０００μｍにおよぶ特徴的なサイズを有する生分解性構築物質の複数の層で構築されている。この物体は各々３つの分注ノズルで製造された。
（実施例４：３Ｄ組織構築物）
３Ｄの生物学は、免疫学的ＥＴＣの適切な機能を誘導するのに重要である。細胞プロセスを研究するための重要なアプローチは、インビトロで細胞を培養することである。これは代表的には、プラスチックまたはガラスの支持体上に細胞をプレートする工程を包含する。この適用では、固体またはフィルター支持体上で増殖された細胞は、２次元（２Ｄ）培養物と呼ばれる。多孔性支持体上のこのような２Ｄ培養物は、生物学の多くの局面を研究するために有用である。しかし、現在、かなり多くのインビトロ様の条件が３Ｄ培養物中で実現され得る。
ほとんどのワクチンは、身体の皮膚または粘膜表面を介して送達される。送達部位内では、ワクチンの作用の重要な工程は、前駆体細胞の樹状細胞（ＤＣ）への分化、ＤＣによる抗原の獲得、そして抗原を最適に処理してＴ細胞、Ｂ細胞および他の免疫細胞を活性化するためのＤＣの成熟である。ＤＣ成熟の期間中に、ＤＣはまた、固定されてリンパ節のＴ細胞ゾーン内の位置に輸送されなければならず、ここでＤＣは最適に遭遇して、該当の処理された抗原に対して応答するために最も適切なＴ細胞レセプターを有するＴ細胞を選択し得る。ある場合には、抗原は、流入領域リンパ節に直接拡散し、次いでリンパ節ＤＣによって捕獲される。
今日まで、ヒトにおいてワクチンの作用のこれらの早期の段階のモデルはなかった；さらに、ヒトではこれらの段階を研究することはできない。なぜなら、この段階は、アクセスできない末梢組織で生じ、そしてよりアクセス可能な血液では生じないからである。従って、本発明は、現在利用可能であるよりも、細胞および構造のさらに現実的な状況でこれらの初期段階の研究を可能にするモデル系を提供する。
本発明は、抗原ローディングおよび免疫細胞、特に樹状細胞の活性化におけるワクチンの有効性を試験するための、インビトロにおけるモデルのワクチン接種部位を提供する。このワクチン接種部位は、血管内皮およびリンパ内皮に結合される皮膚と等価な（または粘膜組織と等価な）組織に包埋された、単球および樹状細胞を含む、免疫細胞を含む。このインビトロ組織構築物によって、ワクチン候補物の迅速な試験、およびワクチン接種の早期段階でのそれらの効果の評価が可能になる。次いでワクチン接種部位に、リンパ組織等価物を組み込み、ヒトの免疫系のさらに完全なモデルにおいてワクチンの有効性を試験するための人工的な免疫系を形成する。
ＶＳは、インビトロの免疫系への皮膚等価物またはワクチン接種部位等価物として想定され得る。別の実施形態では、粘膜組織等価物も容易に想定され得る。インビトロにおける皮膚組織モデルの最近の進歩のおかげで、皮膚等価物が好ましい。実際には、ヒト皮膚移植片を用いた文献では多数の研究が存在し、さらに他の研究者らが、免疫修飾研究の間に生検を承認したボランティアの被験体においてＤＣ挙動を証明している（Ｃｕｍｂｅｒｂａｔｃｈら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４１：１９２〜２００，（１９９９））。インビトロにおける培養物中の皮膚のＤＣの組み込みに対しては２〜３の報告しかない（Ｒｅｇｎｉｅｒら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０９：５１０〜５１２（１９９７）；Ｆｒａｎｓｓｏｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３９：５９８〜６０４（１９９８））。最後にかつ最も重要なことに、皮膚はワクチン接種の最も一般的な部位である。結果として、末梢におけるＤＣ活性化の早期段階を研究するために皮膚モデルを使用することは論理的である。
本発明は、ワクチン候補物および他の薬物、生物製剤および化合物を試験するための、そしてこの組織をリンパ組織等価物とともにインビトロで組み込んで、Ｔ細胞およびＢ細胞の免疫応答を測定するための、再生可能な皮膚等価物モデルを提供する。インビボの分化、成熟および遊走性の機能を再利用する方式で単球および他のＤＣ前駆体の経内皮輸送を支持し得る血管およびリンパの内皮細胞を含む、３Ｄ構造を構築するための段階的なアプローチを提供する。
異種の細胞間相互作用を可能にする３Ｄ組織構築物は、単球を含むＤＣ前駆体の分化に対して、２Ｄ培養物で観察されるよりもインタクトなヒトの系をより厳密に模倣する様式で、影響することが公知である（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ ＆ Ｋｅｅｆｅｒ，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９２：１〜６（２００５）を参照のこと）。詳細には、再構成されたＩ型コラーゲンマトリックス（Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｂｌｏｏｄ ９２：４１６７〜４１７７（１９９８ａ）；Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：４８０〜４８３（１９９８ｂ）；Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６９２４〜６９２９（１９９８ｃ）；Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：５１７〜５２７（２００２））（図１０）、または天然の羊膜結合組織（Ｒａｎｄｏｌｐｈ ＆ Ｆｕｒｉｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：４５１〜４６２（１９９６））のいずれかで増殖された血管内皮単層とのＰＢＭＣ全体の同時培養は、化学誘引物質である単球化学誘引物質タンパク質（ＭＣＰ）−１（ＣＣＬ２）の内因性の生成に対して大きく応答して、内皮を横切る特に単球の通過を促進する（Ｒａｎｄｏｌｐｈ ＆ Ｆｕｒｉｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３６１０〜３６１８（１９９５））。これは、正常な定常状態では、多くの単球が血液を日ごとに出ていくという知見と一致している。内皮が活性化されるとき、他の炎症性細胞タイプ、例えば、好中球は、内皮を通過し得、ここではやはりインビボで作動することが理解される同じ調節性の事象をともなう（Ｆｕｒｉｅ＆ＭｃＨｕｇｈ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３３０９〜３３１７（１９８９））。単球の運命が、内皮細胞／コラーゲン培養物中で経時的である場合、単球の実質的な画分は、ＤＣ中で上方制御されることが公知である、ある範囲の分子（ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６を含む）の産生を増大すること、そしてこれらの細胞はまた、遊走性の特性を獲得し、その結果それらは、管腔から離れた方向から管腔方向へ内皮を横切って、血管内皮から離れ、そして内皮下のマトリックスに残留しているマクロファージから離れて、培養物の外側に遊走することが明らかになる。
図１０Ａに示されるとおり、フィブロネクチンでコーティングされたコラーゲンの３Ｄ構築物上で増殖された血管内皮細胞は、漸増する深さまでの内皮下マトリックスへの単球の通過後にインタクトで残る細胞内接合部を形成する（矢印、種々の干渉コントラスト顕微鏡によって可視化される単球）。培養物の表面図および断面を示しており、ここでは遊出された白血球が、特徴的に平坦な内皮単層の下でマトリックスを通じて分布される。デザインの特徴１および２で記載されたとおり、このようなマトリックスの現在裸(ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ ｂａｒｅ)の下部の表面上の、それぞれ、リンパの内皮単層または表皮の単層。図１０Ｂは、このような３Ｄ培養物における単球の挙動の段階を示す模式図である。左の画像は、マトリックスが微生物抗原の供給源を含まない場合の観察の順序を示しているが、右側の画像は、酵母粒子（ザイモサン）がマトリックス中のモデルの微生物抗原として組み込まれた場合に行われる観察の順序を示す。第Ｉステージでは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のインキュベーションを内皮とともに１．５時間インキュベートして、ほとんどの単球（３）、いくつかのＢＤＣＡ１＋血中樹状細胞（データ示さず）、ナチュラルキラー細胞（Ｂｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：１５１５〜１５２４（１９９６））の皮下コラーゲンへの遊出を生じるが、リンパ球の遊出は少ない。遊走しないわずかなリンパ球のうち、記憶の表現型の可能性は高く（Ｇｅｒｇｅｌ＆Ｆｕｉｒｅ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：２１９０〜２１９７（２００１））、ナイーブなＴ細胞のリンパ節に直接のそして記憶Ｔ細胞への輸送が組織に入り得るという本発明者らの理解と一致する。第ＩＩ段階では、細胞培養物を洗浄し、皮下のマトリックスに蓄積した単球はインタクトな内皮単層とともに残り、ここで単球は食作用性の粒子を、このような粒子がコラーゲンマトリックスに含まれている場合、飲み込む。第ＩＩＩ段階では、いくつかの食作用性の単球由来細胞は、同じ内皮を再通過して、先端の区画に蓄積する。これらの逆に移動した単球は、事前にまたは同時にＤＣに分化する。写真（上の右側、Ｂ）は、それらの特徴的な形態を示す。活性化刺激が、培養物（左）に含まれない場合、逆に移動された細胞は、未成熟のＤＣであり、そして細胞内サイトカイン染色によって観察されるとおりＩＬ−１０を生成するようにＴ細胞を促進する。これらの細胞の多くは、ＤＣと同様に非接着性であるが、２〜３の拡散性の細胞は分化程度の低い単球と同様である（左側の写真の差込，Ｂ）。活性化刺激が培養物に含まれる場合、逆に移動された細胞は、成熟ＤＣになり、そして主にＩＦＮγ産生Ｔ細胞の発達を促進する。Ｃ）単球は、以前にインフルエンザに感染された成体由来のＴ細胞における想起応答の間のＩＦＮγ誘導および増殖の活性化を測定するためにインフルエンザで感染されてもよい（Ｑｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１０１０〜１０１８，（２００３））。プロセシングされたウイルスの呈示に対する応答における増殖で開始するＴ細胞クローンの数（各々がＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける「スポット（ｓｐｏｔ）」に相当する）は、単球が裸のプラスチック上で培養された場合の応答と比較して３−Ｄ内皮培養物（黒いバー）中で分化することが可能である場合、３倍より大きく増大される。内皮／コラーゲン培養物における成熟刺激の非存在下でさえ、いくつかの単球は、マクロファージにとってさらに特徴的な、細胞表面上で大きく減少した量のＭＨＣ ＩＩを発現する、プラスチック上で培養された同じ単球に比較して、未成熟のＤＣの指標として、ＭＨＣＩＩを特定の区画で蓄積する（Ｍｅｌｌｍａｎら、Ｃｅｌｌ １０６：２５５〜２５８、（２００１））（写真、Ｃ）。
ＤＣは、管腔から離れたところから管腔の方向にリンパ内皮を移動することによって、実質的にリンパ管を通じて移動することが公知であるので、これらのデータによって、インビトロモデルがリンパ管を介したＤＣ輸送の局面を模倣することが実証される。このモデルにおいてＤＣ遊走を媒介する分子を特定し、次いでインタクトな確証的なヒト皮膚移植片において同じ媒介因子がＤＣ遊走を制御するか否かを評価する実験によってこれが支持される（Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：４８０〜４８３（１９９８ｂ）；Ｒｏｂｂｉａｎｉら、Ｃｅｌｌ １０３：７５７〜７６８（２０００））。このモデル系によってまた、例えば、ＤＣへの分化における単球の異質性の役割の評価が可能になる；ＣＤ１６＋単球サブセットは、他の単球よりも優先的にＤＣに発達する（Ｒａｎｄｏｌｐｈｒａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：５１７〜５２７（２００２））。マウスでの近年のインビボ研究では、ＣＤ１６＋単球に見かけ上等価である単球の集団を特定しており、そして研究によってこのサブセットは容易にＤＣになることが示される（Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９６：５１７〜５２７（２００２））。このように、本発明の３Ｄモデルは、正常な免疫生理学を模倣する。
微生物が巻き込まれて破壊され得る前に、末梢中の白血球がそれらの微生物に到達できなければならない。このプロセスは複雑なものであり、変異的なデータによって、これが極めて重要であることが示される：いくつかの免疫不全は、いままでのところ皮膚等価物では取り組まれていないリンパ球接着の失敗、血管外漏出および走化性から生じる。
３Ｄ構築物の複雑性を段階的な様式で増大すること、および途中での検証のためにアッセイを行うことによって、ＤＣ前駆体およびそれらの応答を調節する他の炎症性細胞の補充を調節する事象の忠実な再現が得られる。ワクチン処方物または特徴付けられた抗原／病原体に応答するこれらのＤＣの分化、ならびにそれらのリンパ管への輸送。１実施形態では、これは、本明細書に記載された印刷された足場および新規なマトリックス／方法論、ならびに皮膚由来の血液および詳細にはリンパ内皮の単離および増殖におけるさらなる経験を用いて達成され得る（Ｐｏｄｇｒａｂｉｎｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１６０６９〜１６０７４（２００２））。さらに、ヒトの皮膚移植片での本発明者らの研究によって、インビトロモデルとインタクトな皮膚におけるＤＣの挙動との間の結果の比較について、アッセイおよび信頼できる基礎が提供される（Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：６９２４〜６９２９（１９９８ｃ））。
１実施形態では、血管およびリンパの内皮細胞を含む３Ｄモデルを構築した。この血管およびリンパの内皮細胞は、単球および他のＤＣ前駆体の経内皮輸送を、インビボの分化および遊走機能を再現する方式で支持する。血管およびリンパの内皮を示差的に分離することが現在可能であり（Ｐｏｄｇｒａｂｉｎｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６０６９〜１６０７４（２００２））、これらの細胞を調製するための知識および資源を考慮すれば、機能的なモデルが図１１に図示されるとおり設計される。いくつかのマトリックスが用いられてもよく、これには、異種移植片のＥＣＭシート、天然に重合されたヒト羊膜結合組織（Ｒａｎｄｏｌｐｈ ＆ Ｆｕｉｒｅ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：４５１〜４６２（１９９６））、再構成されたコラーゲンマトリックス、プロタサン／コラーゲン膜足場、または好ましくは、線維芽細胞および／または肥満細胞を含むマトリックスが挙げられる。線維芽細胞を含む皮膚組織のいくつかの市販の調製物が利用可能であり、そしてこれらは、前に記載したように、例えば、マトリックス成分とともに線維芽細胞を播種することおよび線維芽細胞を改良してこれらの成分を縮小させることによってインビトロで容易に調製される。
マトリックス内に細胞を組み込むプロセスは、線維芽細胞または肥満細胞のような種々の細胞の組み込みについて適合され得ることが理解される。好ましい実施形態では、血管および内皮の単層が構築され、これは免疫の間に免疫細胞の補充および輸送を協調させることにおいてこれらの血管の正常な生理を模倣する。別の実施形態では、内皮細胞は、ヒトの包皮（Ｐｏｄｇｒａｂｉｎｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６０６９〜１６０７４（２００２））に由来してもまたは成体の皮膚に由来してもよい。
３Ｄのインビトロモデルを用いて、免疫学的プライミングの開始における重要なプロセスであるＤＣ遊走が試験されている（Ｐｏｄｇｒａｂｉｎｓｋａら、前出（２００２））。インビトロの構築物、エキソビボのモデルおよびインビボの研究の間の強固な変換が行なわれてもよい。中和ｍＡｂの大きいパネルの最初のスクリーニングにおいて、ＡＢＣＢ１を認識したｍＡＢは、インビトロの内皮細胞／コラーゲン構築物における単球由来細胞の逆移動をブロックしただけでなく、同じｍＡｂがまたヒト表皮からのランゲルハンス細胞の遊走を効率的に妨げたことが見出された。このファミリーの脂質輸送体のさらなる分析によって、ヒトの皮膚ＤＣにおける、別のメンバーのＡＢＣＣ１（ＡＴＰ結合カセットタンパク質Ｃ１、ＭＲＰ−１）の強力な発現が明らかになり、そしてＡＢＣＣ１の特異的なアンタゴニストはまた、移植片からの皮膚ランゲルハンス細胞誘導をブロックする。マウスでは、ＡＢＣＣ１は、ＡＢＣＢ１よりもかなり強力に発現される。機能的な研究によって、ＡＢＣＣ１はＤＣ遊走にインビボで関与することが示された。従って、ヒト単球が内皮単層を通じたその通過と組み合わせてＤＣになるインビトロモデルでは、遊走の関連媒介因子についてのスクリーニングツールとしての有用性が証明された。同様の実験では、インビトロでの、続いてインビボでの逆の移動におけるケモカインレセプターＣＣＲ８の重要な役割が明らかになっている（Ｑｕら、ＪＥＭ ２００：１２３１〜１２４１（２００４））。
従って、本発明のインビトロモデルではＤＣの分化および遊走は、ヒト−マウス種の障壁をまたいだ後でさえ、インビボの結果を正確に反映する。
以前の方法論を超える本発明で示された進歩としては、このデザインの特徴の結果として、リンパ輸送のさらに自然な再現が挙げられる。単球由来のＤＣは、血管内皮を最初に移動した後にリンパ内皮を横切って遊走するように再指向されるように設計される。２Ｄ培養物における内皮の研究に基づいて、これらの特徴は正確に維持される（Ｐｏｄｇｒａｂｉｎｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１６０６９〜１６０７４（２００２））。
（実施例５：白血球でのＶＳのローディング）
ＶＳデザインの信憑性のさらなる証明は、例えば、免疫刺激アッセイを用いて行なわれ得る。種々の送達デポによって送達される刺激を含む、種々の組成物の抗原が用いられてもよい。この系がインビボとして機能する場合、顆粒球を含む、より多様な白血球が、血管内皮を横切って、細菌のような病原体刺激の導入後に、このような刺激で活性化されない培養物と比較して、マトリックスに入る。ウイルスは種々の組成物の細胞浸潤を促進し得る。初代のＤＣおよび記憶Ｔ細胞は、第一の血管内皮を横切り、結合組織マトリックスに浸透してここで沈着された抗原を捕獲し得、次いでリンパ内皮を横切って移動して、完全な構築物を横切ると予想される。
１実施形態では、細胞は成体の白血球、ならびに成体ヒト皮膚由来の血管および内皮の細胞であってもよい。このような実施形態では、内皮細胞と白血球との間に組織適合性はない。別の実施形態では、組織適合性は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来の全ての細胞を用いることによって達成され得る。種々のドナー由来の細胞を用いるモデルで作成したデータは、完全に組織適合性のシステムのデータと同様であることが現在確認可能である。
別の実施形態では、白血球および内皮細胞の完全組織適合性は、特定の雄性ドナー包皮由来の内皮細胞での研究、および単球およびＴ細胞を含む、白血球についてのドナーと同じ個体由来の臍帯血を用いることによって達成され得る。包皮組織および臍帯血は、同じドナーから得られてもよい（Ｐｏｄｇｒａｂｉｎｓｋａら、前出（２００２））。さらに、臍帯血は、成体の単球で観察された輸送パターンおよびＤＣの生成を一般に再現する単球およびＴ細胞の有用な供給源であり（Ｑｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１０１０〜１０１８（２００３））、そして臍帯血の単球の使用は自系のＴ細胞集団のプライミングをもたらし得る。別の実施形態では、ＨＬＡの適合した包皮および臍帯血を用いて、組織適合性を達成し得る。
（実施例６：Ｐｒｏｔａｓａｎを用いるＶＳ足場の製造）
本発明の別の実施形態では、多孔性のキトサン／コラーゲン足場を、ワクチン接種部位組織操作構築物で用いる。ＶＳのための膜の足場は、血管およびリンパ管内皮細胞のコンフルエントな培養物と適合する好ましくは天然のバイオポリマー（生体高分子）を含む多孔性の膜を含み、単球の移動を未成熟の樹状細胞へのそれらの変換の間に提供するように十分に浸透可能なままである。
この実施形態ではＶＳ足場は、凍結、アルカリゲル化および減圧乾燥によって調製した。要するに、プロタサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ）（８ｍｇ／ｍｌ）を、７０μｍの細孔サイズを有するナイロンメッシュストレーナーに沈着させ、次いでゆっくりと−３０℃で凍結させて、−３０℃で一晩、冷エタノール／ＮａＯＨ溶液（１部が飽和ＮａＯＨ＋５０部が９５％エタノール）中に入れた。次いでこのストレーナーを純粋な冷エタノール（−３０℃）に移して、時おり撹拌しながら半時間洗浄し、最終的に減圧乾燥した。足場の写真は図１２に示す。
（実施例７：ラット尾Ｉ型コラーゲンを用いるＶＳ足場の製造）
この実施形態では、ＶＳ足場は、浸出（ｌｅａｃｈｉｎｇ）、アルカリゲル化および減圧乾燥によって調製した。プロタサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ）（０．５ｍｇ／ｍｌ）に加えてラット尾Ｉ型コラーゲン（３．６ｍｇ／ｍｌ）を、１．５ｍｌの微量遠心管バイアル（２００μｌのコラーゲン（３．８ｍｇ／ｍｌ）に加えて約５μｌの２％Ｐｒｏｔａｓａｎ）に入れた。乾燥ポリスチレンビーズ（（７μｍのサイズ）を、重量で１：１に添加して、ペーストを得て、これを５０００ｇで２〜３分間遠心分離した。このペレットを慎重に１００μｍの細孔サイズのナイロンメッシュ上に沈着させて６０℃で風乾させた。次いでこのメッシュをゆっくり撹拌しながら、室温で２時間、エタノール／ＮａＯＨ溶液に入れた。次いでこれをゆっくり撹拌しながら半時間、純粋なエタノール中で洗浄した。最後に、このメッシュを、ゆっくり撹拌しながら１時間テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に移した；次いでこれを純粋なエタノール中で洗浄して減圧乾燥した。足場の写真は図１３に示す。
（実施例８：ウシＩ型コラーゲンを用いるＶＳ足場の製造）
この実施形態では、ＶＳ足場は、連続のコラーゲン膜（ナイロンメッシュ上に沈着され凝固されるウシＩ型コラーゲンマトリックス）を含む。詳細には、酸性のウシコラーゲン（３ｍｇ／ｍｌ）を、氷上で水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて中和し、１００μｍの細孔サイズのナイロンメッシュ上に沈着させ、ステンレス鋼のＯリング中に積層して、これによってバイオリアクターに適合可能にさせた。この足場を３７℃、９５％ＲＨで凝固させて、細胞培養培地に入れた。足場の写真は図１４に示す。
（実施例９：Ｐｒｏｔａｓａｎ／コラーゲン多孔性マトリックス上でのヒト内皮細胞の両側の培養）
この実施形態では、コンフルエントな内皮細胞をＶＳ膜マトリックス上で増殖した。新鮮に増殖したヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、多孔性Ｐｒｏｔａｓａｎ／コラーゲン膜を含むナイロンメッシュストレーナーの底側に沈着させた。この工程のために、ストレーナーを培養ウェル中で逆さまにおいた。細胞懸濁液は約５×１０５細胞／ｍｌを含んだ。細胞を固着させ適合させた後、ＨＵＶＥＣの別の沈着をこの膜の反対の表面上で行い、このときストレーナーをその正常な位置に戻した。両側培養物をＤＭＥＭ培地中で１２日間維持した。足場の写真は図１５に示す。
（実施例１０：両側のＨＵＶＥＣ培養物の浸透性）
両側のＨＵＶＥＣ培養物の末梢血単球に対する浸透性を試験した。Ｐｒｏｔａｓａｎ／コラーゲン多孔性マトリックス上で増殖した両側のＨＵＶＥＣ培養物の標本を、ヒトＰＢＭＣとともに、底面に位置する単球特異的なケモカインＭＣＰ−１の有無のもとで播種した。図１６は、膜上の適用の３０分後にＭＣＰ−１なし（左パネル）ＭＣＰ−１あり（右側のパネル）でのチャンバの底の単球を示す。
（実施例１１：ウシコラーゲン膜上で増殖したＨＵＶＥＣ培養物）
ナイロンメッシュによって支持されるウシコラーゲン膜上で増殖されたコンフルエントなＨＵＶＥＣ培養物。細胞は、首尾よい（「適切な（ｈａｐｐｙ）」）内皮培養物の特徴である、十分規定された多数の角の形状、および明確に視認できる細胞内接触部を示した。適切な播種条件下で、コンフルエンシーは２４時間で達成された（図１７）。
（実施例１２：ヒト単球はＨＵＶＥＣ培養物に浸透する）
ヒト単球は、コラーゲンメッシュで支持されたマトリックス上のＨＵＶＥＣ培養物に浸透した（図１８）。ＨＵＶＥＣ単層（５×１０６／ｍｌ）上のヒトＰＢＭＣの沈着の１．５時間後、多数の単球がコラーゲンのクッションに入り、管腔から管腔を離れた方向に単層を移動する。この図は、表面のＨＵＶＥＣ細胞の２０μｍ下の細胞とともにリングメッシュに結合されたコラーゲン中のトルイジンブルー染色された細胞を示す。
（実施例１３：皮膚上皮を用いるＶＳの構築）
本発明のＡＩＳでは、皮膚上皮は、３Ｄ組織構築物に組み込まれ、その結果ＤＣ前駆体は、表皮に定着し得、そして正常な免疫生理学が保たれる。この実施形態では、皮膚が免疫の最も一般的な部位であるという事実に基づいて皮膚の重要な要素を含むようにワクチン接種部位の複雑性が増大される。実際、見込みがあると思われる最新のワクチン候補物のいくつかは実際には、表皮に適用された皮膚パッチである。
皮膚の良好な供給源は、同意している器官ドナー由来の新鮮に単離された死体皮膚である。この分層皮膚は皮膚リンパ管を通じたＤＣの遊走を支持するのに十分に機能的であり（Ｌｕｋａｓら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０６：１２９３〜１２９９（１９９６））、そして表皮からＤＣ遊走の新規な媒介因子を確認して特定するために以前に用いられている（Ｒａｎｄｏｌｐｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：６９２４〜６９２９（１９９８ｃ）；Ｒｏｂｂｉａｎｉら、Ｃｅｌｌ，１０３：７５７〜７６８（２０００））。従って、本発明の皮膚のモデルと比較するために真正の皮膚を用いてもよい；ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、ＤＣおよび真皮のマトリックスの供給源のための移植片も用いられ得る（図１１）。
（実施例１４：ＶＳの構築）
「皮膚等価物（ｓｋｉｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）」中のランゲルハンス細胞の組み込みは取り組まれている（Ｒｅｇｎｉｅｒら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０９：５１０〜５１２（１９９７）；Ｆｒａｎｓｓｏｎら、Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３９：５９８〜６０４（１９９８））。これらは、有望な説明であり、モデルの１つとして、ケラチノサイトが外因性のサイトカインの通常は追加なしのＣＤ３４＋前駆体からのランゲルハンス細胞分化を支持し得ることが示された（Ｆｒａｎｓｓｏｎら、前出（１９９８））。
本発明の別の実施形態では、種々の正常な皮膚層の層別化を可能にするように、表皮細胞は空気界面で増殖される。このマトリックスの他の側で血管内皮細胞が培養される。後の時点で、単球または他のＤＣ前駆体が内皮を横切って補充されるかだけでなく、これらの細胞が、真皮を横切るかのようにマトリックスを横切って遊走し、次いで表皮層に動いて、組み込まれたランゲルハンス細胞とともにそれを占有するか否かを評価するために、ＣＤ３４＋細胞で富化された成体のＰＢＭＣまたは臍帯血ＰＢＭＣが加えられる。統合が観察されれば、この組み込まれた細胞は、それらがＢｉｒｂｅｃｋ顆粒のような、ランゲルハンス細胞に特異的な特徴を獲得したか否かを決定するために回収されてもよい。ケラチノサイトはまた、強力な抗張力でマトリックスの底面に播種され得る。このような強度を有するマトリックスはＴｅｆｌｏｎリングのような種々の鋳型を横切って容易に伸展される（Ｒａｎｄｏｌｐｈ ＆ Ｆｕｒｉｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３６１０〜３６１８（１９９５））。これらのＴｅｆｌｏｎリングは、伸展したマトリックスが培養ウェルに対して「床（ｆｌｏｏｒ）」を提供するようにさらに設計されている。
合成および天然の膜の両方についての挿入物支持体を作製することは、積層、圧着されたリングおよび接着剤を用いて達成されている。積層および接着剤は主にポリマーメッシュを支持するために用いられており、これが次に合成的に処方された生物学的膜に対して機械的強度を与える。積層プロセスを用いる製造は、次に一緒になって、例えば、熱的にシールされる、２ピースのポリマー積層の間の伸展されたメッシュをサンドイッチする工程を包含する。この接着方法は、メッシュ支持体を伸展させる工程と、生体適合性の接着剤を用いてリング（例えば、ステンレス鋼を含む）を接着させる工程とから構成される。圧着（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）方法は図５３に示され；ここでは、膜は、適切な物質、例えばステンレス鋼の２つのリングの間で圧縮される。一般には、積層および接着の方法は、合成メッシュで支持された膜に好ましいが、圧着（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）法は、天然の生物学的な膜および合成のメッシュの両方に適合し得る。図１９は、薄いステンレス鋼リングの間に圧着された膜の写真を示す。圧着法を用いて、生物学的な膜を接着剤の使用なしに支持して、約４００μｍ未満の厚みプロフィールを有するディスクに圧縮してもよい。次いで表皮をマトリックスの上側または横側で増殖させ、これは、組織培養ディッシュの内側に配置された不活性の多孔性「スタンド（ｓｔａｎｄ）」上にこの構造を設定することによって空気界面に残され得る。次いで内皮をマトリックスの外側上で増殖させて、培養リングの内面上に単層を形成し、ここに培養培地を添加してもよい（図１１、右側パネル）。
図６５は、バイオリアクター中のＶＳについての膜の結合の可視的な方法を示すリング構造の写真である。左のパネルは、羊膜または天然に存在するＥＣＭ膜であるＵＢＭのような「ウエットな（ｗｅｔ）」膜構造を保持するために用いられたスパイクされたリングの設計を示す。右側のパネルは、リング構造に対して「ドライな（ｄｒｙ）」合成膜を付着するために用いられる３つの方法を示す。上の左側（１０セント硬貨の左側に隣接）は圧着され、下の左側は同じ材料の２つのリングの間の膜を積層することにより、そして下の右側（１０セント硬貨の下）は接着される。種々の生物学的に細胞親和性のシアノアクリレート、エポキシおよびシリコンがこのリングに対してメッシュを接着するのに首尾よく用いられている。図６６は、播種の前に適所に加えられて重合化されるＤｅｖｏｎ２部エポキシのビーズとともに培養プレート上のＨＵＶＥＣ細胞を示す。７２時間後細胞に対して影響する傷害は観察されておらず、そして細胞は４８時間後にコンフルエンスに達した。
内皮細胞は、無細胞の天然に重合化されたヒト結合組織であるヒト羊膜結合組織上で、非炎症性の設定で（Ｆｕｒｉｅ ＆ ＭｃＨｕｇｈ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３３０９〜３３１７（１９８９））増殖し得るので、羊膜マトリックスを、ヒト胎盤から調製した。血管内皮は、炎症性シグナルを受けることなく、羊膜マトリックスの両側で増殖された（図４７）。なぜならこのマトリックス上では、好中球は、内皮を横切って補充されることなく追加され得る（非炎症性であるとみなされる範囲内で、これらの培養物においてほぼ約１％のみの好中球が追加され遊走されたからである（Ｆｕｒｉｅ＆ＭｃＨｕｇｈ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：３３０９〜３３１７（１９８９））。これらの実験における「炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」のための陽性コントロールは、いくつかの内皮／羊膜構築物を炎症促進性サイトカインＩＬ−１で刺激することであった（ＩＬ−１を用いた同じ実験において平均で７６％の好中球が遊走し、その非存在下ではわずか１％しか遊走しなかった（図４７）。これらの結果によって以下が実証される：（ａ）２層の内皮の増殖を支持した培養系の構築、そして（ｂ）生得的には炎症でないが、適切な刺激（例えば、ＩＬ−１）に応答して炎症性になり得る培養系の構築。
ワクチン接種部位にそしてその外側への補充を制御するために内皮層を有することに加えて、他の細胞タイプを培養物に添加してもよい（例えば、線維芽細胞；それらは、全ての組織の正常な成分である）。単離されたおよび培養された初代ヒト線維芽細胞を、ヒト胎盤から得た。これらの細胞を、第一の内皮層の追加後に、ただし第二の内皮層の追加前にマトリックスに播種した。線維芽細胞はそれ自体が構築物中に組み込まれ、そして内皮の２つの層によってサンドイッチされたマトリックス中に居留した（図４７）。
単球はＤＣ前駆体の１タイプであり；それらはまた、マクロファージに発達し得る。単球を、二重の内皮／羊膜構築物上に播種した。全体的な構築物を横切る単球の遊走が観察されたが、多くの単球はもとの内皮層の比較的近位に滞留した（図４７）。これによって、マトリックスの全ての部分が「細胞親和性（ｃｅｌｌ ｆｒｉｅｎｄｌｙ）」であり、遊走についてアクセス可能であることが実証される。好中球に比較して、単球は、炎症の非存在下で内皮を横切って遊走し得る。なぜなら内皮は構成的に、それらの遊走を支持する因子を生成するからである。
別の実施形態では、マトリックスの良好な選択肢は、無細胞のヒト真皮自体であり得る；前に考察した分層皮膚からこのようなマトリックスを作製することは実現可能である。表皮のシートを取り除くいくつかの方法が存在する（ディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ）またはチオシアン酸アンモニウム）、そして適切な厚みの残りのシートを選択して、血管内皮が一方で、そして表皮が他方で培養される所望の構築物を達成し得る。このデザインは、マトリックス中に駐在するマクロファージと一緒に、マトリックス中の真皮タイプのＤＣである、表皮中のランゲルハンス細胞へ移動する血中細胞前駆体の組み込みを考慮する。
（実施例１５：ＶＳとＬＴＥとの間の接続）
ＶＳは、本発明の人工的なリンパ節（ＬＴＥ）と接続して配置され得る。このような直接接続は、このような接続を可能にするフローチャンバを含めるによって達成され得る。この実施形態については、デジタル印刷技術が所望され得る。
図２０は、本発明の局面を図示する。ある実施形態では、流動を支持された、カニューレ挿入された、内皮細胞裏打ちされたチューブのための足場を、デジタル印刷技術を用いて構築する。好ましくは、これは、表皮層（ＩＶ）を含むが、またさらに単純な脈管構造（ＩＩＩ）であってもよい。赤い矢印は、構築物の３Ｄの性質を示しており、ここではチューブは結合組織マトリックスによって完全に囲まれている。本発明の実施形態では、この構築物は、皮膚に天然に存在するかのように、真皮乳頭付近に絡み付けられて配置されたリンパ管および血管を有する。
天然の皮膚の機能的な構造および免疫生理学を複製する、この進歩したインビトロの皮膚等価構築物を用いれば、インビトロで化合物を試験することが可能である。ＶＳは、化粧品、化合物、ローション、クリーム、アジュバント、ワクチン、薬物、生物製剤および他の化合物の安全な試験のための、動物系に取って代わる、正確で、信頼ができ、かつ再現可能な方法である。
安全性およびリスク評価の理由によって、新規な化合物は現在、動物に対する適用および可視の変化の観察、例えば、紅斑（皮膚の紅化）および浮腫（漿液の蓄積）によって刺激性能力について評価されている。動物における皮膚刺激についての試験は潜在的に動物に疼痛および不快感を生じ、その結果は必ずしもヒトでの予測とはならない。近年では、皮膚の毒性効果のための動物試験は、非人道的かつ不必要であると、動物権の活動家からの監視および批判の増大にさらされている。動物に対して試験されている成分を含む製品の販売を制限するための試みが行われている。しばしばこの矛盾によって、作業者および消費者の安全性を保護し、規制状況に従い、動物の試験手順を減らすことが必要であり、動物試験手順関する信頼性なしに化合物および生成物の処方の皮膚侵食および刺激の危険性を評価するための別の試験方法を開発するために工業、行政および学会において大きな労力がもたらされる。
化粧品、個人医療、化合物、家庭用品および製薬工業における広範な製品についての信頼できる予測安定性データを提供する、標準化された、バリデートされたインビトロアッセイの必要性が引き続き存在する。インビトロモデルの開発を促進する要因としては、動物データとヒトの応答との間の相関が頻繁に欠失すること、３Ｄ組織操作構築物を用いるヒトの相関試験データの重要性、感度の増大、より良好な制御条件、より良好な実験の柔軟性、より容易な診断、ならびにインビボの動物研究に必要な費用および時間の大きさが挙げられる。
インビトロモデルの主な利点は、洗練された複数のエンドポイントのデータの明確な解釈を介してデータ分析および意思決定のための迅速な応答時間を誇るということである。皮膚毒物学者を誘導する最も顕著な問題は、ケラチノサイトおよび線維芽細胞からなる皮膚等価物が、物質の刺激能力を評価するのに十分であるか否かである。確実に、インビトロの等価物と天然の皮膚との間の有意な相違は、細胞の組成および他の組織との連絡がないことである。
刺激後の可視の症状の評価のために、血管内皮、炎症性細胞、および神経の相互作用が必要であり、そしていままでのところ大きく無視されている。本発明では、利点は、血管内皮およびリンパ管内皮、ならびに種々の免疫細胞（単球、樹状細胞、肥満細胞、マクロファージ、好中球、線維芽細胞）、刺激に対する炎症性応答を評価するために重要な細胞タイプ、足場材料、およびこのような構築物の集合をＶＳが含むということである。これらの追加は、該当の化粧品、化合物、薬物、生物製剤、ワクチンもしくはアジュバントを適切に評価するための有効な生理学的応答を達成するために重要である。
本発明のある実施形態は、血管内皮およびリンパ管内皮を裏打ちされた構築物へ脈管チューブを組み込むための組織操作された足場を、表皮の上皮の有無において含む。これには、後毛細血管細静脈を通じた既知の血流速度で、カニューレ挿入された足場中において所望の細胞タイプの増殖を可能にする条件を特定する必要がある。このデザインを考慮すれば、この結果はより現実的なワクチン接種部位である。例えば、脈管区画を通じた白血球の連続フローループを考慮すれば、結合組織空間に対する炎症性刺激物の投与によって、細胞の補充をそれらの正常な反応速度論でかつ正常な内皮の合図で生じることが可能になり、その結果、内因性の環境は投与されたワクチンに対する全体的な応答を調整する。細胞は、分析のためにリンパのカニューレから収集されてもよく、このカニューレは、人工的なリンパ節と接続するように固定されてもよい。
決定された所望の細胞タイプおよび足場特徴を有しているＶＳ組織を形成する組織操作アプローチにおいて、１実施形態では、デジタル印刷システムを用いて、足場を形成し、最終のＡＩＳバイオリアクター形式に従い易い構成に細胞を播種する。沈着条件としては以下が挙げられる：
１．細胞のＢＡＴ取り扱い、
２．最適の足場細孔サイズおよびフレームワーク寸法、
３．各々の組織タイプについての足場特徴、
４．種々の組織タイプおよび液体／栄養経路のための接合（ｉｎｔｅｒｆａｃｉｎｇ）／接続（ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ）足場、
５．他の組織タイプに対して考案された足場領域に対する細胞の接着を含む、所望されないバイオリアクター表面に対する細胞接着を妨げるための物質、
６．各々の組織タイプのための細胞播種密度、
７．細胞播種の順序（同時にまたは段階的に；そして最終のバイオリアクター構成において達成する方法）、ならびに
８．最終バイオリアクター構成への組み込みおよびデジタル印刷の方法。
本発明による操作されたヒト組織を作製するのにおける種々の操作の挑戦としては、足場または増殖組織構築物を通じた栄養の送達および細胞の均一な播種が挙げられる。好ましい実施形態では、デジタル印刷ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｔｏｏｌ（ＢＡＴ）システムを用いて、栄養物、酸素および組織経路の３Ｄ織り合わせ構造を作製する。ＢＡＴは適切な経路へ細胞を印刷し、そして各々の経路を作製するために用いられた材料は、特定のタイプの細胞について増殖するが他に対しては阻害性であるように導かれる。例えば、内皮細胞のみが、酸素送達チャネルに結合して裏を覆う。間質細胞および実質細胞のみが、組織領域中で固着する。隣接領域は、所望されない細胞タイプに対して阻害性でなければならないと思われる。なぜなら、操作された組織が２Ｄ表面と接触されておかれる場合、細胞は組織を遊出して２Ｄ表面上で単層を形成するということが本発明者らの経験であるからである。このおかげで、本発明では、３Ｄ構造は好ましくは、任意の２Ｄバイオリアクター表面から離れて培地中で増殖停止される。好ましい実施形態では、ＢＡＴが、この構造を作製するために用いられ得る。
操作された組織がインビボ設定を十分に模倣する場合、組織はそれらがインビボで応答するとおりに応答する。従って、操作された皮膚等価物が抗原とともに注射され、単球を含む液体のストリームと接触させられる場合、皮膚等価物自体が単球を誘引するのに必要なケモカインを生成し得ることが可能である。
未成熟なＤＣは、病原体侵襲後に末梢組織中の炎症の部位に補充される；これは、本発明のインビトロ免疫系におけるＶＳ（皮膚等価物）に対して細胞を指向することである。外来抗原の内部移行は引き続き、それらの成熟および末梢組織からリンパ器官への遊走を誘発し得る。ケモカイン応答性およびケモカインレセプター発現は、炎症の部位に対するＤＣ補充プロセスおよびリンパ器官への遊走の重要な成分である。未成熟のＤＣは、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６およびＣＸＣＲ１．１４，１５を含むケモカインレセプターを発現し得る。従って、それらは、主にＭＩＰ−３βによる、ただしやはりＲＡＮＴＥＳ（活性化に対して調節された、正常なＴ細胞で発現されかつ分泌される）／ＣＣＬ５およびＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症性タンパク質−１α）／ＣＣＬ３．１６に対する応答における炎症の領域に対する化学誘引であってもよい。抗原の獲得および処理の後、ＤＣが、リンパ器官内のＴ細胞富化領域に対して血液またはリンパを介して遊走し、同時にケモカインの成熟および調節ならびにケモカインレセプター発現プロフィールを受ける。ケモカインレセプターＣＣＲ６およびＣＣＲ７の発現レベルにおける変化は、ＤＣ成熟の間に観察された機能的なシフトに寄与する。
ＶＳ（単球）へ、ＶＳ以外（成熟ＤＣ）、そしてＬＴＥ（成熟ＤＣ、Ｔ細胞およびＢ細胞）へのこれらの遊走性経路の全てを協調させるため、インビトロ免疫系へ走化性を組み込むことが本発明の重要な特徴である。重要な物質／デバイスのデザインの特徴は、細胞の誘引を促進するメッセージ、可溶性および不溶性の分子の組み込みである。さらに、完全なＬＴＥの開発には、ＬＴＥ足場上でこれらの細胞を組織化するような合図を与える、Ｔ細胞と同様にＢ細胞に対するシグナル送達が必要である。
（実施例１６：迅速なケモカイン試験システム）
ＢｉｏＡｓｓｅｍｂｌｙ Ｔｏｏｌ（ＢＡＴ）は、走化性に対する実験における細胞の横向き運動の観察における使用のために改変されている。記載された設定によってケモカインおよび細胞マトリックスの迅速なスクリーニングが可能になる（代表的には、１つの実験で、約半時間〜１時間を要し得る）。
３つのケモカイン、ｆＭＬＰ−ＦＩＴＣ；ＭＩＰ−β（マクロファージ炎症性タンパク質−β）およびＭＩＰ−３βを、ヒト単球で試験した。ｆＭＬＰ ＦＩＴＣ（Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン−フルオレセイン−イソチオシアネート）の飽和レベル（約４０ｎＭ）は、ｆＭＬＰ（Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン）について公知のレベル（約３０ｎＭ）に近いことが見出された。ＭＩＰ−３βは、（未成熟の単球について予想されるとおり）無効であることが見出された；ＭＩＰ−３αは、負の情報および予想にもかかわらず有効であることが見出された。フィブリン接着剤は低濃度（約１ｍｇ／ｍｌ）でさえ細胞の運動を効率的に停止するが、コラーゲンは運動を支持することも見出された。従って、フィブリンマトリックスは、細胞保持が必要な場合に優先的に用いられるべきであり、コラーゲンは、細胞浸透性の障壁を作製するために用いられるべきである。この後者の観察は、創傷治癒手順のためにＥＴＣの使用を考慮する場合に重要であり得る。迅速なケモカイン試験系の模式図を図２１に示す。このシステムは、細胞遊走に対して、種々の微小粒子ストラテジーおよび処方物、一時的な放出特徴、ならびに足場特徴（例えば、幾何形状、多孔性、物質）を用いて、ケモカイン用量をさらに絞込みかつ最適化するために用いられ得る。
ケモカインによる細胞レセプターの飽和を試験するために迅速なケモカイン試験系を用いてもよい。ケモカインがその飽和濃度に達したとき、細胞は、シグナルに対して鈍感になり、それらの動きを停止する。ほとんどの場合、走化性は、ケモカインの勾配を通じて生じる。勾配が険しいほど、誘引はさらに有効になる；同時に、飽和に達する前に勾配によってカバーされ得る距離は短くなる。
（実施例１７：ＬＴＥにおける細胞成熟）
本実施例は、人工的なリンパ組織とも呼ばれるリンパ組織等価物（ＬＴＥ）に関する。ＬＴＥは、ナイーブなおよび／または記憶Ｔリンパ球およびＢリンパ球を含む人工的な（エキソビボ）免疫系の司令部である。Ｔ細胞およびＢ細胞は、感染した細胞を破壊すること、病原体をオプソニン化する抗体を生成すること、および他の免疫細胞中でエフェクター機能を誘導するサイトカインを分泌することによって適応免疫において重要な役割を果たす。ナイーブなリンパ球の活性化は、二次的なリンパ組織（リンパ節、パイエル板、脾臓を含む）内で生じる。Ｔ細胞は、末梢からリンパ節に遊走する樹状細胞によってクラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子の間隙においてＴ細胞に対して提示された抗原性ペプチドによって活性化されるが、Ｂ細胞は、外来の分子とそれらの抗原レセプターとの直接結合および活性化Ｔ細胞との引き続く相互作用によって活性化される。
リンパ節中のＴ細胞、Ｂ細胞およびＤＣは、２つの解剖学的に別個の領域で見出される（図２２）。これらは副皮質またはＴゾーン（Ｔ細胞および樹状細胞へ戻る）および小胞（Ｂ細胞および濾胞樹状細胞を含む関連の支持細胞へ戻る）である。
恒常性を休止している間、Ｔ細胞およびＢ細胞は二次的なリンパ器官の間の血液を通じて連続的に再循環する。Ｔリンパ球およびＢリンパ球は、副皮質における高内皮細静脈（ＨＥＶ）として公知の特殊な血管を介して血液からリンパ節に入り、そして各々のゾーンで生成される特定のケモカインによってＴゾーンまたは濾胞に向かって指向される。Ｔ細胞およびＢ細胞は代表的には、所定のリンパ節内に２４〜４８時間残留し、そして活性化シグナルが遭遇しない場合、Ｔ細胞およびＢ細胞は他の二次的なリンパ器官に対して血液を介してそれらの再循環を継続するように進む。
免疫応答の開始の際、これらの細胞は、それぞれのゾーンを残して、リンパ節内の協調された様式で細胞間相互作用のプログラムに従う。適応免疫応答の生成におけるこれらの工程は以下に考察される。
本発明の実施形態では、合成および／または天然のＥＣＭ物質は、リンパ球を含む、リンパ節の「オープンな（ｏｐｅｎ）」細網の網目状構造を模倣する物理的構造、ならびに二次的なリンパ組織においてリンパ球によって期待される生化学的合図（例えば、接着モチーフ、ケモカイン勾配）を提供する３Ｄ構造を達成するためのＬＴＥのためのマトリックスを製造するために用いられ得る。さらに、制御された微小構造設計の合成アプローチと天然のＥＣＭのさらに天然の材料とを組み合わせるハイブリッドアプローチが用いられてもよい。隔離されたＴゾーンおよびＢゾーンを含む例示的なＬＴＥ構造は、図２３Ａ〜２３Ｉに示される物理的な配置を模倣する全体的な構造を用いて製造され得る。要するに、図２３Ａおよび図２３Ｂは、コラーゲンクッション上のトルイジンブルー染色されたＨＵＶＥＣ細胞の画像であり、特徴的な細胞充填を示す。コラーゲンクッション上にＨＵＶＥＣ細胞を播種した時点から、代表的には、コンフルエンシーが生じてから細胞が正常な脈管内皮の形態学的特徴をとるまでに約５日を要する。図２３Ｃは、ＨＵＶＥＣの層上の新規に加えられた高密度の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を示す。図２３Ｄは、ＰＢＭＣの適用の４５分後、コラーゲンマトリックス内の、ＨＵＶＥＣ細胞の下の焦点面を示す。焦点の細胞は、コラーゲン内であり、そしてＨＵＶＥＣと表面ＰＢＭＣとの間で容易に識別される。図２３Ｅでは、ＣＭＦＤＡ標識を行って、コラーゲンクッション内の細胞の生存度および生きた細胞の位置を示した。図２３Ｆは、ザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）の存在の有無における、コラーゲンクッション中へのＰＢＭＣの移動を示す。位相差およびＣＭＦＤＡ標識を行って、クッション内の細胞位置を決定した。Ｚスタック画像を、クッション全体からとって、クッション内の細胞の数および移動を受けた細胞の数を決定した。データ分析によって、ザイモサンなしのクッションと比較した、ザイモサンの存在下のクッション中に残った移動された細胞の数の増大が示された（図２３Ｈおよび図２３Ｇ）。ザイモサンの存在下の移動細胞は、ザイモサンの刺激性の性質に起因して、深くは浸透しなかった。
コラーゲンクッションにおけるＨＵＶＥＣ内皮細胞の特徴は、コンフルエントな層、およびコラーゲンクッションへ遊走するＰＢＭＣの数を最高にし得る適切な形態学的特徴を示すには決定的である。図５８に示されるとおり、ＨＵＶＥＣ細胞は、培養の１０日後代表的な形態学的特徴を有するコンフルエントな単層を維持する（パネルＢ）。これらの形態学的な特徴は、ＰＢＭＣ適用の前に維持することが重要である。
これらのＬＴＥマトリックスにおいてＴ細胞およびＢ細胞の機能を支持することにおけるリンパ組織間質細胞の役割を評価して、リンパ節がインビボで形成する方法をさらに決定し、そしてリンパ節の自己組織化を制御する重要な要因を同定し得る。
抗原特異的なナイーブなＴ細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に対して主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の間隙において外来ペプチドを呈示する樹状細胞によって、一次的な免疫応答が開始される（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５〜２５２（１９９８）；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７６７〜８１１（２０００））。ＤＣによって呈示されるそれらの同系の抗原との接触の際、Ｔ細胞はリンパ節に２〜４日間残って、分化／クローン増幅を受け、抗原特異的Ｂ細胞に対する補助を与え、その後にリンパ節を出て、末梢においてエフェクター機能を果たす（Ｂｕｔｃｈｅｒら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７２：２０９〜２５３（１９９９）；Ｓｐｒｅｎｔら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１７１〜１８１（１９７１））。
ナイーブなＴ細胞活性化は、リンパ節のＴゾーンで生じ（図２４）；Ｔ細胞は、血液およびリンパを介して末梢組織の感染の部位からＴゾーンに遊走した抗原保有ＤＣを探索する（Ｇａｒｓｉｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１：９６〜９９（１９９８）；Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，２３〜４５（２００１）；Ｋａｌｄｊｉａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３，１２４３〜１２５３（２００１））。
末梢の結合組織の微細なコラーゲン原繊維メッシュとは異なり、Ｔゾーンの細胞外マトリックスは、細網の網目状構造として公知の、開放型のコラーゲン線維のクモの巣状の系に組織化される（Ｋａｌｄｊｉａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１２４３〜１２５３（２００１））。これらの厚い（約０．５〜約５μｍの直径（Ｇｒｅｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９５〜４９９（１９９６）））線維は、約２０〜約３０μｍ離れて空間を空けられ（図２４）；この細網の網目状構造と、代表的なコラーゲンゲルの構造との間の対比は図２４に図示する。この細網線維は主にコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩおよびフィブロネクチンから構成され（Ｋａｌｄｊｉａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１２４３〜１２５３（２００１）；Ｇｒｅｔｚら、前出（１９９６））、そしてβ１インテグリンを介して線維芽細胞性細網細胞（ＦＲＣ）として公知の、間質細胞の層の付着を支持する（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：１０９８〜１１１０（１９９３）；Ｇｒｅｔｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１４２５〜１４４０（２０００））。ＦＲＣは細網線維を鞘で覆い、一方を密着結合複合体と結合させて（Ｓｔｕａｒｔ ＆ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１０３：４１〜４７（１９７１）、Ｔ細胞および樹状細胞の遊走のための「生きた基板（ｌｉｖｉｎｇ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」を形成する（Ｃｒｉｖｅｌｌａｔｏ ＆ Ｍａｌｌａｒｄｉ，Ｊ．Ａｎａｔ．１９０：８５〜９２（１９９７））。
Ｔゾーンはまた、リンパまたは血液の大きな流れから区画化されて、免疫応答の間にＴゾーンにおける特定の制御された微小環境を保存し得る（Ｇｒｅｔｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１４２５〜１４４０（２０００））。従って、外因性の因子が最小化され、反対に樹状細胞および間質性ＦＲＣによって分泌される因子が最大の力価を有し得る条件下で、Ｔ細胞活性化が間質細胞格子内で生じる。一旦ＣＤ４＋Ｔ細胞がＤＣによって活性化されれば、それらは濾胞の末梢に遊走して、増殖および抗体アイソタイプ切り替えに関して活性化されたＢ細胞に「補助（ｈｅｌｐ）」を提供し得る（Ｇａｒｓｉｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：９６〜９９（１９９８））。
Ｔゾーンの固有の微小環境が、ナイーブなＴ細胞活性化に絶対に必要であるか否かは不明確なままであるが、病原体に対する効率的かつ有効な応答を増大させるのにおけるその重要さに対してはいくつかの系統の証拠が指摘する。ケモカインレセプターＣＣＲ７（ＣＣＲ７−／−）を欠くマウスでは、Ｔ細胞およびＤＣは、Ｔゾーン中で出会わず、そしてこれらのマウスは、免疫応答を増大することができない（Ｆｏｒｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ ９９：２３〜３３（１９９９））。Ｔゾーン構造の破壊を生じる変異（ｐｌｔ／ｐｌｔ）を保有するマウスは、いくつかの（全てではないが）ウイルスに対する高い感受性、Ｔ細胞応答の遅延、および異常なＴ細胞増殖／生存を示す（Ｇｕｎｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：４５１〜４６０（１９９９）；Ｊｕｎｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：６０３２〜６０４０（２００２）；Ｍｏｒｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：２０７〜２１８（２００１））。３Ｄのコラーゲンゲル中でＤＣと相互作用するＴ細胞のインビトロ研究では、単純な液相同時培養に比較して、生じるＴ細胞ＤＣ接触の期間および数について極めて異なる動態が示されており（Ｇｕｎｚｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３２３〜３３２（２０００））、そしてインタクトなリンパ節におけるＴ細胞ＤＣ相互作用を画像化する近年のインビボ研究では、これらの細胞が、２Ｄ培養物に比較してそれらの天然の３Ｄ微小環境では極めて異なって挙動することが確認されている（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１８６９〜１８７３（２００２）；Ｓｔｏｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：１８７３〜１８７６（２００２））。
（実施例１８：Ｂ細胞の活性化）
一次的な免疫応答におけるＢ細胞活性化の現在のモデルは、図２７に図示される（Ｂａｕｍｇａｒｔｈ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７６：１７１〜１８０（２０００）より）。濾胞中のＢ細胞は最初に、リンパ管によってリンパ節に担持される可溶性抗原に結合し、これが濾胞の端部へのＢ細胞の遊走を誘発し、ここでＢ細胞は活性化されたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に出会う。次いで活性化されたＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４０−ＣＤ４０リガンド相互作用ならびにＢ細胞増殖およびアイソタイプ切り替えを促進するサイトカインという形態で「補助（ｈｅｌｐ）」を提供する。
このモデルは、ほとんどの抗原に対する強力な体液性免疫応答には活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の存在を必要とするということを示す多くの研究と一致している（Ｆｕｌｃｈｅｒ ＆ Ｂａｓｔｅｎ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：３３〜５２（１９９７）；Ｐａｒｋｅｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３３１〜３６０（１９９３）；Ｇｏｏｄｎｏｗら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：２７９〜３６８（１９９５））。このパターンのＢ細胞輸送は、マウスのリンパ節で可視化されている（Ｇａｒｓｉｄｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：９６〜９９（１９９８））。
Ｔ細胞との相互作用後、いくつかの活性化されたＢ細胞は、免疫応答の間に発達する濾胞の特定の領域である胚中心に進む。濾胞内では、Ｂ細胞が増殖して体細胞の超変異を受けるが、これは活性化された細胞の抗体特異性を遺伝子的に操作して病原体をさらに効率的に排出し得る高い親和性の変異を見出すように設計されたプロセスである。
特化した樹状細胞（濾胞樹状細胞）は、抗原抗体補体複合体を捕捉し、それらを胚中心における抗体再配列Ｂ細胞に対して提示する；より親和性の高い抗体（それらのＢ細胞の表面上で膜結合型で発現される）を発達させるＢ細胞は、生存および増殖のシグナルを与えられるが、その抗体が繋ぐＢ細胞は、抗原のアポトーシスを認識できなくなる（Ｋｏｓｃｏ Ｖｉｌｂｏｓｉｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７６４〜７６９（２００３））。この結果は、アイソタイプ切り替えされた、高い親和性の抗体を産生するＢ細胞の急速に増殖する集団であり、最終的に長期生存形質細胞または記憶Ｂ細胞のいずれかに分化する。
本発明のＡＩＳのような、単純化されたインビトロの免疫系の機能的なモデルの開発のためには２つのポイントが特に関連する。第一は、Ｂ細胞増殖およびアイソタイプ切り替えを生じることにおけるＴ細胞補助の重要な性質である。第二は、胚中心の反応がアイソタイプ切り替え、親和性成熟および記憶細胞発達に絶対的に必要であるか否かに関して明確でないことである。
リンパ節内の細胞状態に対する効果に加えて、３Ｄマトリックスは、Ｂ細胞活性化および抗体産生のための補助の送達を容易にする、Ｔ細胞ＤＣ相互作用ならびにＴ細胞およびＢ細胞遊走を可能にさせるのに重要であると考えられる。多くの動物研究によって、Ｔ細胞の補助は強力な抗体応答に重要であるという証拠が提供されている。従って、リンパ組織等価物は、Ｔ細胞とＢ細胞との相互作用を支持しなければならない。本発明では、Ｔ細胞およびＢ細胞に特異的なまれな抗原の「調和（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｕｐ）」は、リンパ節における自立的な遊走によってこれらの細胞集団を一緒にさせる自然の「自己アセンブリ（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ）」プロセスを可能にするＬＴＥ構造を介して達成される。
３Ｄ支持マトリックスの効果に加えて、細胞相互作用は、リンパ節で重要である。これはおそらく、リンパ球と間質細胞との間の相互作用を含む。近年の研究では、Ｂ細胞の生存および機能は、それらが二次的なリンパ組織間質細胞とともに培養された場合にインビトロにおいて強化されることが示されている（Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３９４０〜３９４８（１９９８））。リンパ節内のリンパ球はまた、複雑な相互依存を有する；例えば、樹状細胞は、抗体の産生およびＢ細胞の生存／増殖を促進する因子を分泌する（Ｄｕｂｏｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：９４１〜９５１（１９９７））。ＬＴＥの一部であり得る全ての細胞タイプ（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ、リンパ間質細胞を含む）は、互いに対して相互作用して影響する能力を有する。
（実施例１９：ＬＴＥ構造および胚中心）
ＬＴＥは、ナイーブなＴ細胞およびＢ細胞の活性化の重要な場所として機能する。本発明は、ＬＴＥの設計において、リンパ節細胞外マトリックスのモデルの製造および種々の微小環境の合図（例えば、ケモカイン、サイトカイン、細胞（例えば、線維芽細胞性細網細胞））を提供するための多様なアプローチを包含する。ＬＴＥの特定の設計の検討材料としては以下が挙げられる：
１．リンパ節の細網の網目状構造「足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」のモデルとして、合成および／または天然のリンパＥＣＭ由来ヒドロゲルマトリックスを用いること、
２．ＬＴＥ内でのＴ細胞活性化およびＤＣ生存／機能に対するマトリックス組成および支持リンパ間質細胞の存在の役割、
３．ＴゾーンおよびＢゾーンの両方を含むＬＴＥ構造の製造。これらはいくつかの相補的なストラテジーを用いて組み立てられる。
ａ．隔離されたＴ細胞およびＢ細胞領域の直接の物理的なアセンブリ
ｂ．マトリックス内の別個の位置内の操作された局所ケモカイン供給源の作成を介する、Ｔ細胞およびＢ細胞領域の自己組織化および維持。
以下の説明は、本発明のこれらの特徴の各々について実験的なおよびアプローチを詳細に示す。
明らかに、リンパ節または他の二次的なリンパ組織において免疫応答の間に生じる動的な多数の細胞相互作用は、全体としてエキソビボの器官培養を除いて、現在まで組織または器官の機能のインビトロモデルで試みられた上記のいずれかの複雑性をはっきりと示す。この問題の複雑性を取り扱うために、本発明は、比較的よく理解されており、リンパ節の基本的な機能に重要であると思われる、リンパ節の生理学の局面のモデルに限定される。
胚中心は、身体における最も複雑でかつ動的な組織微小環境の１つである；それらの機能は、まだ十分理解されていない。胚中心内で生じる親和性成熟は、十分理解されていない非常に複雑なプロセスである；間質細胞および関与する濾胞の樹状細胞および局所の微小環境因子（サイトカイン、ケモカイン）は両方とも、十分規定されないままである（Ｋｏｓｃｏ Ｖｉｌｂｏｉｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：７６４〜７６９（２００３）；Ｃｙｓｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７６：１８１〜１９３（２０００））。
従って、本発明のＬＴＥは、「操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」胚中心も胚中心前駆体も欠く。この選択は、以下の実験的観察に基づく。第一に、胚中心を欠く、変異マウス（リンホトキシン−αまたは腫瘍壊死因子−αを欠損）由来のＢ細胞は、依然として、抗体アイソタイプクラスの切り替えおよび体細胞変異を受けることが可能であり、さらに抗原に応答して高い親和性の抗体を生じ、このことは胚中心が親和性成熟に絶対的に必要ではないことを示唆している（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ ３８２：４６２〜４６６（１９９６）；Ｐａｓｐａｒａｋｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１３９７〜１４１１（１９９６））。第二に、機能的なＢ細胞記憶（抗原再チャレンジに応答する高力価ＩｇＧ１の急速な生成によって規定される）は、これも胚中心を形成しないＢｃｌ６を欠くマウスではインタクトであることが見出されている（Ｋｏｓｃｏ−Ｖｉｌｂｏｉｓ、前出（２００３）；Ｔｏｙａｍａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １７：３２９〜３３９（２００２））。最終的に、インビトロ研究によって、活性化Ｔ細胞（またはＣＤ４０Ｌシグナルを提供する代用の細胞）とともに培養されたＢ細胞は、部分的な胚中心表現型、アイソタイプ切り替え、および体細胞変異を促進し得ることが示されている（Ｇａｌｉｂｅｒｔら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：７７〜８５；Ｒａｚａｎａｊａｏｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３３４７〜３３５３（１９９＆））。
本発明のＬＴＥにおける第二の単純化は、プログラムされたナイーブなＴ細胞／Ｂ細胞の再循環の欠失である；ＬＴＥにロードされた細胞は、恒常性の間にリンパ節から出ることを促進し得る高内皮静脈（ＨＥＶ）を模倣する構造には曝露されない。インビボではＴ細胞は、所定のリンパ節を出発して、２４〜４８時間ごとに血液を介して種々の二次リンパ組織の間で再循環する。本発明の別の実施形態では、ＬＴＥ構造の上のＨＥＶ単層のインビトロモデルが企図される（図２６）。マウスの系では、高内皮細胞が単離されている（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＆ Ａｇｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：８３７〜８４７（２００２）；Ｒｏｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７３：６３〜７１（２００３））。
１実施形態では、ＬＴＥは、合成のヒドロゲル「逆オパール（ｉｎｖｅｒｓｅ ｏｐａｌ）」マトリックスを含む。整列された多孔性のヒドロゲルは、整列されたコロイド状結晶のポリ（メチルメタクリレート）ラテックスマイクロスフェア（約５〜１５０μｍの直径を有する単分散）およびＵＶ重合化ゲルの上に、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ジメタクリレートおよびＰＥＧペプチドのＰＥＧブロックコポリマー溶液を注ぐことによって調製される（図２７Ａ）。次いでマイクロスフェアを、酢酸を用いた短時間処理、その後のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含むゲルの過剰な洗浄によって浸出させる。図２７Ｂに示されるのは、この方法によって得られる整列されたハニカム様構造の例であり；４つのさらに小さい画像の順序は、回転中の足場の１つの「セル（ｃｅｌｌ）」の３Ｄ再構成であり、これはｘ−ｙ平面において足場のこの細孔をその隣に接続する「側面ポート（ｓｉｄｅ ｐｏｒｔｓ）」を示す。図６０に例示されるとおり、任意の形状および寸法の足場が、肉眼的な寸法または顕微鏡的な寸法の両方で合成されてもよい。
ゲル中に架橋を含むペプチドの使用によって、ペプチドを模倣する仕立てられたＥＣＭまたは所望の場合完全なＥＣＭタンパク質がこのゲルに含まれることが可能になる（図２７Ｃ）（Ｉｒｖｉｎｅら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌ．２：８５〜９４（２００１）；Ｗｅｓｔ ＆ Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２：２４１〜２４４（１９９９））。構造中の細胞接着および遊走を促進するために、接着配列もヒドロゲルに含まれてもよい。さらに、このデザインは、細胞が天然の経路（例えば、コラゲナーゼ）を用いて構造を再構築することを可能にする酵素感受性の化学架橋剤を組み込む。このシステムを用いれば、仕立てられた細孔サイズ、機械的な特性および生化学的組成物を有する十分規定されたＥＣＭ模倣構造がデザインされる。
ＬＴＥについて適切なマトリックスを製造する上記のアプローチを補完するために、本発明はまた、ハイブリッドの合成／天然のＥＣＭ構造を製造するというアプローチを包含し、ここでは規定の構造を有する天然のＥＣＭ足場を製造するのにコロイド結晶鋳型法（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｃｒｙｓｔａｌ ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を適用することができる。これらの実験では、鋳型工程におけるヒドロゲルプレポリマー溶液（図２７Ａ）は、ＥＣＭゲルとその液体型で置換されてもよい。このゲルは引き続き３７℃で、鋳型スフェアの存在下で凝固され、ＥＣＭを適切な位置で共有結合的に架橋し、そして酢酸を用いて鋳型スフェアを溶出させる。このアプローチは、ＥＣＭゲルの天然の生化学的構造と合成の逆オパール構造の規定の微小構造とを組み合わせる。
（実施例２０：リンパの細胞外マトリックスから製造されたマイクロビーズ）
マイクロビーズは、ピッツバーグ大学のＳｔｅｐｈｅｎ Ｂａｙｌａｋ博士によって提供されたプロトコールを用いて調製されたブタのリンパの細胞外マトリックスから製造された。
２ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔａｓａｎに約１０ｍｇ／ｍｌのリンパ節（ＬＮ）ＥＣＭの微小なフラグメントを含む懸濁物（ｐＨ３．５）を液体窒素の表面上に、層流中で、点滴の方式で噴霧して、約１．５ｍｍのサイズの液滴をつくった。次いで、凍結されたビーズを一晩凍結乾燥させて、１０％トリポリリン酸塩（ＴＰＰ），ｐＨ６．０中でその後１時間インキュベートし、次いで１００μｍの細胞ストレイナー上で脱イオン水で３回洗浄し、次いで再度凍結乾燥した（図２８）。
（実施例２１：ケモカインおよびリンパ球でのＬＴＥローディング）
本発明の別の実施形態では、ＬＴＥはケモカインおよびリンパ球でロードされたマイクロキャリアを含む。本発明の別の実施形態は、ＬＴＥを構築する方法に関する；この方法は、（１）マトリックスを提供する工程と；（２）ケモカインでこのマトリックスをロードする工程と；（３）このマトリックスとともにリンパ球を培養する工程と；を包含する。
マイクロキャリアに対してＢ細胞およびＴ細胞を結合させるために、Ｂ細胞およびＴ細胞画分は、磁気ビーズに基づく分離プロトコールを用いて末梢血リンパ球からネガティブに選択した。ＰＢＳに懸濁された細胞を、種々のマイクロキャリア上に沈着させて、１時間インキュベートさせた。次いで、マイクロキャリアをＰＢＳ中で４回洗浄して、結合された細胞を、内部移行されたＣＦＳＥ染色の緑色蛍光によってキャリアの表面上で明らかにさせた（図２９（Ａ）、図２９（Ｂ）、図２９（Ｃ））。
このマイクロキャリアをケモカインで飽和させた。１実施形態では、ＣＸＣＬ−１３（ＢＣＡ−１；ＢＬＣ）およびＣＣＬ−２１（ＳＬＣ；Ｅｘｏｄｕｓ−２）を、それぞれ塩基性のＢ細胞およびＴ細胞特異的なケモカインとして選択した。
多くのケモカインは強力に塩基性のタンパク質である；すなわち、それらは、中性のｐＨで正に荷電されているアミノ基を保有する（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１０６２０〜１０６２６（２００１））。他方では、多くのマイクロキャリアはまた、正に荷電された基を含む（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍの製品のジエチルアミノエチルフラグメント；キトサン／Ｐｔｏｔａｓａｎ中のアミノ基）。結果として、ケモカインの適切な接着を得るためには、キャリアの表面の荷電変更が重要である。
１例として、これは、層ごとの（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ）（ＬＢＬ）超分子アセンブリの公知の機構に従って（Ｋｏｔｏｖ，ＮａｎｏＳｔｒｕｃｔｕｒｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ １２：７８９〜７９６（１９９９））、正に荷電されたマイクロビーズに対して結合してこの電荷を過補償するポリアニオン性媒介因子を用いて達成され得、これによって、正に荷電されたケモカインの引き続く可逆性の静電気的結合が得られる。
細胞外マトリックスの天然の成分であるヘパリンを、媒介因子として選択した。ヘパリンは、硫酸基およびカルボン酸基を保有する複数の五糖単位を含む；１単位比あたりの平均荷電は２．３である（Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｎ ＆ Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４：６２６〜６３１（２０００））（図３０）。
ある実施形態では、ｃｙｔｏｐｏｒｅ−１マイクロキャリア（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、全部で１０ｍｇを、１０ｍｇのブタヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ緩衝液中に一晩浸漬した；Ｃｙｔｏｐｏｒｅ−１の別の部分を、ヘパリンを含有しない緩衝液中に浸漬した。このサンプルを、その後に脱イオン水の多量の容積を用いて７回、そして０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で１回洗浄して、２ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡに加えて約２００ｎｇ／ｍｌのＢＬＣケモカインを含有するガラス試験管に移した。一晩のインキュベーションの際、サンプルを、溶液中に残留するＢＬＣについて分析して、１工程のＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＣｙｔｏｐｏｒｅマイクロキャリア上に吸着させた（図３１）。
（実施例２２：ＬＴＥにおけるＴ細胞活性化に対する組織およびマトリックスの影響）
細胞外マトリックスおよびリンパ節の間質細胞の両方が、二次的なリンパ器官において、Ｔ細胞、Ｂ細胞および樹状細胞の機能に重大な役割を果たすようである。リンパ節の細胞構築の見地から、Ｔゾーンの間質細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインの産生を介して、Ｔ細胞活性化に、そしてＴゾーンを通じてＴ細胞およびＤＣの遊走を支持するレセプターの発現に重要な役割を果たすようである。
Ｔゾーンの間質細胞の誘導。本発明のＬＴＥのデザインは、ヒドロゲル足場上のＴゾーン線維芽細胞性細網細胞（ＦＲＣ、Ｔゾーンの間質細胞）の移植を含む。１例として、間質細胞は、本発明者らの合成物質に対するこれらの細胞の応答を試験するために、以前の報告（Ｂｏｇｄａｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：２１２１〜２１３０（２０００）；Ｃａｓｔｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７４：３２１〜３２８（１９９７）；Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０２：５０６〜５１４（２００１）；ＬｅＢｅｄｉｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １００：２〜８（２００２））と同様の方式でＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節から単離された。このようにして得られた間質細胞は、特徴的な線維芽様の形態を有する（図３２Ａ）。リンパ節の間質細胞は、高レベルのＣＤ４４およびＶＣＡＭ１を発現する（Ｓｋｉｂｉｎｓｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３９４０〜３９４８（１９９８）；Ｒｕｃｏら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：１３３７〜１３４４（１９９２））；抗ＣＤ４４および抗ＶＣＡＭ１で染色されたＦＲＣのフローサイトメトリー分析によって、間質細胞株によるこれらの分子の発現が確認された（図３２Ｂ）。ＲＧＤ接着ペプチドを呈示する合成のポリ（エチレングリコール）に基づくヒドロゲルは、培養中数日間にわたってＦＲＣの接着、伝播および増殖を支持した（図３２Ｃ）。これらの細胞はまた、フィブロネクチン、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＩコーティング表面上で十分増殖したが、ラミニン上では増殖しなかった（データ示さず）。
（実施例２３：Ｔ細胞およびＢ細胞領域のアセンブリ）
Ｂ細胞抗体産生のためのＴ細胞補助のリンパ節機能を提供するために、本発明のＬＴＥ内の別個のＴ細胞およびＢ細胞領域を、デジタル印刷（別個のゾーン内のＴ細胞およびＢ細胞を直接アセンブリする）および／または徐放性技術（例えば、それぞれＴ細胞およびＢ細胞の領域を維持するようにＴ細胞およびＢ細胞の誘引物質を放出するマイクロスフェアを用いる）の組み合わせ作用によって製造する。マトリックスを製造するために用いられる物質と一緒になって、これによって、モデルのリンパの微小環境に対する空間的および一時的な制御で、細胞遊走および細胞間相互作用を適切に調節することが可能になる：接着リガンドおよびケモカインタイプ、空間的な位置、密度および時間による濃度は、リンパ球機能を最適化するために変えられてもよい。これらの変数の全てに対する完全な制御で、インビボの環境の最も完全な模倣が得られるが、モデルのＬＴＥ構造について上記されたデータで例示されるとおり、ＬＴＥ中の接着分子、ケモカインおよび他の可溶性の因子の情報のいくつかの限られたサブセットは、これらのインビトロ構築物内で重要な機能を達成し得る。
異種ＬＴＥゾーンのデジタル印刷。Ｂｉｏ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｔｏｏｌ（ＢＡＴ）によって、コンピューター制御を用いて、マイクロメートルスケールの正確さで、生きた細胞懸濁物を含む粘着性の液体の沈着が可能になる。連続的な沈着によって、偽のリンパ節ゲル構造によって図示されるとおり、３Ｄ構築物が構築されることが可能になる（図３３Ａ）。ＢＡＴのデジタル印刷能力を用いて、例えば、合成および／または天然の上記のＥＣＭマトリックスの例を含む、ＬＴＥ足場内のデザインされた「ゾーン（ｚｏｎｅｓ）」への徐放性のマイクロスフェアの有無のもとで、リンパ球を同時沈着させる。
（実施例２４：ケモカインを用いるＴ細胞およびＢ細胞の領域の維持）
Ｔリンパ球およびＢリンパ球は高度に運動性であり、そしてＬＴＥマトリックスの微小環境が遊走を支持する場合、ＬＴＥへの直接印刷によって作成されたＴ細胞およびＢ細胞領域は、培養物中で経時的に十分規定されないということが予期され得る。インビボでは、これらのゾーンは、二次リンパ組織内のそれぞれの区画へＴ細胞およびＢ細胞を局所的に誘引する局所ケモカイン勾配の作用によって維持されると考えられる（Ｃｙｓｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７６：１８１〜１９３（２０００）；Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：４４７〜４５０（１９９９））（図３４Ａ）。ＬＴＥにおけるこれらの条件の規定されたシミュレーションを得るために、本発明のＬＴＥの実施形態は、各々の細胞タイプについて重力の局所中心をそれらの局所ゾーンで得るようにデザインされた、ケモカイン放出マイクロスフェアとの細胞の同時沈着を含む（図３４Ｂ）。
別個のケモカインが、リンパ節のＴ細胞およびＢ細胞領域を組織化するように機能する；ＣＸＣＬ１３（ＢＬＣ）は、リンパ節濾胞にＢ細胞を局在させる重要な因子であることが公知であり（Ｃｙｓｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７６：１８１〜１９３（２０００）；Ａｎｓｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ ４０６，３０９〜３１４（２０００））、一方ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３β）およびＣＣＬ２１（ＳＬＣ）は、Ｔ細胞および樹状細胞をＴゾーンに誘引する（Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：４４７〜４５０（１９９９）；Ｍｅｂｉｕｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：２９２〜３０３（２００３））。本発明のある実施形態では、足場のＴゾーンを自己組織化するためにケモカインの「天然の（ｎａｔｉｖｅ）」供給源を得るように、リンパ節の線維芽細胞性細網細胞がＬＴＥのＴゾーンに含まれてもよい。別の実施形態では、ＬＴＥは、ＬＴＥ内で規定の化学誘因物質デポが得られるように徐放性のマイクロスフェアを含む。例えば、ホルミルペプチドまたはケモカインＭＩＰ−３βを用いる、化学誘引性の樹状細胞および単球に対する分解性のポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアの使用が実証されている。ＬＴＥの自己組織化のために、同様の手順を用いて、ＬＴＥマトリックス内の徐放性のためにマイクロスフェアにＢＬＣ、ＭＩＰ−３βおよびＳＬＣをカプセル化してもよい。ＭＩＰ−３βおよびＳＬＣの両方がＴゾーン組織化に関与するので、これらは別々に含まれても、または組み合わせて含まれてもよい。次いで、ＬＴＥ足場へマイクロスフェアをＴ細胞およびＢ細胞と同時沈着して、そして、このようなマイクロスフェアを欠くマトリックスと比較されたこれらのケモカイン指向足場において、規定されたＴ細胞およびＢ細胞領域のこれらの構造内での経時的な維持を比較する。別の実施形態では、重合化の間にヒドロゲルマトリックスの「支柱（ｓｔｒｕｔｓ）」内にマイクロスフェアを直接カプセル化することが可能である。さらに別の実施形態では、これらの間質細胞が、足場内のＴ細胞局在を導き得るか否かを確認するために、ＦＲＣ移植されたＴ細胞領域を調製してもよい。
（実施例２５：インビトロの組織スライス鋳型）
機能的なＬＴＥを構築するためのさらなるアプローチ。上記実施形態は、哺乳動物、好ましくはヒトの二次的なリンパ組織の最小の機能的な模倣物を製造するアプローチを記載する。本発明の範囲内で考慮される他の実施形態がここで記載される。
別の実施形態は、インビトロの人工的な胸腺を開発する研究者らによる試みを報告したのと同様の方式で、天然のヒト間質細胞を用いてＬＴＥを「鋳型にする工程（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）」を包含する（図３５）（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：７２９〜７３４（２０００））。それらのアプローチは、以下の工程を包含した：
１．マウス由来の小さい胸腺フラグメントを、Ｃｅｌｌ Ｆｏａｍディスク（多孔性マトリックス）の表面上で、１２ウェルのプレート中で培養し、間質のコンフルエントな層がマトリックス全体にわたって形成されるまで、増殖培地中で１４日間カバーした。
２．コンフルエンスに達した際、ヒトリンパ球前駆細胞を同時培養物に加えた。
３．４〜２１日間の同時培養の間、接着しない細胞は定期的に回収し、細胞表面マーカーを分析してＴリンパ球産生を決定した。
本発明の実施形態における同様のスキームに従って、天然の間質細胞を有する構築物を播種して、添加されたＴ細胞、Ｂ細胞およびＤＣのための前もって準備された微小環境を提供するために、リンパ節フラグメントもしくはリンパ節、脾臓、または扁桃腺「切片（ｓｌｉｃｅｓ）」由来の間質細胞を用いてＬＴＥマトリックスは「鋳型にされ（ｔｅｍｐｌａｔｅｄ）」得る。このような培養物は、この鋳型工程の間に標準的な器官培養方法を用いてインビトロで維持され得、そして鋳型にされたＬＴＥは引き続いて、持続的な維持のためのＡＩＳバイオリアクターにロードされ得る。このアプローチは、正確なリンパ微小環境を生成するための代替を提供するだけでなく、リンパ節形成および組織化原理の分析のための補完的なインビトロアプローチも提供する。
（実施例２６：人工的な免疫系に居住する細胞の供給源）
インビトロの免疫系を構成するために、単球、Ｔ細胞およびＢ細胞、内皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、間質細胞、ならびに好中球、肥満細胞および他の免疫細胞を含む多数の細胞が必要であり得る。１実施形態では、免疫細胞の準備された供給源は、末梢血（ＰＢＭＣ）であり、これはワクチン接種部位に、そしてＬＴＥに必要な多くの細胞を提供する。別の実施形態では、ヒトサンプル由来の皮膚関連細胞（ワクチン接種部位の節で記載）が用いられ得る。さらに別の実施形態では、ＣＤ３４＋幹細胞からインビボで生成される造血細胞の供給源としてＨｕＳｃｉｄマウスを用いることが可能である。さらに、胚性幹（ＥＳ）細胞からこれらの細胞タイプの全てを生成するための方法論が開発されているので、本発明は、１つのＥＳ細胞株／系統由来の完全に適合した細胞を用いる工程を包含するとみなされる。
（実施例２７：バイオリアクターの設計および構築物：ＡＩＳ成分の組み込み）
高処理能力の薬物スクリーニング技術との類似を描写すれば、迅速なワクチンまたは化合物のスクリーニングに適切なＡＩＳには、単回使用のために設計された、多数の低コストの使い捨て可能なバイオリアクターが必要である。各々のバイオリアクターは種々の抗原をチャレンジされ、そして免疫応答の活性化の際に、抗体、Ｂ細胞およびＴ細胞について回収される。微小流体バイオリアクターは、この目的を達成するために好ましく、そして、組織構築物を播種するにはより少ないわずかな細胞しか要しないというさらなる利点をもたらす。
図３６に例示されるとおり、ある実施形態では、ＡＩＳバイオリアクターは、顕微鏡試験のための透明なポリマーシートまたはガラスのカバーガラスを備える２区画の顕微鏡スライドとして製造され得る。好ましい実施形態では、各々の免疫バイオリアクターの物理的な寸法は、約７．５ｃｍ長でかつ約２．５ｃｍ幅程度であり、全体的な厚みは約２ｍｍ以下である。第一のチャンバは、モジュール単位として増殖され得、そして後に下部の構造的な層に挿入されるか、または最初から完全に統合型のシステムとして挿入され得る、ＶＳおよびＬＴＥ膜を含む。第二のチャンバは、ＬＴＥを含み、これはＴ細胞およびＢ細胞の集団を含む。必要に応じて、リンパ器官輸送または他の組織への輸送を可能にするようにさらなるＬＴＥ構築物が追加されてもよい。上部の層に配置されるシリンジチューブポートによって、脈管経路に沿い、そしてＥＴＣ内の、戦略的な位置での因子および／または細胞の注射が可能になる。図４８は、ＶＳおよびＬＴＥ ＥＴＣの下の高い接触領域を有する微小加工された血管およびリンパ経路を示す組み込み型バイオリアクターの例の平面図を示す。
血管およびリンパ経路に沿って遊走する細胞と、ＶＳおよびＬＴＥ組織構築物における細胞との間の相互作用を促進するために、各々の組織膜の間の接触空間は、例えば、小型の組み込まれたマイクロチャネルを有する加工された挿入物または薄い積層を用いて調整され得る。適切な構築物質としては、生物学的に適合性のポリマー、例えば、ポリカーボネート、ポリエチレンまたはアクリル酸が挙げられる。積層に基づく挿入物は、より大きい粉砕管状デザインが図３６に例示されるデザインに組み込まれるているような、実施例（図３７）に示されたとおりである。ある意味では、これらのデザインは、末梢血から二次リンパ器官へのリンパ球の遊走を支持する細い細静脈経路を模倣する。
栄養富化培地を、チャネルを通じて外部培地リザーバからポンピングし、ＶＳおよびＬＴＥ構築物を通って接線方向に流し、このリザーバに戻す。再循環する培地と組織構築物との間の栄養物および廃棄物の輸送は、拡散性および対流性（水切りフロー（Ｓｔａｒｌｉｎｇ ｆｌｏｗ））プロセスの両方を通じて生じる。
他の栄養物とは対照的に、酸素は細胞培養培地にはごくわずかにしか溶けない。結果として、十分な酸素供給を維持し、かつ壊死ゾーンの発達を回避するためには高い還流速度が必要になり得る。必要な還流速度が物理的な能力を超える（例えば、異常な高圧の液滴がバイオリアクターのシールの完全性を損ない得る）か、過剰な液体剪断を生じる場合、別の実施形態では、培地中の酸素分圧は、例えば、循環している血液培地と直列であるＯ２マイクロエクスチェンジャーを用いることによって増大され得る。反対側で高い酸素濃度に曝されたガス透過性のポリマーに血液培地を循環させることによって、Ｏ２環境は、Ｏ２の消費および損失を補償するように調節され得る。バイオリアクター中のＯ２濃度に対するモニタリングおよび調節の実施は、酸素空気供給へのフィードバックを提供するための市販の非接触蛍光プローブを用いて達成され得る。ポリマーの界面と組織構築物との間の気体としての酸素の高い濃度勾配を作成することは、拡散性の輸送およびより厚い構築物の培養を促進し得る。光学的検査／蛍光画像のための透明なカバーを有する組み立てられた構築物の例は図３８に示される。
（実施例２８：層状のＡＩＳの製造およびアセンブリ）
このような微小流体バイオリアクターの製造には、最適の処理条件（例えば、レーザー流量および変換速度）を決定するために、生体適合性物質を用いた超短パルス加工トライアルが必要であり得る。本発明のデザインは、デバイスが組み立てられた後に、バイアまたはポートの追加のために、層状にされたデバイス（例えば、ガス透過性のポリマーの頂部層、ＢＡＴ沈着された中間層、およびＰＤＭＳの底部層）のレーザー加工を可能にするのに十分に可塑性である。
図４９は、ＡＩＳデバイスの実施形態における直接沈着の断面図を示す。種々の生体材料構造が、人工的な免疫系の構成要素として組み込まれ得る（例えば、バイオコンクリート、逆ヒドロゲルオパール、コロイド粒子、ＥＣＭゲル、コラーゲンゲル、マイクロキャリア）。例えば、ポリマーメッシュのレバー（ｒｅｂａｒ）は、ＶＳおよびＬＴＥ領域のくぼみに層ごとに直接沈着され得る。このようなデザインでは、メッシュレバーをプレートに結合することを可能にするために、ポリアクリレート、ポリスチレンまたはＤＭに鋭敏な別の透明なプラスチックから作成されたＡＩＳユニットの下部のプレートを有することが好ましい。この実施形態では、この表面はＥＳＣ足場に対して同様の方式でＫＯＨを用いてマイクロパターン化される。全ての必要な栄養物およびサイトカインを保有するフィブリンゲルマトリックスを用いて、薄膜としてメッシュのスレッドをコーティングして、細胞の適応および動きのための十分な空間を残す。
図５０および５１に示されるように、本発明のデザインは、層状化されたデバイス（例えば、ガス透過性のポリマーの頂部層、ＢＡＴ沈着された中間層、およびＰＤＭＳの底部層）のレーザー加工を可能にするのに十分に可塑性である。図５２は、リンパ管および血管のループおよび外部培地リザーバのための接続された外部ポンプを有する灌流バイオリアクターシステムの模式図を示す。ＡＩＳバイオリアクターは、半回分式または連続式のいずれで操作されてもよい。
本発明のある実施形態では、バイオリアクター中の膜の組み込みは、図５３に例示されるように、細い金属（例えば、ステンレス鋼）リングの間に膜を圧接することによって達成される。このような圧接方法を用いて、生物学的な膜は、接着剤の使用なしに支持されてもよく、そして約４００μｍ以下の厚みプロフィールを有するディスクに圧縮されてもよい。
図５４は、３層の平面的な導波管の製造を示す。図５５は、灌流バイオリアクターと、内蔵型光導波管を備えるＥＬＩＳＡチップと、デバイスを接続し交換を可能にするための微小流体バックプレーンと、外部ポンプおよびリザーバのための微小流体コネクターとを備えるデバイスの例を示す。
チャネルを直接加工することに加えて、モールドを適切な材料で加工して、ＰＤＭＳデバイスが形成され得る再利用可能な母型を作成してもよい。これによって、連続したレーザー加工よりも高容積のデバイスを製造することが可能になる。漏れのない構築物を得るためにチャネル封入方法が評価される。デバイスを構成する物質は、高温で損傷される可能性が高く、そのため頑強な低温結合方法が必要である。
デバイスの試験には、外部接続を装着することおよび提供するために付属品を必要とする。レーザー加工はまた、外部ポンプもリザーバも接続を断つ必要なしにデバイスの素早い切り替えを支援するこれらの試験付属品のためのマニホールドを提供するためにも用いられ得る。圧力、粘性および流速を測定するための装置も、このマニホールドを介してデバイスに接続されてもよい。チャネルの形状を最適化するための修正は、このデータおよびＥＴＣの能力に基づいて行なわれ得る。
ＡＩＳ微小流体バイオリアクターシステムは、一定の温度、湿度および二酸化炭素の制御を維持するインキュベーターに入れられてもよい。フェノールレッドは、培地中で比色的なｐＨ指示薬として機能し得、その結果ｐＨは、例えば、対数増殖能力での視覚検査または光度定量を通じて定期的にモニターされ得る。別の実施形態では、ｐＨは、ｐＨプローブおよびレコーダーを備える外部培地リザーバ中で連続的かつ正確にモニターされてもよい。
剪断力を制御するフローチャネルのデザインは、膜を通じた細胞遊走を補助して、細胞のストレスまたは損傷を最小にするのに重要である。２．５ダイン／ｃｍ２に近い制御された範囲で剪断力を加えることによって、内皮膜を横切るリンパ球遊走が改善され得るということが、研究およびモデリングによって示されている（Ｃｉｎｎａｍｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：５１５〜５２１（２００１））。７０ダイン／ｃｍ２の大きさへ増大された剪断力は、細胞を損傷し得、細胞機能を変更し得ることも示されている（Ｍｏａｚｚａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：５３３８〜５３４３（１９９７）；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６７：１８７６〜１８８１（１９９４）；Ｈｏｃｈｍｕｔｈ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｃｈ．Ｅｎｇ．１１５：５１５〜５１９（１９９３））。バイオリアクター中のチャネルの寸法は好ましくは、最小の剪断応力を生じるように改変される。好ましくは、入口ポートはサイズが最大化され、一方で膜を横切るフローチャネルは、剪断力を膜の界面に局在させて、注入ポートの剪断力を減少させるように減少される。膜界面で剪断力を増大することによって、細胞遊走が改善され、そして細胞の変化は排除され得る。
合成膜および天然の膜の両方に挿入支持体を作製することは、積層物、圧着されたリングおよび接着剤を用いることによって達成されている（図１９）。積層物および接着剤は主にポリマーメッシュを支持するために用いられており、ポリマーメッシュが次に、合成的に形成された生物学的な膜に対する機械的な強度を提供する。積層物を用いる製造は、次に熱的に一緒にシールされるポリマー積層物の２つの小片の間に伸展されたメッシュをサンドイッチする工程を包含する。この接着方法は、メッシュ支持体を伸展させる工程と、生体適合性の接着剤を用いてステンレス鋼リングを接着させる工程とを包含する。前に考察されたこの圧着方法は、２つのステンレス鋼リングの間に膜を圧縮させる工程を包含する。一般には、この積層および接着の方法は、合成のメッシュで支持された膜に限定されるが、この圧着方法は、天然の生物学的膜および合成のメッシュの両方に適合し得る。
（実施例２９：光学的診断ＡＩＳ微小流体バイオリアクター）
免疫学は、いずれのヒトの系でもこの時点では観察できない事象の多くのカスケードを有する。詳細には、ワクチンが免疫学的組織内に入ることに関連する律速段階および免疫学的組織内での相互作用の結果として失敗する場合、ヒトでこのプロセスを測定する方法も改善する方法も現在はない。この問題に取り組むため、本発明のある実施形態は、インビトロの免疫学的プロセス／ワクチン接種プロセスのインサイチュの工程において光学的にモニターできるような方法でＡＩＳを構築する工程を包含する。
１実施形態では、内蔵型の光導波管は、単独の微小流体バイオリアクターシステム上での光学的励起、吸収、蛍光および画像化を含む多くの異なる機能を備える、ＡＩＳのμ−トータル分析システム（μ−ｔｏｔａｌ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍ）（μＴＡＳ）の一部になる。インサイチュの診断システムは、さらに迅速な免疫学的構築物の最適化および診断評価の実施を行う。二光子蛍光は、人工的組織および生きている組織の両方において３次元の全てで免疫学的事象の可視化を可能にし得る。この技術によって、種々のアジュバント、ワクチン候補物、薬物、生物製剤、生体分子および抗原呈示ビヒクルの効果をインビトロで、そしてインサイチュの診断で理解し最適化することが補助され得る。
プロセスを単純化し、かつ分析時間を減らすため、インサイチュにおいて免疫学的分析工程を行うために用いられ得るμＴＡＳの製造に関して、プロトタイプの結果が呈示される。１実施形態では、本発明は、インサイチュの光学診断のための内蔵型光導波管の追加を伴うＡＩＳデバイスを提供する。これらの導波管は、比色分析（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ吸収および蛍光分析）のための光学的励起および検出経路を提供する。
本実施例では、単層の平面なポリマー導波管を、ポリマー基板の選択的なフェムト秒のレーザーアブレーションを用いて製造した。ガラススライドを、８０μｍ厚の層の単一部分、１．５６の屈折率を有する紫外線硬化ポリマーでコーティングした。紫外（ＵＶ）ランプ（４Ｗ）での３０分間の硬化後、平坦な光導波管および微小流体チャネルを、Ｔｉ：サファイアフェムト秒レジメンレーザーを用いてポリマーに加工した。光導波管および微小流体チャネルは各々約１００μｍ幅で８０μｍの深さであった。ＣＷ Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザーからの光は、左側に示されるようなテーパー状の配列の溝に挿入された５０μｍのコア直径の光ファイバーを通じて平坦な導波管に結合された。平坦な導波管を通じて導かれた光は、微小流体チャネルを横断して通過する。この導波管／チャネル横断は、レーザー源オフで真ん中に、そしてレーザー源オンで右側に示される。右からのチャネルに入る光は、チャネルの反対側で導波管に収束される。次いでこの光は、別の５０μｍのコアの光ファイバーにカップリングされて、測定のためのシリコン検出器に送られる。
（実施例３０：インサイチュ診断バイオリアクターの開発）
インビボの系を模倣する微小流体デバイスは、細胞の相互作用および生物学的プロセスのインビトロでの研究における価値を提供している。このようなデバイスは、小さいサンプルおよび試薬の容積、小さい廃棄容積、増大した表面積対容積比、低いレイノルド数（層流）、粒子分離のための速い沈殿、反応時間の短縮および携行性を含む、伝統的な大規模の液体アセンブリを上回るいくつかの利点を提供する。いくつかの微小流体デバイスはまた、ポンプ、バルブ、フィルター、ミキサー、電極および検出器を組み込む。整列の容易さおよびさらに短い反応時間によって、このアプローチを用いて可能なほぼリアルタイムの検出が行われる。
微小流体デバイスの製造は主に、シリコンまたはガラスのフォトリソグラフィーおよび引き続くエッチングのような、微小電子工学産業において開発された技術に依拠している。これらの技術はしばしば、複数の処理工程およびクリーンルーム施設を要し、そして作業デバイスを作成するためには数日または数週間を要し得る；それらはラピッドプロトタイピング（ｒａｐｉｄ ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ）よりもデバイスの大量生産によりよく適している。製造の比較的新しい方法は極短パルスレーザー微小加工（ｕｌｔｒａ−ｓｈｏｒｔ ｐｕｌｓｅ ｌａｓｅｒ ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｉｎｇ）（ＵＳＰＬＭ）である。ＵＳＰＬＭは、マスクの必要性もフォトレジスト現像の必要性もなしに物質が直接製造され得るという利点を有する。従ってデバイスは、さらに迅速に、しばしば１日以下で、製造されてもよく、これによってラピッドプロトタイピングが可能になる。さらに、極端に短いパルスの継続期間（＜１５０ｆｓ）および高度集中に起因して、ほとんどの任意の物質が、多光子吸収およびイオン化のおかげで、それがレーザー波長で透明であってさえ、容易にアブレーションされ得る。これは光学的に透明なバイオリアクターのために物質を加工するには特に有用である。図４６は、微小流体チャネルに組み込まれた超短パルスレーザー微小加工された平坦な光導波管を示す。左側のパネル：光ファイバーのカップリングのためのテーパー状のポート。真ん中のパネル：平坦な導波路の微量流体チャネル交差点（電源オフ）。右側のパネル：平坦な導波路の微量流体チャネル交差点（電源オン、右側から入る）。
本発明のある実施形態では、ＵＳＰＬＭを用いて、バイオリアクター中の微小流体チャネル、バイアス、リザーバ、および内蔵された光導波管を加工した。高価でなく広範に用いられる生体適合性のシリコンエラストマー、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、この構造の本体を含む。ＰＤＭＳのシートは、ＵＳＰＬＭによってパターン化され、次いで３Ｄ構築物を形成するように組み立てられ得る（Ｌａｓｅｒ−ｍａｃｈｉｎｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｐｒｉｎｔｅｄ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｏｐｔｉｃａｌ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ，Ｎｇｕｙｅｎら、Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ Ｉｎｔ．Ｓｏｃ．Ｏｐｔ．Ｅｎｇ．，５５９１）。この層は、酸素プラズマを処理することによって永続的に結合されてもよいし、または機械的な圧力を加えることによって一時的に結合されてもよい。従って、使い捨て可能または再使用可能なデバイスの製造が容易に達成される。
１実施形態では、組み込まれた光導波管は、図３９に図示されるように製造される。この導波管は、真ん中のポリマー層が高い屈折率を有する複数の交互の屈折率のポリマー層を含む。好ましい実施形態では、このポリマーは、ＵＶもしくは熱で硬化されるかまたはその両方の組み合わせで硬化されてもよい（例えば、ＰＤＭＳ被覆加工およびＵＶ硬化コア）。導波管は超短パルスレーザーを用いていずれかの側で物質を除くことによって規定される。このレーザーはまた、導波管に対する光ファイバーのカップリングのためのテーパーを組み込むように用いられ得る。微小流体チャネルは、導波管に対して平行であるかまたは垂直に加工される。光は微小流体チャネルの片側で導波管に進行され、チャネルを通過して、ここでチャネル中の液体と相互作用し、次いでチャネルの反対側で導波管によって収束されて、検出器に送られる。別の実施形態では、光ファイバーはＰＤＭＳに包埋され、次いで微小流体チャネルはファイバーに垂直に加工されて、このチャネル内のファイバーの小断面が取り除かれる。これによって平坦なポリマー導波管の必要性、ならびにスプリッターおよびコンバイナのような複雑な導波管形状の犠牲であるファイバー対導波管カップリングの損失が省かれる（図４０）。
図５９は、リングおよび支持マトリックス上にコラーゲン膜を有するバイオリアクター構築物の例を示す。３７℃で１時間凝固させたコラーゲンクッションは、３週間より長くコラーゲン分解なしで極めて安定を維持した。パネルＡは、バイオリアクターの設計を示す。パネルＢは、バイオリアクター全体からメッシュ内のコラーゲンマトリックスクッションのレベルへの進行を示す。コラーゲンクッション上でＨＵＶＥＣ細胞がコンフルエンスに達した後、滅菌条件下でバイオリアクターは組み立てられる（パネルＣ）。一旦組み立てられれば、培地の流れが始まる。
（実施例３１：画像化システム）
複雑な生存しているシステムを理解するには、細胞およびそれらの３Ｄの微小環境の相互作用の全体的な理解が必要である。それらの細胞を理解するには、全ての機能的な単位、シグナル伝達分子、構造的な足場および遺伝物質の統合された理解が必要である。
画像化は、このような研究のための強力な統一型のツールである。詳細には、本発明のある実施形態では、共焦点顕微鏡および２光子蛍光が、ワクチン接種部位（ＶＳ）およびリンパ組織等価物（ＬＴＥ）を収容する透明なバイオリアクターに組み込まれてもよい。蛍光でタグ化されたマーカーの光学顕微鏡分析によって、タンパク質の位置および挙動に関して重要な情報、ならびにタンパク質間相互作用の多くの詳細を得ることができる。比較的低い解像度では、共焦点顕微鏡は、蛍光タグ化された遺伝子産物の３次元（３Ｄ）画像を生成して、細胞周期の種々の段階の間または種々の環境条件下での細胞における遺伝子産物の分布を決定し得る。このような情報によって、細胞および細胞小器官の生物学への洞察が可能になる。さらに、共焦点顕微鏡によって、従来の光学顕微鏡では達成できないＥＴＣの３Ｄ構造の分析が可能になる。この広範な目的は、できるだけ天然の器官に近い状態で細胞構成および一般的な細胞構築を可視化することである。１例として、共焦点顕微鏡を用いれば、ファイバー導波管がバイオリアクター中に組み込まれている、内蔵型の光学的に透明なバイオリアクターを用いてインビトロでＤＣ成熟状態を検討できる。
多くの生物学的プロセスをワクチン接種部位構築物において３Ｄで画像化する必要性がある。このために、ポリマーサンプルの３Ｄ共焦点画像化を、２光子励起蛍光を用いて行ってもよい。蛍光分子は、発光の前に同時に２光子を吸収し得る。この現象は、「２光子励起（ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）」と呼ばれる。従来の顕微鏡で２光子励起を用いれば、十分なバックグラウンドの却下、低い光損傷および深部識別を含む、生物学的サンプルを研究するためのいくつかの利点が得られる。励起源の比較的長い波長（例えば、モードロックされたＴｉ：サファイアレーザーからの７９８ｎｍ）を用いて、従来の単光子蛍光共焦点顕微鏡によって提供されるよりも３ＤのＥＴＣへのより大きい浸透深度を得ることができる。
２光子共焦点顕微鏡は、高度に有効な発蛍光団と組み合わせて、インビトロのワクチン接種部位（ＶＳ）およびＬＴＥの表面、界面および内部の寸法を研究するためのツールとして有用である。これによって種々のＤＣ活性の最適化を可能にするための、ＶＳに向かう、そしてＶＳ内の細胞運動性、細胞分化、および細胞成熟のような特徴を理解することを補助する診断情報を得ることができる。
いくつかのバイオマーカーは、このシステムにおけるモニタリングを目的とする。これらとしては、ＩＬ−１２（ＤＣが成熟した場合ＤＣによって分泌され：ＤＣの遊走を阻害する）、ＩＬ−４（Ｔｈ２様応答）、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＣＲ７（遊走性ケモカインレセプター）、ＩＬ−１β（免疫細胞によって分泌される炎症性化合物）、ＴＮＦ−αおよびＶＥＧＦ（マクロファージまたはＤＣへの単球分化の重要な修飾因子）が挙げられる。
（実施例３２：ＡＩＳデバイスの完全なデザイン）
ＡＩＳデバイスの例を図３８に例示する。このデバイスは、微小流体バイオリアクターと、内蔵光導波管を備えるＥＬＩＳＡチップと、デバイスを接続し交換を可能にするための微小流体バックプレーンと、外部ポンプおよびリザーバのための微小流体コネクターとを備える。このバイオリアクターは４つの外部ポートを有し、２つが各々組織構築物の上と下にある。３セットの２つのチャネルを有するＥＬＩＳＡチップが図示されるが、他の実施形態ではより多いチャネルが同じフットプリントに組み込まれる。各々のセットでは、１チャネルが１つのサンプルアッセイのためであり、その他はサンプルなしのコントロールである。各々のセットを同じＥＬＩＳＡインプットポートに接続し、これによって両方のチャネルを同時に調製することが可能になる；しかし、セット中の１つのチャネルのみがサンプルの液体に接続される。この液体は、微小流体バックプレーン中のチャネルを通じてバイオリアクターからＥＬＩＳＡチップにポンピングされる。バルブは、各々のチャネルへのサンプル液体の添加を制御する。光ファイバーを通じてＥＬＩＳＡチャネルに光をカップリングして、この伝達された光を検出器に接続された別のファイバーにカップリングさせる。この好ましい実施形態では、バイオリアクターおよびＥＬＩＳＡチップは両方とも、２光子および共焦点顕微鏡検査のために光学的に透明である。この好ましい実施形態では、本実施例における全体的なアセンブリのフットプリントは約５０×７５ｍｍである。
（実施例３３：磁石支援ＡＩＳ）
さらなる実施形態では、ＡＩＳの機能を、磁気マイクロビーズまたはナノビーズ（磁気支援ＡＩＳ、ＭａＡＩＳ）を用いて増強する。ＡＩＳによって、区画（血液、皮膚、リンパ節）の間の単球およびＤＣの輸送を説明することが可能になるので、ＡＩＳ中の免疫学的構築物へのそしてそれからの遊走のための生体模倣経路によって、ワクチンのデザインにおける新規な洞察およびＡＩＳの良好な予測力がもたらされる。２つの脈管ハイウェイは、ＶＳおよびリンパ管に対して単球を動かして、ＶＳからＬＴＥへ成熟ＤＣを動かす血液である。
バイオリアクター（それぞれＶＳおよびＬＴＥで供給源を有する）のフローループにおいて化学誘引物質を介して区画の間で導かれた単球およびＤＣの遊走は、インビボにおけるこれらの細胞の天然の輸送特性（「生体模倣（ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ）」溶液）を模倣する。別の実施形態では、磁気マイクロビーズおよび電磁場をＡＩＳの区画の間で細胞を直接動かす手段、「操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」溶液として用い得る。
磁気ビーズは、細胞分離、ソーティングおよびアッセイのためのツールとして一般に用いられており、ここではキャリア粒子は、詳細には、通常抗原抗体相互作用を介してまたはストレプトアビジンビオチンカップリングを用いて細胞に結合する。磁気ビーズは代表的には、親和性基がそれに共有結合され得る、生体適合性ポリマーでコーティングされた１〜５μｍの磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）または他の常磁性コアからなる。しかし、ＤＹＮＡＬ（Ｎｏｒｗａｙ）の製品は、細孔の内側の磁気物質のインサイチュの形成によって磁化されるマクロ多孔性ポリスチレン粒子である（Ｓａｆａｒｉｋ ＆ Ｓａｆａｒｉｋｏｖａ Ｒｅｖ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ ７２２：３３〜５３（１９９９）；ＤＹＮＡＬ（Ｎｏｒｗａｙ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｙｎａｌｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）。ミクロンサイズの磁気粒子はそれらの強磁性を無効にし（すなわち、磁場の除去後、磁化を保持する能力）、そのためビーズは集合しない。
これらの常磁性ビーズの局在化および分離は、単純かつ明快である；これには適度な磁場、代表的には数百から数千ガウス、そして容易に獲得可能な磁場勾配で十分である（ＤＹＮＡＬ（Ｎｏｒｗａｙ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｙｎａｌｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）。ストレプトアビジン、プロテインＡおよび他の結合基と同様に、種々の抗体と接続された多くのタイプの磁気ビーズ表面が市販されている（Ｓａｆａｒｉｋ ＆ Ｓａｆａｒｉｋｏｖａ，Ｒｅｖ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ ７２２：３３〜５３（１９９９）；ＤＹＮＡＬ（Ｎｏｒｗａｙ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｙｎａｌｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）；ＡＧＯＷＡ ＧＭＢＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｏｗａ．ｄｅ／ｓｔｒｕｋｔｕｒ／ｍａｇｎｅｔｉｃｂａｓｉｓ．ｈｔｍｌ）。閉じられたプールにアセンブリした場合、ビーズは尖った磁石の動きによって水溶液中で容易に輸送され得る。これらの特徴によって磁気ビーズは、マイクロバイオリアクターにおいて種々のタスク、例えば、適切な表面マーカー（レセプター；エピトープ）を有する細胞の選択を行うこと；１つの領域から別の領域へ選択された細胞を遊走すること；そして細胞を他の細胞を含む所望の環境と接触させることが可能になる。化学的および生物学的な分析および合成において、輸送磁場および他の場の使用によって制御されるビーズは、現在Ｏｅｓｔｅｒｇａａｒｄ ＆ Ｂａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ（１９９９）ＷＯ国際特許出願第ＷＯ９９／４９３１９に詳細に説明されている。このアプローチは、さらなる工程をとり得る。本発明の別の実施形態では、ビーズ輸送は、ＡＩＳのデザインで行なわれ得る。
このさらなる実施形態では、この磁石支援ＡＩＳは、以下の重要な特徴を含む：
１．インビトロのデバイスは、単一のユニットであって、好ましくは平坦で、その主要な要素は単独の隔離された容積に位置する単一ユニットのままである。
２．ほとんどの利用可能な容積は依然として、必要な栄養、シグナル分子およびガスを含む培地で充填されて、定期的に再循環される。
３．ほとんどの細胞輸送は、ビヒクルとして用いられる特定のビーズで指向される（細胞の無作為な移動は大きく減少される）。
４．ビーズは、先鋭な永久磁石または電磁石を用いて、好ましくはＭａＡＩＳ構築物における平面の上部プレートの底部表面に沿って動かされる。
５．主なシグナル伝達および活性化分子、例えば、ケモカイン、成熟シグナル、抗原は、所望の場合、制御された方式で特別なビーズによって細胞に送達され得る。
６．磁気輸送の事象の順序および経路は、コンピューターによって制御され得る。
ＭａＡＩＳバイオリアクターは、「生体模倣」ＡＩＳシステムの発展である。ある実施形態では、この構築物は透明で平坦な２プレートサンドイッチである。底部のプレートはＶＳおよびＬＴＥの部位に特異的な領域を保有する。これらの後者のエレメントは、底部プレート中で平坦なくぼみとして加工され、好ましくは、例えば、バイオコンクリート成分、組織化されたＰＣＬメッシュおよびマトリックス（ＥＣＭ；適切な物質としてはコラーゲン、フィブリン塊、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔが挙げられる）で充填されてもよい。このプレートは、磁気ビーズの送達および／または排除のための特別なポートを有する。このビーズは、ＢＡＴにおけるものと同様のコンピューター制御沈着ヘッドによりポートにもたらされ得る。このプレートは、メディアフローを提供する再循環チャネルを有する。システムが用いられ得る方法は、図３９に模式的に図示される。
ＤＣは、磁気ビーズに結合されて、成熟過程が完了したときだけ動かされ得る。これは、成熟ＤＣ表面マーカー（例えば、ヒト細胞におけるＣＤ８３であって、これは市販されている）に対する抗体で機能化されたマイクロビーズを用いて達成され得る。
抗原取り込み後にＶＳを励起する細胞の成熟ＤＣ特異的標識を可能にするために、ＤＣ成熟の際に上方制御されたマーカーに対する抗体で機能化された磁気粒子を用いてもよい（例えば、ＣＤ８３（ヒト細胞中）、ＣＤ８０およびＣＤ８６を含む）。別の実施形態では、汎ＤＣマーカー、例えばＣＤ１１ｃは、ＶＳ内皮をＡＩＳバイオリアクター経路へ出る全てのＤＣ（成熟または未成熟）を輸送するために用いられ得る。
磁気ビーズはまた、ＡＩＳの液体チャネルにおいて細胞移動を容易にする、非特異的な原動力として用いられ得る。液体チャネルの断面を部分的にまたは実質的に充填するのに十分な多さの磁気ビーズの集合体は、液体チャネルの循環ルートの周囲を移動するようにコンピューター制御された磁石によって強制され得、これによってそれらにそって任意の粒子状物体を動かす。ビーズが生体適合性物質でコーティングされ、かつそれらの動きの速度が十分に遅ければ（低レイノルズ数）、それらは細胞との衝突を介して細胞の動きを損傷なしに補助し得る（図４２）。ある場合には、細胞上の特異的なレセプターが関与せず、細胞状態を調節するリスクを最小化するので、この種類の輸送が好ましいかもしれない。
（実施例３４：ＡＩＳ機能の迅速なインサイチュの読み取りのための磁気ビーズに基づくＥＬＩＳＡ）
ＡＩＳにおいて評価されるべき免疫応答の少なくとも２つのパラメーターがある：活性化されたＢ細胞によって産生された特定の抗体の力価、ならびに活性化されたヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の総量および比（すなわち、ＣＤ４／ＣＤ８応答）。ある実施形態では、磁気ビーズをまた、この段階で用いて、迅速で、コンピューター制御され、そして磁気作動されるアッセイを得てもよい。
１９９０年代初期に導入された（Ｌｕｋ ＆ Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１３７：１〜８（１９９１）；Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４８，１〜８（１９９２））、いわゆる免疫磁気分離（Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）ＥＬＩＳＡ（ＩＭＳ−ＥＬＩＳＡ）は、近年注目を浴びており、現在速くかつ鋭敏なイムノアッセイ法である（Ｃｈｏｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５５：１５〜２２（２００１）；Ｋｏｕｒｉｌｏｖ ＆ Ｓｔｅｉｎｉｔｚ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：１６６〜１７０（２００２））。例えば、Ｋｏｕｒｉｌｏｖ ＆ Ｓｔｅｉｎｉｔｚは、決定されるべき抗体の結合のための固相プラットフォームとして、慣習的なＥＬＩＳＡプレートの代わりに磁気ビーズを用いた（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：１６６〜１７０（２００２））。一次抗体に対して惹起され、例えば、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼでタグ化された二次抗体を用いて、一次標的を滴定した。この一般的なスキームによって、可能性として完全に自動化された、手軽なマイクロスケールの方式で、ＡＩＳデバイスにおいてアッセイを行うための機構が得られる。
（実施例３５：食作用）
食作用は報告によれば、該当の粒子のサイズおよび表面特性に依存する。一般には、マイクロ粒子は約１〜約３μｍのサイズ範囲において、さらに疎水性であるものであり；そして正の表面電荷を保有するマイクロ粒子は、囲まれる可能性が最も高いものである。約５μｍより大きいかまたは約１μｍより小さい粒子、親水性の高い粒子、そして負に荷電された表面を保有する粒子は、ＤＣによって容易に囲まれない（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．１９０：１１８〜１３３（１９９８））。結果として、大きく適切にコーティングされた粒子を用いて、食作用を最小化するか、または効率的に停止し得る。ＤＹＮＡＬ（Ｎｏｒｗａｙ）によって生成された最大のＤｙｎａｂｅａｄ粒子は約５μｍである（Ｓａｆａｒｉｋ ＆ Ｓａｆａｒｉｋｏｖａ，Ｒｅｖ．Ｊ，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ７２２：３３〜５３（１９９９）；ＤＹＮＡＬ（Ｎｏｒｗａｙ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｙｎａｌｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）。かなり大きいビーズ（１０μｍ以上）が、例えば、ＡＧＯＷＡ（ＡＧＯＷＡ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｇｏｗａ．ｄｅ／ｓｔｒｕｋｔｕｒ／ｍａｇｎｅｔｉｃｂａｓｉｓ．ｈｔｍｌ）から入手可能である。Ｄｙｎａｌ生成物に構造的に似ている、それより大きい磁気ビーズでさえ、キトサンから合成され得る（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ ＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５〜２５２，（１９９８））。図４１は、種々のタイプおよびサイズの細胞に結合されたＭ４５０ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを図示する。成熟ＤＣはほぼ、図の右側に捕捉された腫瘍細胞のサイズ、約３０〜３５μｍである（Ｓｉｅｂｅｎら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ）。結果として、約２０μｍ以上のサイズだとしたらそのビーズをそれらが食菌し得ると期待することは困難である。図５６は、単球による微小粒子の食作用を示す。
食作用はまた、ＡＩＳのＶＳの温度を４℃に一時的に減少させることによって最小化され得る。これは、例えば、ミニチュア熱電性エレメントを用いて達成され得る。
本発明の別の実施形態では、食作用が生じさせられ得、次いで内部移行された細胞特異的な磁気ナノ粒子／マイクロ粒子を有する細胞が、磁石を用いて動かされ得る。Ｄｙｎａｌ（Ｎｏｒｗａｙ）によって、そして他の製造業者によって作成される磁気ビーズは、ビーズの最小成分として磁気物質を含む；重量の８０％以上、従って、容積の９０％より多くが、生体適合性物質で占有される（Ｓａｆａｒｉｋ ＆ Ｓａｆａｒｉｋｏｖａ，Ｒｅｖ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ｂ ７２２：３３〜５３（１９９９）；ＤＹＮＡＬ（Ｎｏｒｗａｙ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｙｎａｌｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／）；Ｄｅｎｋｂａｓら、Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ５０：２２５〜２３２（２００２））、これは、ビーズの他の有用な特性の消失なしに生分解性にされ得る。磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）は生体適合性である。
（実施例３６：ＡＩＳの刺激物質）
ＡＩＳのデザインによって、インフルエンザ、ＣＭＶまたは破傷風毒素を含む、共通の病原体またはワクチン由来のペプチドまたはタンパク質の導入が可能になる。このような抗原は、インビトロのＶＳに直接注入されてもよい。さらに、生得的な免疫系の種々のアジュバントまたは刺激物質を導入して、樹状細胞および他の細胞が活性化されるように誘発させ、そして次にＴ応答およびＢ応答を誘導してもよい。
（実施例３７：ＡＩＳにおける免疫応答の測定）
ＤＣ後、Ｔ細胞およびＢ細胞を約１〜約７日間相互作用させて、細胞をＬＴＥから抽出させてそれらの特性を詳細に評価し得る。さらに、ＬＴＥおよびＶＳの液相をサンプリングして、抗体の力価およびサイトカイン／ケモカインのレベルを測定してもよい。
（ａ）Ｔ細胞：抗原特異的なＴ細胞活性化を計測するための好ましい直接法は、テトラマー染色である。ＡＩＳが、利用可能なテトラマー（例えば、インフルエンザ応答のためのＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ＭＰペプチド）がある規定のＨＬＡタイプの細胞で占められる場合、抗原特異的応答を定量するためにテトラマー技術が用いられ得る（Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１１８２〜１１９０（２０００）；Ｄａｎｋｅ ＆ Ｋｗｏｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：３１６３〜３１６９（２００３））。次いでＴ細胞は、適切なＭＨＣクラスＩまたはＩＩテトラマーを用いて染色され得る。さらに、それらは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のエフェクター機能を評価するために、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４）に関して細胞内で同時染色されてもよい。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞はさらに、同じペプチドでパルスされた標的細胞を溶解する能力について試験され得る。
会合するテトラマー染色試薬が利用できない抗原については、伝統的な再刺激アプローチを用いて、例えば、抗原パルスされた同系の樹状細胞に対する応答において［３Ｈ］チミジン取り込みを探すことによって、抗原特異的Ｔ細胞における増大について試験し得る。さらに、サイトカイン産生は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴおよび細胞内染色、および標準的な標的溶解方法によるＣＴＬ溶解によって測定され得る。Ｔ細胞増殖を研究するために用いられ得るさらに一般的な方法は、ＣＦＳＥ色素でインプットＴ細胞を染色することであり、これによって、フローサイトメトリーを用いてＣＦＳＥ希釈を測定することによる細胞分裂の定量が可能になる（Ｈａｓｂｏｌｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７７：５１６〜５２２（１９９９））。
（ｂ）Ｂ細胞：平行して、人工的な免疫系の「血清（ｓｅｒｕｍ）」または体液におけるＢ細胞応答および抗体力価が測定され得る
（ｃ）樹状細胞：樹状細胞は、免疫のおよそ数時間からおよそ数日後に単離されて、例えば、生存度、成熟マーカー発現および機能について試験され得る。ＤＣは、内部ワクチン刺激に依存して、それらの特性を変化すると予測される。
（ｄ）サイトカインおよびケモカイン。ワクチンの有効性を計測するために、ワクチン作用のカスケードの間に存在する重要なサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２を含む）およびケモカイン（ＥＬＣ、ＢＬＣを含む）のレベルを評価することも重要である。
（実施例３８：ワクチン特異的な抗体の滴定）
ＬＴＥ中で培養されたＢ細胞は、試験されたワクチンによるＡＩＳデバイスの免疫に応答して抗体（Ａｂｓ）を産生すると期待される。免疫の抗原（例えば、オボアルブミン）でタグ化された磁気ビーズは、これらの抗体に結合するはずである。一次Ａｂｓに対して惹起されて、酵素または蛍光のレポーティング基でタグ化された二次抗体を用いて、伝統的なＥＬＩＳＡサンドイッチを形成し得、これによって一次Ａｂｓのレベルの決定が可能になる（図４３）。
（実施例３９：ＣＤ４／ＣＤ８ Ｔ細胞の滴定）
Ｔ細胞上のＣＤ４＋およびＣＤ８＋マーカーの出現は、それらのＤＣ誘導性活性化の結果判定法である。ＣＤ４／ＣＤ８アッセイのためのＩＭＳ−ＥＬＩＳＡサンドイッチスキームを使用するために、活性化されたＴ細胞を磁気ビーズに対して固定することが重要である；これは、ＣＤ３またはＣＤ２活性化マーカーを用いて達成され得る。しかし、これらのマーカーに対する抗体の結合自体が代表的には、Ｔ細胞活性の評価では望ましくないＴ細胞の活性化を開始することが公知である。他方では、ＣＤ３に対するＡｂ固定を介してＴ細胞を活性化するのに必要な期間は、約２〜４日間である（Ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／ａｐｐｌｓ／ＡＣ１４５．ｈｔｍ＃ｈｕｍａｎ））のＴ細胞の抗ＣＤ３活性化のプロトコール）。結果として、有意に短い時間で行われたアッセイでもやはり情報としてためになるようである。ＣＤ２またはＣＤ３に対するビーズの結合を介して形成された磁気ビーズ／Ｔ細胞結合体は、特定の標識で、好ましくは蛍光基でタグ化された抗ＣＤ４および抗ＣＤ８抗体のための標的である（図４４）。
一般には、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性の、より洗練されかつ慣用的でない多数の標的の評価は、磁気ビーズおよびサンドイッチＥＬＩＳＡ技術の補助によってＡＩＳデバイスについて行なわれ得る。
（実施例４０：迅速なワクチン評価：ワクチンを評価するためにＡＩＳが用いられる方法）
例えば、生物戦争剤（ｂｉｏｗａｒｆａｒｅ ａｇｅｎｔｓ）、新興の感染性疾患、および現在の世界的な蔓延についてヒトワクチンの評価のためのさらに正確なインビトロのモデルが呈示される。以下の例は、ＡＩＳが、ワクチンおよび他の免疫療法の有効性および機構を評価するために用いられ得る方法を例示している。
伝統的なワクチン処方は、免疫原性およびアジュバント活性は保存されているままで、感染性および病原性の影響を減じるためのウイルスまたは細菌の株の弱毒化で開始する。従ってワクチンの重要な特徴は、中和抗体のため、およびＣＴＬ応答のための標的の抗原性エピトープならびに強力なＢ細胞およびＴ細胞免疫応答を刺激するためのアジュバント活性を提供することである。しかし、最適なエピトープまたはアジュバントを確実に設計するための公式はない；多くは経験的なままである。ＡＩＳは、ワクチンの有効性における律速段階を発見すること、ならびに改良されたワクチンのデザインおよび処方物を得るためのデータを得ることを補助し得る。
ＡＩＳの使用は、ヒト免疫応答の抗原送達およびアジュバント刺激のための最適の方法を見出すワクチン処方物の迅速なスクリーニングにある。詳細には、ＡＩＳでは、ワクチンの有効性は、さらに生理学的な状況で試験され得、これによって、現在試験中の方法論の予測力を上回る改善が得られる。ワクチンのライフサイクルの各段階でのワクチンの活性が測定され得、これによってどの工程がワクチンの成功および失敗に重要であるかを決定することが補助される。
ＡＩＳを用いれば、組織培養皿または非ヒト動物で見出されるさらに生理学的な環境の状況でＴ細胞およびＢ細胞刺激を定量的に評価することが可能である。詳細には以下である：
１．ＤＣ、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋ＴおよびＢ細胞を会合させるためのＬＴＥ中の場所を提供することによって、候補ワクチンがＣＴＬおよびＢ細胞応答を誘導するためのＴ細胞の補助の最適のレベルを促進するか否かが決定され得る；
２．ＤＣ、Ｔ細胞およびＢ細胞を、細胞外マトリックスおよび支持細胞を有する３Ｄ環境で会合させることを可能にさせることによって、ＬＴＥはさらに現実的に、細胞のこの三つ組みがインビボで相互作用するリンパ節の環境を模倣する；
３．単球およびＤＣは、再循環および遊出の間に内皮細胞と相互作用するということを内皮の包含で確実にさせる；これらの相互作用には、免疫および内皮細胞の表面上の特定のタンパク質であって、そのいくつかがワクチン候補物に対して感受性であり得、従ってヒトでのワクチン有効性に影響し得るタンパク質の発現を要する；そして
４．さらに代表的な細胞の集団の存在、ならびに局所の組織シグナルに応答して内皮を横切って遊走し、分化するはずである細胞の存在は、さらに正確な結果をもたらす（例えば、ＴＬＲ９（トール様レセプター９）リガンド対ＴＬＲ４リガンドの効果を識別することができる、なぜならそれらは２Ｄ培養物には存在し得ない、そしてマウスにおいてそれらのＴｌｒ発現が相違していることが公知である複数のＤＣサブタイプで示差的に発現されるからである（Ｋａｄｏｗａｋｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：８６３〜８６９（２００１））。
本発明のＡＩＳは、さらに正確な読み取りを可能にする。なぜなら、ＡＩＳは、種々の細胞タイプの代表的な分布、代表的な細胞間相互作用の機会、生きている組織での細胞を模倣する細胞の基礎的な活性化状態、ならびに細胞の挙動および機能を支持するためのさらに自然な３Ｄの細胞外マトリックスを含むからである。
ＡＩＳは、ＶＳにおける応答の多くの重要な早期かつ正確なパラメーター、ならびにＬＴＥにおける応答の後期のパラメーターの測定を可能にする。このような測定は、ヒト臨床トライアルにおいてはほとんど行うことが不能である。多くのパラメーターを測定する能力によって、ワクチン候補物の間で異なる工程の特定が可能になり、そしてワクチン候補物の合理的な変化および最適化が可能になる。ＡＩＳで行なわれ得る測定としては、以下が挙げられる：
１．単球補充；
２．ＤＣサブタイプの分化；
３．ＤＣ抗原ローディング；
４．ＤＣ成熟；
５．ＤＣ遊出；
６．内皮の活性化および機能；
７．リンパ節に到達するＤＣの反応速度論および数；
８．Ｔ細胞とＤＣとの間の相互作用の有効性；
９．Ｂ細胞とＤＣとの間の相互作用の有効性；
１０．Ｔ細胞とＢ細胞とＤＣとの間の相互作用の有効性；ならびに
１１．Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化状態。
ワクチン候補物の間の有効性の相違は、ワクチン候補物がこれらまたは他の工程のうちのいずれか１つを調節する示差的な能力に起因し得る。首尾よいワクチンおよび失敗したワクチンで異なる工程の特定によって、ワクチンがどのように機能するかというさらに合理的なモデルが可能になる。
例えば、図４５は、インビトロおよびインビボのモデルの両方における単球移入でのＣＣＲ８の役割を示す。パネルＡおよびＣでは、単球は、Ｉ型コラーゲンゲルで４８時間増殖された内皮細胞で同時培養され、これによってこの集団の、内皮下層に残る逆遊出ＤＣまたはマクロファージへの分離が可能になる。単球が先端から基部の方向で内皮を横断するアッセイ期間の間の中和抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ３Ｂ１０の包含は、効果がない（パネルＡ）が、３Ｂ１０抗ＣＣＲ８ ｍＡｂおよび抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ５Ｂ１１は、５つを超える独立した実験で逆遊出を有意に阻害した（パネルＣ）。パネルＢおよびＤでは、緑色蛍光ラテックスマイクロスフェアを、ＣＣＲ８欠損マウスの皮膚に注射して、これを年齢および性別のマッチした野性型Ｃ５７ＢＬ／６の対応マウスと比較した。この方法は、流入領域リンパ節に抗原を提示するＤＣへの単球の変換を追跡する。ゲートのない（ｕｎｇａｔｅｄ）１日目の皮膚分析によって、注射部位から回収された細胞懸濁物が示される。蛍光ラテックスは、野性型およびＣＣＲ８ノックアウトマウスの両方における浸潤している単球の集団に見出される。流入領域リンパ節に２つ以上のラテックス粒子を保有するＤＣの数を、３日後に定量した。種々の実験からのデータを合わせるために、野性型マウスで遊走した細胞の平均数は、各々の実験について１．０に等しく設定し、そしてその実験における全ての野性型およびノックアウト個体についての相対的な値を算出した。リンパ節ドットプロットによって、野性型およびＣＣＲ８−／−マウスのリンパ節および皮膚におけるＭＨＣ ＩＩ（Ｉ−Ａｂ）およびＧｒ−１のレベルが示される。これらは定量的な比較である。なぜなら、それらは、個々のマウス由来のプールされた上腕リンパ節から回収されたラテックス保有細胞の全体的な集団を示すからである。
（実施例４１：バイオリアクターとしてのＡＩＳの利用）
本発明のある実施形態では、アセンブルされたＬＴＥを、種々の所望の生体分子（例えば、サイトカイン、タンパク質、抗体）を生合成する「バイオファクトリー（ｂｉｏｆａｃｔｏｒｙ）」として用いる。例えば、抗原がＢ細胞に提示される場合、それらのＢ細胞はＬＴＥ中で抗体を生成し得る。潜在的に、生成された抗体はまた、Ｂ細胞のレパートリーおよびこのペプチドがＢ細胞にどのように提示されるかに依存してモノクローナルであってもよい。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、基本的な生物医学研究において、疾患の診断において、そして感染およびガンのような疾病の処置において広く用いられる。抗体は、多くの研究者らによって、彼らの研究において用いられる重要なツールであり、多くの医学上の進歩をもたらしている。
（実施例４２：逆オパール足場におけるＴ細胞運動誘導）
とりわけ天然のＴ細胞遊走、接着分子およびケモカインに影響する多様な要因は、有意な役割を果たし、そして逆オパールヒドロゲルＬＴＥにおけるこれらの要因の正確なバランスの包含によって、インビボの細胞遊走と量的に同様のナイーブなＴ細胞運動が刺激されることが可能になる。１例として、蛍光的に標識された、成熟マウス樹状細胞（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１６９３（１９９２）の方法によってＣ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から生成され、そしてＬＰＳを用いた１２時間の処置によって成熟された）、そしてＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウスのリンパ節由来の標識されたナイーブなＣＤ４＋Ｔ細胞を、フィブロネクチンでコーティングされた逆オパール足場に加えた。成熟樹状細胞（例えば、ＣＣＬ１９）によって生成されたケモカイン、およびこれらの細胞の表面で発現された接着分子は、ナイーブなＴ細胞運動を促進することが想定される。コマ撮りの３Ｄビデオ顕微鏡検査を用いて２時間にわたって足場内で細胞の動態を記録した。Ｔ細胞は高度に活性であり、マウスリンパ節におけるＴ細胞遊走の生体内画像化研究によって観察された遊走挙動の「スタート−ストップ（ｓｔａｒｔ−ｓｔｏｐ）」遊走パターン連想が示された。図６１に示されるように、Ｔ細胞は、垂直（図６１Ａ）および水平（図６１Ｂ）の両方で、足場内の樹状細胞の表面にわたって空隙から空隙へ遊走し得る。細胞の通路および速度の定量（図６２）によって、細胞が、ナイーブなＴ細胞についてインビボで報告された値に達する４．６μｍ／分の平均速度で動いたこと、そしてＴ細胞がインビボで示されるように、最大３０μｍ／分までの速度の最大の「バースト（ｂｕｒｓｔｓ）」を有したことが示された。ナイーブなＴ細胞は単独で、逆オパール足場においてリンパ節様の密度では、極性化も遊走もできず（図６３）、これによって、細胞遊走を刺激するためにさらに完全なリンパ微小環境を必要とすることが示される。
（実施例４３：ヘパリン飽和されたＣｙｔｏｐｏｒｅの吸着能）
Ｃｙｔｏｐｏｒｅアリコート（０．４ｍｌ、堅く沈降した）をヘパリンで処理して、徹底的に洗浄し、種々の濃度のＢＬＣを含む３ｍｌ ＰＢＳ／ＢＳＡ中でインキュベートして洗浄した。後に、溶液中に残るＢＬＣおよびＣｙｔｏｐｏｒｅ／ヘパリンによって吸着されたＢＬＣを別々に決定した。図６７に示されるとおり、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ／ヘパリンの吸着曲線は十分に直線で出現した。結果として、用いられた条件は、ＢＬＣケモカインによるＣｙｔｏｐｏｒｅの飽和とはかなり離れているようであった。これによって上記のようにヘパリンで飽和されたＣｙｔｏｐｏｒｅが潜在的に、本実施例の実験においてよりもケモカインのかなり高い（約１０倍以上）の負荷を担持し得ることが示唆される。
（実施例４４：ＬＴＥにおけるＴおよびＢの相互作用の反応速度論的なインシリコモデリング）
図５７に示されるように、Ｂ細胞およびＴ細胞を、ランダムウォークする能力を与えられた物体として２Ｄ空間でモデル化して、お互いと特定の時間、物理的に接触させた。合理的に高濃度で、例えば約３×１０７細胞／ｍｌで、周囲をランダムウォークするＢ細胞およびＴ細胞の自己集中の中心としてマイクロキャリアを含むＬＴＥモデルは、無作為に分布され同時培養されたＢ細胞およびＴ細胞のモデルに対して利点を有することが見出された：Ｔ細胞は、ＬＴＥモデルにおいてＢ細胞と接触するのに十分に高い確率を有した。この利点は細胞濃度をさらに増大させることで徐々に減少し、細胞の濃密なスラリーに対応する約３×１０８細胞／ｍｌの濃度ではごくわずかになる（図５７）。この計算結果は、濃縮されたＢ細胞（天然のリンパ節の胚中心を模倣する）およびルーズに遊走しているＴ細胞の領域を含むＬＴＥデザインを支持する状況証拠であるとみなされる。
上記の説明は、本発明を実施する方法を当業者に教示する目的であり、本説明を読めば当業者には明白になるものの明白な改変および変形の全てを詳述するものではない。しかし、このような明白な改変および変形の全てが、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれることが意図される。この特許請求の範囲は、文脈が特に逆を示すのでない限り、意図される目的を満たすのに有効である任意の順序で、特許請求された成分および工程を包含することが意図される。
図１（Ａ）は、ＬＴＥの模式図であって、ここではＴ細胞およびＢ細胞が、マイクロキャリア上で一緒に培養され、次いで多孔性の容器に移される。 図１（Ｂ）は、ＬＴＥの模式図であって、ここではＴ細胞およびＢ細胞が、別々のマイクロキャリア上で培養され、次いで多孔性の容器で一緒にされる。 図１（Ｃ）は、ＬＴＥの模式図であって、ここでは別々のＴ細胞およびＢ細胞マイクロキャリアが、別々のマイクロキャリア上で培養され、次いで別々の区画を有する多孔性の容器で一緒にされる。 図１（Ｄ）は、結合リガンドとしてＣＸＣ１３リガンドを有するマイクロキャリアに対するＴ細胞およびＢ細胞の結合を示す模式図である。 図１（Ｅ）は、マイクロキャリアの間の多孔性および開口に対するマイクロキャリア粒子のサイズの影響を図示する。 図２は、本発明のＡＩＳがどのように機能するかを図示する。 図３は、ワクチン接種部位（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ＶＳ）の模式図である。 図４は、人工的なリンパ組織（またはリンパ組織等価物）の模式図である。 図５。インビトロの免疫系集合体の模式図。 図６Ａは、蛍光色素標識したｆＭＬＰケモカイン（単球および未成熟のＤＣの化学誘引物質）をカプセル化するマイクロスフェアの顕微鏡写真例である。 図６Ｂは、ペプチドケモカイン（ｆＭＬＰ）および１０ｋＤａのケモカイン（ＭＩＰ−３α）についてのインビトロでの放出の反応速度論を示す図である。 図７Ａ〜７Ｄは、単球および樹状細胞の走化性のインビトロの制御を実証する。図７Ａは、実験デザインの模式図である。 図７Ａ〜７Ｄは、単球および樹状細胞の走化性のインビトロの制御を実証する。図７Ｂは、ケモカインの非存在下における単球由来ＤＣの動きを示す。 図７Ａ〜７Ｄは、単球および樹状細胞の走化性のインビトロの制御を実証する。図７Ｃは、ワクチン接種部位の供給源のウェルに向かう、それぞれ単球由来のＤＣおよび単球の動きを示す。 図７Ａ〜７Ｄは、単球および樹状細胞の走化性のインビトロの制御を実証する。図７Ｄは、ワクチン接種部位の供給源のウェルに向かう、それぞれ単球由来のＤＣおよび単球の動きを示す。 図８Ａは、リンパ組織等価物（ＬＴＥ）マトリックスにおける細胞発達を示す写真である。合成の逆オパールヒドロゲル足場を合成し、この足場は、Ｔ細胞遊走およびＢ細胞との相互作用（図８Ａ）、ならびに高い細胞密度の接着および増殖を支持し、このことはリンパ節の微小環境を模倣するのにおける重要な特徴である（図８Ｂ）。 図８Ｂは、リンパ組織等価物（ＬＴＥ）マトリックスにおける細胞発達を示す写真である。合成の逆オパールヒドロゲル足場を合成し、この足場は、Ｔ細胞遊走およびＢ細胞との相互作用（図８Ａ）、ならびに高い細胞密度の接着および増殖を支持し、このことはリンパ節の微小環境を模倣するのにおける重要な特徴である（図８Ｂ）。 図９は、デジタル印刷されたリンパ節の模型（左側パネル）および脈管の網状画像（右側パネル）を示す。 図１０Ａ〜図１０Ｃは、人工的免疫系における抗原呈示細胞の挙動を示す。図１０Ａは、フィブロネクチンでコートしたコラーゲンの３Ｄ構築物上で増殖された血管内皮細胞の写真を示す。 図１０Ａ〜図１０Ｃは、人工的免疫系における抗原呈示細胞の挙動を示す。図１０Ｂは、このような３Ｄ培養物における単球の挙動の段階を示す模式図である。 図１０Ａ〜図１０Ｃは、人工的免疫系における抗原呈示細胞の挙動を示す。図１０Ｃは、インフルエンザに以前に感染した成人由来のＴ細胞における想起応答の間のＩＦＮγ誘導および増大の活性化を測定するために、単球がインフルエンザで感染され得るという実証を示す。 図１１は、ワクチン接種部位（ＶＳ）の３Ｄモデルを示す模式図である。 図１２は、実施例６の方法を用いて調製された多孔性の足場の写真である。 図１３は、実施例７の方法を用いて調製された多孔性の足場の写真である。 図１４は、実施例８の方法を用いて調製された多孔性の足場の写真である。 図１５は、ナイロンメッシュによって支持される多孔性のＰｒｏｔａｓａｎ／コラーゲン膜の底部（左側）および頂部（右側）の表面でのコンフルエントなＨＵＶＥＣ培養の写真を示す。 図１６は、多孔性のＰｒｏｔａｓａｎ／コラーゲンメッシュで支持された膜で増殖した両面のＨＵＶＥＣ培養を通じて遊走された単球を示す。左側：ＭＣＰ−１なしのチャンバの底の上の単球、両側ＨＵＶＥＣ培養の底面、膜への適用の３０分後。右側：ＭＣＰ−１ありでのチャンバの底の上の単球、、膜への適用の３０分後。 図１７は、ウシコラーゲンＩ型膜で増殖しているＨＵＶＥＣ培養物を示す写真である。 図１８は、コラーゲンメッシュで支持されたマトリックス上のＨＵＶＥＣ培養物に浸透したヒト単球を示す写真の組み合わせである。 図１９は、ステンレス鋼リングによって支持された合成および天然の膜の写真である。 図２０は、インビトロのワクチン接種部位の実施形態の模式図である。 図２１は、迅速ケモカイン試験系の模式的な図である。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、リンパ節の構造を示す。図２２Ａはリンパ節の模式図である。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、リンパ節の構造を示す。図２２Ｂはリンパ節の組織学的切片である；Ｂ細胞は青に染色され、そしてＴ細胞は褐色に染色されている［Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）（２０００）］。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ａは、コラーゲンクッション上のトルイジンブルー染色したＨＵＶＥＣ細胞の画像である。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ｂは、図２３Ａの高倍率である。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ｃは、ＨＵＶＥＣの層上に新しく加えられた高い密度の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を示す。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ｄは、ＰＢＭＣの適用の４５分後、コラーゲンマトリックス内のＨＵＶＥＣ細胞の下の焦点面を示す。焦点の細胞は、コラーゲン内であり、ＨＵＶＥＣと表面のＰＢＭＣとの間で容易に識別される。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ｅは、コラーゲンクッション内の細胞生存度および生きている細胞の位置を示すＣＭＦＤＡ標識の画像である。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ｆは、ザイモサン（Ｚｙｍｏｓａｎ）の有無におけるコラーゲンクッションへのＰＢＭＣの遊出を示す。位相差およびＣＭＦＤＡ標識を行ってクッション内の細胞の位置を確認した。クッション全体を通じてＺ−スタック画像をとり、このクッション内の細胞数および遊出を受けていた細胞の数を確認した。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ｇは、ザイモサンなしのクッションと比較した、ザイモサンの存在下のクッション中に残っていた遊出された細胞数の増大を示す。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ｈは、ザイモサンの存在下対ザイモサンなしでの浸透の深さの比較である。 図２３Ａ〜２３Ｉは、コラーゲンクッション上のＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真である。図２３Ｉは、この実験デザインの模式図である。 図２４Ａ〜２４Ｃは、リンパ節のＴゾーンの組織化を示す。図２４Ａは、全体的なリンパ節構造の模式図およびＴゾーンにおけるＥＣＭ構造の走査電子顕微鏡写真を示す（Ｇｒｅｔｚら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５６：１１〜２４，（１９９７））。 図２４Ａ〜２４Ｃは、リンパ節のＴゾーンの組織化を示す。図２４Ｂは、網状の網目状構造を裏打ちしている間質細胞の共焦点免疫蛍光画像である（Ｇｒｅｔｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１４２５〜１４４０、（２０００））。この網目状構造の膠原線維は赤に染色されるが、細網線維芽細胞は緑に染色される。 図２４Ａ〜２４Ｃは、リンパ節のＴゾーンの組織化を示す。図２４Ｃは、インビトロのＩ型コラーゲンゲルにおける線維の組織化を示す（Ｋａｌｄｊｉａｎら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１２４３〜１２５３，（２００１）；Ｆｒｉｅｄｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：２３３１〜２３４３（１９９８））。 図２５は、リンパ節におけるＢ細胞活性化のモデルを示す（Ｂａｕｍｇａｒｔｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７６：１７１〜１８０，（２０００）より）。 図２６は、インビトロモデルの免疫系のための可能性のあるＨＥＶモデルを示す。ＨＥＶ表面の平面における別々の単層は、ＬＴＥに対する別のアクセスポイントを提供するようにリンパ管の内皮から構成される。 図２７Ａ〜図２７Ｃは、リンパ組織等価物のマトリックスのデザインを示す。（Ａ）ＬＴＥについての規則的な足場を製造するためのアプローチ。 図２７Ａ〜図２７Ｃは、リンパ組織等価物のマトリックスのデザインを示す。（Ｂ）ヒドロゲル足場の高度に規則的な性質を示す明視野顕微鏡写真の例（培地中においてインサイチュで観察されたいくつかの層を通して見たもの）。 図２７Ａ〜図２７Ｃは、リンパ組織等価物のマトリックスのデザインを示す。（Ｃ）マトリックスの表面の生体機能化のための化学。右側に示したのは、ＦＩＴＣ標識したフィブロネクチンで機能化した足場の蛍光顕微鏡写真である。 図２８は、急速冷凍、凍結乾燥およびトリポリリン酸塩でのゲル化によってリンパのＥＣＭ（８０％（ｗ／ｗ））およびＰｒｏｔａｓａｎ（２０％（ｗ／ｗ））から製造されたマイクロビーズの画像を示す。 図２９（Ａ）は、Ｃｙｔｏｄｅｘ−１マイクロキャリア（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上のＢ細胞の画像、明視野顕微鏡写真（左側）および蛍光（右側）を示す。図２９（Ｂ）は、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ−１マイクロキャリア（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上のＴ細胞の画像、明視野顕微鏡写真（左側）および蛍光（右側）を示す。図２９（Ｃ）は、ＬＮ ＥＣＭ／Ｐｒｏｔａｓａｎのインハウス（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）マイクロキャリア上のＴ細胞の共焦点蛍光画像を示す。 図３０は、細胞外マトリックスの天然の成分であるヘパリンの構造を示す。ヘパリンは、硫酸塩およびカルボン酸基を保有する複数の五糖単位を含む；１単位あたりの平均電荷は２．３である。 図３１は、ヘパリン処理したＣｙｔｏｐｏｒｅが、ＢＬＣケモカイン（頂部）および急勾配の時間放出曲線（底部）について豊富な吸着能力を有することを示す。従って、これはＢ細胞および／またはＴ細胞について適切なキャリアである。 図３１は、ヘパリン処理したＣｙｔｏｐｏｒｅが、ＢＬＣケモカイン（頂部）および急勾配の時間放出曲線（底部）について豊富な吸着能力を有することを示す。従って、これはＢ細胞および／またはＴ細胞について適切なキャリアである。 図３２は、細網線維芽細胞株の誘導を示す。（Ａ）培養物中のＴゾーンＦＲＣのコンフルエントな単層の位相差顕微鏡写真。（Ｂ）ＦＲＣによるＣＤ４４およびＶＣＡＭ−１発現のフローサイトメトリー測定。（Ｃ）平坦なＲＧＤ−ＰＥＧヒドロゲル表面上のＦＲＣ増殖の顕微鏡写真。 図３３は、ニセのリンパ節を例示する。（Ａ）異種のマトリックスの直接印刷。デジタル印刷したニセの「リンパ節（ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）」構造の例。 図３３は、ニセのリンパ節を例示する。（Ｂ）リンパ球の局在化を維持するために共沈着された制御された放出マイクロスフェアを用いる、ＴゾーンおよびＢゾーンを有する異種ＬＴＥのデジタル印刷アセンブリの模式図。 図３４は、リンパ組織等価物（ＬＴＥ）を示す。（Ａ）インビボにおけるＴ細胞およびＢ細胞の領域の維持。 図３４は、リンパ組織等価物（ＬＴＥ）を示す。（Ｂ）ＭＩＰ−３β放出マイクロスフェアを介するＬＴＥのＴ細胞領域に対するＴ細胞ＤＣ局在化の模式図。 図３５は、インビトロの人工的な胸腺を作製する研究者らの試みによって報告されたのと同様の方式での天然のヒト間質細胞を用いてＬＴＥを「鋳型にする工程（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）」に関するさらなる実施形態を示す（Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：７２９〜７３４，（２０００））。 図３６はバイオリアクターの模式図である。 図３７は、積層に基づく挿入物を示しているが、より大型の圧延された管状のデザインが、図３６に図示されたデザインに組み込まれている。 図３８は、微小流体のバックプレーン上の光診断での例示的な微小流体バイオリアクターを示す。 図３９は、ＭａＡＩＳの実施形態を示す。 図４０は、レーザー装置を組み込んだ光導波路を示す：ｎ１は導波路のコアの屈折率を示し、ｎ２はクラッディング係数である。 図４１は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ４５０を用いて捕獲された細胞の画像を示す。左側：Ｔリンパ球（Ｓａｆａｒｉｋ＆Ｓａｆａｒｉｋｏｖａ，Ｒｅｖ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ，（１９９９）Ｂ，７２２：３３〜５３；ＤＹＮＡＬ（Ｎｏｒｗａｙ）より）；右側：ＭＣＦ−７乳癌細胞（Ｓｉｅｂｅｎら、より）。 図４２は、ＶＳからＬＴＥに細胞を動かすために用いられる「磁気ほうき（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｒｏｏｍ）」の模式図である。 図４３は、ＬＴＥ区画における抗体の磁気ビーズ支援ＥＬＩＳＡを示す模式図である。 図４４は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有する抗ＣＤ３磁気ビーズと、蛍光の抗ＣＤ４および抗ＣＤ８抗体との仮説的な超結合を示す模式図である。 図４５は、ＤＣ遊走におけるＣＣＲ８の役割を示す。ＣＣＲ８遊走のための役割。パネルＡおよびパネルＣは、抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ３Ｂ１０の有無における単球の遊走を示すグラフである。パネルＢおよびパネルＤは、ＣＣＲ８が欠失し、かつ年齢／性別の適合した野性型Ｃ５７ＢＬ／６対応物の皮膚へ注射された緑色蛍光ラテックスマイクロスフェアを用いる、インビボにおける単球のＤＣへの変換を示す。 図４５は、ＤＣ遊走におけるＣＣＲ８の役割を示す。ＣＣＲ８遊走のための役割。パネルＡおよびパネルＣは、抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ３Ｂ１０の有無における単球の遊走を示すグラフである。パネルＢおよびパネルＤは、ＣＣＲ８が欠失し、かつ年齢／性別の適合した野性型Ｃ５７ＢＬ／６対応物の皮膚へ注射された緑色蛍光ラテックスマイクロスフェアを用いる、インビボにおける単球のＤＣへの変換を示す。 図４５は、ＤＣ遊走におけるＣＣＲ８の役割を示す。ＣＣＲ８遊走のための役割。パネルＡおよびパネルＣは、抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ３Ｂ１０の有無における単球の遊走を示すグラフである。パネルＢおよびパネルＤは、ＣＣＲ８が欠失し、かつ年齢／性別の適合した野性型Ｃ５７ＢＬ／６対応物の皮膚へ注射された緑色蛍光ラテックスマイクロスフェアを用いる、インビボにおける単球のＤＣへの変換を示す。 図４５は、ＤＣ遊走におけるＣＣＲ８の役割を示す。ＣＣＲ８遊走のための役割。パネルＡおよびパネルＣは、抗ＣＣＲ８ ｍＡｂ ３Ｂ１０の有無における単球の遊走を示すグラフである。パネルＢおよびパネルＤは、ＣＣＲ８が欠失し、かつ年齢／性別の適合した野性型Ｃ５７ＢＬ／６対応物の皮膚へ注射された緑色蛍光ラテックスマイクロスフェアを用いる、インビボにおける単球のＤＣへの変換を示す。 図４６は、微量流体チャネルに組み込まれた超短パルスレーザーのマイクロマシンの平面的な光導波路の画像を示す。左側のパネル：光ファイバーのカップリングのためのテーパー状のポート。真ん中のパネル：平坦な導波路の微量流体チャネル交差点（電源オフ）。右側のパネル：平坦な導波路の微量流体チャネル交差点（電源オン、右側から入る）。 図４７は、羊膜の両側の内皮細胞の播種を示す写真の組み合わせである。パネルＡは、それぞれの内皮単層の免疫組織学的染色である。青＝内皮の核；緑＝コンフルエントな内皮接合部を特定するためのＣＤ３１染色；赤＝全ての細胞タイプおよび詳細には線維芽細胞におけるアクチン束を特定するための作用。いくつかの線維芽細胞は血管内皮の真下にみられる。 図４７は、羊膜の両側の内皮細胞の播種を示す写真の組み合わせである。パネルＢは、それぞれの内皮単層の免疫組織学的染色である。青＝内皮の核；緑＝コンフルエントな内皮接合部を特定するためのＣＤ３１染色；赤＝全ての細胞タイプおよび詳細には線維芽細胞におけるアクチン束を特定するための作用。いくつかの線維芽細胞は血管内皮の真下にみられる。 図４７は、羊膜の両側の内皮細胞の播種を示す写真の組み合わせである。パネルＣは、羊膜内の線維芽細胞の免疫組織学的染色である。 図４７は、羊膜の両側の内皮細胞の播種を示す写真の組み合わせである。パネルＤは、血管内皮を横切って、第二の内皮単層に向かって移動している単球の免疫組織学的染色である。 図４７は、羊膜の両側の内皮細胞の播種を示す写真の組み合わせである。パネルＥは内皮単層のヘマトキシリン染色である。 図４７は、羊膜の両側の内皮細胞の播種を示す写真の組み合わせである。パネルＦは、単球が第二の内皮単層に向かって羊膜に深く浸透していることを示す。 図４７は、羊膜の両側の内皮細胞の播種を示す写真の組み合わせである。パネルＧは、単球が第二の内皮単層に向かって羊膜に深く浸透していることを示す。 図４８は、マイクロマシン化された血管およびリンパ系路をＶＳおよびＬＴＥＥＴＣ（右側パネル）の真下の高い接触領域（左側パネル）で示す組み込まれたバイオリアクターの例の平面図である。 図４９は、ＡＩＳデバイスにおける直接の沈着の断面図を示す。種々の医用材料の構造が、人工的免疫系の構成として組み込まれてもよい（例えば、バイオコンクリート、逆ヒドロゲルオパール、コロイド粒子、ＥＣＭゲル、コラーゲンゲル、マイクロキャリア）。例えば、ポリマーのメッシュレバー（ｒｅｂａｒ）は、ＶＳおよびＬＴＥ領域の後退において直接、レーザーによって層沈着され得る。このようなデザインでは、ＤＭに鋭敏なポリアクリレート、ポリスチレンまたは別の透明なプラスチックからなるＡＩＳ単位の下のプレートを有して、メッシュラバーをプレートに結合させることが好ましい。この実施形態では、ＥＳＣ足場と同様の方式でＫＯＨを用いて表面をマイクロパターン化する。細胞の適用および動きのために十分な空間を残して、薄膜としてメッシュのスレッドをコーティングするために、全ての必要な栄養素およびサイトカインを保有するフィブリンゲルマトリックスを用い得る。 図４９は、ＡＩＳデバイスにおける直接の沈着の断面図を示す。種々の医用材料の構造が、人工的免疫系の構成として組み込まれてもよい（例えば、バイオコンクリート、逆ヒドロゲルオパール、コロイド粒子、ＥＣＭゲル、コラーゲンゲル、マイクロキャリア）。例えば、ポリマーのメッシュレバー（ｒｅｂａｒ）は、ＶＳおよびＬＴＥ領域の後退において直接、レーザーによって層沈着され得る。このようなデザインでは、ＤＭに鋭敏なポリアクリレート、ポリスチレンまたは別の透明なプラスチックからなるＡＩＳ単位の下のプレートを有して、メッシュラバーをプレートに結合させることが好ましい。この実施形態では、ＥＳＣ足場と同様の方式でＫＯＨを用いて表面をマイクロパターン化する。細胞の適用および動きのために十分な空間を残して、薄膜としてメッシュのスレッドをコーティングするために、全ての必要な栄養素およびサイトカインを保有するフィブリンゲルマトリックスを用い得る。 図４９は、ＡＩＳデバイスにおける直接の沈着の断面図を示す。種々の医用材料の構造が、人工的免疫系の構成として組み込まれてもよい（例えば、バイオコンクリート、逆ヒドロゲルオパール、コロイド粒子、ＥＣＭゲル、コラーゲンゲル、マイクロキャリア）。例えば、ポリマーのメッシュレバー（ｒｅｂａｒ）は、ＶＳおよびＬＴＥ領域の後退において直接、レーザーによって層沈着され得る。このようなデザインでは、ＤＭに鋭敏なポリアクリレート、ポリスチレンまたは別の透明なプラスチックからなるＡＩＳ単位の下のプレートを有して、メッシュラバーをプレートに結合させることが好ましい。この実施形態では、ＥＳＣ足場と同様の方式でＫＯＨを用いて表面をマイクロパターン化する。細胞の適用および動きのために十分な空間を残して、薄膜としてメッシュのスレッドをコーティングするために、全ての必要な栄養素およびサイトカインを保有するフィブリンゲルマトリックスを用い得る。 図５０は、別々の層における微小流体バイオリアクターの例を示す。 図５１は、組み立てられた微小流体バイオリアクターを示す。 図５２は、リンパ管および血管のループおよび外部の培地リザーバのための会合された外部ポンプを有する灌流バイオリアクター系の模式図である。ＡＩＳバイオリアクターは、半バッチ方式または連続方式のいずれで作動されてもよい。 図５３は、金属（例えば、ステンレス鋼）リングの間の膜を示す。このような圧着（ｃｒｉｍｐｉｎｇ）方法を用いて、生物学的な膜は接着の使用なしに支持され得、そして約４００μｍ以下の厚みプロフィールでディスクに圧縮され得る。 図５４は、３層の平坦な導波管の製造を示す模式図である。 図５５は、灌流バイオリアクターと、組み込まれた光導波管を備えるＥＬＩＳＡチップと、デバイスを接続して交換を可能にする微小流体バックプレーンと、外部ポンプおよびリザーバのための微小流体コネクターとを備えるデバイスの例を示す。 図５６は、単球による微小粒子の食作用を示す。 図５７（Ａ）は、ＬＴＥにおけるＴおよびＢの相互作用の反応速度論のインシリコのモデリングを示す。図５７（Ａ）は、ＢおよびＴ細胞の相互作用のインシリコの２Ｄモデルである。細胞のサイズは１２μｍである；キャリアのサイズは２５０μｍである；Ｔ細胞の速度は１２μｍ／分である；Ｂ細胞の速度：６μｍ／分；Ｂ−Ｔ相互作用時間は３分である；細胞集団密度：２．７６×１０７／ｍｌ（細胞によって１／４０の空間が占められた）；Ｂ細胞の数は６５である；そしてＴ細胞の数は６５である。 図５７（Ｂ）は、ＬＴＥにおけるＴおよびＢの相互作用の反応速度論のインシリコのモデリングを示す。図５７（Ａ）は、ＢおよびＴ細胞の相互作用のインシリコの２Ｄモデルである。細胞のサイズは１２μｍである；キャリアのサイズは２５０μｍである；Ｔ細胞の速度は１２μｍ／分である；Ｂ細胞の速度：６μｍ／分；Ｂ−Ｔ相互作用時間は３分である；細胞集団密度：２．７６×１０７／ｍｌ（細胞によって１／４０の空間が占められた）；Ｂ細胞の数は６５である；そしてＴ細胞の数は６５である。 図５８は、コラーゲンクッションにおけるＨＵＶＥＣ内皮細胞の特徴付けを示す。パネルＡ：遊走研究のためにＰＢＭＣの適用の前にエピ蛍光照明によって細胞生存度を決定するためにＣＭＦＤＡを用いた染色の前（Ａ）および後（Ｂ）のＨＵＶＥＣ細胞。 図５８は、コラーゲンクッションにおけるＨＵＶＥＣ内皮細胞の特徴付けを示す。パネルＢ：遊走研究のためにＰＢＭＣの適用の前にエピ蛍光照明によって細胞生存度を決定するためにＣＭＦＤＡを用いた染色の前（Ａ）および後（Ｂ）のＨＵＶＥＣ細胞。 図５８は、コラーゲンクッションにおけるＨＵＶＥＣ内皮細胞の特徴付けを示す。 図５８は、コラーゲンクッションにおけるＨＵＶＥＣ内皮細胞の特徴付けを示す。パネルＤ：位相差によるＨＵＶＥＣ細胞の特徴付け。 図５８は、コラーゲンクッションにおけるＨＵＶＥＣ内皮細胞の特徴付けを示す。パネルＥは、生きた細胞を示すＣＭＦＤＡ（Ｅ）と、死んだ細胞を示すエチジウムホモ二量体−１（Ｆ）で染色している。 図５８は、コラーゲンクッションにおけるＨＵＶＥＣ内皮細胞の特徴付けを示す。パネルＦは、生きた細胞を示すＣＭＦＤＡ（Ｅ）と、死んだ細胞を示すエチジウムホモ二量体−１（Ｆ）で染色している。 図５９は、リングおよび支持マトリックス上にコラーゲン膜を有するバイオリアクター構築物の例を示す。パネルＡは、バイオリアクターの設計を示す。 図５９は、リングおよび支持マトリックス上にコラーゲン膜を有するバイオリアクター構築物の例を示す。パネルＢは、バイオリアクター全体からメッシュ内のコラーゲンマトリックスクッションのレベルへの進行を示す。パネルＣは、コラーゲンクッション上でＨＵＶＥＣ細胞がコンフルエンスに達した後の、滅菌条件下のバイオリアクターのアセンブリを示す。一旦アセンブルされれば、培地の流れが始まる。 図６０は、逆オパールゲル足場の調製を示す。パネルＡ：逆オパールゲル足場は、コロイドの結晶鋳型を作製するための型の選択によって任意の寸法で調製してもよい。スパチュラ（ｓｐａｔｕｌａ）の末端上に約６ｍｍの直径でかつ約２ｍｍの高さの鋳型ゲルの写真が示される（スケールはコイン）。パネルＢ：極めて正確な厚みのゲルは、ゲルを鋳型にすること、鋳型にされた足場の周囲にさらなるゲル材料を重合すること、次いでバルクゲル周囲の構築物を任意の薄層にスライスすることによって製造され得る。 図６１は、逆オパール足場上のＴ細胞運動性誘導を示す。パネルＡ：逆オパール足場の空隙内の成熟樹状細胞（赤）のクラスターを超えて遊走するナイーブなＴ細胞（緑）の３Ｄ再構築。上部の角における時間は、相対的な経過の分：秒である。色でコードした矢印は視野におけるいくつかの細胞の位置を通る。パネルＢ：足場の２つの空隙を接続するウインドウを側方に通じる、ＤＣの１つのクラスターからもう一方（第一のフレームにおける点線で特定されたクラスター）への１つのナイーブなＴ細胞（緑、矢印で記される）の迅速な輸送を示す逆畳み込みされた２Ｄの蛍光画像。パネル（Ａ）と同様の経過時間。 図６２は、細胞の動きの定量を示す。パネルＡ：足場における細胞遊走の単独細胞瞬間速度の対時間。 図６２は、細胞の動きの定量を示す。パネルＢ：ｘおよびｙでの単独細胞遊走経路の２Ｄ投射であって、位置はミクロンで示し、３０分にわたってプロットしている。Ｔ細胞は、リンパ節Ｔゾーンにおいて観察されるとおり、足場内のランダムな遊走を示す。 図６２は、細胞の動きの定量を示す。パネルＣ：成熟樹状細胞とともに同時に培養された、逆オパール足場におけるナイーブなＴ細胞の時間の関数としての平均移動。 図６３は、足場内の細胞間接触単独ではＴ細胞遊走をもたらさないことを示す。逆オパール足場でリンパ節様細胞密度で培養されたナイーブなＯＴ−ＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞は、分裂も遊走もしない。パネルＡ：明視野顕微鏡による足場の領域の全体的な様子。パネルＢ：マトリックスの１空隙内の細胞の３つのこま撮りのカット。時間は経過した分：秒である。 図６４は、ナイロンメッシュ上のプロタサン／コラーゲンマトリックス上で増殖するＨＵＶＥＣ細胞を示す。ナイロン膜の高倍率ＳＥＭおよび分散されたプロタサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ）／コラーゲンマトリックス材料は、頂部の画像に示す。ＨＵＶＥＣ細胞の一次層の播種は、反転した膜上で行われ（左側、１側）、次いで、２４時間後に正立の位置（右側、２側）にされて、ここで第二の層が加えられる。ＨＵＶＥＣ細胞の各々の面の位相差画像は、真ん中の２つの下側の画像に示され、ここでは左側に第一の層が、そして右側に第二の層が加えられる。 図６５は、バイオリアクターにおけるＶＳのための膜の付着の可変の方法を示すリング構造の写真を示す。左のパネルは、羊膜または天然に存在するＥＣＭ膜であるＵＢＭのような「ウエットな（ｗｅｔ）」膜構造を保持するために用いられたスパイクされたリングのデザインを示す。右側のパネルは、リング構造に対して「ドライな（ｄｒｙ）」合成膜を付着するために用いられる３つの方法を示す。上の左側（１０セント硬貨の左側に隣接）は圧着され、下の左側は同じ材料の２つのリングの間の膜を積層することにより、そして下の右側（１０セント硬貨の下）は接着される。 図６６は、播種の前に適所に加えられかつ重合されたＤｅｖｏｎ２部エポキシのビーズとともに培養プレート上のＨＵＶＥＣ細胞を示す。 図６７は、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ／ヘパリンの吸着曲線である。 図６８Ａは、Ｂ細胞およびＴ細胞の相互作用のインシリコの２Ｄモデルを示す。 図６８Ｂは、モデル１からモデル２への接触頻度の比を示す。

Claims (20)

  1. インビトロの隣り合う２つの培養細胞系であって：
    末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の集団を受容して該末梢血単核球の集団の中に存在する樹状細胞前駆体を細胞培養培地中で成熟させるために、細胞培養培地、平面のマトリックス、該第一のマトリックスに接着したヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）からなる複数の細胞、並びに標的の外来抗原を含み、且つ
    前記平面のマトリックスが、異種移植片細胞外マトリックス（ＥＣＭ）シート、自然に重合化したヒト羊膜結合組織、再構成されたコラーゲンマトリックスおよびキトサン／コラーゲン膜の足場からなる群より選択され、且つ
    前記複数の細胞が前記平面のマトリックス上に血管内皮を形成する、
    ワクチンが接種される部位と等価な培養物Ａと；
    Ｂ細胞及びＴ細胞を含む複数のリンパ球、並びに合成及び／又は天然のリンパＥＣＭ由来物質を含むヒドロゲルマトリックスを含み、且つ
    前記ヒドロゲルマトリックスがリンパ節の網目状足場を形成し、且つＢ細胞、Ｔ細胞、及び成熟樹状細胞の相互作用を支持する、
    前記培養物Ａ中の成熟樹状細胞を受容するための、三次元の、リンパ組織と等価な培養物Ｂと；
    を含む２つの培養細胞系。
  2. 前記複数の細胞が前記平面のマトリックスの両側上に血管内皮を形成する、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  3. 前記複数の細胞が前記平面のマトリックスの片側に血管内皮を形成し、そして皮膚上皮細胞が前記平面のマトリックスのもう一方の側に上皮を形成する、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  4. 前記培養物Ａにおける前記複数の細胞がヒト細胞を含む、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  5. 前記培養物Ａにおける前記複数の細胞がヒト皮膚由来血管細胞および内皮細胞を含む、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  6. 前記平面のマトリックスが、無細胞ヒト真皮を含む、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  7. 前記複数のリンパ球がさらに樹状細胞を含む、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  8. 前記ヒドロゲルマトリックスが隔離されたＴ細胞およびＢ細胞ゾーンを含む、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  9. 前記Ｔ細胞ゾーンがナイーブなＴ細胞および膠原線維を含む、請求項８に記載の２つの培養細胞系。
  10. 前記膠原線維がコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩまたはフィブロネクチンを含む、請求項９に記載の２つの培養細胞系。
  11. 前記Ｔ細胞ゾーンが細網線維芽細胞を含む、請求項８に記載の２つの培養細胞系。
  12. 前記隔離されたＴ細胞およびＢ細胞のゾーンが、化学誘引物質の制御放出によって作られる、請求項８に記載の２つの培養細胞系。
  13. 前記培養物Ｂがケモカインを含む、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  14. 前記ケモカインが、ＣＸＣＬ−１３、ＣＣＬ−２１およびＭＩＰ３からなる群より選択される、請求項１３に記載の２つの培養細胞系。
  15. 前記複数のリンパ球が、末梢血リンパ球からネガティブに選択されたＢ細胞およびＴ細胞を含む、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
  16. 請求項１に記載のインビトロの隣り合う２つの培養細胞系を用いる方法であって、該方法は：
    前記培養物Ａに末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の集団を導入する工程と；
    該末梢血単核球の集団の中に存在する樹状細胞前駆体の刺激を促進する条件下で、前記培養物Ａ及び標的抗原を培養する工程と；
    刺激された樹状細胞前駆体を成熟樹状細胞に変換させる工程と；
    前記培養物Ａにおいて成熟した樹状細胞を前記培養物Ｂに移動させる工程と；
    前記培養物Ｂにおける前記複数のリンパ球の、前記成熟樹状細胞による刺激を促進する条件下で、前記培養物Ｂを培養する工程と；
    該成熟樹状細胞による刺激後に該複数のリンパ球からの応答を測定する工程と；
    を包含する、方法。
  17. 前記標的抗原が、ワクチン、アジュバント、薬物、生体分子、化合物および化粧品からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記成熟樹状細胞による刺激後の前記複数のリンパ球からの応答が、リンホカインの存在を検出する工程またはリンホカインのレベルを測定する工程によって決定される、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記成熟樹状細胞による刺激後の前記複数のリンパ球からの応答が、複数のリンホカインの存在を検出することまたは複数のリンホカインのレベルを測定することによって決定される、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記培養物Ａ及び前記培養物Ｂが抗原特異的なリンパ球の免疫応答を解析するときに連続して使用される、請求項１に記載の２つの培養細胞系。
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