JP5734595B2 - コロニーの特性評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、コロニーの特性評価方法に関するものである。

近年、幹細胞研究やｉＰＳ細胞研究が注目されており、これらの研究では細胞の分化や成長過程の解明が重要視されている。例えば、細胞を多く含むコロニーを特定したりそのコロニーに含まれる細胞数を検出したりする方法や、細胞の増殖能力を評価する方法が知られている（例えば、特許文献１，２および３参照。）。

特許文献１に記載の個数計数方法および特許文献２に記載の細胞の検出方法は、コロニーを形成する細胞に予め蛍光標識等を行い、ＣＣＤ投影型顕微鏡装置等を用いてその細胞を観測することとしている。また、特許文献３に記載の細胞の増殖能力評価方法は、ディッシュ等の培養容器内で培養する細胞に対し、培養容器の底面に接着する細胞の接着面の面積の時系列変化を分析し、その面積変化の傾向から細胞の集団全体の増殖能力を評価することとしている。

特開２００３−８５５３３号公報 特表２００５−５１８５５３号公報 特開２００２−２１８９９５号公報

しかしながら、特許文献１に記載の個数計数方法および特許文献２に記載の細胞の検出方法は、コロニーに含まれる細胞の有無を検出することはできるが、一定期間監視しなければ将来的に細胞が分化を繰り返し成長が見込めるコロニーか否か、または、将来的にどのような細胞に成長するコロニーか等を評価することができず、コロニーの特性を評価するのに多大な時間を要するという問題がある。

また、特許文献３に記載の細胞の増殖能力評価方法は、観察対象とする細胞が容器の底面上で単層培養することを前提にしており、細胞どうしが接着して重なり合うような集団を形成する場合には増殖能力の有効な評価を行うことができないという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、コロニー形成の早い段階でその特性を精度よく評価することができるコロニーの特性評価方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、細胞に照明光を照射して集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させ、前記細胞からの戻り光を撮影して３次元画像を取得する画像取得工程と、該画像取得工程により取得された前記３次元画像上で、複数の前記細胞により形成されるコロニーに含まれる個々の前記細胞の特徴量として、前記細胞の蛍光強度、蛍光波長、大きさ、形状、密度、これら蛍光強度、蛍光波長、大きさ、形状または密度の変化量、ＤＮＡの量、および、ＤＮＡの密度のうち少なくとも１つを抽出する特徴量抽出工程と、前記３次元画像内の細胞数に対する前記特徴量抽出工程により抽出された前記特徴量が所定の閾値を超える細胞数の割合もしくは所定の閾値を下回る細胞数の割合に基づいて前記コロニーの特性として該コロニーの増殖または分化の能力を評価する評価工程とを含むコロニーの特性評価方法を提供する。

本発明によれば、画像取得工程により取得される複数の細胞を含む３次元画像を用いることで、培養容器内でコロニーを形成する細胞どうしが重なり合って接着する場合であっても、他の細胞に隠れて視認し難い細胞も見逃すことなく認識することができる。したがって、特徴量抽出工程により、コロニー内の個々の細胞の特徴量を的確に抽出することができる。

また、コロニーの特性は個々の細胞が有する性質に影響されるので、コロニーに占める個々の細胞の特徴量の割合に基づいてコロニー全体としての特性を把握することができる。また、評価工程により、コロニー内の所定の閾値を超える特徴量を有する細胞数もしくは所定の閾値を下回る特徴量を有する細胞数を全体の細胞数と比較することで、コロニーの特性評価の有効性を判断することができる。これにより、コロニー形成の早い段階でその特性を精度よく評価することができる。

例えば、細胞の増殖能力に関係する特徴量に着目すれば、コロニー全体としての増殖能力を評価することができる。また、特定の器官（神経、血、内蔵等）に成長する傾向が高い細胞に固有の特徴量に着目すれば、コロニー全体として将来的にどのような器官に成長する可能性が高いかを評価することができる。

上記発明においては、前記特徴量が、蛍光強度、蛍光波長、前記細胞の大きさ、形状、
密度、または、これらの変化量のうち少なくとも１つを含む。

このように構成することで、細胞の蛍光強度や密度等の特徴により未分化細胞を特定すれば、コロニー内にその数が多く含まれているか否かによりコロニーの増殖能力を評価することができる。また、特定の細胞（例えば、神経細胞等）に固有の蛍光強度等の特徴を有する細胞がコロニー内に多く含まれているか否かにより、例えば、成長して神経細胞になる可能性が高いコロニーか否かを評価することができる。
上記発明においては、前記評価工程において、前記コロニーの特性として、コロニーに未分化細胞が多く含まれるかどうかを評価することで前記コロニーの増殖または分化の能力を評価することとしてもよい。上記発明においては、前記評価工程において、前記細胞数の割合として、Ｇ１期の細胞数の割合に基づいてコロニーに未分化細胞が多く含まれるかどうかを評価することとしてもよい。上記発明においては、前記特徴量抽出工程において、特徴量として、ＤＮＡ量および密度を抽出し、前記評価工程において、前記ＤＮＡ量および密度によってＧ１期の細胞数の割合を特定し、Ｇ１期の細胞数の割合に基づいてコロニーに未分化細胞が多く含まれるかどうかを評価することとしてもよい。上記発明においては、前記評価工程において、複数のコロニーの前記Ｇ１期の細胞数の割合を比較することにより、コロニーに未分化細胞が多く含まれるかどうかを評価することとしてもよい。
上記発明においては、前記評価工程において、前記コロニーの特性として、コロニーが将来どのような器官になる可能性が高いかを評価することで前記コロニーの増殖または分化の能力を評価することとしてもよい。上記発明においては、前記特徴量抽出工程において、特徴量として、ニューロン特異的なマーカーが発する蛍光量を抽出し、前記評価工程において、前記蛍光量が所定の閾値を超える細胞数の割合に基づいて前記コロニーが将来ニューロンになる可能性が高いと評価することとしてもよい。

本発明によれば、コロニー形成の早い段階でその特性を精度よく評価することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るコロニーの特性評価方法の各工程を示すフローチャートである。 （ａ）は複数の細胞を示す概略図であり、（ｂ）は（ａ）の細胞により形成されるコロニーを示す図である。 （ａ）は複数の細胞を染色した様子を示す概略図であり、（ｂ）は（ａ）の細胞により形成されるコロニーを示す図である。 （ａ）は複数の細胞を特徴量により分類した様子を示す概略図であり、（ｂ）は（ａ）の細胞により形成されるコロニーを示す図である。

以下、本発明の一実施形態に係るコロニーの特性評価方法について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係るコロニーの特性評価方法は、図１のフローチャートに示すように、培養容器内で培養している細胞に照明光を照射し、細胞の３次元画像を取得する画像取得工程ＳＡ１と、取得された３次元画像上で、複数の細胞により形成される細胞集団（コロニー）に含まれる個々の細胞の特徴量を抽出する特徴量抽出工程ＳＡ２と、抽出した細胞の特徴量に基づきコロニーの特性を評価する評価工程ＳＡ３とを含んでいる。

このコロニーの特性評価方法においては、公知の共焦点顕微鏡装置を用いることができる。共焦点顕微鏡装置は、例えば、細胞を収容した培養容器を載置するステージと、ステージ上の細胞に向けて励起光（照明光）を発する光源と、細胞上で励起光を走査するガルバノミラー等の走査部と、細胞に励起光を照射する一方、細胞において発生する蛍光を集光する対物レンズと、対物レンズの焦点位置に共役な位置に配置され蛍光を部分的に透過させるピンホールと、ピンホールを透過した蛍光を検出する検出部等を備えている。

また、共焦点顕微鏡装置には、検出部により検出された蛍光信号をイメージングして３次元画像を取得する画像取得部と、画像取得部により取得された画像や評価工程ＳＡ３における判定結果を表示するモニタや、３次元画像上で細胞の特徴量を抽出したり、抽出した細胞の特徴量を用いて演算処理したりするＣＰＵ等が備えられている。

また、本実施形態においては、細胞の観察を行う前に、細胞内に色素を導入して染色し細胞およびコロニーを可視化する前処置を行うようになっている。例えば、コロニーの特性として増殖能力を評価する場合は、色素としてＤＡＰＩ（４′６‐ｄｉａｍｉｄｉｎｏ‐２‐ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）が用いられる。

画像取得工程ＳＡ１は、共焦点顕微鏡装置のステージに載置された培養容器に含まれる細胞に対し、光源から発せられる励起光を照射するようになっている。また、ステージを励起光の光軸方向に移動させることにより対物レンズと細胞との相対位置を変化させながら、細胞に照射される励起光をガルバノミラーによって細胞上で光軸に交差する方向に走査するようになっている。

また、画像取得工程ＳＡ１は、励起光が照射された細胞において発生する蛍光を検出部により検出するようになっている。また、画像取得部により、検出部によって検出された蛍光信号を処理し、細胞の２次元画像を取得するようになっている。さらに、対物レンズと細胞の各相対位置における各２次元画像を積み重ね、細胞の３次元画像を構築するようになっている。

特徴量抽出工程ＳＡ２は、ユーザにより３次元画像上で特定されたコロニーに含まれる個々の細胞に対し、ＣＰＵの作動により、例えば、蛍光強度、蛍光波長、細胞の大きさ（面積）、形状、密度（凝縮度）等を特徴量として抽出するようになっている。本実施形態においては、ＣＰＵは、細胞の特徴量としてＤＮＡ量（例えば、ＤＡＰＩ総蛍光量）と密度を抽出するようになっている。

評価工程ＳＡ３は、ＣＰＵにより、コロニー内における細胞の特徴量が所定の閾値を超える細胞数を検出するようになっている。所定の閾値は、評価するコロニーの特性に応じてユーザが設定する。また、評価工程ＳＡ３は、ＣＰＵにより、３次元画像の視野範囲内における全細胞数に対するコロニー内の所定の閾値を超える特徴量を有する細胞数の割合を算出し、算出された細胞数の割合がユーザにより予め設定された所定の基準値以上か否かを判定するようになっている。

このように構成された本実施形態に係るコロニーの特性評価方法の作用について説明する。
本実施形態に係るコロニーの特性評価方法により、図２（ａ），（ｂ）に示すような複数の細胞Ｓにより形成されたコロニーＣの増殖能力を評価する場合は、前処置として細胞ＳにＤＡＰＩを導入し、図３（ａ），（ｂ）に示すように細胞ＳおよびコロニーＣを染色して可視化する。

続いて、共焦点顕微鏡装置のステージに染色した細胞Ｓを含む培養容器を載置し、顕微鏡観察を行う。まず、光源から励起光を発して対物レンズにより細胞Ｓに照射し、ステージ位置を光軸方向に移動して励起光の集光位置を深さ方向に変化させつつ、ガルバノミラーにより細胞Ｓ上で励起光を光軸に交差する方向に走査する。

また、検出部により、励起光が照射された細胞Ｓにおいて発生し対物レンズにより集光されてピンホールを通過する蛍光を検出部により検出する。そして、画像取得部により、検出部により検出された蛍光信号を処理し細胞Ｓの２次元画像を取得する。そして、対物レンズと細胞Ｓの各相対位置における各２次元画像を積み重ね、細胞Ｓの３次元画像を取得する（ステップＳＡ１)。画像取得部により取得された３次元画像はモニタに表示される。

次に、モニタに表示される細胞Ｓの３次元画像上でユーザが評価対象とするコロニーＣを特定すると、ＣＰＵの作動により、特定されたコロニーＣ内の個々の細胞ＳのＤＮＡ量と密度が特徴量として抽出される（ステップＳＡ２）。この場合において、３次元画像を用いることで、培養容器内で細胞Ｓどうしが重なり合って接着しているような場合であっても、他の細胞Ｓに隠れて視認し難い細胞Ｓも見逃すことなく認識することができる。したがって、図４（ａ），（ｂ）に示すように、コロニーＣ内の１つ１つの細胞Ｓの特徴量を的確に抽出することができる。

続いて、ＣＰＵにより、抽出した個々の細胞ＳのＤＮＡ量と密度により細胞周期が特定される。例えば、予備実験として、分化細胞のみを集めた標本の画像からＧ１期（細胞周期におけるＤＮＡ合成準備期）の細胞の割合を出す。同様に、未分化細胞のみを集めた標本の画像からＧ１期の細胞の割合を出す。次に、観察したいコロニー全体の画像からＧ１期の細胞の割合を検出する。

検出された観察したいコロニー内のＧ１期の細胞の割合と予備実験の結果（分化細胞のみを集めた標本におけるＧ１期の細胞の割合および未分化細胞のみを集めた標本におけるＧ１期の細胞の割合）から、当該観察したいコロニーにおける未分化細胞の割合が分かる。以上から、コロニーＣに未分化細胞が多く含まれているかどうかを判断することができる。

このようにして、ＣＰＵにより、３次元画像における全細胞数に対する未分化細胞の割合が算出されると、その割合がユーザにより設定された所定の基準値以上か否かが判定される（ステップＳＡ３）。この場合において、コロニーＣの特性は個々の細胞Ｓが有する性質に影響されるので、コロニーＣに占める個々の細胞Ｓの特徴量の割合に基づいてコロニーＣ全体としての特性を把握することができる。また、未分化細胞を多く含むコロニーＣは成長を見込めると判断することができる。

また、ＣＰＵにより算出された全細胞数に対するコロニーＣ内の未分化細胞の割合に基づいて、コロニーの特性評価の有効性を判断することができる。例えば、ＣＰＵにより未分化細胞の割合が所定の基準値（５０％以上）を超えると判定されると、そのコロニーＣは増殖能力が高いと評価することができる。

以上説明したように、本実施形態に係るコロニーの特性評価方法によれば、３次元画像を用いることにより重なり合う細胞Ｓの特徴量も的確に抽出するとともに、個々の細胞Ｓの特徴量に着目してコロニー全体としての特性を把握することによりコロニー形成の早い段階でコロニーＣの特性を精度よく評価することができる。

なお、本実施形態においては、前処置として細胞に色素を導入することとしたが、例えば、前処置を施さずに、細胞において発現しているＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）やＦｕｃｃｉ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ, ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）等の蛍光タンパクの蛍光量を用いて細胞周期を特定することとしてもよい。

また、本実施形態においては、評価工程ＳＡ３より、コロニーＣ内における細胞Ｓの特徴量が所定の閾値を超える細胞数を検出することとしたが、これに代えて、例えば、評価工程ＳＡ３により、コロニーＣ内における細胞Ｓの特徴量が所定の閾値を下回る細胞数を検出することとしてもよい。この場合、ＣＰＵにより、３次元画像の視野範囲内における全細胞数に対するコロニーＣ内の所定の閾値を下回る特徴量を有する細胞数の割合を算出し、算出された細胞数の割合がユーザにより予め設定された所定の基準値以上か否かを判定することとすればよい。

また、本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、本実施形態においては、評価工程ＳＡ３において、ＣＰＵにより、３次元画像内の全細胞数に対するコロニー内の所定の閾値を超える細胞数の割合が所定の基準値以上か否かを判定することとしたが、ユーザが複数のコロニーを特定した場合に、ＣＰＵにより、コロニーごとの算出結果、すなわち、３次元画像内の全細胞数に対するコロニー内の所定の閾値を超える細胞数の割合（もしくは所定の閾値を下回る細胞数の割合）を比較したり、複数のコロニーのうち、その算出結果が所定の基準値を満たすコロニーを抽出したりすることとしてもよい。

具体的には、ＣＰＵにより、コロニーＣごとに統計量を取得し、コロニーＣどうしの３次元画像内の全細胞数に対する未分化細胞の割合、すわなち、増殖能力を比較してモニタに表示することとすればよい。また、ＣＰＵにより、複数のコロニーＣのうち、３次元画像内の全細胞数に対する未分化細胞の割合が所定の基準値を満たすコロニーＣを抽出することとすればよい。

また、例えば、本実施形態においては、コロニーの特性評価として、コロニー内の未分化細胞の解析によりコロニーの増殖能力を評価することとしたが、コロニー内の特定の細胞の割合を解析することにより、コロニーが将来的にどのような器官（神経、血、内蔵等）になる可能性が高いかを評価することとしてもよい。

この場合、前処置として、例えば、細胞核をＤＡＰＩにより染色し、また、ニューロン（神経細胞）に特異的なマーカー（ＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、または、ＴＵＪ１（ｃｌａｓｓ ＩＩＩ ｔｕｂｕｌｉｎ）等）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（登録商標、以下「Ａｌeｘａ４８８」という。）等により染色し、細胞およびコロニーを可視化する。また、特徴量抽出工程ＳＡ２においては、ＣＰＵにより、例えば、細胞の蛍光量（ＧＦＡＰまたはＴＵＪ１等に由来のもの）を特徴量として抽出する。

また、評価工程ＳＡ３においては、ＣＰＵにより、コロニー内のＤＡＰＩを含む細胞の中で、Ａｌeｘａ４８８を含む細胞の割合を検出する。そして、３次元画像内の全細胞数に対するコロニー内のＡｌeｘａ４８８を含む細胞の割合が所定の基準値以上か否かを判定する。これにより、その割合が所定の基準値以上のコロニーは将来的にニューロンに成長する可能性が高いと評価することができる。

本変形例においては、ユーザが複数のコロニーを特定した場合に、ＣＰＵにより、コロニーどうしの３次元画像内の全細胞数に対するＡｌeｘａ４８８を含む細胞の割合、すなわち、将来的にニューロンに成長する可能性を比較してモニタに表示することとしてもよい。また、ＣＰＵにより、複数のコロニーＣのうち、３次元画像内の全細胞数に対するＡｌeｘａ４８８を含む細胞の割合が基準値以上のコロニーを抽出することとしてもよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の一実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。また、例えば、コロニーと解析結果とを関連付けてモニタに表示することとしてもよい。また、本実施形態においては、コロニーの特性評価として、増殖能力の評価と将来的にコロニーがどのような器官になる可能性が高いか否かの評価を例示して説明したが、これに限定されるものではない。

ＳＡ１ 画像取得工程
ＳＡ２ 特徴量抽出工程
ＳＡ３ 評価工程

Claims (7)

1. 細胞に照明光を照射して集光位置を深さ方向に変化させつつ深さ方向に交差する方向に走査させ、前記細胞からの戻り光を撮影して３次元画像を取得する画像取得工程と、
   該画像取得工程により取得された前記３次元画像上で、複数の前記細胞により形成されるコロニーに含まれる個々の前記細胞の特徴量として、前記細胞の蛍光強度、蛍光波長、大きさ、形状、密度、これら蛍光強度、蛍光波長、大きさ、形状または密度の変化量、ＤＮＡの量、および、ＤＮＡの密度のうち少なくとも１つを抽出する特徴量抽出工程と、
   前記３次元画像内の細胞数に対する前記特徴量抽出工程により抽出された前記特徴量が所定の閾値を超える細胞数の割合もしくは所定の閾値を下回る細胞数の割合に基づいて、前記コロニーの特性として該コロニーの増殖または分化の能力を評価する評価工程とを含むコロニーの特性評価方法。
2. 前記評価工程において、前記コロニーの特性として、コロニーに未分化細胞が多く含まれるかどうかを評価することで前記コロニーの増殖または分化の能力を評価する請求項１に記載のコロニーの特性評価方法。
3. 前記評価工程において、前記細胞数の割合として、Ｇ１期の細胞数の割合に基づいてコロニーに未分化細胞が多く含まれるかどうかを評価する請求項２に記載のコロニーの特性評価方法。
4. 前記特徴量抽出工程において、特徴量として、ＤＮＡ量および密度を抽出し、
   前記評価工程において、前記ＤＮＡ量および密度によってＧ１期の細胞数の割合を特定し、Ｇ１期の細胞数の割合に基づいてコロニーに未分化細胞が多く含まれるかどうかを評価する請求項３に記載のコロニーの特性評価方法。
5. 前記評価工程において、複数のコロニーの前記Ｇ１期の細胞数の割合を比較することにより、コロニーに未分化細胞が多く含まれるかどうかを評価する請求項３または４に記載のコロニーの特性評価方法。
6. 前記評価工程において、前記コロニーの特性として、コロニーが将来どのような器官になる可能性が高いかを評価することで前記コロニーの増殖または分化の能力を評価する請求項１に記載のコロニーの特性評価方法。
7. 前記特徴量抽出工程において、特徴量として、ニューロン特異的なマーカーが発する蛍光量を抽出し、
   前記評価工程において、前記蛍光量が所定の閾値を超える細胞数の割合に基づいて前記コロニーが将来ニューロンになる可能性が高いと評価する請求項６に記載のコロニーの特性評価方法。

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