JPWO2003008634A1 - 微生物の検査装置および検査方法 - Google Patents
微生物の検査装置および検査方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2003008634A1 JPWO2003008634A1 JP2003514949A JP2003514949A JPWO2003008634A1 JP WO2003008634 A1 JPWO2003008634 A1 JP WO2003008634A1 JP 2003514949 A JP2003514949 A JP 2003514949A JP 2003514949 A JP2003514949 A JP 2003514949A JP WO2003008634 A1 JPWO2003008634 A1 JP WO2003008634A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- fluorescence
- microorganisms
- inspection
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 324
- 238000007689 inspection Methods 0.000 title claims abstract description 104
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 259
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 173
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 48
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 77
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 73
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 claims description 72
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 58
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 46
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 9
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 3
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims 8
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 142
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 abstract description 22
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 abstract description 10
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 44
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 35
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 34
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 32
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 20
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 16
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 10
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 4
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003703 image analysis method Methods 0.000 description 1
- 239000008235 industrial water Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 238000005211 surface analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 description 1
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
- G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
- G01J3/28—Investigating the spectrum
- G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
- G01J3/4406—Fluorescence spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/02—Food
- G01N33/14—Beverages
- G01N33/146—Beverages containing alcohol
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1429—Signal processing
- G01N15/1433—Signal processing using image recognition
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
- G01N2015/019—Biological contaminants; Fouling
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6421—Measuring at two or more wavelengths
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
- G01N2021/6423—Spectral mapping, video display
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
- G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N2021/6463—Optics
- G01N2021/6471—Special filters, filter wheel
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/84—Systems specially adapted for particular applications
- G01N2021/8411—Application to online plant, process monitoring
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
試料液中の微生物をフィルターで捕捉し、蛍光染色して得られる試料より、微生物に関する情報を検出する検査装置を提供できる。異なる励起光（１、２）をフィルタに照射し、それぞれの励起光に対応して各フィールドごとに得られる蛍光の２値化画像（Ａ、Ｂ、Ｃ）を撮像する。次に、各励起光（１、２）に対して得られる２値化画像（Ａ、Ｂ、Ｃ）を比較し、特定の励起光（例えば１）に対してのみ蛍光を発する２値化画像Ｂは微生物に基づく蛍光像であり、全ての励起光に対して蛍光を発する２値化画像Ａ、Ｃは微生物以外の蛍光像であると自動的に識別することにより、試料液中の微生物を簡単に無人で識別することができる。
Description
技術分野
本発明は、微生物の検査装置および検査方法に関し、例えば、試料液中に含まれる微生物などをフィルターで捕捉し、捕捉した微生物に蛍光染色し、顕微鏡を用いて微生物を微生物以外のものと自動識別して表示する微生物の検査装置および検査方法に関する。
背景技術
従来、微生物検査、例えば、ビールなどの飲料、食品、医薬品、化粧品などの製造工程管理、製品品質管理などにおける微生物検査は、多種多様な培地を必要とする培養検査により行なわれており、検査が終了するまでに相当な日数を要していた。
このため検査対象中に微生物が存在するか否か、あるいは微生物の数、あるいは存在している微生物種の同定などの検査結果の判明が遅れ、種々の分野における研究、開発、製造あるいは製品出荷の段階で多大な制約があった。
このような背景から、現在に至るまで多くの微生物を含む液体試料中などから微生物を迅速に測定する方法が考案されている（例えば、「微生物検査技術の最新動向」，食品と開発３５（１），Ｐ３２−４０（２０００）など）。
微生物を迅速に測定する方法として知られているものとしては、例えば、インピーダンス法（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．、Ｗａｒｎｅｒ，Ｍ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．、Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．、Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、３７、６５〜６９（１９８４））、酵素−蛍光検出法（特開昭５８−１１６７００号公報）、ＰＣＲ法、メンブレンフィルター法と蛍光顕微鏡法とを組み合わせたＤＥＦＴ法（Ｇ．Ｌ．ＰＥＴＴＩＰＨＥＲ，ＵＢＡＬＤＩＮＡＭ．ＲＯＤＲＩＧＵＥＳ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．５３，３２３（１９８２））、あるいはメンブランフィルター法とＡＴＰ法を組み合わせたＲＭＤＳ法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｎａｋａｋｉｔａ．Ｙ．，Ｗａｔａｒｉ．Ｊ．，Ｓｈｉｎｏｔｓｕｋａ．Ｋ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（５），Ｐ１０３２−１０３７（２０００））などがあり、これらの測定原理を応用した機器も市販されている。
しかしながら、上記説明した方法には、１）精度が不十分である、２）迅速な測定に適さない、３）定量性が不十分である、４）人為的誤差を含む可能性が高いなど、多くの問題が残されている。また、５）測定に必要な培地や試薬等のランニングコストが高い点も問題である。
一方、試料溶液中に存在する微生物をろ過して微生物等を分離し、得られた微生物を含む試料を蛍光染色し、この試料を蛍光顕微鏡で、観測者が目視観察しながら微生物と微生物以外のものを識別する方法も知られている。
しかしながら、上記の方法では、蛍光染色した試料から発生する蛍光像を観測者が目視観察しながら微生物と微生物以外のものとに識別するために、測定結果に対して測定者の誤認などによる誤りが入る可能性もあった。また、微生物と微生物以外のものとを無人で識別することは不可能であった。
発明の開示
本発明は、上記説明した従来技術の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、例えば、検査対象となる試料中に含まれる微生物を自動で迅速に識別可能な微生物の検査装置および検査方法を提供することである。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の検査方法は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査方法であって、前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射する照射工程と、前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、例えば、前記各物体から得られる蛍光体の蛍光強度あるいは形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する検査工程を更に有し、前記識別工程では、前記検査工程で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
ここで、例えば、前記照射工程では、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順にまたは同時に前記試料に照射することが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別工程では、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記識別工程では、前記各物体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
ここで、例えば、前記微生物は特定の微生物であることが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別工程では、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記識別工程では、前記各物体から得られる蛍光スペクトルを前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
ここで、例えば、前記微生物は特定の微生物であることが好ましい。
ここで、例えば、前記検査方法は、１次検査工程と、２次検査工程とを含み、前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光物体を特定し、前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で特定された各蛍光物体を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各蛍光物体の蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
ここで、例えば、前記検査方法は、１次検査工程と、２次検査工程とを含み、前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光物体のうち、標的の微生物を標的以外の微生物から分離して抽出し、前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で抽出した各標的の微生物を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各標的の微生物の蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、該フィルタ上に捕捉された微生物を含む物体を蛍光標識物質を用いて染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、２つ以上の波長を含む励起光を照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が１つ以上の蛍光におけるピークを有するように該フィルタ上に捕捉された微生物を蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
ここで、例えば、前記２つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
ここで、例えば、前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）、プロビディウム・イオダイド、およびフルオレセインニソチシオシアネート（ＦＩＴＣ）のうちのいずれか１つ以上の蛍光標識物質が用いられることが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、３つ以上の波長を含む励起光を該フィルタに照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が２つ以上の蛍光におけるピークを有するように、該フィルタ上に捕捉された微生物を異なる種類の蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
ここで、例えば、前記３つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される３つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
ここで、例えば、前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）、プロビディウム・イオダイドおよびフルオレセインニソチシオシアネート（ＦＩＴＣ）のうちのいずれか２つ以上の蛍光標識物質が用いられることが好ましい。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の検査装置は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査装置であって、前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射する照射機構と、前記試料を撮像する撮像装置と、前記撮像装置による撮像結果を分析する分析装置と、を備え、前記分析装置は、前記撮像結果より前記複数の励起光に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別するように構成されていることを特徴とする。
ここで、例えば、前記分析装置は、前記各物体から得られる蛍光体の蛍光強度あるいは形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する検査部を更に有し、前記分析装置は、前記検査部で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の検査装置は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査装置であって、前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射しながら該試料を撮像した結果を取り込む入力装置と、前記入力装置で取り込んだ撮像結果より前記複数の励起光に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する分析装置と、を備えることを特徴とする。
ここで、例えば、前記照射機構は、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順にまたは同時に前記試料に照射することが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記分析装置は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記分析装置は、前記各物体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
ここで、例えば、前記検査装置は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記分析装置は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記分析装置は、前記各物体から得られる蛍光スペクトルを前記励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各物体が微生物であるか否かを識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記検査装置は、前記照射機構と前記撮像装置と前記分析装置とを制御する制御装置を更に備え、前記制御装置は、前記照射機構を用いて前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析して前記試料中に含まれる蛍光物体を特定するように制御し、次に、前記特定された各蛍光物体に前記照射機構を用いて前記励起光を照射しながら、前記特定された各蛍光物体のみを前記第１倍率よりも高い第２倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析することにより前記各蛍光物質の蛍光におけるピークの分布を得るように制御することが好ましい。
ここで、例えば、前記検査装置は、前記照射機構と前記撮像装置と前記分析装置とを制御する制御装置を更に備え、前記制御装置は、前記照射機構を用いて前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析して前記試料中に含まれる蛍光物体のうち、標的の微生物を標的以外の微生物から分離して抽出するように制御し、次に、前記抽出された各標的の微生物を前記第１倍率よりも高い第２倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析することにより前記標的微生物の蛍光におけるピークの分布を得るように制御することが好ましい。
ここで、例えば、前記複数の励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
ここで、例えば、前記撮像装置は、電動ステージを更に備え、前記制御装置は、前記電動ステージを制御して前記試料の全領域を走査しながら前記試料の全領域を撮像するように前記撮像装置を制御することが好ましい。
ここで、例えば、前記撮像装置は、対物レンズと、前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保つように予め設定されている方程式とを備え、前記制御装置は、前記走査の際に前記方程式に基づいて焦点のずれが生じないように前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保ちながら前記試料の全領域を撮像するように前記撮像装置を制御することが好ましい。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の制御プログラムは、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査装置を制御する制御プログラムであって、前記検査装置から前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光が照射された際に前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程を含むことを特徴とする。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態のコンピュータ可読記憶媒体は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査装置を制御する制御プログラムを格納したコンピュータ可読記憶媒体であって、前記制御プログラムは、前記検査装置から前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光が照射された際に前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程を含むことを特徴とする。
上記構成を有する微生物の検査方法および装置により、２波長または３波長以上の励起光を試料に照射し、それぞれの励起光に対応して得られる複数の蛍光像を比較することにより、試料液中に混入した微生物を自動で識別することが可能となるため検査時間が短縮でき、人為的なミスによる測定の誤りを防止することもできる。
発明を実施するための最良の形態
以下に図面を参照して、本発明に係る好適な実施の形態を説明する。
［微生物の検査装置：図１、２］
まず図１および図２を用いて本発明に係る一実施形態の微生物検出装置１について説明する。図１は、微生物検査装置１の全体構成を説明する図であり、図２は、微生物検査装置１の各部の制御を説明する図である。
図１において、微生物検査装置１は、蛍光顕微鏡部２と画像解析部３より構成されている。
蛍光顕微鏡部２は、微生物を含む試料を拡大観察する蛍光顕微鏡本体１０と、蛍光顕微鏡本体１０で拡大観察された試料像を光電変換して画像化する画像取得部２１（例えば、冷却ＣＣＤカメラ等のモノクロあるいはカラーのカメラ）とを有する。画像取得部２１は、画像解析部３によって制御２３され、画像取得部２１で取得した画像データ２２は、画像解析部３に送られる。画像データ２２は演算部５０や識別部４４で解析され、試料に含まれる微生物が識別される。
ここで、微生物を含む試料とは、例えば、ビールなどの飲料であり、本来は微生物や微生物以外の混入物を含まないもの（検査試料液）であるが、製造工程などで、微生物や微生物以外の混入物が混入しているか否かを調べるために検査試料液から所定量取り出したものをいう。また、検査試料液から微生物検出装置１で用いる試料は、メンブレンフィルタを用いたろ過器を用いて検査試料液をろ過して、メンブレンフィルタ上に微生物や微生物以外の混入物を捕捉し、次に、ろ過器からメンブレンフィルタを取り出し、微生物や微生物以外のものが捕捉されたメンブレンフィルタに蛍光標識物質を作用させて、試料中の微生物を蛍光標識物質で染色する手順で調製される。なお試料中の微生物の染色に用いる蛍光標識物質は、必要に応じて１種または複数使用する。
光学顕微鏡１０は、蛍光染色した微生物を含む試料の載置用の顕微鏡電動ステージ１６、電動フォーカスモーター１７、高出力水銀ランプ、キセノンランプなどを用いて発生する励起光を上記試料に照射し、標的微生物を強く蛍光標識する光源部１８、光源部１８から顕微鏡電動ステージ１６への光路中に設けられた励起光のうちの１つあるいは複数の特定波長を選択するフィルタおよび励起光の照射により試料から発生する蛍光のうち１つあるいは複数の特定波長を選択するフィルターを備えた蛍光フィルターブロック切り換え部１９および対物レンズを切り換えるレンズ切り換え部２０を備えている。
光学顕微鏡１０は、蛍光標識物質で染色した微生物を含む試料を励起するために、異なる特定波長を有する複数の励起光を順次、この試料に照射し、蛍光フィルターブロック切り換え部１９を順次切り替えることにより、各励起光に応じて得られる蛍光をそれぞれ検出することができる。また、異なる特定波長を有する複数の励起光を同時にこの試料に照射してもよい。
光学顕微鏡１０より、画像解析部３には、現在の諸条件、例えば、レンズ、フィルタ、ステージ位置、フォーカス位置などの測定情報２４が送られる。
また、画像解析部３は、顕微鏡電動ステージ１６用の電動フォーカスモーター１７の制御に必要な演算を実行する制御部４０、得られた画像データ２２に適切な処理を施し、後述する個々の画素の連結成分に基づいて微生物か否かを識別するための特徴情報を自動で算出する演算部５０、検査方法の定義入力や微生物の判定に使用する閾値などを入力するキーボード７２とステージフォーカス移動用トラックボール７１などからなる入力部７０および光学顕微鏡による撮像結果や各種解析結果等を表示する表示部６０とを備えている。
なお画像解析部３における処理は、各励起光ごとに行われるため、異なる波長を有する複数の特定波長を有する励起光を用いて各領域ごとに蛍光体が発する蛍光像を取得することができる。また、蛍光像を取得した場合には、各励起光ごとに得られる蛍光像を記憶すると共に、各励起光ごとに得られる蛍光像を組み合わせて蛍光スペクトル（あるいはピークの波長）を作成し、この蛍光スペクトルを予め設定されている判定用蛍光スペクトル（あるいは判定基準）と比較することで、蛍光体を、標的の微生物、標的以外の微生物、微生物でない異物などに識別することができる。判定用蛍光スペクトル（あるいは判定基準）は、画像解析部３に記憶されている。
画像解析部３では、試料の測定から微生物を識別する解析までの各工程を制御する自動蛍光検査機能を有している。この自動蛍光検査機能は、画像解析部３のＲＯＭに格納された自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３のＣＰＵがＲＡＭを用いて実行するものであり、蛍光染色された試料（例えば、メンブレンフィルター上に微生物を捕捉してこれを蛍光染色した試料）の全面を走査できるように顕微鏡電動ステージ１６を駆動させる機能、試料の全面走査に連動して各測定視野ごとに行われるフォーカス制御機能、試料における蛍光信号の検出部位を記憶しておき、試料を走査した後にこの部位の蛍光体を顕微鏡観察によって再確認できるようにする機能（例えば１次全領域検査時よりも高倍率レンズを用いる、あるいは１次検査に用いた励起光に加えて一つ以上の異なる励起光を照射する方法、あるいは両者を組み合わせる方法、すなわち無人自動および目視のＶａｌｉｄａｔｉｏｎ機能）、あるいは取得した画像中の個々の連結成分から蛍光強度や形状の特徴量を自動検出し、微生物の可能性がある蛍光体を特定する機能、この特定された微生物の可能性がある蛍光体に基づいて蛍光スペクトルやピークの波長を自動で作成し、微生物を識別する機能などがある。
なお制御部４０は、メンブランフィルタの全領域に励起光を順次照射するためにメンブランフィルタの全領域を所定領域ずつに分割し、試料台をその所定領域ずつ移動させる顕微鏡電動ステージ１６の移動に追従しながらフォーカス制御を実行して常に焦点を合わせる電動フォーカス制御部４１、顕微鏡電動ステージ１６を駆動させて微生物を含む試料の全面走査を可能にする電動ステージ制御部４２および顕微鏡及びカメラ制御部４３および画像取得部２１から送信される画像データ２２から微生物を識別する識別部４４を有する。顕微鏡及びカメラ制御部４３は、光源シャッター、レンズ切り替え、蛍光フィルターブロック切り替え、露光開始タイミング、露光時間の制御などを行う。また、制御部４０を用いて種々の制御ができるが、一例を示すと、光学顕微鏡１０の倍率を低倍率のレンズを用いて低倍率にしてから、特定波長を有する励起光で微生物を含む試料の各領域を順次照射しながら微生物を含む試料の全面を走査することにより蛍光体を検出し記憶し（第１次自動識別）、次に、蛍光体が検出された領域のみを、高倍率のレンズを用いて１種または２種以上の複数の特定波長を有する励起光で順次照射しながら各蛍光体の詳細な識別を行えるように制御することもできる。
測定する蛍光体の最大径の定義域内において、試料走査域数を計算する演算部５０は、検査域定義演算部５１および、顕微鏡電動ステージ１６と電動フォーカスモーター１７を制御することにより、微生物を含む試料を全面走査する際に微生物を含む試料の所定平面に焦点を設定すると常にその同一平面に自動的に焦点を合わせるようにする（プレディクティブフォーカス法などと呼ぶことがある）プレディクティブフォーカス演算部５２とを有する。
プレディクティブフォーカス法を更に詳しく説明すると、プレディクティブフォーカス法とは、走査定義範囲（ＸＹ一定範囲）内において、試料面と対物レンズとの距離（Ｚ一定）を一定に保つ方程式（試料平面の式）を予め設定し、測定走査の際には走査座標に応じて自動的に試料平面方程式どおりに焦点位置を制御する方法である。
［微生物の検査方法］
次に、上記説明した微生物検査装置１を用いる微生物の自動識別方法について説明する。
すなわち、まず、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出する第１次自動識別処理を図５を用いて説明し、次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理について、１波長識別法（図６）、２波長識別法（図７）、３波長識別法（図１５）の３種類の識別法を詳細に説明する。
なお、第１次および第２次自動識別処理は、どのようなレンズの倍率で行うことも可能であるが、以下の説明では、第１次自動識別処理を低倍率のレンズを用いて行い、第２次自動識別処理を高倍率のレンズを用いて行う場合を例にとって説明する。
［第１次自動識別処理の概要：図５］
図５は、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出するための第１次自動識別処理の手順について説明するフローチャートである。
なお、ステップＳ９１〜Ｓ９３は、前処理であり、ステップＳ９４〜Ｓ９９が第１次自動識別処理である。この第１次自動識別処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
まず、ステップＳ９１において、検査試料液を所定のフィルタ径、例えば１０〜５０ｍｍ径を有するメンブレンフィルタを用いるろ過器でろ過し、メンブレンフィルタ上に微生物や微生物以外の混入物を捕捉する。
次に、ステップＳ９２において、メンブレンフィルター上に捕捉した微生物を所定の蛍光標識物質で染色する。例えば、この染色方法として、ＦＩＳＨ法、蛍光抗体法、核酸染色法および酸素染色法などがある。
次に、ステップＳ９３において、染色された試料を含むメンブレンフィルタを微生物検査装置１の顕微鏡電動ステージ１６に固定することにより、検査試料液からの試料の調製が完了する。
次に、ステップＳ９４において、顕微鏡電動ステージ１６に固定された染色された試料を含むメンブレンフィルタに、各蛍光標識物質に対応する特定波長を有する励起光を照射する。なお、励起光が照射されるメンブレンフィルタは、予め所定の大きさを有する領域に分割されており、励起光はその分割された領域ごとに照射される。
次に、ステップＳ９５において、照射された励起光に応じて、試料中の各蛍光標識物質が微生物に吸収された部分から発生する特有波長を有する蛍光像を撮像する。
次に、ステップＳ９６において、得られた蛍光像について、２値化手法を用いて１ビット階調の２値化画像データを取得し、微生物の識別処理に必要な連結成分を抽出する。若しくは、得られた蛍光像に適当な画像処理を施し、この画像処理後のイメージ像について、２値化手法を用いて１ビット階調の２値化画像データを取得し、微生物の識別処理に必要な連結成分を抽出することもある。
次に、ステップＳ９７において、微生物と微生物以外とを識別する画像解析処理ならびに各連結成分からなる蛍光体の所在位置の決定を行う。この一連の１領域についての、ステップＳ９４の励起光の照射からステップＳ９７の微生物の識別処理までの工程を、試料の各領域毎にそれぞれ行い、試料の全領域を走査して、各領域ごとに蛍光体の所在位置の決定およびその蛍光体が微生物であるか否かの第１次判定を行う。
次に、ステップＳ９８において、微生物と微生物以外の所在位置マップの生成処理を行い、表示画面に検出された微生物を表示する。表示画面には、３種の識別表示で、微生物や微生物以外を表示することができる。
次に、ステップＳ９９において、画像解析処理結果を保存する。
［検査試料液：図５］
次に、図５の第１次自動識別処理について詳細に説明する。この１次自動識別処理は低倍率のレンズを用いて行なわれる。
微生物検査装置１で測定する検査試料液とは、例えば、ビールなどの飲料であり、本来は微生物や微生物以外の混入物を含まないものである。
しかしながら、製造工程などで、上記説明した微生物や微生物以外の混入物が飲料中に混入する可能性がある。飲料中の微生物としては、例えば、細菌や酵母などがある。その一例を示すと、ビールに有害な細菌であるペクチネータス属菌は幅０．５〜２μｍ、曲線長さは１．５〜１０μｍである。もう一例を示すと、酵母は幅並びに曲線長さは３〜１０μｍである。このように混入する対象物の大きさには種々の大きさが考えられる。そのため微生物検査装置１で使用するフィルタの孔径は、混入する対象物の大きさに応じて適宜変更して使用することができる。
そこで、飲料の一部を適時、検査試料液として取り出し、上記説明した微生物検査装置１を用いて分析することにより、迅速かつ定量的に飲料中に微生物や微生物以外の混入物が含まれているかを自動で識別して、微生物と微生物以外の混入物に分けて表示することにより上記飲料の品質管理を行う。
［検査試料液からの試料の調製：図５のステップＳ９１、９２］
微生物検査装置１を用いて、検査試料液中の微生物の定量分析を行うために、まず試料調製を以下の手順で行う。
まず、ビールなどの飲料から所定量の検査試料液を採取する。次に、メンブレンフィルタを用いたろ過器を用いて検査試料液をろ過することにより、検査試料液中に含まれる全ての微生物や微生物以外の混入物は、メンブレンフィルタ上に捕捉される。
そこで、微生物検査装置１を用いてメンブレンフィルタ上に捕捉された微生物の全数を計数することにより、検査試料液中に含まれる全ての微生物および微生物以外の混入物の数を定量的に分析することができる。（この詳細については後述する。）
次に、ろ過器からメンブレンフィルタを取り出し、メンブレンフィルタ上に捕捉された微生物および微生物以外のもの（以下、試料と呼ぶ）に蛍光標識物質を作用させることにより、試料中の微生物を蛍光標識物質で染色する。ここで、試料中の微生物の染色は、例えば、図３より選ばれた１種または複数の蛍光標識物質を用いて行う。次に、染色された試料を含むメンブレンフィルタを微生物検査装置１の顕微鏡電動ステージ１６に固定することにより検査試料液からの試料の調製が完了する。
［メンブレンフィルタ：図５のステップＳ９１］
なお上記説明したメンブレンフィルタについて説明すると、メンブレンフィルタは、例えば、多くの孔を有する円盤等の平板形状を有し、フィルタ直径は１０〜５０ｍｍ程度であり、フィルタ孔径は、例えば、０．２〜５０μｍであり、孔数は、必要に応じて任意に設計することができる。このため、上記メンブレンフィルタを用いて、フィルタ孔径よりも大きな微生物を捕捉することが可能である。
［蛍光標識物質による染色法：図５のステップＳ９２］
次に、上記説明したメンブレンフィルター上に捕捉された微生物を蛍光標識物質で染色する方法について詳細に説明する。微生物を蛍光標識物質で染色する方法としては、以下説明するＦＩＳＨ法や蛍光抗体法などがある。
まずＦＩＳＨ法について説明すると、ＦＩＳＨ法は、核酸プローブを用い、細胞内の核酸を標的として微生物を蛍光染色して検出する方法である。この方法は、微生物からの核酸抽出工程を必要とせず、前処理した微生物に直接蛍光標識した核酸プローブを添加して微生物細胞内の核酸のうちｒＲＮＡあるいは染色体ＤＮＡとハイブリダイズさせる方法である。
一般的には、微生物細胞内の核酸のうちｒＲＮＡをプローブの標的とする。ｒＲＮＡは生きた微生物細胞内には数千から数十万コピー存在するため、プローブの標的がｒＲＮＡコピー数分だけ存在することになる。このため、核酸プローブに結合した蛍光標識物質が標的とする微生物細胞内に多く留まり、使用した蛍光標識物質に対し適当な励起光を照射すると、蛍光顕微鏡下で標的微生物細胞のみが形態を維持したまま蛍光を発して観察できる。
また染色体ＤＮＡの菌種特異的な領域の相補配列をプローブに使用することも可能であり、同様に菌種特異的な微生物細胞を蛍光染色することができる。
次に、蛍光抗体法について説明すると、蛍光抗体法は、標的微生物細胞のタンパク質や糖類もしくは脂質などからなる抗原を特異的に認識する抗体を用いて、標的微生物を選択的に染色する方法である。この方法は、一般的には、細胞表層に存在する抗原を認識する抗体を用いる。抗体を直接蛍光標識するか、あるいは、一次抗体に結合する２次抗体を蛍光標識することにより、一次抗体が認識する表面抗原を有する微生物を特異的に蛍光染色して検出する。
なお上記説明したメンブレンフィルター上に捕捉した微生物をＦＩＳＨ法または蛍光抗体法を用いて染色する場合に使用する蛍光標識物質の一例を図３に示す。図３は、蛍光標識物質とその励起光および蛍光の関係を示す図である。
図３において、各蛍光標識物質に対応する特定波長を有する励起光を照射すると、各蛍光標識物質に対応する特有波長を有する蛍光を発する。そこで、図３を用いて、蛍光標識物質の選択および励起光と蛍光の波長の選択をすることができる。例えば、蛍光標識物質として、インドカルボシアニン色素（Ｃｙ３）を選択し、５５０ｎｍの波長を有する励起光を照射すると、５７０ｎｍの波長を有する蛍光を観測できる。また、予め、図３に示す複数の蛍光標識物質で試料を染色し、対応する励起光を試料に照射すると、試料より異なる波長を有する複数の蛍光を観測することもできる。
［試料の全面分析と連結成分の抽出：図５のステップＳ９５］
次に、画像解析部３で行う自動蛍光検査機能を用いた試料の全面分析について説明する。
自動蛍光検査機能では、まず試料全域の適正な走査範囲を決定する。すなわち測定対象とする蛍光体の最大径定義域、例えば、１μｍ〜２０μｍの範囲から対物レンズの倍率を例えば、１０倍に設定し、これにより一義的に決定されるＣＣＤカメラ有効視野例えば、横方向１１００μｍ縦方向８７０μｍと、測定対象とする蛍光体の最大径最大値２０μｍから、１画面あたりの走査ステップ量（横方向：１０６０μｍ＝１１００−２０＊２、縦方向：８５０μｍ＝８７０−２０）を自動的に求める。
また、画像解析部３では、１画面あたりにつき撮像エリア以外に測定エリアを定義し、これをステップ量と同じ値とする。すなわち、カメラ撮像範囲１視野につき横方向の両側２０μｍと縦方向の上方２０μｍが走査撮像により隣り合うカメラ撮像範囲視野と重複するように設定する。
画像解析部３では、測定エリア内に連結成分終点（連結成分の占有エリアのうち画面上でもっとも下側かつ右側の画面上での座標）が存在する連結成分を測定対象とするために、上記設定方法を採用することによって対象蛍光体を過不足なく確実に測定できる。
上記説明した内容を図４に示す画面の測定エリア８０で具体的に説明する。図４は、後述する２値化画像であり、画素８１のうち、所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素を斜線で表示し、「アクティブ」画素が接続している「塊」を、連結成分８２と定義する。
また、図４の中央部に示す連結成分８２の占有するエリアを連結成分の占有エリア８３といい、連結成分の占有エリア８３のうち画面上でもっとも下側かつ右側の画面上での画素を連結成分終点８４という。
また画像解析部３では、同時に顕微鏡電動ステージ１６および電動フォーカスモーター１７を制御することにより、常に試料が捕捉されているメンブレンフィルターの同一平面上に自動的に焦点を合わせる。そして制御される顕微鏡電動ステージ１６の位置座標（カメラ撮像範囲視野の座標）とその画面上で測定される連結成分の位置座標から、対象とする蛍光体の像のメンブレンフィルター上における絶対的な位置座標が自動的に決定される。
この方法で試料上全域で得られる蛍光体の像を無人の自動走査で検出することができる。そして、個々の蛍光体の像の蛍光強度や形状の特徴量、例えば、面積、曲線長と曲線幅など（詳細は後述する）のパラメータにて微生物判定のための閾値を予め設けておき、また複数もしくは一つの蛍光強度測定結果から得られる上記特徴量と各閾値とを比較することによって蛍光体が微生物であるか微生物以外であるかなどを無人で自動判定できる。
なお、メンブレンフィルター上での位置座標が求められているために、個々の蛍光体の像について、対物レンズの倍率を上記設定した１０倍から例えば２０倍、４０倍などに変更した後で順次走査することにより、個々の蛍光体の像を更に正確に無人自動などで測定することができる（この操作をＶａｌｉｄａｔｉｏｎ操作という）。このため、微生物や微生物以外の判定がより容易にできる。
なお、上記説明した方法によって得られた測定データおよび個々の蛍光体の画像は、画像解析部３にファイルして保存され、必要があればこのファイルを画像解析部３の管理下で任意に引き出して参照することができる。
［蛍光体の２値化手法による画像処理：図５のステップＳ９６］
次に、上記説明した試料上全域で得られる蛍光体の像について、画像解析部３が画像解析の前に行う画像処理（２値化手法）について説明する。
画像解析部３で扱う画像は多値のディジタル情報により構成されている。例えば、モノクロ画像では、２５６階調（８ビット階調）などを用いる。
画像解析部３は、取り込んだ画像をディジタル化する機能を有するが、本実施形態の場合には、画像取得部２１としてディジタルカメラを使用するため、取得した画像はすでにディジタル化され、多階調画像となっている（２５６階調（８ビット階調））。
次に、画像解析部３は、２値化手法による画像処理を行う。すなわち、２値化とは、この多階調画像から画像を構成する各画素を、任意の範囲の輝度を「アクティブ」とし、他の輝度を「ネガティブ」として「２値」化し、８ビット階調の画像を１ビット階調に変更する。
［連結成分の抽出：図４］
次に、メンブレンフィルターの各測定領域ごとに得られる上記説明した１ビット階調の２値化画像を用いて、微生物の識別処理に必要な連結成分の抽出方法について説明する。
図４は、所定領域である測定エリア８０を測定した画像を上記説明した２値化方法で画像処理した２値化画像の一例である。
図４の中央部に位置する画素８１のうち所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素（斜線部）が接続している「塊」を連結成分８２と定義し、連結成分８２の占有するエリアが連結成分の占有エリア８３であり、連結成分終点８４は、連結成分の占有エリアのうちで最も右下の画面上の座標である。
図４において、所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素の集合体である連結成分８２より、後述する画像解析法を用いて、占有エリア８３の占める面積、平均輝度、曲線長、曲線幅、円形度係数を求めることができる。
［第２次自動識別処理：１波長識別法：図６］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理として、１波長識別法（図６）、２波長識別法（図７）、３波長識別法（図１２）の３種類の識別法について詳細に説明する。
この第２次自動識別処理は、微生物を精度良く識別するため高倍率のレンズを用いて行う。
最初に、１波長識別法による第２次自動識別処理について説明する。
図６に、１波長を用いた第２次自動識別処理のフローチャートを示す。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
図６において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ１９５に進み、第１次自動識別処理によって、抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
次に、ステップＳ９５とステップＳ９６の処理を行ってからステップＳ１９６に進む。なお、図６のステップＳ９５とステップＳ９６は、図５で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するのでここでの説明は省略する。
ステップＳ１９６は、１波長の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、微生物の自動識別処理として、蛍光体の像の蛍光強度や形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する面積法、平均輝度法、曲線長法などがある。以下、図８〜図１０を用いて詳細に説明する。
図８は、１波長の励起光を用いる微生物の識別処理法の一例として、面積法、平均輝度法、曲線長法、曲線幅法および円形度係数法と各方法における微生物の判定基準を示している。
図９は、図８に示した曲線長法、曲線幅法および円形度係数法における曲線長、曲線幅および円形度係数の算出式を示している。
図１０は、具体的な蛍光像から曲線長法、曲線幅法および円形度係数法を用いて曲線長、曲線幅および円形度係数を算出した一例を示している。
［面積法：図８］
まず面積法について説明する。
面積法は、図８に示すように、撮像によって得られる連結成分の全画素数（ｐｉｘ）と、予め作成されている単位画素当たりの実面積であるキャリブレーション値（（μｍ）２／ｐｉｘ）との積である連結成分の実面積（（μｍ）２）を求め、次に、予め設定されている判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する方法である。判定基準（図８）の例として、例えば、連結成分の実面積が５〜２００（μｍ）２であれば、連結成分は微生物であると識別する。
［平均輝度法：図８］
次に、平均輝度法について説明する。
平均輝度法は、図８に示すように、連結成分を構成する各画素の輝度（０〜２５５）より平均輝度を求める方法であり、各画素の輝度を合計した全輝度を全画素数（ｐｉｘ）で割った値である。判定基準（図８）の例として、例えば、連結成分の平均輝度が１０〜２５５であれば、連結成分は微生物であると識別する。
［曲線長法：図８］
次に、曲線長法について説明する。
曲線長（ＣＬ：Ｃｕｒｖｅ Ｌｅｎｇｔｈ）法は、図８に示すように、対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も長い画素サイドの長さ（ｐｉｘ）と、予め作成されている単位画素長さであるキャリブレーション値（μｍ／ｐｉｘ）との積である曲線長（μｍ）を求める。
例えば、図１０Ａの対象連結成分の曲線長は、１１（ｐｉｘ）であり、図１０Ｂの対象連結成分の曲線長は、５（ｐｉｘ）である。
次に、予め設定されている微生物の判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する。
なお対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も長い画素サイドの長さは、図９に示す定義式を用いて算出する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、曲線長が０．５〜５０μｍであれば、連結成分は微生物であると識別する。なお曲線長の値は、曲げられた微生物、ファイバ等の長さを与える。
［曲線幅法：図８］
次に、曲線幅法について説明する。
曲線幅（ＣＷ：Ｃｕｒｖｅ Ｗｉｄｔｈ）法は、図８に示すように、対象連結成分と同じエリア、および、周囲長を持つ長方形の最も短いサイドの長さ（ｐｉｘ）と、予め作成されている単位画素長さであるキャリブレーション値（μｍ／ｐｉｘ）との積である曲線長（μｍ）を求める。
例えば、図１０Ａの対象連結成分の曲線幅は、２（ｐｉｘ）であり、図１０Ｂの対象連結成分の曲線幅は、２（ｐｉｘ）である。
次に、予め設定されている微生物の判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する。
なお対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も短い画素サイドの長さは、図９に示す定義式を用いて算出する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、曲線幅が０．１〜１０μｍであれば、連結成分は微生物であると識別する。なお曲線長の値は、曲げられた微生物、ファイバ等の幅を与える。
［円形度係数法：図８］
次に、円形度係数法について説明する。
円形度係数（Ｒ：Ｒｏｕｎｄｎｅｓｓ）法は、図９に示す定義式によって与えられる無次元数であり、対象連結成分が円の場合に最小値１を与え、対象連結成分がそれ以外の場合に１より大きな値を与える。
例えば、図１０Ａの対象連結成分の円形度係数は、２．３であり、図１０Ｂの対象連結成分の円形度係数は、１．５である。
なお図９に示す定義式において、１．０６４は調整ファクタであり、画像のディジタル化によって発生するコーナーの誤差を全周にわたって訂正する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、曲線幅が１〜１０μｍであれば、連結成分は微生物であると識別する。
次に、図６のステップＳ１９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ１９５に戻り上記説明したステップＳ１９５〜ステップＳ１９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ１９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進む。
次に、ステップＳ１９８において、ステップＳ９９で抽出された各蛍光体に対してステップＳ１９６での判定に基づき、微生物と微生物以外の所在位置マップの生成処理を行い、表示画面に検出された微生物を表示する。表示画面には、３種の識別表示で微生物や微生物以外を表示できる。
次にステップＳ１９９において、各蛍光体に関して画像解析処理による微生物判定結果を保存することにより、１波長の励起光を用いる微生物の自動識別処理が終了する。
このようにして、１波長識別法では、蛍光体の形状の特徴から微生物を識別することができる。
［第２次自動識別処理：２波長識別法：図７］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理の２番目の方法として、２波長の励起光を用いる２波長識別法について詳細に説明する。
なお、２波長識別法では、検出したい微生物、すなわち標的とする微生物が特定の励起光を照射したときに蛍光を発するように、試料は予め図３に示す蛍光標識物質を用いて染色しておく。
まず、２波長識別法の概要を説明すると、１種類の蛍光標識物質を用いて試料に含まれる標的微生物を染色し、この蛍光標識物質に対応する励起光とそれ以外の励起光をこの試料に順次照射し、対応して各蛍光体から放出される蛍光像を順次検出し、各励起光に対応して得られる蛍光像を組み合わせて各蛍光体ごとに蛍光スペクトルを作成し、得られた蛍光スペクトルを予め設定されている判定基準用の蛍光スペクトルと比較する。その結果より、各蛍光体が標的微生物なのか、あるいは、標的微生物以外の物であるのかを個々に識別し、試料中の標的微生物を識別することができる。
図７および図１４に、２波長を用いた微生物の自動識別処理のフローチャートを示す。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
図７において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ２９３に進み、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
次に、第１波長を有する励起光を用いてステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を行って蛍光体の形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してからステップＳ２９４に進む。なお、図７のステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その詳しい説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
次に、ステップＳ２９４で、蛍光フィルターを切り換えてから、ステップＳ２９５に進み、第２波長を有する励起光を用いて上記説明したステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を繰り返し行う。
次に、ステップＳ２９５の処理が終了すると、次にステップＳ２９６に進む。ステップＳ２９６では、ステップＳ１９６で特定された各標的の微生物の可能性がある蛍光体の中から標的の微生物を識別する。ステップＳ２９６は、２波長の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、その詳細を図１４に示す。すなわち、ステップＳ２００で、各励起光に対して各フィールドごとに得られる蛍光体より蛍光スペクトルまたはピークの波長を作成し、次に、ステップＳ２０１で、得られた蛍光スペクトルまたはピークの波長を判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と照合して各フィールドの蛍光体から微生物を識別する。
次に、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ２９８に進み、蛍光フィルターを原位置に戻してからステップＳ２９３に戻り上記説明したステップＳ２９３〜ステップＳ２９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進み、ステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理を行う。
なお、図７のステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
次に、上記説明した２波長識別法における第２次自動識別処理について図１１〜図１３を用いて具体的に説明する。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
２波長の励起光を用いる第２次自動識別処理では、まず、１波長識別法で説明した面積法、平均輝度法、曲線長法などを２波長の励起光にそれぞれ適用して各励起光に対する蛍光体の蛍光強度や形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してから（ステップＳ１９６）、次に、各励起光に対して得られる標的の微生物の可能性がある蛍光体の違いを利用して微生物を識別する（ステップＳ２９６）。
図１１は、２波長の励起光を用いる第２次識別処理で得られる各フィールドの蛍光体（２値化画像）の例を説明する図である。
２波長の励起光を用いる第２次識別処理では、異なる２つの励起光１（例：Ｃｙ３検出用）および励起光２をメンブランフィルタ上の試科に照射し、例えば図１１に示すように、それぞれの励起光に対応して各フィールド（ここでは、Ａ、Ｂ、Ｃの３フィールド）ごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）３０１〜３０６を取得する。
次に、図１２に示すように２つの励起光１および励起光２に対してフィールドＡ、Ｂ、Ｃでそれぞれ得られる６つの蛍光体３０１〜３０６を組み合わせて、蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４またはピークの波長３５１、３５３、３５５を作成する。
例えば、フィールドＡでは、２つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体３０１と３０４とを組み合わせて２つのピークを有する蛍光スペクトル３５０またはピークの波長３５１を作成する。フィールドＢでは、２つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体３０２と３０５とを組み合わせて１つのピークを有する蛍光スペクトル３５２またはピークの波長３５３を作成する。フィールドＣも同様に行って、蛍光スペクトル３５４またはピークの波長３５５を作成する。
次に、作成した蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４またはピークの波長３５１、３５３、３５５を、図１３に一例を示す標的の微生物を示す判定用蛍光スペクトル３６０，異物を示す判定用蛍光スペクトル３６１または判定基準（２波長用）３６２とそれぞれ比較する。判定用蛍光スペクトルまたは判定基準は、予め各励起光に対応して得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルまたはピークの波長が標的の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。例えば、図１１の各フィールドごとに得られた蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４を標的の微生物を示す判定用蛍光スペクトル３６０，異物を示す判定用蛍光スペクトル３６１と比較することにより、図１１の３つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＡ、Ｃの蛍光体は異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルまたは判定基準は、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
このようにして、蛍光体（２値化画像）３０１〜３０６から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
［第２次自動識別処理：３波長以上識別法：図１５］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理の３番目の方法として、３波長以上の励起光を用いる３波長以上識別法について、３波長の励起光を用いる３波長識別法を例にとり詳細に説明する。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
なお、３波長を用いる識別法では、予め試料中に含まれる標的の微生物、標的以外の微生物を識別できるように、試料を２種の蛍光標識物質（例えば、Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって染色する。一例を示せば、標的の微生物（例えば、ペクチネータス菌）は、２種の蛍光標識物質（Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって２重に染色し、標的以外の微生物は、１種の蛍光標識物質（ＤＡＰＩ）のみで染色する。
まず３波長識別法の概要を説明する。 ２種の蛍光標識物質を用いて試料に含まれる微生物を標的微生物とそれ以外の微生物が識別できるように染色し、この蛍光標識物質に対応する２種の励起光とそれ以外の励起光をこの試料に順次照射し、対応して各蛍光体から放出される蛍光像を順次検出し、各励起光に対応して得られる蛍光像を組み合わせて各蛍光体ごとに蛍光スペクトルを作成し、得られた蛍光スペクトルを予め設定されている判定用の蛍光スペクトルと比較する。その結果、各蛍光体が標的の微生物なのか、その他の微生物か、あるいは、それ以外の物体であるのかを個々に識別し、試料中の標的微生物を識別することができる。
図１５および図１４に、３波長を用いた微生物の自動識別処理のフローチャートを示す。
図１５において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ２９３に進み、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
次に、第１波長を有する励起光を用いてステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を行って蛍光体の蛍光強度や形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してからステップＳ２９４に進む。なお、図１５のステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
次に、ステップＳ３９０に進み、次の励起光による照射を行うために次の蛍光フィルターに切り替える必要がある場合には、ステップＳ２９４に進み、蛍光フィルターを切り替えてから、ステップＳ２９５に進み、第２波長を有する励起光を用いて上記説明したステップＳ９５とステップＳ９６の処理を繰り返し行ったのちに、ステップＳ３９６に進む。一方、ステップＳ３９０において、全ての励起光による照射が終了し、次のフィルタの切り替えが必要ない場合には、ステップＳ３９６に進む。
ステップＳ３９６では、ステップＳ１９６でそれぞれ特定された標的の微生物の可能性がある蛍光体の中から標的の微生物を識別する。ステップＳ３９６は、３波長以上の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、その詳細を図１４に示す。すなわち、ステップＳ２００で、各励起光に対して各フィールドごとに得られる蛍光体より蛍光スペクトルまたはピークの波長を作成し、次に、ステップＳ２０１で、得られた蛍光スペクトルまたはピークの波長を判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と照合して各フィールドの蛍光体から微生物を識別する。
次に、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ２９８に進み、蛍光フィルターを原位置に戻してからステップＳ２９３に戻り上記説明したステップＳ２９３〜ステップＳ３９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進み、ステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理を行う。
なお、図１２のステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
次に、上記説明した３波長識別法における第２次自動識別処理について図１６〜図２０を用いて具体的に説明する。
３波長の励起光を用いる第２次自動識別処理では、まず、１波長識別法で説明した面積法、平均輝度法、曲線長法などを３波長の励起光にそれぞれ適用して各励起光に対する蛍光体の蛍光強度や形状から標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定し（ステップＳ１９６）、次に、各励起光に対して得られる標的の微生物の可能性がある蛍光体の違いを利用して微生物を識別する（ステップＳ３９６）。
図１６は、３波長の励起光を用いる第１次および第２次識別処理で得られる各フィールドの蛍光体（２値化画像）の例を説明する図である。
３波長の励起光を用いる第１次識別処理では、低倍率のレンズを用い、例えば励起光２（ＤＡＰＩ検出用）をメンブランフィルタ上の試料に照射し、励起光２に対応して各フィールドごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）４１３〜４１６を取得する。
次に、３波長の励起光を用いる第２次識別処理では、第１次識別処理で蛍光体が検出されたフィールドのみに、異なる３つの励起光１〜励起光３を順次照射し、例えば図１６に示すように、それぞれの励起光に対応して各フィールド（ここでは、Ａ〜Ｄの４フィールド）ごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）４０１〜４１２を取得する。
次に、図１７に示すように３つの励起光１〜励起光３に対してフィールドＡ〜Ｄでそれぞれ得られる３つの蛍光体４０１〜４１２を組み合わせて、蛍光スペクトル４５１〜４５４を作成する。なお図１７では省略したが、蛍光スペクトル４５１〜４５４の代わりに図１２で示したようなピークの波長を作成してもよい。
例えば、フィールドＡでは、３つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体４０１と４０５と４０９とを組み合わせて３つのピークを有する蛍光スペクトル４５１を作成する。フィールドＢでは、３つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体４０２と４０６と４１０とを組み合わせて２つのピークを有する蛍光スペクトル４５２を作成する。フィールドＣおよびＤも同様に行って、１つのピークを有する蛍光スペクトル４５３、４５４を作成する。
次に、作成した蛍光スペクトル４５１〜４５４を、図１８に一例を示す判定用蛍光スペクトル４６０〜４６３とそれぞれ比較する。判定用蛍光スペクトルは、１次識別用に用いた励起光と、２次識別用に用いた励起光の組み合わせに対応してそれぞれ用意されており、得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルが標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。
なお、図１８に一例を示す判定用蛍光スペクトル４６１〜４６３は、４６０に示す１次識別用励起光として励起光２を照射したときに試料から検出された蛍光体について、励起光１〜３を用いて２次識別するときに用いる３波長用の判定用蛍光スペクトルの例であり、４６１は異物を、４６２は標的の微生物を、４６３は標的以外の微生物をそれぞれ示している。
図１６の各フィールドごとに得られた蛍光スペクトル４５１〜４５４を判定用蛍光スペクトル４６１〜４６３と照合することにより、図１６の４つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＣ、Ｄの蛍光体は標的以外の微生物、フィールドＡは異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルは、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
また、上記説明した蛍光スペクトルを作成するかわりに図１２で示したピークの波長を作成してもよい。この場合には、判定用蛍光スペクトルの代わりに予め画像解析部３に記憶されている図１３で示したような３波長用の判定基準を用いればよい。
このようにして、蛍光体（２値化画像）４０１〜４１２から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準とを比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
［３波長識別法の別の例：図１９］
図１９は、３波長の励起光を用いる第２次識別処理の別の例について説明する図である。試料中に含まれる微生物は、予め標的の微生物、標的以外の微生物を識別できるように、試料は２種の蛍光標識物質（例えば、Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって染色されている。
図１９の例が図１６に示した例と異なる点は、図１６では、第２次識別処理に先だっで低倍率で蛍光体を検出する第１次識別処理で使用する励起光に励起光２（ＤＡＰＩ検出用）を用いるのに対して、図１９では、第１次識別処理で使用する励起光に励起光１（Ｃｙ３検出用）を用いる点である。
図１９の５０１〜５０５は、第１次識別処理で検出される蛍光体を示している。すなわち、励起光１（Ｃｙ３検出用）をメンブランフィルタ上の試料に照射し、励起光１に対応して各フィールド（ここでは、Ａ〜Ｅの５フィールド）から検出される蛍光体の２値化画像である。なお、フィールドＥからは蛍光体は得られないことを示している。
次に、図１９に示すように３つの励起光１〜励起光３に対してフィールドＡ〜Ｄでそれぞれ得られる３つの蛍光体５０６〜５１７を組み合わせて、図示はしないが、図１７と同様の蛍光スペクトルあるいは図１２で示したピークの波長を作成する。
次に、作成した蛍光スペクトルを、図２０に一例を示す３波長用の判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４とそれぞれ比較する。なお図２０の判定用蛍光スペクトルは、４７０に示す１次識別用に用いた励起光と、２次識別用に用いた励起光の組み合わせに対応してそれぞれ用意されており、得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルが標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。
なお、図２０に一例を示す判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４は、４７０に示す１次識別用励起光として励起光１を照射したときに試料から検出された蛍光体について、励起光１〜３を用いて２次識別するときに用いる３波長用の判定用蛍光スペクトルの例であり、４７１は異物を、４７２は標的の微生物を、４７３、４７４は異物をそれぞれ示している。
図１９の各フィールドごとに得られた図示しない蛍光スペクトルを判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４と照合することにより、図１９の４つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＡ、Ｃ、Ｄの蛍光体は異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルは、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
このようにして、蛍光体（２値化画像）５０６〜５１７から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準とを比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
なお、図１９では、第１次識別処理で使用する励起光に標的の微生物のみを識別する励起光１（Ｃｙ３検出用）を用いるため、標的以外の微生物は、第１次自動識別によって除外される。このため、試料中に含まれる微生物のうちで標的の微生物のみを第１次自動識別で、識別できる。また図１９に示す識別法は、第１次自動識別で識別された蛍光体（フィールドＡ〜Ｄ）の中から標的の微生物（フィールドＢ）を異物（フィールドＡ，Ｃ，Ｄ）と精度良く識別することができる。
以上説明したように、本実施形態の微生物の検査装置は、微量の蛍光を検出することが可能であるため、試料中の１個体の標的微生物を検出することができる。そのため、従来のように多量の微生物を含む試料を作製するために培養に長時間かけてコロニー形成させる必要も無い。
また検出された蛍光体の画像より、形状の特徴量、例えば、連結成分の平均蛍光強度、面積、曲線長と曲線幅の比など各種パラメータを算出し、算出された各種パラメータに基づいて、蛍光体の画像が微生物によるものか否かを無人自動で検出できる。そのため、従来のように目視で微生物の識別を確認も必要としないため精度の高い迅速な微生物の自動検出が可能となる。
したがって、本発明による測定装置は、飲料、食品、医薬、化粧品等の工程管理、製品品質管理等における微生物検査の他、排水、工業用水、環境サンプル、上下水道における微生物検査、生命工学等の種々の研究分野における微生物検査、更には自家蛍光をもつ微小片の検出および数の検査等に応用できる。
以上説明したように、本発明によれば、例えば、検査対象となる試料中に含まれる微生物に関する情報を自動で迅速に取得可能な微生物の検査装置および検査方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係る一実施形態の微生物の検査装置である。
図２は、本発明に係る一実施形態の微生物の検査装置の全体構成を説明する図である。
図３は、蛍光標識物質、励起光および蛍光の関係を示す図である。
図４は、連結成分について説明する図である。
図５は、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出する第１次自動識別処理のフローチャートである。
図６は、１波長識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図７は、２波長識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図８は、微生物の識別方法とその判定基準を説明する図である。
図９は、画素の連結成分から曲線長、曲線幅および円形度係数の算出方法を説明する図である。
図１０は、画素の連結成分から曲線長、曲線幅および円形度係数を算出する例を説明する図である。
図１１は、２波長識別法の第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の例を説明する図である。
図１２は、２波長識別法で、各フィールドの２値化画像から蛍光スペクトル（あるいはピークの波長）を得る手順を説明する図である。
図１３は、２波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルまたは判定基準の一例を示す図である。
図１４は、各フィールドの蛍光体から微生物を識別する処理のフローチャートである。
図１５は、３波長以上識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図１６は、３波長識別法の第１および第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の例を説明する図である。
図１７は、３波長識別法の一例で、第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像から蛍光スペクトルを得る手順を説明する図である。
図１８は、３波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルまたは判定基準の一例を示す図である。
図１９は、３波長識別法の第１および第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の別の例を説明する図である。
図２０は、図１９の３波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルの別の例を示す図である。
本発明は、微生物の検査装置および検査方法に関し、例えば、試料液中に含まれる微生物などをフィルターで捕捉し、捕捉した微生物に蛍光染色し、顕微鏡を用いて微生物を微生物以外のものと自動識別して表示する微生物の検査装置および検査方法に関する。
背景技術
従来、微生物検査、例えば、ビールなどの飲料、食品、医薬品、化粧品などの製造工程管理、製品品質管理などにおける微生物検査は、多種多様な培地を必要とする培養検査により行なわれており、検査が終了するまでに相当な日数を要していた。
このため検査対象中に微生物が存在するか否か、あるいは微生物の数、あるいは存在している微生物種の同定などの検査結果の判明が遅れ、種々の分野における研究、開発、製造あるいは製品出荷の段階で多大な制約があった。
このような背景から、現在に至るまで多くの微生物を含む液体試料中などから微生物を迅速に測定する方法が考案されている（例えば、「微生物検査技術の最新動向」，食品と開発３５（１），Ｐ３２−４０（２０００）など）。
微生物を迅速に測定する方法として知られているものとしては、例えば、インピーダンス法（Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．、Ｗａｒｎｅｒ，Ｍ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｃ．、Ｗａｒｒｅｎ，Ｒ．、Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、３７、６５〜６９（１９８４））、酵素−蛍光検出法（特開昭５８−１１６７００号公報）、ＰＣＲ法、メンブレンフィルター法と蛍光顕微鏡法とを組み合わせたＤＥＦＴ法（Ｇ．Ｌ．ＰＥＴＴＩＰＨＥＲ，ＵＢＡＬＤＩＮＡＭ．ＲＯＤＲＩＧＵＥＳ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．５３，３２３（１９８２））、あるいはメンブランフィルター法とＡＴＰ法を組み合わせたＲＭＤＳ法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．，Ｎａｋａｋｉｔａ．Ｙ．，Ｗａｔａｒｉ．Ｊ．，Ｓｈｉｎｏｔｓｕｋａ．Ｋ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４（５），Ｐ１０３２−１０３７（２０００））などがあり、これらの測定原理を応用した機器も市販されている。
しかしながら、上記説明した方法には、１）精度が不十分である、２）迅速な測定に適さない、３）定量性が不十分である、４）人為的誤差を含む可能性が高いなど、多くの問題が残されている。また、５）測定に必要な培地や試薬等のランニングコストが高い点も問題である。
一方、試料溶液中に存在する微生物をろ過して微生物等を分離し、得られた微生物を含む試料を蛍光染色し、この試料を蛍光顕微鏡で、観測者が目視観察しながら微生物と微生物以外のものを識別する方法も知られている。
しかしながら、上記の方法では、蛍光染色した試料から発生する蛍光像を観測者が目視観察しながら微生物と微生物以外のものとに識別するために、測定結果に対して測定者の誤認などによる誤りが入る可能性もあった。また、微生物と微生物以外のものとを無人で識別することは不可能であった。
発明の開示
本発明は、上記説明した従来技術の問題点を解決するためになされたものであり、その目的は、例えば、検査対象となる試料中に含まれる微生物を自動で迅速に識別可能な微生物の検査装置および検査方法を提供することである。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の検査方法は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査方法であって、前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射する照射工程と、前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程と、を含むことを特徴とする。
ここで、例えば、前記各物体から得られる蛍光体の蛍光強度あるいは形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する検査工程を更に有し、前記識別工程では、前記検査工程で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
ここで、例えば、前記照射工程では、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順にまたは同時に前記試料に照射することが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別工程では、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記識別工程では、前記各物体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
ここで、例えば、前記微生物は特定の微生物であることが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記識別工程では、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記識別工程では、前記各物体から得られる蛍光スペクトルを前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
ここで、例えば、前記微生物は特定の微生物であることが好ましい。
ここで、例えば、前記検査方法は、１次検査工程と、２次検査工程とを含み、前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光物体を特定し、前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で特定された各蛍光物体を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各蛍光物体の蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
ここで、例えば、前記検査方法は、１次検査工程と、２次検査工程とを含み、前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光物体のうち、標的の微生物を標的以外の微生物から分離して抽出し、前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で抽出した各標的の微生物を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各標的の微生物の蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、該フィルタ上に捕捉された微生物を含む物体を蛍光標識物質を用いて染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、２つ以上の波長を含む励起光を照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が１つ以上の蛍光におけるピークを有するように該フィルタ上に捕捉された微生物を蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
ここで、例えば、前記２つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
ここで、例えば、前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）、プロビディウム・イオダイド、およびフルオレセインニソチシオシアネート（ＦＩＴＣ）のうちのいずれか１つ以上の蛍光標識物質が用いられることが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、３つ以上の波長を含む励起光を該フィルタに照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が２つ以上の蛍光におけるピークを有するように、該フィルタ上に捕捉された微生物を異なる種類の蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことが好ましい。
ここで、例えば、前記３つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される３つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
ここで、例えば、前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）、プロビディウム・イオダイドおよびフルオレセインニソチシオシアネート（ＦＩＴＣ）のうちのいずれか２つ以上の蛍光標識物質が用いられることが好ましい。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の検査装置は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査装置であって、前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射する照射機構と、前記試料を撮像する撮像装置と、前記撮像装置による撮像結果を分析する分析装置と、を備え、前記分析装置は、前記撮像結果より前記複数の励起光に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別するように構成されていることを特徴とする。
ここで、例えば、前記分析装置は、前記各物体から得られる蛍光体の蛍光強度あるいは形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する検査部を更に有し、前記分析装置は、前記検査部で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることが好ましい。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の検査装置は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査装置であって、前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射しながら該試料を撮像した結果を取り込む入力装置と、前記入力装置で取り込んだ撮像結果より前記複数の励起光に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する分析装置と、を備えることを特徴とする。
ここで、例えば、前記照射機構は、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順にまたは同時に前記試料に照射することが好ましい。
ここで、例えば、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記分析装置は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記分析装置は、前記各物体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することが好ましい。
ここで、例えば、前記検査装置は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、前記分析装置は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記分析装置は、前記各物体から得られる蛍光スペクトルを前記励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各物体が微生物であるか否かを識別することが好ましい。
ここで、例えば、前記検査装置は、前記照射機構と前記撮像装置と前記分析装置とを制御する制御装置を更に備え、前記制御装置は、前記照射機構を用いて前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析して前記試料中に含まれる蛍光物体を特定するように制御し、次に、前記特定された各蛍光物体に前記照射機構を用いて前記励起光を照射しながら、前記特定された各蛍光物体のみを前記第１倍率よりも高い第２倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析することにより前記各蛍光物質の蛍光におけるピークの分布を得るように制御することが好ましい。
ここで、例えば、前記検査装置は、前記照射機構と前記撮像装置と前記分析装置とを制御する制御装置を更に備え、前記制御装置は、前記照射機構を用いて前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析して前記試料中に含まれる蛍光物体のうち、標的の微生物を標的以外の微生物から分離して抽出するように制御し、次に、前記抽出された各標的の微生物を前記第１倍率よりも高い第２倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析することにより前記標的微生物の蛍光におけるピークの分布を得るように制御することが好ましい。
ここで、例えば、前記複数の励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることが好ましい。
ここで、例えば、前記撮像装置は、電動ステージを更に備え、前記制御装置は、前記電動ステージを制御して前記試料の全領域を走査しながら前記試料の全領域を撮像するように前記撮像装置を制御することが好ましい。
ここで、例えば、前記撮像装置は、対物レンズと、前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保つように予め設定されている方程式とを備え、前記制御装置は、前記走査の際に前記方程式に基づいて焦点のずれが生じないように前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保ちながら前記試料の全領域を撮像するように前記撮像装置を制御することが好ましい。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態の制御プログラムは、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査装置を制御する制御プログラムであって、前記検査装置から前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光が照射された際に前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程を含むことを特徴とする。
上記目的を達成するための本発明に係る一実施形態のコンピュータ可読記憶媒体は、以下の構成を有する。すなわち、試料中に含まれる微生物を検査する検査装置を制御する制御プログラムを格納したコンピュータ可読記憶媒体であって、前記制御プログラムは、前記検査装置から前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光が照射された際に前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程を含むことを特徴とする。
上記構成を有する微生物の検査方法および装置により、２波長または３波長以上の励起光を試料に照射し、それぞれの励起光に対応して得られる複数の蛍光像を比較することにより、試料液中に混入した微生物を自動で識別することが可能となるため検査時間が短縮でき、人為的なミスによる測定の誤りを防止することもできる。
発明を実施するための最良の形態
以下に図面を参照して、本発明に係る好適な実施の形態を説明する。
［微生物の検査装置：図１、２］
まず図１および図２を用いて本発明に係る一実施形態の微生物検出装置１について説明する。図１は、微生物検査装置１の全体構成を説明する図であり、図２は、微生物検査装置１の各部の制御を説明する図である。
図１において、微生物検査装置１は、蛍光顕微鏡部２と画像解析部３より構成されている。
蛍光顕微鏡部２は、微生物を含む試料を拡大観察する蛍光顕微鏡本体１０と、蛍光顕微鏡本体１０で拡大観察された試料像を光電変換して画像化する画像取得部２１（例えば、冷却ＣＣＤカメラ等のモノクロあるいはカラーのカメラ）とを有する。画像取得部２１は、画像解析部３によって制御２３され、画像取得部２１で取得した画像データ２２は、画像解析部３に送られる。画像データ２２は演算部５０や識別部４４で解析され、試料に含まれる微生物が識別される。
ここで、微生物を含む試料とは、例えば、ビールなどの飲料であり、本来は微生物や微生物以外の混入物を含まないもの（検査試料液）であるが、製造工程などで、微生物や微生物以外の混入物が混入しているか否かを調べるために検査試料液から所定量取り出したものをいう。また、検査試料液から微生物検出装置１で用いる試料は、メンブレンフィルタを用いたろ過器を用いて検査試料液をろ過して、メンブレンフィルタ上に微生物や微生物以外の混入物を捕捉し、次に、ろ過器からメンブレンフィルタを取り出し、微生物や微生物以外のものが捕捉されたメンブレンフィルタに蛍光標識物質を作用させて、試料中の微生物を蛍光標識物質で染色する手順で調製される。なお試料中の微生物の染色に用いる蛍光標識物質は、必要に応じて１種または複数使用する。
光学顕微鏡１０は、蛍光染色した微生物を含む試料の載置用の顕微鏡電動ステージ１６、電動フォーカスモーター１７、高出力水銀ランプ、キセノンランプなどを用いて発生する励起光を上記試料に照射し、標的微生物を強く蛍光標識する光源部１８、光源部１８から顕微鏡電動ステージ１６への光路中に設けられた励起光のうちの１つあるいは複数の特定波長を選択するフィルタおよび励起光の照射により試料から発生する蛍光のうち１つあるいは複数の特定波長を選択するフィルターを備えた蛍光フィルターブロック切り換え部１９および対物レンズを切り換えるレンズ切り換え部２０を備えている。
光学顕微鏡１０は、蛍光標識物質で染色した微生物を含む試料を励起するために、異なる特定波長を有する複数の励起光を順次、この試料に照射し、蛍光フィルターブロック切り換え部１９を順次切り替えることにより、各励起光に応じて得られる蛍光をそれぞれ検出することができる。また、異なる特定波長を有する複数の励起光を同時にこの試料に照射してもよい。
光学顕微鏡１０より、画像解析部３には、現在の諸条件、例えば、レンズ、フィルタ、ステージ位置、フォーカス位置などの測定情報２４が送られる。
また、画像解析部３は、顕微鏡電動ステージ１６用の電動フォーカスモーター１７の制御に必要な演算を実行する制御部４０、得られた画像データ２２に適切な処理を施し、後述する個々の画素の連結成分に基づいて微生物か否かを識別するための特徴情報を自動で算出する演算部５０、検査方法の定義入力や微生物の判定に使用する閾値などを入力するキーボード７２とステージフォーカス移動用トラックボール７１などからなる入力部７０および光学顕微鏡による撮像結果や各種解析結果等を表示する表示部６０とを備えている。
なお画像解析部３における処理は、各励起光ごとに行われるため、異なる波長を有する複数の特定波長を有する励起光を用いて各領域ごとに蛍光体が発する蛍光像を取得することができる。また、蛍光像を取得した場合には、各励起光ごとに得られる蛍光像を記憶すると共に、各励起光ごとに得られる蛍光像を組み合わせて蛍光スペクトル（あるいはピークの波長）を作成し、この蛍光スペクトルを予め設定されている判定用蛍光スペクトル（あるいは判定基準）と比較することで、蛍光体を、標的の微生物、標的以外の微生物、微生物でない異物などに識別することができる。判定用蛍光スペクトル（あるいは判定基準）は、画像解析部３に記憶されている。
画像解析部３では、試料の測定から微生物を識別する解析までの各工程を制御する自動蛍光検査機能を有している。この自動蛍光検査機能は、画像解析部３のＲＯＭに格納された自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３のＣＰＵがＲＡＭを用いて実行するものであり、蛍光染色された試料（例えば、メンブレンフィルター上に微生物を捕捉してこれを蛍光染色した試料）の全面を走査できるように顕微鏡電動ステージ１６を駆動させる機能、試料の全面走査に連動して各測定視野ごとに行われるフォーカス制御機能、試料における蛍光信号の検出部位を記憶しておき、試料を走査した後にこの部位の蛍光体を顕微鏡観察によって再確認できるようにする機能（例えば１次全領域検査時よりも高倍率レンズを用いる、あるいは１次検査に用いた励起光に加えて一つ以上の異なる励起光を照射する方法、あるいは両者を組み合わせる方法、すなわち無人自動および目視のＶａｌｉｄａｔｉｏｎ機能）、あるいは取得した画像中の個々の連結成分から蛍光強度や形状の特徴量を自動検出し、微生物の可能性がある蛍光体を特定する機能、この特定された微生物の可能性がある蛍光体に基づいて蛍光スペクトルやピークの波長を自動で作成し、微生物を識別する機能などがある。
なお制御部４０は、メンブランフィルタの全領域に励起光を順次照射するためにメンブランフィルタの全領域を所定領域ずつに分割し、試料台をその所定領域ずつ移動させる顕微鏡電動ステージ１６の移動に追従しながらフォーカス制御を実行して常に焦点を合わせる電動フォーカス制御部４１、顕微鏡電動ステージ１６を駆動させて微生物を含む試料の全面走査を可能にする電動ステージ制御部４２および顕微鏡及びカメラ制御部４３および画像取得部２１から送信される画像データ２２から微生物を識別する識別部４４を有する。顕微鏡及びカメラ制御部４３は、光源シャッター、レンズ切り替え、蛍光フィルターブロック切り替え、露光開始タイミング、露光時間の制御などを行う。また、制御部４０を用いて種々の制御ができるが、一例を示すと、光学顕微鏡１０の倍率を低倍率のレンズを用いて低倍率にしてから、特定波長を有する励起光で微生物を含む試料の各領域を順次照射しながら微生物を含む試料の全面を走査することにより蛍光体を検出し記憶し（第１次自動識別）、次に、蛍光体が検出された領域のみを、高倍率のレンズを用いて１種または２種以上の複数の特定波長を有する励起光で順次照射しながら各蛍光体の詳細な識別を行えるように制御することもできる。
測定する蛍光体の最大径の定義域内において、試料走査域数を計算する演算部５０は、検査域定義演算部５１および、顕微鏡電動ステージ１６と電動フォーカスモーター１７を制御することにより、微生物を含む試料を全面走査する際に微生物を含む試料の所定平面に焦点を設定すると常にその同一平面に自動的に焦点を合わせるようにする（プレディクティブフォーカス法などと呼ぶことがある）プレディクティブフォーカス演算部５２とを有する。
プレディクティブフォーカス法を更に詳しく説明すると、プレディクティブフォーカス法とは、走査定義範囲（ＸＹ一定範囲）内において、試料面と対物レンズとの距離（Ｚ一定）を一定に保つ方程式（試料平面の式）を予め設定し、測定走査の際には走査座標に応じて自動的に試料平面方程式どおりに焦点位置を制御する方法である。
［微生物の検査方法］
次に、上記説明した微生物検査装置１を用いる微生物の自動識別方法について説明する。
すなわち、まず、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出する第１次自動識別処理を図５を用いて説明し、次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理について、１波長識別法（図６）、２波長識別法（図７）、３波長識別法（図１５）の３種類の識別法を詳細に説明する。
なお、第１次および第２次自動識別処理は、どのようなレンズの倍率で行うことも可能であるが、以下の説明では、第１次自動識別処理を低倍率のレンズを用いて行い、第２次自動識別処理を高倍率のレンズを用いて行う場合を例にとって説明する。
［第１次自動識別処理の概要：図５］
図５は、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出するための第１次自動識別処理の手順について説明するフローチャートである。
なお、ステップＳ９１〜Ｓ９３は、前処理であり、ステップＳ９４〜Ｓ９９が第１次自動識別処理である。この第１次自動識別処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
まず、ステップＳ９１において、検査試料液を所定のフィルタ径、例えば１０〜５０ｍｍ径を有するメンブレンフィルタを用いるろ過器でろ過し、メンブレンフィルタ上に微生物や微生物以外の混入物を捕捉する。
次に、ステップＳ９２において、メンブレンフィルター上に捕捉した微生物を所定の蛍光標識物質で染色する。例えば、この染色方法として、ＦＩＳＨ法、蛍光抗体法、核酸染色法および酸素染色法などがある。
次に、ステップＳ９３において、染色された試料を含むメンブレンフィルタを微生物検査装置１の顕微鏡電動ステージ１６に固定することにより、検査試料液からの試料の調製が完了する。
次に、ステップＳ９４において、顕微鏡電動ステージ１６に固定された染色された試料を含むメンブレンフィルタに、各蛍光標識物質に対応する特定波長を有する励起光を照射する。なお、励起光が照射されるメンブレンフィルタは、予め所定の大きさを有する領域に分割されており、励起光はその分割された領域ごとに照射される。
次に、ステップＳ９５において、照射された励起光に応じて、試料中の各蛍光標識物質が微生物に吸収された部分から発生する特有波長を有する蛍光像を撮像する。
次に、ステップＳ９６において、得られた蛍光像について、２値化手法を用いて１ビット階調の２値化画像データを取得し、微生物の識別処理に必要な連結成分を抽出する。若しくは、得られた蛍光像に適当な画像処理を施し、この画像処理後のイメージ像について、２値化手法を用いて１ビット階調の２値化画像データを取得し、微生物の識別処理に必要な連結成分を抽出することもある。
次に、ステップＳ９７において、微生物と微生物以外とを識別する画像解析処理ならびに各連結成分からなる蛍光体の所在位置の決定を行う。この一連の１領域についての、ステップＳ９４の励起光の照射からステップＳ９７の微生物の識別処理までの工程を、試料の各領域毎にそれぞれ行い、試料の全領域を走査して、各領域ごとに蛍光体の所在位置の決定およびその蛍光体が微生物であるか否かの第１次判定を行う。
次に、ステップＳ９８において、微生物と微生物以外の所在位置マップの生成処理を行い、表示画面に検出された微生物を表示する。表示画面には、３種の識別表示で、微生物や微生物以外を表示することができる。
次に、ステップＳ９９において、画像解析処理結果を保存する。
［検査試料液：図５］
次に、図５の第１次自動識別処理について詳細に説明する。この１次自動識別処理は低倍率のレンズを用いて行なわれる。
微生物検査装置１で測定する検査試料液とは、例えば、ビールなどの飲料であり、本来は微生物や微生物以外の混入物を含まないものである。
しかしながら、製造工程などで、上記説明した微生物や微生物以外の混入物が飲料中に混入する可能性がある。飲料中の微生物としては、例えば、細菌や酵母などがある。その一例を示すと、ビールに有害な細菌であるペクチネータス属菌は幅０．５〜２μｍ、曲線長さは１．５〜１０μｍである。もう一例を示すと、酵母は幅並びに曲線長さは３〜１０μｍである。このように混入する対象物の大きさには種々の大きさが考えられる。そのため微生物検査装置１で使用するフィルタの孔径は、混入する対象物の大きさに応じて適宜変更して使用することができる。
そこで、飲料の一部を適時、検査試料液として取り出し、上記説明した微生物検査装置１を用いて分析することにより、迅速かつ定量的に飲料中に微生物や微生物以外の混入物が含まれているかを自動で識別して、微生物と微生物以外の混入物に分けて表示することにより上記飲料の品質管理を行う。
［検査試料液からの試料の調製：図５のステップＳ９１、９２］
微生物検査装置１を用いて、検査試料液中の微生物の定量分析を行うために、まず試料調製を以下の手順で行う。
まず、ビールなどの飲料から所定量の検査試料液を採取する。次に、メンブレンフィルタを用いたろ過器を用いて検査試料液をろ過することにより、検査試料液中に含まれる全ての微生物や微生物以外の混入物は、メンブレンフィルタ上に捕捉される。
そこで、微生物検査装置１を用いてメンブレンフィルタ上に捕捉された微生物の全数を計数することにより、検査試料液中に含まれる全ての微生物および微生物以外の混入物の数を定量的に分析することができる。（この詳細については後述する。）
次に、ろ過器からメンブレンフィルタを取り出し、メンブレンフィルタ上に捕捉された微生物および微生物以外のもの（以下、試料と呼ぶ）に蛍光標識物質を作用させることにより、試料中の微生物を蛍光標識物質で染色する。ここで、試料中の微生物の染色は、例えば、図３より選ばれた１種または複数の蛍光標識物質を用いて行う。次に、染色された試料を含むメンブレンフィルタを微生物検査装置１の顕微鏡電動ステージ１６に固定することにより検査試料液からの試料の調製が完了する。
［メンブレンフィルタ：図５のステップＳ９１］
なお上記説明したメンブレンフィルタについて説明すると、メンブレンフィルタは、例えば、多くの孔を有する円盤等の平板形状を有し、フィルタ直径は１０〜５０ｍｍ程度であり、フィルタ孔径は、例えば、０．２〜５０μｍであり、孔数は、必要に応じて任意に設計することができる。このため、上記メンブレンフィルタを用いて、フィルタ孔径よりも大きな微生物を捕捉することが可能である。
［蛍光標識物質による染色法：図５のステップＳ９２］
次に、上記説明したメンブレンフィルター上に捕捉された微生物を蛍光標識物質で染色する方法について詳細に説明する。微生物を蛍光標識物質で染色する方法としては、以下説明するＦＩＳＨ法や蛍光抗体法などがある。
まずＦＩＳＨ法について説明すると、ＦＩＳＨ法は、核酸プローブを用い、細胞内の核酸を標的として微生物を蛍光染色して検出する方法である。この方法は、微生物からの核酸抽出工程を必要とせず、前処理した微生物に直接蛍光標識した核酸プローブを添加して微生物細胞内の核酸のうちｒＲＮＡあるいは染色体ＤＮＡとハイブリダイズさせる方法である。
一般的には、微生物細胞内の核酸のうちｒＲＮＡをプローブの標的とする。ｒＲＮＡは生きた微生物細胞内には数千から数十万コピー存在するため、プローブの標的がｒＲＮＡコピー数分だけ存在することになる。このため、核酸プローブに結合した蛍光標識物質が標的とする微生物細胞内に多く留まり、使用した蛍光標識物質に対し適当な励起光を照射すると、蛍光顕微鏡下で標的微生物細胞のみが形態を維持したまま蛍光を発して観察できる。
また染色体ＤＮＡの菌種特異的な領域の相補配列をプローブに使用することも可能であり、同様に菌種特異的な微生物細胞を蛍光染色することができる。
次に、蛍光抗体法について説明すると、蛍光抗体法は、標的微生物細胞のタンパク質や糖類もしくは脂質などからなる抗原を特異的に認識する抗体を用いて、標的微生物を選択的に染色する方法である。この方法は、一般的には、細胞表層に存在する抗原を認識する抗体を用いる。抗体を直接蛍光標識するか、あるいは、一次抗体に結合する２次抗体を蛍光標識することにより、一次抗体が認識する表面抗原を有する微生物を特異的に蛍光染色して検出する。
なお上記説明したメンブレンフィルター上に捕捉した微生物をＦＩＳＨ法または蛍光抗体法を用いて染色する場合に使用する蛍光標識物質の一例を図３に示す。図３は、蛍光標識物質とその励起光および蛍光の関係を示す図である。
図３において、各蛍光標識物質に対応する特定波長を有する励起光を照射すると、各蛍光標識物質に対応する特有波長を有する蛍光を発する。そこで、図３を用いて、蛍光標識物質の選択および励起光と蛍光の波長の選択をすることができる。例えば、蛍光標識物質として、インドカルボシアニン色素（Ｃｙ３）を選択し、５５０ｎｍの波長を有する励起光を照射すると、５７０ｎｍの波長を有する蛍光を観測できる。また、予め、図３に示す複数の蛍光標識物質で試料を染色し、対応する励起光を試料に照射すると、試料より異なる波長を有する複数の蛍光を観測することもできる。
［試料の全面分析と連結成分の抽出：図５のステップＳ９５］
次に、画像解析部３で行う自動蛍光検査機能を用いた試料の全面分析について説明する。
自動蛍光検査機能では、まず試料全域の適正な走査範囲を決定する。すなわち測定対象とする蛍光体の最大径定義域、例えば、１μｍ〜２０μｍの範囲から対物レンズの倍率を例えば、１０倍に設定し、これにより一義的に決定されるＣＣＤカメラ有効視野例えば、横方向１１００μｍ縦方向８７０μｍと、測定対象とする蛍光体の最大径最大値２０μｍから、１画面あたりの走査ステップ量（横方向：１０６０μｍ＝１１００−２０＊２、縦方向：８５０μｍ＝８７０−２０）を自動的に求める。
また、画像解析部３では、１画面あたりにつき撮像エリア以外に測定エリアを定義し、これをステップ量と同じ値とする。すなわち、カメラ撮像範囲１視野につき横方向の両側２０μｍと縦方向の上方２０μｍが走査撮像により隣り合うカメラ撮像範囲視野と重複するように設定する。
画像解析部３では、測定エリア内に連結成分終点（連結成分の占有エリアのうち画面上でもっとも下側かつ右側の画面上での座標）が存在する連結成分を測定対象とするために、上記設定方法を採用することによって対象蛍光体を過不足なく確実に測定できる。
上記説明した内容を図４に示す画面の測定エリア８０で具体的に説明する。図４は、後述する２値化画像であり、画素８１のうち、所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素を斜線で表示し、「アクティブ」画素が接続している「塊」を、連結成分８２と定義する。
また、図４の中央部に示す連結成分８２の占有するエリアを連結成分の占有エリア８３といい、連結成分の占有エリア８３のうち画面上でもっとも下側かつ右側の画面上での画素を連結成分終点８４という。
また画像解析部３では、同時に顕微鏡電動ステージ１６および電動フォーカスモーター１７を制御することにより、常に試料が捕捉されているメンブレンフィルターの同一平面上に自動的に焦点を合わせる。そして制御される顕微鏡電動ステージ１６の位置座標（カメラ撮像範囲視野の座標）とその画面上で測定される連結成分の位置座標から、対象とする蛍光体の像のメンブレンフィルター上における絶対的な位置座標が自動的に決定される。
この方法で試料上全域で得られる蛍光体の像を無人の自動走査で検出することができる。そして、個々の蛍光体の像の蛍光強度や形状の特徴量、例えば、面積、曲線長と曲線幅など（詳細は後述する）のパラメータにて微生物判定のための閾値を予め設けておき、また複数もしくは一つの蛍光強度測定結果から得られる上記特徴量と各閾値とを比較することによって蛍光体が微生物であるか微生物以外であるかなどを無人で自動判定できる。
なお、メンブレンフィルター上での位置座標が求められているために、個々の蛍光体の像について、対物レンズの倍率を上記設定した１０倍から例えば２０倍、４０倍などに変更した後で順次走査することにより、個々の蛍光体の像を更に正確に無人自動などで測定することができる（この操作をＶａｌｉｄａｔｉｏｎ操作という）。このため、微生物や微生物以外の判定がより容易にできる。
なお、上記説明した方法によって得られた測定データおよび個々の蛍光体の画像は、画像解析部３にファイルして保存され、必要があればこのファイルを画像解析部３の管理下で任意に引き出して参照することができる。
［蛍光体の２値化手法による画像処理：図５のステップＳ９６］
次に、上記説明した試料上全域で得られる蛍光体の像について、画像解析部３が画像解析の前に行う画像処理（２値化手法）について説明する。
画像解析部３で扱う画像は多値のディジタル情報により構成されている。例えば、モノクロ画像では、２５６階調（８ビット階調）などを用いる。
画像解析部３は、取り込んだ画像をディジタル化する機能を有するが、本実施形態の場合には、画像取得部２１としてディジタルカメラを使用するため、取得した画像はすでにディジタル化され、多階調画像となっている（２５６階調（８ビット階調））。
次に、画像解析部３は、２値化手法による画像処理を行う。すなわち、２値化とは、この多階調画像から画像を構成する各画素を、任意の範囲の輝度を「アクティブ」とし、他の輝度を「ネガティブ」として「２値」化し、８ビット階調の画像を１ビット階調に変更する。
［連結成分の抽出：図４］
次に、メンブレンフィルターの各測定領域ごとに得られる上記説明した１ビット階調の２値化画像を用いて、微生物の識別処理に必要な連結成分の抽出方法について説明する。
図４は、所定領域である測定エリア８０を測定した画像を上記説明した２値化方法で画像処理した２値化画像の一例である。
図４の中央部に位置する画素８１のうち所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素（斜線部）が接続している「塊」を連結成分８２と定義し、連結成分８２の占有するエリアが連結成分の占有エリア８３であり、連結成分終点８４は、連結成分の占有エリアのうちで最も右下の画面上の座標である。
図４において、所定輝度以上の輝度を有する「アクティブ」画素の集合体である連結成分８２より、後述する画像解析法を用いて、占有エリア８３の占める面積、平均輝度、曲線長、曲線幅、円形度係数を求めることができる。
［第２次自動識別処理：１波長識別法：図６］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理として、１波長識別法（図６）、２波長識別法（図７）、３波長識別法（図１２）の３種類の識別法について詳細に説明する。
この第２次自動識別処理は、微生物を精度良く識別するため高倍率のレンズを用いて行う。
最初に、１波長識別法による第２次自動識別処理について説明する。
図６に、１波長を用いた第２次自動識別処理のフローチャートを示す。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
図６において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ１９５に進み、第１次自動識別処理によって、抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
次に、ステップＳ９５とステップＳ９６の処理を行ってからステップＳ１９６に進む。なお、図６のステップＳ９５とステップＳ９６は、図５で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するのでここでの説明は省略する。
ステップＳ１９６は、１波長の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、微生物の自動識別処理として、蛍光体の像の蛍光強度や形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する面積法、平均輝度法、曲線長法などがある。以下、図８〜図１０を用いて詳細に説明する。
図８は、１波長の励起光を用いる微生物の識別処理法の一例として、面積法、平均輝度法、曲線長法、曲線幅法および円形度係数法と各方法における微生物の判定基準を示している。
図９は、図８に示した曲線長法、曲線幅法および円形度係数法における曲線長、曲線幅および円形度係数の算出式を示している。
図１０は、具体的な蛍光像から曲線長法、曲線幅法および円形度係数法を用いて曲線長、曲線幅および円形度係数を算出した一例を示している。
［面積法：図８］
まず面積法について説明する。
面積法は、図８に示すように、撮像によって得られる連結成分の全画素数（ｐｉｘ）と、予め作成されている単位画素当たりの実面積であるキャリブレーション値（（μｍ）２／ｐｉｘ）との積である連結成分の実面積（（μｍ）２）を求め、次に、予め設定されている判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する方法である。判定基準（図８）の例として、例えば、連結成分の実面積が５〜２００（μｍ）２であれば、連結成分は微生物であると識別する。
［平均輝度法：図８］
次に、平均輝度法について説明する。
平均輝度法は、図８に示すように、連結成分を構成する各画素の輝度（０〜２５５）より平均輝度を求める方法であり、各画素の輝度を合計した全輝度を全画素数（ｐｉｘ）で割った値である。判定基準（図８）の例として、例えば、連結成分の平均輝度が１０〜２５５であれば、連結成分は微生物であると識別する。
［曲線長法：図８］
次に、曲線長法について説明する。
曲線長（ＣＬ：Ｃｕｒｖｅ Ｌｅｎｇｔｈ）法は、図８に示すように、対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も長い画素サイドの長さ（ｐｉｘ）と、予め作成されている単位画素長さであるキャリブレーション値（μｍ／ｐｉｘ）との積である曲線長（μｍ）を求める。
例えば、図１０Ａの対象連結成分の曲線長は、１１（ｐｉｘ）であり、図１０Ｂの対象連結成分の曲線長は、５（ｐｉｘ）である。
次に、予め設定されている微生物の判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する。
なお対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も長い画素サイドの長さは、図９に示す定義式を用いて算出する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、曲線長が０．５〜５０μｍであれば、連結成分は微生物であると識別する。なお曲線長の値は、曲げられた微生物、ファイバ等の長さを与える。
［曲線幅法：図８］
次に、曲線幅法について説明する。
曲線幅（ＣＷ：Ｃｕｒｖｅ Ｗｉｄｔｈ）法は、図８に示すように、対象連結成分と同じエリア、および、周囲長を持つ長方形の最も短いサイドの長さ（ｐｉｘ）と、予め作成されている単位画素長さであるキャリブレーション値（μｍ／ｐｉｘ）との積である曲線長（μｍ）を求める。
例えば、図１０Ａの対象連結成分の曲線幅は、２（ｐｉｘ）であり、図１０Ｂの対象連結成分の曲線幅は、２（ｐｉｘ）である。
次に、予め設定されている微生物の判定基準（図８）と比較して、連結成分が微生物であるか、微生物以外のものであるかを識別する。
なお対象連結成分と同じエリアおよび周囲長を持つ長方形の最も短い画素サイドの長さは、図９に示す定義式を用いて算出する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、曲線幅が０．１〜１０μｍであれば、連結成分は微生物であると識別する。なお曲線長の値は、曲げられた微生物、ファイバ等の幅を与える。
［円形度係数法：図８］
次に、円形度係数法について説明する。
円形度係数（Ｒ：Ｒｏｕｎｄｎｅｓｓ）法は、図９に示す定義式によって与えられる無次元数であり、対象連結成分が円の場合に最小値１を与え、対象連結成分がそれ以外の場合に１より大きな値を与える。
例えば、図１０Ａの対象連結成分の円形度係数は、２．３であり、図１０Ｂの対象連結成分の円形度係数は、１．５である。
なお図９に示す定義式において、１．０６４は調整ファクタであり、画像のディジタル化によって発生するコーナーの誤差を全周にわたって訂正する。微生物の判定基準（図８）の例として、例えば、曲線幅が１〜１０μｍであれば、連結成分は微生物であると識別する。
次に、図６のステップＳ１９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ１９５に戻り上記説明したステップＳ１９５〜ステップＳ１９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ１９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進む。
次に、ステップＳ１９８において、ステップＳ９９で抽出された各蛍光体に対してステップＳ１９６での判定に基づき、微生物と微生物以外の所在位置マップの生成処理を行い、表示画面に検出された微生物を表示する。表示画面には、３種の識別表示で微生物や微生物以外を表示できる。
次にステップＳ１９９において、各蛍光体に関して画像解析処理による微生物判定結果を保存することにより、１波長の励起光を用いる微生物の自動識別処理が終了する。
このようにして、１波長識別法では、蛍光体の形状の特徴から微生物を識別することができる。
［第２次自動識別処理：２波長識別法：図７］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理の２番目の方法として、２波長の励起光を用いる２波長識別法について詳細に説明する。
なお、２波長識別法では、検出したい微生物、すなわち標的とする微生物が特定の励起光を照射したときに蛍光を発するように、試料は予め図３に示す蛍光標識物質を用いて染色しておく。
まず、２波長識別法の概要を説明すると、１種類の蛍光標識物質を用いて試料に含まれる標的微生物を染色し、この蛍光標識物質に対応する励起光とそれ以外の励起光をこの試料に順次照射し、対応して各蛍光体から放出される蛍光像を順次検出し、各励起光に対応して得られる蛍光像を組み合わせて各蛍光体ごとに蛍光スペクトルを作成し、得られた蛍光スペクトルを予め設定されている判定基準用の蛍光スペクトルと比較する。その結果より、各蛍光体が標的微生物なのか、あるいは、標的微生物以外の物であるのかを個々に識別し、試料中の標的微生物を識別することができる。
図７および図１４に、２波長を用いた微生物の自動識別処理のフローチャートを示す。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
図７において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ２９３に進み、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
次に、第１波長を有する励起光を用いてステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を行って蛍光体の形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してからステップＳ２９４に進む。なお、図７のステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その詳しい説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
次に、ステップＳ２９４で、蛍光フィルターを切り換えてから、ステップＳ２９５に進み、第２波長を有する励起光を用いて上記説明したステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を繰り返し行う。
次に、ステップＳ２９５の処理が終了すると、次にステップＳ２９６に進む。ステップＳ２９６では、ステップＳ１９６で特定された各標的の微生物の可能性がある蛍光体の中から標的の微生物を識別する。ステップＳ２９６は、２波長の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、その詳細を図１４に示す。すなわち、ステップＳ２００で、各励起光に対して各フィールドごとに得られる蛍光体より蛍光スペクトルまたはピークの波長を作成し、次に、ステップＳ２０１で、得られた蛍光スペクトルまたはピークの波長を判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と照合して各フィールドの蛍光体から微生物を識別する。
次に、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ２９８に進み、蛍光フィルターを原位置に戻してからステップＳ２９３に戻り上記説明したステップＳ２９３〜ステップＳ２９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進み、ステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理を行う。
なお、図７のステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
次に、上記説明した２波長識別法における第２次自動識別処理について図１１〜図１３を用いて具体的に説明する。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
２波長の励起光を用いる第２次自動識別処理では、まず、１波長識別法で説明した面積法、平均輝度法、曲線長法などを２波長の励起光にそれぞれ適用して各励起光に対する蛍光体の蛍光強度や形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してから（ステップＳ１９６）、次に、各励起光に対して得られる標的の微生物の可能性がある蛍光体の違いを利用して微生物を識別する（ステップＳ２９６）。
図１１は、２波長の励起光を用いる第２次識別処理で得られる各フィールドの蛍光体（２値化画像）の例を説明する図である。
２波長の励起光を用いる第２次識別処理では、異なる２つの励起光１（例：Ｃｙ３検出用）および励起光２をメンブランフィルタ上の試科に照射し、例えば図１１に示すように、それぞれの励起光に対応して各フィールド（ここでは、Ａ、Ｂ、Ｃの３フィールド）ごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）３０１〜３０６を取得する。
次に、図１２に示すように２つの励起光１および励起光２に対してフィールドＡ、Ｂ、Ｃでそれぞれ得られる６つの蛍光体３０１〜３０６を組み合わせて、蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４またはピークの波長３５１、３５３、３５５を作成する。
例えば、フィールドＡでは、２つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体３０１と３０４とを組み合わせて２つのピークを有する蛍光スペクトル３５０またはピークの波長３５１を作成する。フィールドＢでは、２つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体３０２と３０５とを組み合わせて１つのピークを有する蛍光スペクトル３５２またはピークの波長３５３を作成する。フィールドＣも同様に行って、蛍光スペクトル３５４またはピークの波長３５５を作成する。
次に、作成した蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４またはピークの波長３５１、３５３、３５５を、図１３に一例を示す標的の微生物を示す判定用蛍光スペクトル３６０，異物を示す判定用蛍光スペクトル３６１または判定基準（２波長用）３６２とそれぞれ比較する。判定用蛍光スペクトルまたは判定基準は、予め各励起光に対応して得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルまたはピークの波長が標的の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。例えば、図１１の各フィールドごとに得られた蛍光スペクトル３５０、３５２、３５４を標的の微生物を示す判定用蛍光スペクトル３６０，異物を示す判定用蛍光スペクトル３６１と比較することにより、図１１の３つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＡ、Ｃの蛍光体は異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルまたは判定基準は、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
このようにして、蛍光体（２値化画像）３０１〜３０６から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
［第２次自動識別処理：３波長以上識別法：図１５］
次に、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体から微生物を識別する第２次自動識別処理の３番目の方法として、３波長以上の励起光を用いる３波長以上識別法について、３波長の励起光を用いる３波長識別法を例にとり詳細に説明する。この処理は、自動蛍光検査プログラムに基づいて画像解析部３で実行される。
なお、３波長を用いる識別法では、予め試料中に含まれる標的の微生物、標的以外の微生物を識別できるように、試料を２種の蛍光標識物質（例えば、Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって染色する。一例を示せば、標的の微生物（例えば、ペクチネータス菌）は、２種の蛍光標識物質（Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって２重に染色し、標的以外の微生物は、１種の蛍光標識物質（ＤＡＰＩ）のみで染色する。
まず３波長識別法の概要を説明する。 ２種の蛍光標識物質を用いて試料に含まれる微生物を標的微生物とそれ以外の微生物が識別できるように染色し、この蛍光標識物質に対応する２種の励起光とそれ以外の励起光をこの試料に順次照射し、対応して各蛍光体から放出される蛍光像を順次検出し、各励起光に対応して得られる蛍光像を組み合わせて各蛍光体ごとに蛍光スペクトルを作成し、得られた蛍光スペクトルを予め設定されている判定用の蛍光スペクトルと比較する。その結果、各蛍光体が標的の微生物なのか、その他の微生物か、あるいは、それ以外の物体であるのかを個々に識別し、試料中の標的微生物を識別することができる。
図１５および図１４に、３波長を用いた微生物の自動識別処理のフローチャートを示す。
図１５において、図５のステップＳ９９に続いてステップＳ２９３に進み、第１次自動識別処理で抽出された蛍光体の所在位置マップに従いステージを移動する。
次に、第１波長を有する励起光を用いてステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理を行って蛍光体の蛍光強度や形状などの特徴から図８に示す微生物の判定基準にしたがって標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定してからステップＳ２９４に進む。なお、図１５のステップＳ９５とステップＳ９６とステップＳ１９６の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
次に、ステップＳ３９０に進み、次の励起光による照射を行うために次の蛍光フィルターに切り替える必要がある場合には、ステップＳ２９４に進み、蛍光フィルターを切り替えてから、ステップＳ２９５に進み、第２波長を有する励起光を用いて上記説明したステップＳ９５とステップＳ９６の処理を繰り返し行ったのちに、ステップＳ３９６に進む。一方、ステップＳ３９０において、全ての励起光による照射が終了し、次のフィルタの切り替えが必要ない場合には、ステップＳ３９６に進む。
ステップＳ３９６では、ステップＳ１９６でそれぞれ特定された標的の微生物の可能性がある蛍光体の中から標的の微生物を識別する。ステップＳ３９６は、３波長以上の励起光を用いた微生物の自動識別処理の特徴を示す工程であり、その詳細を図１４に示す。すなわち、ステップＳ２００で、各励起光に対して各フィールドごとに得られる蛍光体より蛍光スペクトルまたはピークの波長を作成し、次に、ステップＳ２０１で、得られた蛍光スペクトルまたはピークの波長を判定用蛍光スペクトルまたは判定基準と照合して各フィールドの蛍光体から微生物を識別する。
次に、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体がある場合には、ステップＳ２９８に進み、蛍光フィルターを原位置に戻してからステップＳ２９３に戻り上記説明したステップＳ２９３〜ステップＳ３９６までの処理を繰り返し行い、ステップＳ２９７において、次に自動識別処理を行う蛍光体が無い場合には、ステップＳ１９８に進み、ステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理を行う。
なお、図１２のステップＳ１９８とステップＳ１９９の処理は、図６で同じ符号で示した工程の処理と同じである。したがって、その説明は重複するので、ここでの説明では省略する。
次に、上記説明した３波長識別法における第２次自動識別処理について図１６〜図２０を用いて具体的に説明する。
３波長の励起光を用いる第２次自動識別処理では、まず、１波長識別法で説明した面積法、平均輝度法、曲線長法などを３波長の励起光にそれぞれ適用して各励起光に対する蛍光体の蛍光強度や形状から標的の微生物の可能性がある蛍光体を特定し（ステップＳ１９６）、次に、各励起光に対して得られる標的の微生物の可能性がある蛍光体の違いを利用して微生物を識別する（ステップＳ３９６）。
図１６は、３波長の励起光を用いる第１次および第２次識別処理で得られる各フィールドの蛍光体（２値化画像）の例を説明する図である。
３波長の励起光を用いる第１次識別処理では、低倍率のレンズを用い、例えば励起光２（ＤＡＰＩ検出用）をメンブランフィルタ上の試料に照射し、励起光２に対応して各フィールドごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）４１３〜４１６を取得する。
次に、３波長の励起光を用いる第２次識別処理では、第１次識別処理で蛍光体が検出されたフィールドのみに、異なる３つの励起光１〜励起光３を順次照射し、例えば図１６に示すように、それぞれの励起光に対応して各フィールド（ここでは、Ａ〜Ｄの４フィールド）ごとに得られる蛍光体を撮像して蛍光体（２値化画像）４０１〜４１２を取得する。
次に、図１７に示すように３つの励起光１〜励起光３に対してフィールドＡ〜Ｄでそれぞれ得られる３つの蛍光体４０１〜４１２を組み合わせて、蛍光スペクトル４５１〜４５４を作成する。なお図１７では省略したが、蛍光スペクトル４５１〜４５４の代わりに図１２で示したようなピークの波長を作成してもよい。
例えば、フィールドＡでは、３つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体４０１と４０５と４０９とを組み合わせて３つのピークを有する蛍光スペクトル４５１を作成する。フィールドＢでは、３つの励起光に対してそれぞれ得られる蛍光体４０２と４０６と４１０とを組み合わせて２つのピークを有する蛍光スペクトル４５２を作成する。フィールドＣおよびＤも同様に行って、１つのピークを有する蛍光スペクトル４５３、４５４を作成する。
次に、作成した蛍光スペクトル４５１〜４５４を、図１８に一例を示す判定用蛍光スペクトル４６０〜４６３とそれぞれ比較する。判定用蛍光スペクトルは、１次識別用に用いた励起光と、２次識別用に用いた励起光の組み合わせに対応してそれぞれ用意されており、得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルが標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。
なお、図１８に一例を示す判定用蛍光スペクトル４６１〜４６３は、４６０に示す１次識別用励起光として励起光２を照射したときに試料から検出された蛍光体について、励起光１〜３を用いて２次識別するときに用いる３波長用の判定用蛍光スペクトルの例であり、４６１は異物を、４６２は標的の微生物を、４６３は標的以外の微生物をそれぞれ示している。
図１６の各フィールドごとに得られた蛍光スペクトル４５１〜４５４を判定用蛍光スペクトル４６１〜４６３と照合することにより、図１６の４つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＣ、Ｄの蛍光体は標的以外の微生物、フィールドＡは異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルは、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
また、上記説明した蛍光スペクトルを作成するかわりに図１２で示したピークの波長を作成してもよい。この場合には、判定用蛍光スペクトルの代わりに予め画像解析部３に記憶されている図１３で示したような３波長用の判定基準を用いればよい。
このようにして、蛍光体（２値化画像）４０１〜４１２から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準とを比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
［３波長識別法の別の例：図１９］
図１９は、３波長の励起光を用いる第２次識別処理の別の例について説明する図である。試料中に含まれる微生物は、予め標的の微生物、標的以外の微生物を識別できるように、試料は２種の蛍光標識物質（例えば、Ｃｙ３，ＤＡＰＩ）によって染色されている。
図１９の例が図１６に示した例と異なる点は、図１６では、第２次識別処理に先だっで低倍率で蛍光体を検出する第１次識別処理で使用する励起光に励起光２（ＤＡＰＩ検出用）を用いるのに対して、図１９では、第１次識別処理で使用する励起光に励起光１（Ｃｙ３検出用）を用いる点である。
図１９の５０１〜５０５は、第１次識別処理で検出される蛍光体を示している。すなわち、励起光１（Ｃｙ３検出用）をメンブランフィルタ上の試料に照射し、励起光１に対応して各フィールド（ここでは、Ａ〜Ｅの５フィールド）から検出される蛍光体の２値化画像である。なお、フィールドＥからは蛍光体は得られないことを示している。
次に、図１９に示すように３つの励起光１〜励起光３に対してフィールドＡ〜Ｄでそれぞれ得られる３つの蛍光体５０６〜５１７を組み合わせて、図示はしないが、図１７と同様の蛍光スペクトルあるいは図１２で示したピークの波長を作成する。
次に、作成した蛍光スペクトルを、図２０に一例を示す３波長用の判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４とそれぞれ比較する。なお図２０の判定用蛍光スペクトルは、４７０に示す１次識別用に用いた励起光と、２次識別用に用いた励起光の組み合わせに対応してそれぞれ用意されており、得られる蛍光のピークの分布からその蛍光スペクトルが標的の微生物であるか、標的以外の微生物であるか、異物であるかを判定するものである。
なお、図２０に一例を示す判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４は、４７０に示す１次識別用励起光として励起光１を照射したときに試料から検出された蛍光体について、励起光１〜３を用いて２次識別するときに用いる３波長用の判定用蛍光スペクトルの例であり、４７１は異物を、４７２は標的の微生物を、４７３、４７４は異物をそれぞれ示している。
図１９の各フィールドごとに得られた図示しない蛍光スペクトルを判定用蛍光スペクトル４７１〜４７４と照合することにより、図１９の４つのフィールドで得られる蛍光体のうちフィールドＢのみが標的の微生物であり、フィールドＡ、Ｃ、Ｄの蛍光体は異物であると識別される。なお、異物の一例は、励起光に対して蛍光の選択性がない自家蛍光体などがあげられる。また、上記使用した判定用蛍光スペクトルは、各励起光に対応して予め画像解析部３に記憶されている。
このようにして、蛍光体（２値化画像）５０６〜５１７から蛍光スペクトルまたはピークの波長などを作成し、判定用蛍光スペクトルまたは判定基準とを比較することにより、蛍光体が標的の微生物であるか、異物であるかを自動的に識別することができる。このことから、試料液中に含まれる標的の微生物などを簡単に無人で識別することができる。
なお、図１９では、第１次識別処理で使用する励起光に標的の微生物のみを識別する励起光１（Ｃｙ３検出用）を用いるため、標的以外の微生物は、第１次自動識別によって除外される。このため、試料中に含まれる微生物のうちで標的の微生物のみを第１次自動識別で、識別できる。また図１９に示す識別法は、第１次自動識別で識別された蛍光体（フィールドＡ〜Ｄ）の中から標的の微生物（フィールドＢ）を異物（フィールドＡ，Ｃ，Ｄ）と精度良く識別することができる。
以上説明したように、本実施形態の微生物の検査装置は、微量の蛍光を検出することが可能であるため、試料中の１個体の標的微生物を検出することができる。そのため、従来のように多量の微生物を含む試料を作製するために培養に長時間かけてコロニー形成させる必要も無い。
また検出された蛍光体の画像より、形状の特徴量、例えば、連結成分の平均蛍光強度、面積、曲線長と曲線幅の比など各種パラメータを算出し、算出された各種パラメータに基づいて、蛍光体の画像が微生物によるものか否かを無人自動で検出できる。そのため、従来のように目視で微生物の識別を確認も必要としないため精度の高い迅速な微生物の自動検出が可能となる。
したがって、本発明による測定装置は、飲料、食品、医薬、化粧品等の工程管理、製品品質管理等における微生物検査の他、排水、工業用水、環境サンプル、上下水道における微生物検査、生命工学等の種々の研究分野における微生物検査、更には自家蛍光をもつ微小片の検出および数の検査等に応用できる。
以上説明したように、本発明によれば、例えば、検査対象となる試料中に含まれる微生物に関する情報を自動で迅速に取得可能な微生物の検査装置および検査方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明に係る一実施形態の微生物の検査装置である。
図２は、本発明に係る一実施形態の微生物の検査装置の全体構成を説明する図である。
図３は、蛍光標識物質、励起光および蛍光の関係を示す図である。
図４は、連結成分について説明する図である。
図５は、試料全領域より蛍光体の所在位置を抽出する第１次自動識別処理のフローチャートである。
図６は、１波長識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図７は、２波長識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図８は、微生物の識別方法とその判定基準を説明する図である。
図９は、画素の連結成分から曲線長、曲線幅および円形度係数の算出方法を説明する図である。
図１０は、画素の連結成分から曲線長、曲線幅および円形度係数を算出する例を説明する図である。
図１１は、２波長識別法の第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の例を説明する図である。
図１２は、２波長識別法で、各フィールドの２値化画像から蛍光スペクトル（あるいはピークの波長）を得る手順を説明する図である。
図１３は、２波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルまたは判定基準の一例を示す図である。
図１４は、各フィールドの蛍光体から微生物を識別する処理のフローチャートである。
図１５は、３波長以上識別法で、微生物を識別する第２次自動識別処理のフローチャートである。
図１６は、３波長識別法の第１および第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の例を説明する図である。
図１７は、３波長識別法の一例で、第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像から蛍光スペクトルを得る手順を説明する図である。
図１８は、３波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルまたは判定基準の一例を示す図である。
図１９は、３波長識別法の第１および第２次自動識別処理で得られる各フィールドの２値化画像の別の例を説明する図である。
図２０は、図１９の３波長識別法で用いられる判定用蛍光スペクトルの別の例を示す図である。
Claims (37)
- 試料中に含まれる微生物を検査する検査方法であって、
前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射する照射工程と、
前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程と、
を含むことを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記各物体から得られる蛍光体の形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する検査工程を更に有し、前記識別工程では、前記検査工程で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記各物体から得られる蛍光体の蛍光強度に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定する検査工程を更に有し、前記識別工程では、前記検査工程で特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記照射工程では、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順に前記試料に照射することを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記照射工程では、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を同時に前記試料に照射することを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、
前記識別工程では、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することを特徴とする。 - 請求の範囲第６項に記載の検査方法であって、
前記識別工程では、前記各物体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することを特徴とする。 - 請求の範囲第７項に記載の検査方法であって、
前記微生物は特定の微生物であることを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、
前記識別工程では、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することを特徴とする。 - 請求の範囲第９項に記載の検査方法であって、
前記識別工程では、前記各物体から得られる蛍光スペクトルを前記複数の励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することを特徴とする。 - 請求の範囲第１０項に記載の検査方法であって、
前記微生物は特定の微生物であることを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
１次検査工程と、
２次検査工程とを含み、
前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光物体を特定し、
前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で特定された各蛍光物体を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各蛍光物体の蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
１次検査工程と、
２次検査工程とを含み、
前記１次検査工程では、前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で観察することにより、前記試料中に含まれる蛍光物体のうち、標的の微生物を標的以外の微生物から分離して抽出し、
前記２次検査工程では、前記照射工程及び前記識別工程を実施し、この際に、前記１次検査工程で抽出した各標的の微生物を前記第１倍率よりも高い第２倍率で観察しながら前記各標的の微生物の蛍光におけるピークの分布を得ることを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、該フィルタ上に捕捉された微生物を含む物体を蛍光標識物質を用いて染色する試料調製工程を更に含むことを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、２つ以上の波長を含む励起光を照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が１つ以上の蛍光におけるピークを有するように該フィルタ上に捕捉された微生物を蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことを特徴とする。 - 請求の範囲第１５項に記載の検査方法であって、
前記２つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることを特徴とする。 - 請求の範囲第１５項に記載の検査方法であって、
前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）、プロビディウム・イオダイド、およびフルオレセインニソチシオシアネート（ＦＩＴＣ）のうちのいずれか１つ以上の蛍光標識物質が用いられることを特徴とする。 - 請求の範囲第１項に記載の検査方法であって、
前記試料中に含まれる微生物をフィルタ上に捕捉し、３つ以上の波長を含む励起光を該フィルタに照射した際に、該フィルタ上に捕捉された微生物が２つ以上の蛍光におけるピークを有するように、該フィルタ上に捕捉された微生物を異なる種類の蛍光標識物質で染色する試料調製工程を更に含むことを特徴とする。 - 請求の範囲第１８項に記載の検査方法であって、
前記３つ以上の波長を含む励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される３つ以上の励起光が用いられることを特徴とする。 - 請求の範囲第１８項に記載の検査方法であって、
前記蛍光標識物質には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、インドカルボシアニン色素、アレクサ色素、ジブミジノフェニルインドール（ＤＡＰＩ）、プロビディウム・イオダイドおよびフルオレセインニソチシオシアネート（ＦＩＴＣ）のうちのいずれか２つ以上の蛍光標識物質が用いられることを特徴とする。 - 試料中に含まれる微生物を検査する検査装置であって、
前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射する照射機構と、
前記試料を撮像する撮像装置と、
前記撮像装置による撮像結果を分析する分析装置と、
を備え、
前記分析装置は、前記撮像結果より前記複数の励起光に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別するように構成されていることを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記分析装置は、まず前記各物体から得られる蛍光体の形状に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定し、次に特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得るように構成されていることを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記分析装置は、まず前記各物体から得られる蛍光体の蛍光強度に基づいて微生物の可能性がある蛍光体を特定し、次に特定された蛍光体を用いて前記蛍光におけるピークの分布を得るように構成されていることを特徴とする。 - 試料中に含まれる微生物を検査する検査装置であって、
前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光を照射しながら該試料を撮像した結果を取り込む入力装置と、
前記入力装置で取り込んだ撮像結果より前記複数の励起光に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する分析装置と、
を備えることを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記照射機構は、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を順に前記試料に照射することを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記照射機構は、前記互いに異なる波長を有する複数の励起光を同時に前記試料に照射することを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、
前記分析装置は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光における各ピークの波長又は周波数に基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することを特徴とする。 - 請求の範囲第２７項に記載の検査装置であって、
前記分析装置は、前記各物体から得られる蛍光の各ピークの波長又は周波数を、前記励起光に対応して予め定義されている判定基準と照合して、前記各物体が微生物であるか否かを判定することを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光は、１つ以上のピークを有し、
前記分析装置は、前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光スペクトルに基づいて前記試料中に含まれる微生物を識別することを特徴とする。 - 請求の範囲第２９項に記載の検査装置であって、
前記分析装置は、前記各物体から得られる蛍光スペクトルを前記励起光に対応して予め定義されている判定用蛍光スペクトルと照合して、前記各物体が微生物であるか否かを識別することを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記照射機構と前記撮像装置と前記分析装置とを制御する制御装置を更に備え、前記制御装置は、前記照射機構を用いて前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析して前記試料中に含まれる蛍光物体を特定するように制御し、
次に、前記特定された各蛍光物体に前記照射機構を用いて前記励起光を照射しながら、前記特定された各蛍光物体のみを前記第１倍率よりも高い第２倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析することにより前記各蛍光物質の蛍光におけるピークの分布を得るように制御することを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記照射機構と前記撮像装置と前記分析装置とを制御する制御装置を更に備え、
前記制御装置は、前記照射機構を用いて前記試料に前記励起光を照射しながら前記試料の全領域を第１倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析して前記試料中に含まれる蛍光物体のうち、標的の微生物を標的以外の微生物から分離して抽出するように制御し、
次に、前記抽出された各標的の微生物を前記第１倍率よりも高い第２倍率で前記撮像装置を用いて撮像し、前記撮像装置による撮像結果を前記分析装置を用いて分析することにより前記標的微生物の蛍光におけるピークの分布を得るように制御することを特徴とする。 - 請求の範囲第２１項に記載の検査装置であって、
前記複数の励起光には、励起光の最大強度が３４０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲の波長を有する励起光の中から選択される２つ以上の励起光が用いられることを特徴とする。 - 請求の範囲３２項に記載の検査装置であって、
前記撮像装置は、電動ステージを更に備え、
前記制御装置は、前記電動ステージを制御して前記試料の全領域を走査しながら前記試料の全領域を撮像するように前記撮像装置を制御することを特徴とする。 - 請求の範囲第３４項に記載の検査装置であって、
前記撮像装置は、対物レンズと、前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保つように予め設定されている方程式とを備え、前記制御装置は、前記走査の際に前記方程式に基づいて焦点のずれが生じないように前記対物レンズと前記フィルタの表面との距離を一定に保ちながら前記試料の全領域を撮像するように前記撮像装置を制御することを特徴とする。 - 試料中に含まれる微生物を検査する検査装置を制御する制御プログラムであって、
前記検査装置から前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光が照射された際に前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程を含むことを特徴とする。 - 試料中に含まれる微生物を検査する検査装置を制御する制御プログラムを格納したコンピュータ可読記憶媒体であって、
前記制御プログラムは、
前記検査装置から前記試料に互いに異なる波長を有する複数の励起光が照射された際に前記複数の励起光の照射に対応して前記試料中に含まれる各物体から得られる蛍光におけるピークの分布に基づいて、前記試料中に含まれる微生物を識別する識別工程を含むことを特徴とする。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001218625 | 2001-07-18 | ||
| JP2001218625 | 2001-07-18 | ||
| PCT/JP2002/007295 WO2003008634A1 (fr) | 2001-07-18 | 2002-07-18 | Dispositif et procede d'analyse de microbes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2003008634A1 true JPWO2003008634A1 (ja) | 2005-02-24 |
| JP4029983B2 JP4029983B2 (ja) | 2008-01-09 |
Family
ID=19052783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003514949A Expired - Fee Related JP4029983B2 (ja) | 2001-07-18 | 2002-07-18 | 微生物の検査装置および検査方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040243318A1 (ja) |
| EP (1) | EP1418238A4 (ja) |
| JP (1) | JP4029983B2 (ja) |
| KR (1) | KR100753616B1 (ja) |
| CN (1) | CN100510099C (ja) |
| AU (1) | AU2002354896B2 (ja) |
| CA (1) | CA2454294A1 (ja) |
| WO (1) | WO2003008634A1 (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003102224A1 (fr) * | 2002-05-30 | 2003-12-11 | Fuji Electric Holdings Co., Ltd. | Procede de comptage de micro-organismes ou de cellules |
| JP4810871B2 (ja) * | 2004-09-03 | 2011-11-09 | パナソニック株式会社 | 微生物検出方法 |
| JP2007006709A (ja) * | 2005-06-28 | 2007-01-18 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 発光物の判別方法 |
| JP4967280B2 (ja) * | 2005-08-30 | 2012-07-04 | パナソニック株式会社 | 微生物計数装置 |
| JP5422870B2 (ja) * | 2006-10-06 | 2014-02-19 | パナソニック株式会社 | 微生物数計測方法 |
| EP1972928B1 (de) * | 2007-03-21 | 2012-09-19 | Erlus Aktiengesellschaft | Vorrichtung und Verfahren zur zerstörungsfreien Prüfung der biostatischen bzw. bioziden Eigenschaften einer photokatalytischen Oberflächenbeschichtung |
| FR2926820B1 (fr) * | 2008-01-30 | 2014-10-17 | Alain Rambach | Procede de selection de microorganismes dans un echantillon biologique |
| FR2936251B1 (fr) | 2008-09-23 | 2010-11-05 | Millipore Corp | Dispositif pour l'analyse microbiologique. |
| FR2936252B1 (fr) | 2008-09-23 | 2010-11-05 | Millipore Corp | Dispositif pour l'analyse microbiologique. |
| JP5451770B2 (ja) * | 2008-11-24 | 2014-03-26 | コーニンクレッカ フィリップス エヌ ヴェ | 流体サンプルの迅速なフィルタ解析方法及び装置 |
| CN102639986A (zh) * | 2009-08-27 | 2012-08-15 | 夏普株式会社 | 显示控制装置 |
| US8472661B2 (en) * | 2010-09-07 | 2013-06-25 | Alison Dana Bick | Method and apparatus for testing water quality using a cell-phone application, mirror and plastic bag |
| JP2014168442A (ja) * | 2013-03-05 | 2014-09-18 | Azbil Corp | 微生物検出装置及び微生物検出方法 |
| CN107614674B (zh) * | 2015-06-24 | 2022-05-17 | 株式会社日立制作所 | 检查系统、检查装置以及检查方法 |
| WO2018117273A1 (ja) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | 国立大学法人筑波大学 | データ作成方法及びデータ使用方法 |
| CN109496230A (zh) * | 2018-02-09 | 2019-03-19 | 柴崎株式会社 | 细菌检测装置以及细菌检测方法 |
| CN109060674A (zh) * | 2018-08-24 | 2018-12-21 | 张晓焦 | 微生物识别方法 |
| CN110305790A (zh) * | 2019-07-04 | 2019-10-08 | 湖南开启时代智能科技有限公司 | 一种细胞制备培养系统及方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4686372A (en) * | 1983-05-09 | 1987-08-11 | Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha | Method and apparatus for measuring cell counts of Methanogens or methane producing activity thereof |
| JPS62269045A (ja) * | 1986-05-19 | 1987-11-21 | Mitsubishi Electric Corp | メタン菌の菌数またはメタン生成活性の測定方法 |
| JPH0630627B2 (ja) * | 1987-11-16 | 1994-04-27 | 日立電子エンジニアリング株式会社 | 生菌数測定方法 |
| EP0405480A3 (en) * | 1989-06-28 | 1991-05-08 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Method of and apparatus for detecting microorganisms |
| JPH08242886A (ja) * | 1995-03-08 | 1996-09-24 | Dam Suigenchi Kankyo Seibi Center | 植物プランクトンの濃度測定方法 |
| JP2000232897A (ja) * | 1999-02-15 | 2000-08-29 | Nippon Mizushori Giken:Kk | 菌類の即時判別方法 |
| AU5595200A (en) * | 1999-06-04 | 2000-12-28 | Kairos Scientific Inc. | Multispectral taxonomic identification |
-
2002
- 2002-07-18 US US10/484,055 patent/US20040243318A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-18 EP EP02751628A patent/EP1418238A4/en not_active Withdrawn
- 2002-07-18 CN CNB028143779A patent/CN100510099C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-18 KR KR1020047000588A patent/KR100753616B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-07-18 CA CA002454294A patent/CA2454294A1/en not_active Abandoned
- 2002-07-18 JP JP2003514949A patent/JP4029983B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-18 AU AU2002354896A patent/AU2002354896B2/en not_active Ceased
- 2002-07-18 WO PCT/JP2002/007295 patent/WO2003008634A1/ja active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100753616B1 (ko) | 2007-08-29 |
| JP4029983B2 (ja) | 2008-01-09 |
| CN1537171A (zh) | 2004-10-13 |
| AU2002354896B2 (en) | 2007-07-12 |
| EP1418238A4 (en) | 2009-08-12 |
| EP1418238A1 (en) | 2004-05-12 |
| KR20040047775A (ko) | 2004-06-05 |
| US20040243318A1 (en) | 2004-12-02 |
| CA2454294A1 (en) | 2003-01-30 |
| WO2003008634A1 (fr) | 2003-01-30 |
| CN100510099C (zh) | 2009-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4029983B2 (ja) | 微生物の検査装置および検査方法 | |
| AU2022200112B2 (en) | Methods and apparatus for detecting an entity in a bodily sample | |
| US8160348B2 (en) | Methods and system for validating sample images for quantitative immunoassays | |
| CN108572163B (zh) | 荧光图像分析装置、分析方法及预处理的评价方法 | |
| US10648897B2 (en) | Method and apparatus for the identification and handling of particles | |
| JP3035698B2 (ja) | 蛍光による微生物の高速且つ高感度な検出及び計数のための装置及び方法 | |
| JP2001211896A (ja) | 画像解析方法、装置、及び記録媒体 | |
| CA2728965A1 (en) | Optical imaging for identifying cells labeled with fluorescent nanoparticles | |
| JP4967280B2 (ja) | 微生物計数装置 | |
| JP4487985B2 (ja) | 微生物計量装置 | |
| JP6970112B2 (ja) | 概観画像をセグメント化することにより分散オブジェクトを検査するための方法 | |
| WO2007029821A1 (ja) | 微生物計数装置 | |
| EP4137795A1 (en) | Fluorescence image analysis method, fluorescence image analyser, fluoresence image analysis program | |
| JP2007097582A (ja) | 微生物計数装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041013 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050421 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070709 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070822 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070918 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071010 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101026 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101026 Year of fee payment: 3 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101026 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131026 Year of fee payment: 6 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131026 Year of fee payment: 6 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |