KR20040047775A - 미생물의 검사 장치 및 검사 방법 - Google Patents

미생물의 검사 장치 및 검사 방법 Download PDF

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Abstract

시료액 중의 미생물을 필터로 포착하고, 형광 염색하여 얻어지는 시료로부터 미생물에 관한 정보를 검출하는 검사 장치를 제공할 수 있다. 다른 여기광(l, 2)을 필터에 조사하고, 각각의 여기광에 대응하여 각 필드마다 얻어지는 형광의 2치화 화상(A, B, C)을 촬상한다. 다음에, 각 여기광(1, 2)에 대해 얻어지는 2치화 화상(A, B, C)을 비교하고, 특정 여기광(예컨대, 1)에 대해서만 형광을 발하는 2치화 화상B는 미생물에 근거한 형광 상으로서, 모든 여기광에 대해 형광을 발하는 2치화 화상(A, C)은 미생물 이외의 형광상이라고 자동적으로 식별함으로써 시료 중의 미생물을 간단히 무인으로 식별할 수 있다.

Description

미생물의 검사 장치 및 검사 방법{Microbe examining device and method}
종래, 미생물 검사, 예컨대 맥주 등의 음료, 식품, 의약품, 화장품 등의 제조공정 관리, 제품 품질 관리 등에서의 미생물 검사는 다종다양한 배지를 필요로 하는 배양 검사에 의해 행해지게 되어, 검사가 종료될 때까지 상당한 일수를 요구하고 있었다.
이 때문에, 검사 대상 중에 미생물이 존재하는지 여부 또는 미생물의 수 또는 존재하는 미생물종의 동정 등의 검사 결과의 판명이 늦어져, 각종 분야에서의 연구, 개발, 제조 또는 제품 출하 단계에서 많은 제약이 있었다.
이와 같은 배경에서 현재에 이르기까지 많은 미생물을 포함하는 액체 시료 중 등으로부터 미생물을 신속하게 측정하는 방법이 고안되고 있다(예컨대, "미생물 검사 기술의 최신 동향", 식품과 개발 35(1), P32-40(2000) 등).
미생물을 신속하게 측정하는 방법으로서 알려져 있는 것으로는, 예컨대 임피던스법(Brown, D., Warner, M., Taylor, C., Warren, R., Clin. Patho1., 37, 65~69(1984)), 효소-형광 검출법(일본 특허공개 소58-116700호 공보), PCR법, 멤브레인 필터법과 형광 현미경법을 조합한 DEFT법(G. L. PETTIPHER, UBALDINAM. RODRIGUES, J. App1. Bacterio1. 53, 323(1982)), 또는 멤브레인 필터법과 ATP법을 조합한 RMDS법(Takahashi, T., Nakakita. Y., Watari. J., Shinotsuka. K., Biosci. Biotechno1. Biochem. 64(5), P1032-1037(2000)) 등이 있고, 이들의 측정 원리를 응용한 기기도 시판되고 있다.
그렇지만, 상기 설명한 방법에는, 1) 정밀도가 불충분함, 2) 신속한 측정에 적합하지 않음, 3) 정량성이 불충분함, 4) 인위적 오차를 포함할 가능성이 높음 등 많은 문제가 남아 있다. 또한, 5) 측정에 필요한 배지나 시약 등의 러닝 비용이 높은 점도 문제이다.
한편, 시료 용액 중에 존재하는 미생물을 여과하여 미생물 등을 분리하고, 얻어진 미생물을 포함하는 시료를 형광 염색하여 이 시료를 형광 현미경으로 관측자가 육안으로 관찰하면서 미생물과 미생물 이외의 것을 식별하는 방법도 알려져 있다.
그렇지만, 상기한 방법으로는, 형광 염색한 시료로부터 발생하는 형광 상을 관측자가 육안으로 관찰하면서 미생물과 미생물 이외의 것을 식별하기 때문에서 측정 결과에 대해 측정자의 오인 등에 의한 실수가 날 가능성도 있었다. 또한, 미생물과 미생물 이외의 것을 무인으로 식별하는 것은 불가능했다.
본 발명은 미생물의 검사 장치 및 검사 방법에 관한 것으로, 예컨대 시료액 중에 포함된 미생물 등을 필터로 포착하고, 포착한 미생물에 형광 염색하고, 현미경을 사용하여 미생물을 미생물 이외의 것과 자동식별하여 표시하는 미생물의 검사 장치 및 검사 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 관련된 한 실시 형태의 미생물의 검사 장치이다.
도 2는 본 발명에 관련된 한 실시 형태의 미생물의 검사 장치의 전체 구성을설명하는 도면이다.
도 3은 형광 표지 물질, 여기광 및 형광의 관계를 도시하는 도면이다.
도 4는 연결 성분에 대해서 설명하는 도면이다.
도 5는 시료 모든 영역에서 형광체의 소재 위치를 추출하는 제1차 자동식별 처리의 플로 차트이다.
도 6은 1파장 식별법에서 미생물을 식별하는 제2차 자동식별 처리의 플로 차트이다.
도 7은 2파장 식별법에서 미생물을 식별하는 제2차 자동식별 처리의 플로 차트이다.
도 8은 미생물의 식별 방법과 그 판정 기준을 설명하는 도면이다.
도 9는 화소의 연결 성분으로부터 곡선 길이, 곡선 폭 및 원형도 계수의 산출 방법을 설명하는 도면이다.
도 10a 및 도 10b는 화소의 연결 성분으로부터 곡선 길이, 곡선 폭 및 원형도 계수를 산출하는 예를 설명하는 도면이다.
도 11은 2파장 식별법의 제2차 자동식별 처리로 얻어지는 각 필드의 2치화 화상(binary images)의 예를 설명하는 도면이다.
도 12는 2파장 식별법에서 각 필드의 2치화 화상에서 형광 스펙트럼(또는, 피크의 파장)을 얻는 순서를 설명하는 도면이다.
도 13은 2파장 식별법에서 사용되는 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준의 일례를 도시하는 도면이다.
도 14는 각 필드의 형광체로부터 미생물을 식별하는 처리의 플로 차트이다.
도 15는 3파장 이상 식별법에서 미생물을 식별하는 제2차 자동식별 처리의 플로 차트이다.
도 16은 3파장 식별법의 제1 및 제2차 자동식별 처리로 얻어지는 각 필드의 2치화 화상의 예를 설명하는 도면이다.
도 17은 3파장 식별법의 일례로서, 제2차 자동식별 처리로 얻어지는 각 필드의 2치화 화상에서 형광 스펙트럼을 얻는 순서를 설명하는 도면이다.
도 18은 3파장 식별법에서 사용되는 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준의 일례를 도시하는 도면이다.
도 19는 3파장 식별법의 제1 및 제2차 자동식별 처리로 얻어지는 각 필드의 2치화 화상의 다른 예를 설명하는 도면이다.
도 20은 도 19의 3파장 식별법에서 사용되는 판정용 형광 스펙트럼의 다른 예를 도시하는 도면이다.
본 발명은 상기 설명한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로, 그 목적은, 예컨대 검사 대상이 되는 시료 중에 포함된 미생물을 자동적으로 신속하게 식별 가능한 미생물의 검사 장치 및 검사 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 관련된 한 실시 형태의 검사 방법은 이하의 구성을 가진다. 즉, 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 방법으로서, 상기 시료에 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 조사하는 조사 공정과, 상기 복수의 여기광의 조사에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 식별 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 예컨대 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광체의 형광 강도 또는 형상에 근거하여 미생물의 가능성이 있는 형광체를 특정하는 검사 공정을 더 가지고, 상기 식별 공정에서는 상기 검사 공정에서 특정된 형광체를 사용하여 상기 형광에서의 피크 분포를 얻는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 조사 공정에서는, 상기 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 순서대로 또는 동시에 상기 시료에 조사하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광은 하나 이상의 피크를 가지고, 상기 식별 공정에서는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 각 피크의 파장 또는 주파수에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 식별 공정에서는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광의각 피크의 파장 또는 주파수를 상기 복수의 여기광에 대응하여 사전에 정의되어 있는 판정 기준과 대조하여 상기 각 물체가 미생물인지 아닌지를 판정하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 미생물은 특정 미생물인 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광은 하나 이상의 피크를 가지고, 상기 식별 공정에서는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광 스펙트럼에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 식별 공정에서는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광 스펙트럼을 상기 복수의 여기광에 대응하여 사전에 정의되어 있는 판정용 형광 스펙트럼과 대조해서 상기 각 물체가 미생물인지 아닌지를 판정하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 미생물은 특정 미생물인 것이 바람직하다
여기서, 예컨대 상기 검사 방법은, 1차 검사 공정과 2차 검사 공정을 포함하고, 상기 1차 검사 공정에서는 상기 시료에 상기 여기광을 조사하면서 상기 시료의 모든 영역을 제1 배율로 관찰함으로써 상기 시료 중에 포함된 형광 물체를 특정하며, 상기 2차 검사 공정에서는 상기 조사 공정 및 상기 식별 공정을 실시하고, 이 때에 상기 1차 검사 공정에서 특정된 각 형광 물체를 상기 제1 배율보다 높은 제2 배율로 관찰하면서 상기 각 형광 물체의 형광에서의 피크 분포를 얻는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 검사 방법은, 1차 검사 공정과 2차 검사 공정을 포함하고, 상기 1차 검사 공정에서는 상기 시료에 상기 여기광을 조사하면서 상기 시료의 모든 영역을 제1 배율로 관찰함으로써 상기 시료 중에 포함된 형광 물체 중 표적 미생물을 표적 이외의 미생물로부터 분리하여 추출하며, 상기 2차 검사 공정에서는 상기 조사 공정 및 상기 식별 공정을 실시하고, 이 때에 상기 1차 검사 공정에서 추출한 각 표적 미생물을 상기 제1 배율보다 높은 제2 배율로 관찰하면서 상기 각 표적 미생물의 형광에서의 피크 분포를 얻는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 시료 중에 포함된 미생물을 필터 상에 포착하고, 당해 필터 상에 포착된 미생물을 포함하는 물체를 형광 표지 물질을 사용하여 염색하는 시료 조제 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 시료 중에 포함된 미생물을 필터 상에 포착하고, 두 개 이상의 파장을 포함하는 여기광을 조사했을 때에, 당해 필터 상에 포착된 미생물이 하나 이상의 형광에서의 피크를 가지도록 당해 필터 상에 포착된 미생물을 형광 표지 물질로 염색하는 시료 조제 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 두 개 이상의 파장을 포함하는 여기광에는, 여기광의 최대 강도가 340nm~750nm 범위의 파장을 가지는 여기광 중에서 선택되는 두 개 이상의 여기광이 사용되는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 형광 표지 물질로는, 텍사스 레드, 테트라메틸 로다민, 인도카르보시아닌 색소, 알렉사 색소, 디아미디노페닐인돌(DAPI), 프로비듐·이오다이드 및 플루오로세인 이소티오시아네이트(FITC) 중에서 어느 하나 이상의 형광 표지 물질이 사용되는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 시료 중에 포함된 미생물을 필터 상에 포착하고, 3개 이상의 파장을 포함하는 여기광을 당해 필터에 조사했을 때에, 당해 필터 상에 포착된 미생물이 두 개 이상의 형광에서의 피크를 가지도록 당해 필터 상에 포착된 미생물을 다른 종류의 형광 표지 물질로 염색하는 시료 조제 공정을 더 포함하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 3개 이상의 파장을 포함하는 여기광으로는, 여기광의 최대 강도가 340nm~750nm 범위의 파장을 가지는 여기광 중에서 선택되는 3개 이상의 여기광이 사용되는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 형광 표지 물질로는, 텍사스 레드, 테트라메틸 로다민, 인도카르보시아닌 색소, 알렉사 색소, 디아미디노페닐인돌(DAPI), 프로비듐·이오다이드 및 플루오로세인 이소티오시아네이트(FITC) 중에서 어느 두 개 이상의 형광 표지 물질이 사용되는 것이 바람직하다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 관련된 한 실시 형태의 검사 장치는 이하의 구성을 가진다. 즉, 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 장치로서, 상기 시료에 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 조사하는 조사 기구와, 상기 시료를 촬상하는 촬상 장치와, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 분석하는 분석 장치를 구비하며, 상기 분석 장치는 상기 촬상 결과로부터 상기 복수의 여기광에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 한다.
여기서, 예컨대 상기 분석 장치는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광체의 형광 강도 또는 형상에 근거하여 미생물의 가능성이 있는 형광체를 특정하는 검사부를 더 가지며, 상기 분석 장치는 상기 검사부에서 특정된 형광체를 사용하여 상기 형광에서의 피크 분포를 얻는 것이 바람직하다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 관련된 한 실시 형태의 검사 장치는 이하의 구성을 가진다. 즉, 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 장치로서, 상기 시료에 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 조사하면서 당해 시료를 촬상한 결과를 수용하는 입력 장치와, 상기 입력 장치에서 수용한 촬상 결과로부터 상기 복수의 여기광에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 분석 장치를 구비하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 예컨대 상기 조사 기구는 상기 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 순서대로 또는 동시에 상기 시료에 조사하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광은 하나 이상의 피크를 가지고, 상기 분석 장치는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 각 피크의 파장 또는 주파수에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 분석 장치는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광의 각 피크의 파장 또는 주파수를 상기 여기광에 대응하여 사전에 정의되어 있는 판정 기준과 대조해서 상기 각 물체가 미생물인지 아닌지를 판정하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 검사 장치는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광은 하나 이상의 피크를 가지고, 상기 분석 장치는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광 스펙트럼에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 분석 장치는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광 스펙트럼을 상기 여기광에 대응하여 사전에 정의되어 있는 판정용 형광 스펙트럼과 대조해서 상기 각 물체가 미생물인지 아닌지를 식별하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 검사 장치는 상기 조사 기구와 상기 촬상 장치와 상기 분석 장치를 제어하는 제어 장치를 더 구비하고, 상기 제어 장치는 상기 조사 기구를 사용하여 상기 시료에 상기 여기광을 조사하면서 상기 시료의 모든 영역을 제1 배율로 상기 촬상 장치를 사용하여 촬상하며, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 상기 분석 장치를 사용하여 분석하고 상기 시료 중에 포함된 형광 물체를 특정하도록 제어하고, 이어서 상기 특정된 각 형광 물체에 상기 조사 기구를 사용하여 상기 여기광을 조사하면서 상기 특정된 각 형광 물체만을 상기 제1 배율보다 높은 제2 배율로 상기 촬상 장치를 사용하여 촬상하며, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 상기 분석 장치를 사용하여 분석함으로써 상기 각 형광 물질의 형광에서의 피크 분포를 얻도록 제어하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 검사 장치는 상기 조사 기구와 상기 촬상 장치와 상기 분석 장치를 제어하는 제어 장치를 더 구비하고, 상기 제어 장치는 상기 조사 기구를 사용하여 상기 시료에 상기 여기광을 조사하면서 상기 시료의 모든 영역을 제1배율로 상기 촬상 장치를 사용하여 촬상하며, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 상기 분석 장치를 사용하여 분석하여 상기 시료 중에 포함된 형광 물체 중 표적 미생물을 표적 이외의 미생물로부터 분리하여 추출하도록 제어하고, 이어서 상기 추출된 각 표적 미생물을 상기 제1 배율보다 높은 제2 배율로 상기 촬상 장치를 사용하여 촬상하며, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 상기 분석 장치를 사용하여 분석함으로써 상기 표적 미생물의 형광에서의 피크 분포를 얻도록 제어하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 복수의 여기광에는 여기광의 최대 강도가 340nm~750nm 범위의 파장을 가지는 여기광 중에서 선택되는 두 개 이상의 여기광이 사용되는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 촬상 장치는 전동 스테이지를 더 구비하고, 상기 제어 장치는 상기 전동 스테이지를 제어하여 상기 시료의 모든 영역을 주사하면서 상기 시료의 모든 영역을 촬상하도록 상기 촬상 장치를 제어하는 것이 바람직하다.
여기서, 예컨대 상기 촬상 장치는, 대물렌즈와, 상기 대물렌즈와 상기 필터 표면과의 거리를 일정하게 유지하도록 사전에 설정되어 있는 방정식을 구비하고, 상기 제어 장치는 상기 주사 시에 상기 방정식에 근거하여 초점의 어긋남이 생기지 않도록 상기 대물렌즈와 상기 필터 표면과의 거리를 일정하게 유지하면서 상기 시료의 모든 영역을 촬상하도록 상기 촬상 장치를 제어하는 것이 바람직하다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 관련된 한 실시 형태의 제어 프로그램은 이하의 구성을 가진다. 즉, 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 장치를제어하는 제어 프로그램으로서, 상기 검사 장치로부터 상기 시료로 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광이 조사됐을 때에, 상기 복수의 여기광의 조사에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 식별 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 관련된 한 실시 형태의 컴퓨터 가독 기억 매체는 이하의 구성을 가진다. 즉, 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 장치를 제어하는 제어 프로그램을 저장한 컴퓨터 가독 기억 매체로서, 상기 제어 프로그램은 상기 검사 장치로부터 상기 시료로 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광이 조사됐을 때에 상기 복수의 여기광의 조사에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 식별 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 구성을 가지는 미생물의 검사 방법 및 장치에 의해, 2파장 또는 3파장 이상의 여기광을 시료에 조사하고, 각각의 여기광에 대응하여 얻어지는 복수의 형광 상을 비교함으로써 시료액 중에 혼입된 미생물을 자동적으로 식별하는 것이 가능하게 되기 때문에, 검사 시간을 단축할 수 있고, 인위적인 에러에 의한 측정 실수를 방지할 수도 있다.
이하, 도면을 참조하여 본 발명에 관련된 바람직한 실시 형태를 설명한다.
[미생물의 검사 장치: 도 1, 2]
우선, 도 1 및 도 2를 사용하여 본 발명에 관련된 한 실시 형태의 미생물 검출 장치(1)에 대해서 설명한다. 도 1은 미생물 검사 장치(1)의 전체 구성을 설명하는 도면이고, 도 2는 미생물 검사 장치(1)의 각부의 제어를 설명하는 도면이다.
도 1에 있어서, 미생물 검사 장치(1)는 형광 현미경부(2)와 화상 해석부(3)로 구성되어 있다.
형광 현미경부(2)는 미생물을 포함하는 시료를 확대 관찰하는 형광 현미경 본체(10)와, 형광 현미경 본체(10)에서 확대 관찰된 시료 상을 광전 변환하여 화상화하는 화상 취득부(21)(예컨대, 냉각 CCD 카메라 등의 흑백 또는 컬러의 카메라)를 가진다. 화상 취득부(21)는 화상 해석부(3)에 의해 제어(23)되고, 화상 취득부(21)에서 취득한 화상 데이터(22)는 화상 해석부(3)에 보내진다. 화상 데이터(22)는 연산부(50)나 식별부(44)에서 해석되어 시료에 포함된 미생물이 식별된다.
여기서, 미생물을 포함하는 시료란, 예컨대 맥주 등의 음료로서, 본래는 미생물이나 미생물 이외의 혼입물을 포함하지 않는 것(검사 시료액)이지만, 제조 공정 등에서 미생물이나 미생물 이외의 혼입물이 혼입되어 있는지 아닌지를 조사하기 위해서 검사 시료액으로부터 소정량 취한 것을 말한다. 또한, 검사 시료액으로부터 미생물 검출 장치(1)에서 사용하는 시료는 멤브레인 필터를 사용한 여과기를 사용하여 검사 시료액을 여과하고, 멤브레인 필터 상에 미생물이나 미생물 이외의 혼입물을 포착하며, 다음에 여과기로부터 멤브레인 필터를 꺼내어 미생물이나 미생물 이외의 것이 포착된 멤브레인 필터에 형광 표지 물질이 작용시키고, 시료 중의 미생물을 형광 표지 물질로 염색하는 순서로 조제된다. 그리고 시료 중의 미생물의 염색에 사용하는 형광 표지 물질은 필요에 따라 1종 또는 복수 사용한다.
광학 현미경(10)은 형광 염색된 미생물을 포함하는 시료의 재치용 현미경 전동 스테이지(16), 전동 포커스 모터(17), 고출력 수은 램프, 크세논 램프 등을 사용하여 발생하는 여기광을 상기 시료에 조사하고, 표적 미생물을 강하게 형광 표지하는 광원부(18), 광원부(18)로부터 현미경 전동 스테이지(16)로의 광로 도중에 마련된 여기광 중에서 하나 또는 복수의 특정 파장을 선택하는 필터 및 여기광의 조사에 의해 시료로부터 발생하는 형광 중에서 하나 또는 복수의 특정 파장을 선택하는 필터를 구비한 형광 필터 블록 전환부(19) 및 대물렌즈를 전환하는 렌즈 전환부(20)를 구비하고 있다.
광학 현미경(10)은 형광 표지 물질로 염색된 미생물을 포함하는 시료를 여기하기 위해, 다른 특정 파장을 가지는 복수의 여기광을 순차적으로 이 시료에 조사하고, 형광 필터 블록 전환부(19)를 순차적으로 전환함으로써 각 여기광에 따라 얻어지는 형광을 각각 검출할 수 있다. 또한, 다른 특정 파장을 가지는 복수의 여기광을 동시에 이 시료에 조사해도 된다.
광학 현미경(10)으로부터 화상 해석부(3)로는 현재의 제 조건, 예컨대 렌즈, 필터, 스테이지 위치, 포커스 위치 등의 측정 정보(24)가 보내진다.
또한, 화상 해석부(3)는 현미경 전동 스테이지(16)용의 전동 포커스 모터(17)의 제어에 필요한 연산을 실행하는 제어부(40), 얻어진 화상 데이터(22)에 적절한 처리를 실시하여 후술하는 개개의 화소의 연결 성분에 근거하여 미생물인지 아닌지를 식별하기 위한 특징 정보를 자동적으로 산출하는 연산부(50), 검사 방법의 정의 입력이나 미생물의 판정으로 사용하는 문턱 값 등을 입력하는 키보드(72)와 스테이지 포커스 이동용 트랙 볼(71) 등으로 이루어지는 입력부(70) 및 광학 현미경에 의한 촬상 결과나 각종 해석 결과 등을 표시하는 표시부(60)를 구비하고 있다.
그리고 화상 해석부(3)에서의 처리는 각 여기광마다 행해지기 때문에, 다른 파장을 가지는 복수의 특정 파장을 가지는 여기광을 사용하여 각 영역마다 형광체가 발하는 형광 상을 취득할 수 있다. 또한, 형광 상을 취득한 경우에는 각 여기광마다 얻어지는 형광 상을 기억함과 동시에, 각 여기광마다 얻어지는 형광 상을 조합하여 형광 스펙트럼(또는, 피크의 파장)을 작성하며, 이 형광 스펙트럼을 사전에 설정되어 있는 판정용 형광 스펙트럼(또는, 판정 기준)과 비교함으로써 형광체를 표적 미생물, 표적 이외의 미생물, 미생물이 아닌 이물질 등으로 식별할 수 있다. 판정용 형광 스펙트럼(또는, 판정 기준)은 화상 해석부(3)에 기억되어 있다.
화상 해석부(3)에서는, 시료의 측정으로부터 미생물을 식별하는 해석까지의 각 공정을 제어하는 자동 형광 검사 기능을 가지고 있다. 이 자동 형광 검사 기능은 화상 해석부(3)의 ROM에 저장된 자동 형광 검사 프로그램에 근거하여 화상 해석부(3)의 CPU가 RAM을 사용하여 실행하는 것으로, 형광 염색된 시료(예컨대, 멤브레인 필터 상에 미생물을 포착하여 이것을 형광 염색한 시료)의 전면을 주사할 수 있도록 현미경 전동 스테이지(16)를 구동시키는 기능, 시료의 전면 주사에 연동되어 각 측정 시야마다 행해지는 포커스 제어 기능, 시료에서의 형광 신호의 검출 부위를 기억해 놓고, 시료를 주사한 후에 이 부위의 형광체를 현미경 관찰에 의해 재확인할 수 있도록 하는 기능(예컨대, 1차 모든 영역 검사 시보다 고배율 렌즈를 사용하거나, 또는 1차 검사에 사용한 여기광에 더하여 하나 이상의 다른 여기광을 조사하는 방법, 또는 양자를 조합하는 방법, 즉 무인 자동 및 육안의 Validation기능), 또는 취득한 화상 중의 개개의 연결 성분으로부터 형광 강도나 형상의 특징량을 자동 검출하고, 미생물의 가능성이 있는 형광체를 특정하는 기능, 이 특정된 미생물의 가능성이 있는 형광체에 근거하여 형광 스펙트럼이나 피크의 파장을 자동적으로 작성하여 미생물을 식별하는 기능 등이 있다.
그리고 제어부(40)는 멤브레인 필터의 모든 영역에 여기광을 순차적으로 조사하기 위해서 멤브레인 필터의 모든 영역을 소정 영역씩 분할하고, 시료대를 그 소정 영역씩 이동시키는 현미경 전동 스테이지(16)의 이동을 추종하면서 포커스 제어를 실행하여 항상 초점을 맞추는 전동 포커스 제어부(41), 현미경 전동 스테이지(16)를 구동시켜 미생물을 포함하는 시료의 전면 주사를 가능하게 하는 전동 스테이지 제어부(42) 및 현미경 및 카메라 제어부(43) 및 화상 취득부(21)로부터 송신되는 화상 데이터(22)로부터 미생물을 식별하는 식별부(44)를 가진다. 현미경 및 카메라 제어부(43)는 광원 셔터, 렌즈 전환, 형광 필터 블록 전환, 노광 개시 타이밍, 노광 시간의 제어 등을 행한다. 또한, 제어부(40)를 사용하여 여러 가지의 제어가 가능하지만, 일례를 제시하면 광학 현미경(10)의 배율을 저배율의 렌즈를 사용하여 저배율로 하고 나서 특정 파장을 가지는 여기광으로 미생물을 포함하는 시료의 각 영역을 순차적으로 조사하면서 미생물을 포함하는 시료의 전면을 주사함으로써 형광체를 검출하여 기억하며(제1차 자동식별), 다음에 형광체가 검출된 영역만을 고배율의 렌즈를 사용하여 1종 또는 2종 이상의 복수의 특정 파장을 가지는 여기광으로 순차적으로 조사하면서 각 형광체의 상세한 식별을 행할 수 있도록 제어할 수도 있다.
측정하는 형광체의 최대경의 정의 역내에 있어서, 시료 주사 역수를 계산하는 연산부(50)는 검사역 정의 연산부(51) 및 현미경 전동 스테이지(16)와 전동 포커스 모터(17)를 제어함으로써, 미생물을 포함하는 시료를 전면 주사할 때에 미생물을 포함하는 시료의 소정 평면에 초점을 설정하면, 항상 그 동일 평면에 자동적으로 초점을 맞추도록 하는(프리딕티브 포커스법 등이라고 부를 수도 있음) 프리딕티브 포커스 연산부(52)를 가진다.
프리딕티브 포커스법을 더 상세하게 설명하면, 프리딕티브 포커스법이란 주사 정의 범위(XY 일정 범위)중에 있어서, 시료 면과 대물렌즈와의 거리(Z 일정)를 일정하게 유지하는 방정식(시료 평면의 식)을 사전에 설정하고, 측정 주사 시에는 주사 좌표에 따라 자동적으로 시료 평면방정식대로 초점 위치를 제어하는 방법이다.
[미생물의 검사 방법]
다음에, 상기 설명한 미생물 검사 장치(1)를 사용하는 미생물의 자동식별 방법에 대해서 설명한다.
즉, 우선 시료 모든 영역에서 형광체의 소재 위치를 추출하는 제1차 자동식별 처리를 도 5를 사용하여 설명하고, 다음에 제1차 자동식별 처리에서 추출된 형광체로부터 미생물을 식별하는 제2차 자동식별 처리에 대해, 1파장 식별법(도 6), 2파장 식별법(도 7), 3파장 식별법(도 15)의 3종의 식별법을 자세히 설명한다.
그리고 제1차 및 제2차 자동식별 처리는 어떠한 렌즈의 배율로 하는 것도 가능하지만, 이하의 설명에서는 제1차 자동식별 처리를 저배율의 렌즈를 사용하여 행하고, 제2차 자동식별 처리를 고배율의 렌즈를 사용하여 행하는 경우를 예로 들어 설명한다.
[제1차 자동식별 처리 개요: 도 5]
도 5는 시료 모든 영역에서 형광체의 소재 위치를 추출하기 위한 제1차 자동식별 처리 순서에 대해서 설명하는 플로 차트이다.
그리고 스텝 S91~S93은 전처리로서, 스텝 S94~S99가 제1차 자동식별 처리이다. 이 제1차 자동식별 처리는 자동 형광 검사 프로그램에 근거하여 화상 해석부(3)에서 실행된다.
우선, 스텝 S91에 있어서 검사 시료액을 소정의 필터경, 예컨대 10~50mm의 지름을 가지는 멤브레인 필터를 사용하는 여과기로 여과하고, 멤브레인 필터 상에 미생물이나 미생물 이외의 혼입물을 포착한다.
다음에, 스텝 S92에 있어서 멤브레인 필터 상에 포착된 미생물을 소정의 형광 표지 물질로 염색한다. 예컨대, 이 염색 방법으로서 FISH법, 형광 항체법, 핵산 염색법 및 산소 염색법 등이 있다.
다음에, 스텝 S93에 있어서, 염색된 시료를 포함하는 멤브레인 필터를 미생물 검사 장치(1)의 현미경 전동 스테이지(16)에 고정함으로써 검사 시료액으로부터의 시료의 조제가 완료한다.
다음에, 스텝 S94에 있어서 현미경 전동 스테이지(16)에 고정된 염색된 시료를 포함하는 멤브레인 필터에 각 형광 표지 물질에 대응하는 특정 파장을 가지는 여기광을 조사한다. 그리고 여기광이 조사되는 멤브레인 필터는 사전에 소정의 크기를 가지는 영역으로 분할되어 있고, 여기광은 그 분할된 영역마다 조사된다.
다음에, 스텝 S95에 있어서 조사된 여기광에 따라 시료 중의 각 형광 표지 물질이 미생물에 흡수된 부분에서 발생하는 특유 파장을 가지는 형광 상을 촬상한다.
다음에, 스텝 S96에 있어서 얻어진 형광 상에 대해 2치화 방법을 사용하여 1비트 계조의 2치화 화상(binary images) 데이터를 취득하고, 미생물의 식별 처리에 필요한 연결 성분을 추출한다. 또는, 얻어진 형광 상에 적당한 화상 처리를 실시하고, 이 화상 처리 후의 이미지상에 대해 2치화 방법을 사용하여 1비트 계조의 2치화 화상 데이터를 취득하며 미생물의 식별 처리에 필요한 연결 성분을 추출하기도 한다.
다음에, 스텝 S97에 있어서 미생물과 미생물 이외를 식별하는 화상 해석 처리 및 각 연결 성분으로 이루어지는 형광체의 소재 위치의 결정을 행한다. 이 일련의 1영역에 대한 스텝 S94의 여기광의 조사로부터 스텝 S97의 미생물의 식별 처리까지의 공정을 시료의 각 영역마다 각각 행하고, 시료의 모든 영역을 주사하여 각 영역마다 형광체의 소재 위치의 결정 및 그 형광체가 미생물인지 아닌지를 알아보는 제1차 판정을 행한다.
다음에, 스텝 S98에 있어서 미생물과 미생물 이외의 소재 위치 맵의 생성 처리를 하고, 표시 화면에 검출된 미생물을 표시한다. 표시 화면에는 3종의 식별 표시로 미생물이나 미생물 이외를 표시할 수 있다.
다음에, 스텝 S99에 있어서 화상 해석 처리 결과를 보존한다.
[검사 시료액: 도 5]
다음에, 도 5의 제1차 자동식별 처리에 대해서 상세히 설명한다. 이 1차 자동식별 처리는 저배율의 렌즈를 사용하여 행해진다.
미생물 검사 장치(1)에서 측정하는 검사 시료액이란, 예컨대 맥주와 같은 음료로서, 본래는 미생물이나 미생물 이외의 혼입물을 포함하지 않는 것이다.
그렇지만, 제조 공정 등에서 상기 설명한 미생물이나 미생물 이외의 혼입물이 음료 중에 혼입할 가능성이 있다. 음료 중의 미생물로서는, 예컨대 세균이나 효모 등이 있다. 그 일례를 나타내면, 맥주에 유해한 세균인 펙티네이터스속 균은 폭 0.5~2μm, 곡선 길이는 1.5~10μm이다. 또 하나의 예를 나타내면, 효모는 폭 및 곡선 길이는 3~l0μm이다. 이와 같이 혼입하는 대상물의 크기에는 여러 가지의 크기가 고려될 수 있다. 그 때문에, 미생물 검사 장치(1)에서 사용하는 필터의 공경은 혼입하는 대상물의 크기에 따라 적절히 변경하여 사용할 수 있다.
그래서 음료의 일부를 적시에 검사 시료액으로서 꺼내고, 상기 설명한 미생물 검사 장치(1)를 사용하여 분석함으로써 신속하고 또한 정량적으로 음료 중에 미생물이나 미생물 이외의 혼입물이 포함되어 있는지를 자동적으로 식별하고 미생물과 미생물 이외의 혼입물로 나눠 표시함으로써 상기 음료의 품질 관리를 행한다.
[검사 시료액으로부터의 시료의 조제: 도 5의 스텝 S91, 92]
미생물 검사 장치(1)를 사용하여 검사 시료액 중의 미생물의 정량 분석을 하기 위해, 우선 시료 조제를 이하의 순서로 행한다.
우선, 맥주 등의 음료로부터 소정 량의 검사 시료액을 채취한다. 다음에, 멤브레인 필터를 사용한 여과기를 사용하여 검사 시료액을 여과함으로써 검사 시료액 중에 포함된 모든 미생물이나 미생물 이외의 혼입물은 멤브레인 필터 상에 포착된다.
그래서 미생물 검사 장치(1)를 사용하여 멤브레인 필터 상에 포착된 미생물의 모든 숫자를 계수함으로써 검사 시료액 중에 포함된 모든 미생물 및 미생물 이외의 혼입물의 숫자를 정량적으로 분석할 수 있다(이 상세에 대해서는 후술함).
다음에, 여과기로부터 멤브레인 필터를 꺼내고, 멤브레인 필터 상에 포착된 미생물 및 미생물 이외의 것(이하, 시료라고 함)에 형광 표지 물질을 작용시킴으로써 시료 중의 미생물을 형광 표지 물질로 염색한다. 여기서, 시료 중의 미생물의 염색은, 예컨대 도 3에서 선택된 1종 또는 복수의 형광 표지 물질을 사용하여 행한다. 다음에, 염색된 시료를 포함하는 멤브레인 필터를 미생물 검사 장치(1)의 현미경 전동 스테이지(16)에 고정함으로써 검사 시료액으로부터의 시료 조제가 완료된다.
[멤브레인 필터: 도 5의 스텝 S91]
그리고 상기 설명한 멤브레인 필터에 대해서 설명하면, 멤브레인 필터는, 예컨대 많은 공(孔)을 가지는 원반 등의 평판 형상을 가지고, 필터 직경은 10~50mm 정도로서, 필터 공경은, 예컨대 0. 2~50μm으로서 공 숫자는 필요에 따라 임의로 설계할 수 있다. 이 때문에, 상기 멤브레인 필터를 사용하여 필터 공경보다 더 큰 미생물을 포착하는 것이 가능하다.
[형광 표지 물질에 의한 염색법: 도 5의 스텝 S92]
다음에, 상기 설명한 멤브레인 필터 상에 포착된 미생물을 형광 표지 물질로 염색하는 방법에 대해서 상세히 설명한다. 미생물을 형광 표지 물질로 염색하는 방법으로서는, 이하 설명하는 FISH법이나 형광 항체법 등이 있다.
우선, FISH법에 대해서 설명하면, FISH법은 핵산 프로브를 사용하고, 세포 내의 핵산을 표적으로 하여 미생물을 형광 염색하여 검출하는 방법이다. 이 방법은 미생물로부터의 핵산 추출 공정을 필요로 하지 않으며, 전처리한 미생물에 직접 형광 표지한 핵산 프로브를 첨가하여 미생물 세포 내의 핵산 중 rRNA 또는 염색체 DNA와 혼성화시키는 방법이다.
일반적으로는, 미생물 세포 내의 핵산 중에 rRNA를 프로브의 표적으로 한다. rRNA는 살아있는 미생물 세포 내에는 수 천에서 수 십만 복사물이 존재하기 때문에, 프로브의 표적이 rRNA 복사물 숫자만큼 존재하게 된다. 이 때문에, 핵산 프로브에 결합된 형광 표지 물질이 표적으로 하는 미생물 세포 내에 많이 머물고, 사용한 형광 표지 물질에 대해 적당한 여기광을 조사하면, 형광 현미경 하에서 표적 미생물 세포만이 형태를 유지한 채 형광을 발하여 관찰할 수 있다.
또한, 염색체 DNA의 균종 특이적인 영역의 상보 서열을 프로브로 사용하는 것도 가능하고, 마찬가지로 균종 특이적인 미생물 세포를 형광 염색할 수 있다.
다음에, 형광 항체법에 대해서 설명하면, 형광 항체법은 표적 미생물 세포의 단백질이나 당류 또는 지질 등으로 이루어지는 항원을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 표적 미생물을 선택적으로 염색하는 방법이다. 이 방법은, 일반적으로는 세포 표층에 존재하는 항원을 인식하는 항체를 사용한다. 항체를 직접 형광 표지하거나 또는 1차 항체에 결합되는 2차 항체를 형광 표지함으로써 1차 항체가 인식하는 표면 항원을 가지는 미생물을 특이적으로 형광 염색하여 검출한다.
그리고 상기 설명한 멤브레인 필터 상에 포착한 미생물을 FISH법 또는 형광 항체법을 사용하여 염색하는 경우에 사용하는 형광 표지 물질의 일례를 도 3에 나타낸다. 도 3은 형광 표지 물질과 그 여기광 및 형광의 관계를 도시하는 도면이다.
도 3에 있어서, 각 형광 표지 물질에 대응하는 특정 파장을 가지는 여기광을 조사하면, 각 형광 표지 물질에 대응하는 특유 파장을 가지는 형광을 발한다. 그래서 도 3을 사용하여 형광 표지 물질의 선택 및 여기광과 형광의 파장의 선택을 할 수 있다. 예컨대, 형광 표지 물질로서 인도카르보시아닌 색소(Cy3)를 선택하고 550nm의 파장을 가지는 여기광을 조사하면, 570nm의 파장을 가지는 형광을 관측할 수 있다. 또한, 사전에 도 3에 도시하는 복수의 형광 표지 물질로 시료를 염색하여 대응하는 여기광을 시료에 조사하면, 시료와 다른 파장을 가지는 복수의 형광을 관측할 수도 있다.
[시료의 전면 분석과 연결 성분의 추출: 도 5의 스텝 S95]
다음에, 화상 해석부(3)에서 행하는 자동 형광 검사 기능을 사용한 시료의 전면 분석에 대해서 설명한다.
자동 형광 검사 기능에서는, 우선 시료 전역의 적정한 주사 범위를 결정한다. 즉, 측정 대상으로 하는 형광체의 최대경 정의역, 예컨대 1μm~20μm의 범위부터 대물렌즈의 배율을, 예컨대 10배로 설정하고, 이에 의해 일의적으로 결정되는 CCD 카메라 유효 시야, 예컨대 횡 방향 1100μm, 종 방향 870μm으로 측정 대상으로 하는 형광체의 최대경 최대치 20μm으로부터 1화면 당의 주사 스텝량(횡 방향: 1060μm= 1100-20*2, 종 방향: 850μm=870-20)을 자동적으로 구한다.
또한, 화상 해석부(3)에서는 1화면 당 촬상 에어리어 이외에서 측정 에어리어를 정의하고, 이것을 스텝량과 동일한 값으로 한다. 즉, 카메라 촬상 범위 1시야에 대해서 횡방향의 양측 20μm과 종 방향의 위쪽 20μm이 주사 촬상에 의해 인접하는 카메라 촬상 범위 시야와 중복되도록 설정한다.
화상 해석부(3)에서는, 측정 에어리어 내에 연결 성분 종점(연결 성분의 점유 에어리어 중 화면상에서 가장 아래쪽, 또한 우측의 화면상에서의 좌표)이 존재하는 연결 성분을 측정 대상으로 하기 위해 상기 설정 방법을 채용함으로써 대상 형광체를 과부족 없이 확실히 측정할 수 있다.
상기 설명한 내용을 도 4에 도시하는 화면의 측정 에어리어(80)에서 구체적으로 설명한다. 도 4는 후술하는 2치화 화상으로, 화소(81) 중 소정 휘도 이상의 휘도를 가지는 "액티브" 화소를 사선으로 표시하며, "액티브" 화소가 접속되어 있는 "덩어리"를 연결 성분(82)으로 정의한다.
또한, 도 4의 중앙부에 도시하는 연결 성분(82)이 점유하는 에어리어를 연결 성분의 점유 에어리어(83)라고 하고, 연결 성분의 점유 에어리어(83) 중 화면상에서 가장 아래쪽 또한 우측의 화면상에서의 화소를 연결 성분 종점(84)이라고 한다.
또한, 화상 해석부(3)에서는 동시에 현미경 전동 스테이지(16) 및 전동 포커스 모터(17)를 제어함으로써 항상 시료가 포착되어 있는 멤브레인 필터의 동일 평면상에 자동적으로 초점을 맞춘다. 그리고 제어되는 현미경 전동 스테이지(16)의위치 좌표(카메라 촬상 범위 시야의 좌표)와 그 화면상에서 측정되는 연결 성분의 위치 좌표에서, 대상으로 하는 형광체 상의 멤브레인 필터 상에서의 절대적인 위치 좌표가 자동적으로 결정된다.
이 방법으로 시료 상 전역에서 얻어지는 형광체의 상을 무인의 자동 주사로 검출할 수 있다. 그리고 개개의 형광체의 상의 형광 강도나 형상의 특징량, 예컨대 면적, 곡선 길이와 곡선 폭 등(상세하게는 후술함)의 파라미터에서 미생물 판정을 위한 문턱 값을 사전에 설정해 두고, 또한 복수 또는 하나의 형광 강도 측정 결과로부터 얻어지는 상기 특징량과 각 문턱 값을 비교함으로써 형광체가 미생물인지 미생물 이외의 것인지 등을 무인으로 자동 판정할 수 있다.
그리고 멤브레인 필터 상에서의 위치 좌표가 요구되고 있기 때문에, 개개의 형광체의 상에 대해서 대물렌즈의 배율을 상기 설정한 10배에서, 예컨대 20배, 40배 등으로 변경한 후에 순차적으로 주사함으로써 개개의 형광체의 상을 더 정확하게 무인 자동 등으로 측정할 수 있다(이 조작을 Validation 조작이라고 함). 이 때문에, 미생물이나 미생물 이외의 판정이 보다 용이하게 된다.
그리고 상기 설명한 방법에 의해 얻어진 측정 데이터 및 개개의 형광체의 화상은 화상 해석부(3)에 파일하여 보존되고, 필요할 때 이 파일을 화상 해석부(3)의 관리 하에서 임의로 인출하여 참조할 수 있다.
[형광체의 2치화 방법에 의한 화상 처리: 도 5의 스텝 S96]
다음에, 상기 설명한 시료 상 전역에서 얻어지는 형광체의 상에 대해 화상 해석부(3)가 화상 해석 전에 행하는 화상 처리(2치화 방법)에 대해서 설명한다.
화상 해석부(3)에서 다루는 화상은 다치(多値)의 디지털 정보에 의해 구성되어 있다. 예컨대, 흑백 화상에서는 256계조(8비트 계조) 등을 사용한다.
화상 해석부(3)는 수용한 화상을 디지털화하는 기능을 가지지만, 본 실시 형태의 경우에는 화상 취득부(21)로서 디지털 카메라를 사용하기 때문에, 취득한 화상은 이미 디지털화되어 다계조 화상이 되어 있다(256계조(8비트 계조)).
다음에, 화상 해석부(3)는 2치화 방법에 의한 화상 처리를 행한다. 즉, 2치화란 이 다계조 화상에서 화상을 구성하는 각 화소를 임의의 범위의 휘도를 "액티브"로 하고, 다른 휘도를 "네거티브"로 하여 "2치"화하며 8비트 계조의 화상을 1비트 계조로 변경한다.
[연결 성분의 추출: 도 4]
다음에, 멤브레인 필터의 각 측정 영역마다 얻어지는 상기 설명한 1비트 계조의 2치화 화상을 사용하여 미생물의 식별 처리에 필요한 연결 성분의 추출 방법에 대해서 설명한다.
도 4는 소정 영역인 측정 에어리어(80)를 측정한 화상을 상기 설명한 2치화 방법으로 화상 처리한 2치화 화상의 일례이다.
도 4의 중앙부에 위치하는 화소(81) 중 소정 휘도 이상의 휘도를 가지는 "액티브" 화소(사선부)가 접속되고 있는 "덩어리"를 연결 성분(82)으로 정의하고, 연결 성분(82)이 점유하는 에어리어가 연결 성분의 점유 에어리어(83)이고, 연결 성분 종점(84)은 연결 성분의 점유 에어리어 중 가장 오른쪽 아래의 화면상의 좌표이다.
도 4에 있어서, 소정 휘도 이상의 휘도를 가지는 "액티브" 화소의 집합체인 연결 성분(82)으로부터 후술하는 화상 해석법을 사용하여 점유 에어리어(83)가 차지하는 면적, 평균 휘도, 곡선 길이, 곡선 폭, 원형도 계수를 구할 수 있다.
[제2차 자동식별 처리: 1파장 식별법: 도 6]
다음에, 제1차 자동식별 처리에서 추출된 형광체로부터 미생물을 식별하는 제2차 자동식별 처리로서, 1파장 식별법(도 6), 2파장 식별법(도 7), 3파장 식별법(도 12)의 3종의 식별법에 대해서 상세히 설명한다.
이 제2차 자동식별 처리는 미생물을 정밀하게 식별하기 위해 고배율의 렌즈를 사용하여 행한다.
우선, 1파장 식별법에 의한 제2차 자동식별 처리에 대해서 설명한다.
도 6에 1파장을 사용한 제2차 자동식별 처리의 플로 차트를 나타낸다. 이 처리는 자동 형광 검사 프로그램에 근거하여 화상 해석부(3)에서 실행된다.
도 6에 있어서, 도 5의 스텝 S99에 이어 스텝 S195로 진행하고 제1차 자동식별 처리에 의해, 추출된 형광체의 소재 위치 맵에 따라 스테이지를 이동한다.
다음에, 스텝 S95와 스텝 S96의 처리를 하고 나서 스텝 S196으로 진행한다. 그리고 도 6의 스텝 S95와 스텝 S96은 도 5에 같은 부호로 나타낸 공정의 처리와 동일하다. 따라서 그 설명은 중복되기 때문에 여기에서의 설명은 생략한다.
스텝 S196은 1파장의 여기광을 사용한 미생물의 자동식별 처리의 특징을 나타내는 공정이며, 미생물의 자동식별 처리로서 형광체의 상의 형광 강도나 형상에 근거하여 미생물의 가능성이 있는 형광체를 특정하는 면적법, 평균 휘도법, 곡선길이법 등이 있다. 이하, 도 8~ 도 10을 사용하여 상세히 설명한다.
도 8은 1파장의 여기광을 사용하는 미생물의 식별 처리법의 일례로서, 면적법, 평균 휘도법, 곡선 길이법, 곡선 폭법 및 원형도 계수법과 각 방법에서의 미생물의 판정 기준을 나타내고 있다.
도 9는 도 8에 나타낸 곡선 길이법, 곡선 폭법 및 원형도 계수법에서의 곡선 길이, 곡선 폭 및 원형도 계수의 산출식을 나타내고 있다.
도 10a 및 도 10b는 구체적인 형광 상부터 곡선 길이법, 곡선 폭법 및 원형도 계수법을 사용하여 곡선 길이, 곡선 폭 및 원형도 계수를 산출한 일례를 나타내고 있다.
[면적법: 도 8]
우선, 면적법에 대해서 설명한다.
면적법은 도 8에 도시되는 바와 같이, 촬상에 의해 얻어지는 연결 성분의 전화소수(pix)와, 사전에 작성되어 있는 단위 화소 당의 실면적인 캘리브레이션치((μm)2/pix)와의 곱인 연결 성분의 실면적((μm)2)을 구하고, 다음에 사전에 설정되어 있는 판정 기준(도 8)과 비교하여 연결 성분이 미생물인지 미생물 이외의 것인지를 식별하는 방법이다. 판정 기준(도 8)의 예로서, 예컨대 연결 성분의 실면적이 5~200(μm)2이면, 연결 성분은 미생물이라고 식별한다.
[평균 휘도법: 도 8]
다음에, 평균 휘도법에 대해서 설명한다.
평균 휘도법은 도 8에 도시되는 바와 같이, 연결 성분을 구성하는 각 화소의 휘도(0~255)로부터 평균 휘도를 구하는 방법으로, 각 화소의 휘도를 합계한 모든 휘도를 전화소수(pix)로 나눈 값이다. 판정 기준(도 8)의 예로서, 예컨대 연결 성분의 평균 휘도가 10~255라면 연결 성분은 미생물이라고 식별한다.
[곡선 길이법: 도 8]
다음에, 곡선 길이법에 대해서 설명한다.
곡선 길이(CL: Curve Length)법은 도 8에 도시되는 바와 같이, 대상 연결 성분과 동일한 에어리어 및 주위 길이를 가진 직사각형의 가장 긴 화소 측면의 길이(pix)와, 사전에 작성되어 있는 단위 화소 길이인 캘리브레이션치(μm/pix)와의 곱인 곡선 길이(μm)를 구한다.
예컨대, 도 10a의 대상 연결 성분의 곡선 길이는 11(pix)이고, 도 10b의 대상 연결 성분의 곡선 길이는 5(pix)이다.
다음에, 사전에 설정되어 있는 미생물의 판정 기준(도 8)과 비교하여 연결 성분이 미생물인지 미생물 이외의 것인지를 식별한다.
그리고 대상 연결 성분과 동일한 에어리어 및 주위 길이를 가진 직사각형의 가장 긴 화소 측면의 길이는 도 9에 도시되는 정의식을 사용하여 산출한다. 미생물의 판정 기준(도 8)의 예로서, 예컨대 곡선 길이가 0.5~5Oμm이면 연결 성분은 미생물이라고 식별한다. 그리고 곡선 길이의 값은 구부려진 미생물, 파이버 등의 길이를 부여한다.
[곡선 폭법: 도 8]
다음에, 곡선 폭법에 대해서 설명한다.
곡선 폭(CW: Curve Width)법은 도 8에 도시되는 바와 같이, 대상 연결 성분과 동일한 에어리어 및 주위 길이를 가진 직사각형의 가장 짧은 측면의 길이(pix)와 사전에 작성되어 있는 단위 화소 길이인 캘리브레이션치(μm/pix)와의 곱인 곡선 길이(μm)를 구한다.
예컨대, 도 10a의 대상 연결 성분의 곡선 폭은 2(pix)이고, 도 10b의 대상 연결 성분의 곡선 폭은 2(pix)이다.
다음에, 사전에 설정되어 있는 미생물의 판정 기준(도 8)과 비교하여 연결 성분이 미생물인지 미생물 이외의 것인지를 식별한다.
그리고 대상 연결 성분과 동일한 에어리어 및 주위 길이를 가진 직사각형의 가장 짧은 화소 측면의 길이는 도 9에 도시되는 정의식을 사용하여 산출한다. 미생물의 판정 기준(도 8)의 예로서, 예컨대 곡선 폭이 0.1~1Oμm이면 연결 성분은 미생물이라고 식별한다. 그리고 곡선 길이의 값은 구부려진 미생물, 파이버 등의 폭을 부여한다.
[원형도 계수법: 도 8]
다음에, 원형도 계수법에 대해서 설명한다.
원형도 계수(R: Roundness)법은 도 9에 도시되는 정의식에 의해 부여되는 무차원수로서, 대상 연결 성분이 원인 경우에 최소치 1을 주고, 대상 연결 성분이 그 이외의 경우에 1보다 더 큰 값을 준다.
예컨대, 도 10a의 대상 연결 성분의 원형도 계수는 2.3이고, 도 10b의 대상연결 성분의 원형도 계수는 1.5이다.
그리고 도 9에 도시되는 정의식에 있어서, 1.064는 조정 팩터로서 화상의 디지털화에 의해 발생하는 코너의 오차를 전 주위에 걸쳐 정정한다. 미생물의 판정 기준(도 8)의 예로서, 예컨대 곡선 폭이 1~1Oμm이면 연결 성분은 미생물이라고 식별한다.
다음에, 도 6의 스텝 S197에 있어서, 이어서 자동식별 처리를 하는 형광체가 있는 경우에는, 스텝 S195로 돌아가 상기 설명한 스텝 S195~스텝 S196까지의 처리를 반복적으로 행하고, 스텝 S197에 있어서 이어서 자동식별 처리를 하는 형광체가 없는 경우에는 스텝 S198로 진행한다.
다음에, 스텝 S198에 있어서 스텝 S99에서 추출된 각 형광체에 대해 스텝 S196에서의 판정에 근거하여 미생물과 미생물 이외의 소재 위치 맵의 생성 처리를 하고, 표시 화면에 검출된 미생물을 표시한다. 표시 화면에는 3종의 식별 표시로 미생물이나 미생물 이외를 표시할 수 있다.
다음에, 스텝 S199에 있어서 각 형광체에 대해 화상 해석 처리에 의한 미생물 판정 결과를 보존함으로써 1파장의 여기광을 사용하는 미생물의 자동식별 처리가 종료된다.
이와 같이, 1파장 식별법에서는 형광체의 형상의 특징으로부터 미생물을 식별할 수 있다.
[제2차 자동식별 처리: 2파장 식별법: 도 7]
다음에, 제1차 자동식별 처리에서 추출된 형광체로부터 미생물을 식별하는제2차 자동식별 처리의 2번째 방법으로서, 2파장의 여기광을 사용하는 2파장 식별법에 대해서 상세히 설명한다.
그리고 2파장 식별법에서는, 검출하고자 하는 미생물, 즉 표적으로 하는 미생물이 특정 여기광을 조사했을 때 형광을 발하도록 시료는 사전에 도 3에 도시되는 형광 표지 물질을 사용하여 염색해 놓는다.
우선, 2파장 식별법의 개요를 설명하면, 1종류의 형광 표지 물질을 사용하여 시료에 포함된 표적 미생물을 염색하고, 이 형광 표지 물질에 대응하는 여기광과 그 이외의 여기광을 이 시료에 순차적으로 조사하며, 대응하여 각 형광체로부터 방출되는 형광 상을 순차적으로 검출하고, 각 여기광에 대응하여 얻어지는 형광 상을 조합해서 각 형광체마다 형광 스펙트럼을 작성하고, 얻어진 형광 스펙트럼을 사전에 설정되어 있는 판정 기준용의 형광 스펙트럼과 비교한다. 그 결과로부터 각 형광체가 표적 미생물인지, 또는 표적 미생물 이외의 것인지를 제각기 식별하여 시료 중의 표적 미생물을 식별할 수 있다.
도 7 및 도 14에 2파장을 사용한 미생물의 자동식별 처리의 플로 차트를 도시한다. 이 처리는 자동 형광 검사 프로그램에 근거하여 화상 해석부(3)에서 실행된다.
도 7에 있어서, 도 5의 스텝 S99에 이어 스텝 S293으로 진행하고, 제1차 자동식별 처리에서 추출된 형광체의 소재 위치 맵에 따라 스테이지를 이동한다.
다음에, 제1파장을 가지는 여기광을 사용하여 스텝 S95와 스텝 S96과 스텝 S196의 처리를 하고, 형광체의 형상 등의 특징으로부터 도 8에 도시되는 미생물의판정 기준에 따라서 표적이 미생물인 가능성이 있는 형광체를 특정하고 나서 스텝 S294로 진행한다. 그리고 도 7의 스텝 S95와 스텝 S96과 스텝 S196의 처리는 도 6에서 동일한 부호로 나타낸 공정의 처리와 같다. 따라서 그 상세한 설명은 중복되기 때문에 여기에서의 설명에서는 생략한다.
다음에, 스텝 S294에서 형광 필터를 전환하고 나서 스텝 S295로 진행하고, 제2 파장을 가지는 여기광을 사용하여 상기 설명한 스텝 S95와 스텝 S96과 스텝 S196의 처리를 반복적으로 행한다.
다음에, 스텝 S295의 처리가 종료되면, 다음에 스텝 S296으로 진행된다. 스텝 S296에서는, 스텝 S196에서 특정된 각 표적이 미생물인 가능성이 있는 형광체 중에서 표적 미생물을 식별한다. 스텝 S296은 2파장의 여기광을 사용한 미생물의 자동식별 처리 특징을 도시하는 공정으로 그 상세를 도 14에 나타낸다. 즉, 스텝 S200에서, 각 여기광에 대해 각 필드마다 얻어지는 형광체로부터 형광 스펙트럼 또는 피크의 파장을 작성하고, 다음에 스텝 S201에서, 얻어진 형광 스펙트럼 또는 피크의 파장을 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준과 대조하여 각 필드의 형광체로부터의 미생물을 식별한다.
다음에, 스텝 S297에 있어서, 이어서 자동식별 처리를 하는 형광체가 있는 경우에는 스텝 S298로 진행하고, 형광 필터를 원 위치로 돌리고 나서 스텝 S293으로 되돌아가 상기 설명한 스텝 S293~스텝 S296까지의 처리를 반복적으로 행하며, 스텝 S297에 있어서, 이어서 자동식별 처리를 하는 형광체가 없는 경우에는 스텝 S198로 진행하여 스텝 S198과 스텝 S199의 처리를 행한다.
그리고 도 7의 스텝 S198과 스텝 S199의 처리는 도 6에 같은 부호로 나타낸 공정의 처리와 같다. 따라서 그 설명은 중복되기 때문에 여기에서의 설명에서는 생략한다.
다음에, 상기 설명한 2파장 식별법에서의 제2차 자동식별 처리에 대해서 도 11~ 도 13을 사용하여 구체적으로 설명한다. 이 처리는 자동 형광 검사 프로그램에 근거하여 화상 해석부(3)에서 실행된다.
2파장의 여기광을 사용하는 제2차 자동식별 처리에서는, 우선 1파장 식별법에서 설명한 면적법, 평균 휘도법, 곡선 길이법 등을 2파장의 여기광에 각각 적용하여 각 여기광에 대한 형광체의 형광 강도나 형상 등의 특징으로부터 도 8에 도시되는 미생물의 판정 기준에 따라서 표적이 미생물인 가능성이 있는 형광체를 특정하고 나서(스텝 S196), 다음에 각 여기광에 대해 얻어지는 표적이 미생물인 가능성이 있는 형광체의 차이를 이용하여 미생물을 식별한다(스텝 S296).
도 11은 2파장의 여기광을 사용하는 제2차 식별 처리로 얻어지는 각 필드의 형광체(2치화 화상)의 예를 설명하는 도면이다.
2파장의 여기광을 사용하는 제2차 식별 처리에서는 다른 2개의 여기광1(예:Cy3 검출용) 및 여기광2를 멤브레인 필터 상의 시료에 조사하고, 예컨대 도 11에 도시되는 바와 같이, 각각의 여기광에 대응하여 각 필드(여기서는 A, B, C의 3필드)마다 얻어지는 형광체를 촬상하여 형광체(2치화 화상)(301~306)를 취득한다.
다음에, 도 12에 도시되는 바와 같이 2개의 여기광1 및 여기광2에 대해필드A, B, C에서 각각 얻어지는 6개의 형광체(30l~306)를 조합하여 형광 스펙트럼(350, 352, 354) 또는 피크의 파장(351, 353, 355)을 작성한다.
예컨대, 필드A에서는 2개의 여기광에 대해 각각 얻어지는 형광체(30l, 304)를 조합하여 2개의 피크를 가지는 형광 스펙트럼(350) 또는 피크의 파장(351)을 작성한다. 필드B에서는 2개의 여기광에 대해 각각 얻어지는 형광체(302, 305)를 조합하여 하나의 피크를 가지는 형광 스펙트럼(352) 또는 피크의 파장(353)을 작성한다. 필드C도 마찬가지로 해서 형광 스펙트럼(354) 또는 피크의 파장(355)을 작성한다.
다음에, 작성한 형광 스펙트럼(350, 352, 354) 또는 피크의 파장(351, 353, 355)을 도 13에 일례를 도시하는 표적 미생물을 도시하는 판정용 형광 스펙트럼(360), 이물질을 도시하는 판정용 형광 스펙트럼(361) 또는 판정 기준(2파장용)(362)과 각각 비교한다. 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준은 사전에 각 여기광에 대응하여 얻어지는 형광의 피크 분포로부터 그 형광 스펙트럼 또는 피크의 파장이 표적 미생물인지 이물질인지를 판정하는 것이다. 예컨대, 도 11의 각 필드마다 얻어진 형광 스펙트럼(350, 352, 354)을 표적 미생물을 가리키는 판정용 형광 스펙트럼(360), 이물질을 가리키는 판정용 형광 스펙트럼(361)과 비교함으로써 도 11의 3개의 필드에 얻어지는 형광체 중 필드B만이 표적 미생물이고, 필드A, C의 형광체는 이물질이라고 식별된다. 그리고 이물질의 일례는 여기광에 대해 형광의 선택성이 없는 자가 형광체 등을 들 수 있다. 또한, 상기 사용한 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준은 각 여기광에 대응하여 사전에 화상 해석부(3)에 기억되어있다.
이와 같이, 형광체(2치화 화상)(301~306)로부터 형광 스펙트럼 또는 피크의 파장 등을 작성하고, 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준과 비교함으로써 형광체가 표적 미생물인지 이물질인지를 자동적으로 식별할 수 있다. 이 것에서 시료 중에 포함된 표적 미생물 등을 간단히 무인으로 식별할 수 있다.
[제2차 자동식별 처리: 3파장 이상 식별법: 도 15]
다음에, 제1차 자동식별 처리에서 추출된 형광체로부터 미생물을 식별하는 제2차 자동식별 처리의 3번째의 방법으로서, 3파장 이상의 여기광을 사용하는 3파장 이상 식별법에 대해 3파장의 여기광을 사용하는 3파장 식별법을 예로 상세히 설명한다. 이 처리는 자동 형광 검사 프로그램에 근거하여 화상 해석부(3)에서 실행된다.
그리고 3파장을 사용하는 식별법에서는 사전에 시료 중에 포함된 표적 미생물, 표적 이외의 미생물을 식별할 수 있도록 시료를 2종의 형광 표지 물질(예컨대, Cy3, DAPI)에 의해 염색한다. 일례를 나타내면, 표적 미생물(예컨대, 펙티네이터스균)은 2종의 형광 표지 물질(Cy3, DAPI)에 의해 2중으로 염색하고, 표적 이외의 미생물은 1종의 형광 표지 물질(DAPI)만으로 염색한다.
우선, 3파장 식별법의 개요를 설명한다. 2종의 형광 표지 물질을 사용하여 시료에 포함된 미생물을 표적 미생물과 그 이외의 미생물이 식별될 수 있도록 염색하고, 이 형광 표지 물질에 대응하는 2종의 여기광과 그 이외의 여기광을 이 시료에 순차적으로 조사하며, 대응하여 각 형광체로부터 방출되는 형광 상을 순차적으로 검출하고, 각 여기광에 대응하여 얻어지는 형광 상을 조합하여 각 형광체마다 형광 스펙트럼을 작성하고, 얻어진 형광 스펙트럼을 사전에 설정되어 있는 판정용의 형광 스펙트럼과 비교한다. 그 결과, 각 형광체가 표적 미생물인지 기타의 미생물인지 또는 그 이외의 물체인지를 개별적으로 식별하여 시료 중의 표적 미생물을 식별할 수 있다.
도 15 및 도 14에 3파장을 사용한 미생물의 자동식별 처리의 플로 차트를 나타낸다.
도 15에 있어서, 도 5의 스텝 S99에 이어서 스텝 S293으로 진행하고, 제1차 자동식별 처리에서 추출된 형광체의 소재 위치 맵에 따라 스테이지를 이동한다.
다음에, 제1파장을 가지는 여기광을 사용하여 스텝 S95와 스텝 S96과 스텝 S196의 처리를 행하고 형광체의 형광 강도나 형상 등의 특징으로부터 도 8에 도시되는 미생물의 판정 기준에 따라서 표적이 미생물인 가능성이 있는 형광체를 특정하고 나서 스텝 S294로 진행한다. 그리고 도 15의 스텝 S95와 스텝 S96과 스텝 S196의 처리는 도 6에서 같은 부호로 도시한 공정의 처리와 같다. 따라서 그 설명은 중복되기 때문에 여기에서의 설명에서는 생략한다.
다음에, 스텝 S390으로 진행하고, 다음 여기광에 의한 조사를 행하기 위해 다음의 형광 필터로 전환할 필요가 있는 경우에는 스텝 S294로 진행하며, 형광 필터를 전환하고 나서 스텝 S295로 진행하고, 제2 파장을 가지는 여기광을 사용하여 상기 설명한 스텝 S95와 스텝 S96의 처리를 반복적으로 행한 후에 스텝 396으로 진행한다. 한편, 스텝 S390에 있어서, 모든 여기광에 의한 조사가 종료되고 다음 필터의 전환이 필요 없을 경우에는 스텝 S396으로 진행한다.
스텝 S396에서는, 스텝 S196에서 각각 특정된 표적이 미생물인 가능성이 있는 형광체 중에서 표적 미생물을 식별한다. 스텝 S396은 3파장 이상의 여기광을 사용한 미생물의 자동식별 처리 특징을 도시하는 공정으로 그 상세를 도 14에 도시한다. 즉, 스텝 S200에서 각 여기광에 대해 각 필드마다 얻어지는 형광체로부터 형광 스펙트럼 또는 피크의 파장을 작성하고, 이어서 스텝 S201에서, 얻어진 형광 스펙트럼 또는 피크의 파장을 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준과 대조하여 각 필드의 형광체로부터 미생물을 식별한다.
다음에, 스텝 S297에 있어서, 이어서 자동식별 처리를 하는 형광체가 있을 경우에는, 스텝 S298로 진행하며, 형광 필터를 원 위치로 돌리고 나서 스텝 S293으로 되돌아가 상기 설명한 스텝 S293~스텝 S396까지의 처리를 반복적으로 행하고, 스텝 S297에 있어서, 이어서 자동식별 처리를 하는 형광체가 없을 경우에는 스텝 S198로 진행하며 스텝 S198과 스텝 S199의 처리를 행한다.
그리고 도 12의 스텝 S198과 스텝 S199의 처리는 도 6에서 같은 부호로 나타낸 공정의 처리와 같다. 따라서 그 설명은 중복되기 때문에, 여기에서의 설명에서는 생략한다.
다음에, 상기 설명한 3파장 식별법에서의 제2차 자동식별 처리에 대해서 도 16~ 도 20을 사용하여 구체적으로 설명한다.
3파장의 여기광을 사용하는 제2차 자동식별 처리에서는, 우선 1파장 식별법에서 설명한 면적법, 평균 휘도법, 곡선 길이법 등을 3파장의 여기광에 각각 적용하여 각 여기광에 대한 형광체의 형광 강도나 형상으로부터 표적이 미생물인 가능성이 있는 형광체를 특정하고(스텝 S196), 다음에 각 여기광에 대해 얻어지는 표적이 미생물인 가능성이 있는 형광체의 차이를 이용하여 미생물을 식별한다(스텝 S396).
도 16은 3파장의 여기광을 사용하는 제1차 및 제2차 식별 처리에서 얻어지는 각 필드의 형광체(2치화 화상)의 예를 설명하는 도면이다.
3파장의 여기광을 사용하는 제1차 식별 처리에서는 저배율의 렌즈를 사용하고, 예컨대 여기광2(DAPI 검출용)를 멤브레인 필터 상의 시료에 조사하며, 여기광2에 대응하여 각 필드마다 얻어지는 형광체를 촬상하여 형광체(2치화 화상)(413~4l6)를 취득한다.
다음에, 3파장의 여기광을 사용하는 제2차 식별 처리에서는, 제1차 식별 처리에서 형광체가 검출된 필드만에 다른 3개의 여기광1~여기광3을 순차적으로 조사하고, 예컨대 도 16에 도시되는 바와 같이 각각의 여기광에 대응하여 각 필드(여기서는 A~D의 4필드)마다 얻어지는 형광체를 촬상하여 형광체(2치화 화상)(401~412)를 취득한다.
다음에, 도 17에 도시되는 바와 같이 3개의 여기광1~여기광3에 대해 필드A~D에서 각각 얻어지는 3개의 형광체(401~412)를 조합하여 형광 스펙트럼(451~454)을 작성한다. 그리고 도 17에서는 생략됐지만, 형광 스펙트럼(451~454) 대신에 도 12에서 도시된 바와 같은 피크의 파장을 작성해도 된다.
예컨대, 필드A에서는 3개의 여기광에 대해 각각 얻어지는 형광체(401, 405,409)를 조합하여 3개의 피크를 가지는 형광 스펙트럼(451)을 작성한다. 필드B에서는, 3개의 여기광에 대해 각각 얻어지는 형광체(402, 406, 410)를 조합하여 2개의 피크를 가지는 형광 스펙트럼(452)을 작성한다. 필드C 및 D도 마찬가지로 행하여 하나의 피크를 가지는 형광 스펙트럼(453, 454)을 작성한다.
다음에, 작성한 형광 스펙트럼(451~454)을 도 18에 일례를 나타내는 판정용 형광 스펙트럼(460~463)과 각각 비교한다. 판정용 형광 스펙트럼은 1차 식별용으로 사용한 여기광과 2차 식별용으로 사용한 여기광의 조합에 대응하여 각각 준비되어 있고, 얻어지는 형광의 피크 분포로부터 그 형광 스펙트럼이 표적 미생물인지 표적 이외의 미생물인지 이물질인지를 판정하는 것이다.
그리고 도 18에 일례를 나타내는 판정용 형광 스펙트럼(461~463)은 460에 도시되는 1차 식별용 여기광으로서 여기광2를 조사했을 때, 시료로부터 검출된 형광체에 대해 여기광1~3을 사용하여 2차 식별할 때 사용하는 3파장용의 판정용 형광 스펙트럼의 예로서, 461은 이물질을, 462는 표적 미생물을, 463은 표적 이외의 미생물을 각각 가리키고 있다.
도 16의 각 필드마다 얻어진 형광 스펙트럼(451~454)을 판정용 형광 스펙트럼(461~463)과 조합함으로써 도 16의 4개의 필드에서 얻어지는 형광체 중 필드B만이 표적 미생물이고, 필드C, D의 형광체는 표적 이외의 미생물, 필드A는 이물질이라고 식별된다. 그리고 이물질의 일례는 여기광에 대해 형광의 선택성이 없는 자가 형광체 등을 들 수 있다. 또한, 상기 사용한 판정용 형광 스펙트럼은 각 여기광에 대응하여 사전에 화상 해석부(3)에 기억되어 있다.
또한, 상기 설명한 형광 스펙트럼을 작성하는 것 대신에 도 12에서 나타낸 피크의 파장을 작성해도 된다. 이 경우에는, 판정용 형광 스펙트럼 대신에 사전에 화상 해석부(3)에 기억되어 있는 도 13에서 나타낸 바와 같은 3파장용의 판정 기준을 사용하면 된다.
이와 같이, 형광체(2치화 화상)(401~412)로부터 형광 스펙트럼 또는 피크의 파장 등을 작성하고, 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준과 비교함으로써, 형광체가 표적 미생물인지, 표적 이외의 미생물인지, 이물질인지를 자동적으로 식별할 수 있다. 이것에서, 시료액 중에 포함된 표적 미생물 등을 간단히 무인으로 식별할 수 있다.
[3파장 식별법의 다른 예: 도 19]
도 19는 3파장의 여기광을 사용하는 제2차 식별 처리의 다른 예에 대해서 설명하는 도면이다. 시료 중에 포함된 미생물은 사전에 표적 미생물, 표적 이외의 미생물을 식별할 수 있도록 시료는 2종의 형광 표지 물질(예컨대, Cy3, DAPI)에 의해 염색되어 있다.
도 19의 예가 도 16에 도시된 예와 다른 점은 도 16에서는 제2차 식별 처리에 앞서서 저배율로 형광체를 검출하는 제1차 식별 처리에서 사용하는 여기광으로 여기광2(DAPI 검출용)를 사용하는 것에 대해, 도 19에서는 제1차 식별 처리에서 사용하는 여기광에 여기광1(Cy3 검출용)을 사용하는 점이다.
도 19의 501~505는 제1차 식별 처리에서 검출되는 형광체를 나타내고 있다. 즉, 여기광1(Cy3 검출용)을 멤브레인 필터 상의 시료에 조사하고, 여기광1에 대응하여 각 필드(여기서는, A~E의 5필드)로부터 검출되는 형광체의 2치화 화상이다. 그리고 필드E로부터는 형광체는 얻어지지 않는 것을 나타내고 있다.
다음에, 도 19에 도시되는 바와 같이 3개의 여기광1~여기광3에 대해 필드A~D에서 각각 얻어지는 3개의 형광체(506~517)를 조합하여, 도시는 하지않았으나, 도 17과 같은 형광 스펙트럼 또는 도 12에 나타낸 피크의 파장을 작성한다.
다음에, 작성한 형광 스펙트럼을 도 20에 일례를 나타내는 3파장용의 판정용 형광 스펙트럼(471~474)과 각각 비교한다. 그리고 도 20의 판정용 형광 스펙트럼은 470에 도시하는 1차 식별용으로 사용한 여기광과 2 차 식별용으로 사용한 여기광의 조합에 대응하여 각각 준비 되어 있으며, 얻어지는 형광의 피크 분포로부터 그 형광 스펙트럼이 표적 미생물인지 표적 이외의 미생물인지 이물질인지를 판정하는 것이다.
그리고 도 20에 일례를 나타내는 판정용 형광 스펙트럼(471~474)은 470에 도시하는 1차 식별용 여기광으로서 여기광1을 조사했을 때 시료로부터 검출된 형광체에 대해 여기광1~3을 사용하여 2차 식별할 때에 사용하는 3파장용의 판정용 형광 스펙트럼의 예로서, 471은 이물질을, 472는 표적 미생물을, 473, 474는 이물질을 각각 가리키고 있다.
도 19의 각 필드마다 얻어진 형광 스펙트럼(미도시)을 판정용 형광 스펙트럼(471~474)과 조합함으로써 도 19의 4개의 필드에서 얻어지는 형광체 중 필드B만이 표적 미생물이고, 필드A, C, D의 형광체는 이물질이라고 식별된다. 그리고 이물질의 일례는 여기광에 대해 형광의 선택성이 없는 자가 형광체 등을 들 수 있다. 또한, 상기 사용한 판정용 형광 스펙트럼은 각 여기광에 대응하여 사전에 화상 해석부(3)에 기억되어 있다.
이와 같이, 형광체(2치화 화상)(506~517)로부터 형광 스펙트럼 또는 피크의 파장 등을 작성하고, 판정용 형광 스펙트럼 또는 판정 기준을 비교함으로써 형광체가 표적 미생물인지 이물질인지를 자동적으로 식별할 수 있다. 이것에서, 시료액 중에 포함된 표적 미생물 등을 간단히 무인으로 식별할 수 있다.
그리고 도 19에서는, 제1차 식별 처리에서 사용되는 여기광에 표적 미생물만을 식별하는 여기광1(Cy3 검출용)을 사용하기 때문에, 표적 이외의 미생물은 제1차 자동식별에 의해 제외된다. 이 때문에, 시료 중에 포함된 미생물 중 표적 미생물만을 제1차 자동식별에서 식별할 수 있다. 또한, 도 19에 도시하는 식별법은 제1차 자동식별에서 식별된 형광체(필드A~D) 중에서 표적 미생물(필드B)을 이물질(필드A, C, D)과 정밀하게 식별할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 실시 형태의 미생물의 검사 장치는 미량의 형광을 검출하는 것이 가능하기 때문에, 시료 중의 한 개체의 표적 미생물을 검출할 수 있다. 이 때문에, 종래와 같이 다량의 미생물을 포함하는 시료를 제작하기 위해 배양에 장시간 동안 콜로니 형성시킬 필요도 없다.
또한, 검출된 형광체의 화상으로부터 형상의 특징량, 예컨대 연결 성분의 평균 형광 강도, 면적, 곡선 길이와 곡선 폭의 비 등 각종 파라미터를 산출하고, 산출된 각종 파라미터에 근거하여 형광체의 화상이 미생물에 의한 것인지 아닌지를 무인 자동적으로 검출할 수 있다. 이 때문에, 종래와 같이 육안으로 미생물의 식별도 확인도 필요로 하지 않기 때문에 정밀하고 신속한 미생물의 자동 검출이 가능하게 된다.
따라서 본 발명에 의한 측정 장치는 음료, 식품, 의약, 화장품 등의 공정 관리, 제품 품질 관리 등에서의 미생물 검사 이외에, 배수, 공업용 물, 환경 샘플, 상하수도에서의 미생물 검사, 생명 공학 등의 여러 가지의 연구 분야에서의 미생물 검사, 더 나아가서는 자가 형광을 가진 미소편의 검출 및 숫자의 검사 등에 응용될 수 있다.
이상, 설명한 바와 같이 본 발명에 의하면, 예컨대 검사 대상이 되는 시료 중에 포함된 미생물에 관한 정보를 자동적으로 신속하게 취득할 수 있는 미생물의 검사 장치 및 검사 방법을 제공할 수 있다.

Claims (37)

  1. 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 방법으로서,
    상기 시료에 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 조사하는 조사 공정과,
    상기 복수의 여기광의 조사에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 식별 공정을
    포함하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 각 물체로부터 얻어지는 형광체의 형상에 근거하여 미생물의 가능성이 있는 형광체를 특정하는 검사 공정을 더 가지고, 상기 식별 공정에서는 상기 검사 공정에서 특정된 형광체를 사용하여 상기 형광에서의 피크 분포를 얻는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 각 물체로부터 얻어지는 형광체의 형광 강도에 근거하여 미생물의 가능성이 있는 형광체를 특정하는 검사 공정을 더 가지고, 상기 식별 공정에서는 상기 검사 공정에서 특정된 형광체를 사용하여 상기 형광에서의 피크 분포를 얻는 것을특징으로 하는 검사 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조사 공정에서는 상기 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 순서대로 상기 시료에 조사하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조사 공정에서는 상기 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 동시에 상기 시료에 조사하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광은 하나 이상의 피크를 가지고,
    상기 식별 공정에서는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 각 피크의 파장 또는 주파수에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 식별 공정에서는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광의 각 피크의 파장 또는 주파수를 상기 복수의 여기광에 대응하여 사전에 정의되어 있는 판정 기준과대조해서 상기 각 물체가 미생물인지 아닌지를 판정하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 미생물은 특정 미생물임을 특징으로 하는 검사 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광은 하나 이상의 피크를 가지고,
    상기 식별 공정에서는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광 스펙트럼에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 식별 공정에서는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광 스펙트럼을 상기 복수의 여기광에 대응하여 사전에 정의되어 있는 판정용 형광 스펙트럼과 대조해서 상기 각 물체가 미생물인지 아닌지를 판정하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 미생물은 특정 미생물임을 특징으로 하는 검사 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    1차 검사 공정과,
    2차 검사 공정을 포함하고,
    상기 1차 검사 공정에서는 상기 시료에 상기 여기광을 조사하면서 상기 시료의 모든 영역을 제1 배율로 관찰함으로써 상기 시료 중에 포함된 형광 물체를 특정하며,
    상기 2차 검사 공정에서는 상기 조사 공정 및 상기 식별 공정을 실시하고, 이 때에 상기 1차 검사 공정에서 특정된 각 형광 물체를 상기 제1 배율보다 높은 제2 배율로 관찰하면서 상기 각 형광 물체의 형광에서의 피크 분포를 얻는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    1차 검사 공정과,
    2차 검사 공정을 포함하고,
    상기 1차 검사 공정에서는 상기 시료에 상기 여기광을 조사하면서 상기 시료의 모든 영역을 제1 배율로 관찰함으로써 상기 시료 중에 포함된 형광 물체 중 표적 미생물을 표적 이외의 미생물로부터 분리하여 추출하며,
    상기 2차 검사 공정에서는 상기 조사 공정 및 상기 식별 공정을 실시하고, 이 때에 상기 1차 검사 공정에서 추출한 각 표적 미생물을 상기 제1 배율보다 높은제2 배율로 관찰하면서 상기 각 표적 미생물의 형광에서의 피크 분포를 얻는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 시료 중에 포함된 미생물을 필터 상에 포착하고, 당해 필터 상에 포착된 미생물을 포함하는 물체를 형광 표지 물질을 사용하여 염색하는 시료 조제 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 시료 중에 포함된 미생물을 필터 상에 포착하고, 두 개 이상의 파장을 포함하는 여기광을 조사했을 때에, 당해 필터 상에 포착된 미생물이 하나 이상의 형광에서의 피크를 가지도록 당해 필터 상에 포착된 미생물을 형광 표지 물질로 염색하는 시료 조제 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 두 개 이상의 파장을 포함하는 여기광에는 여기광의 최대 강도가 340nm~750nm 범위의 파장을 가지는 여기광 중에서 선택되는 두 개 이상의 여기광이 사용되는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 형광 표지 물질로는, 텍사스 레드, 테트라메틸 로다민, 인도카르보시아닌 색소, 알렉사 색소, 디아미디노페닐인돌(DAPI), 프로비듐·이오다이드 및 플루오로세인 이소티오시아네이트(FITC) 중에서 어느 하나 이상의 형광 표지 물질이 사용되는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 시료 중에 포함된 미생물을 필터 상에 포착하고, 3개 이상의 파장을 포함하는 여기광을 당해 필터에 조사했을 때에, 당해 필터 상에 포착된 미생물이 두 개 이상의 형광에서의 피크를 가지도록 당해 필터 상에 포착된 미생물을 다른 종류의 형광 표지 물질로 염색하는 시료 조제 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 3개 이상의 파장을 포함하는 여기광에는 여기광의 최대 강도가 340nm~750nm 범위의 파장을 가지는 여기광 중에서 선택되는 3개 이상의 여기광이 사용되는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 형광 표지 물질로는, 텍사스 레드, 테트라메틸 로다민, 인도카르보시아닌 색소, 알렉사 색소, 디아미디노페닐인돌(DAPI), 프로비듐·이오다이드 및 플루오로세인 이소티오시아네이트(FITC) 중에서 어느 두 개 이상의 형광 표지 물질이 사용되는 것을 특징으로 하는 검사 방법.
  21. 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 장치로서,
    상기 시료에 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 조사하는 조사 기구와,
    상기 시료를 촬상하는 촬상 장치와,
    상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 분석하는 분석 장치를 구비하고,
    상기 분석 장치는 상기 촬상 결과로부터 상기 복수의 여기광에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 분석 장치는, 우선 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광체의 형상에 근거하여 미생물의 가능성이 있는 형광체를 특정하고, 이어서 특정된 형광체를 사용하여 상기 형광에서의 피크 분포를 얻도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 분석 장치는, 우선 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광체의 형광 강도에 근거하여 미생물의 가능성이 있는 형광체를 특정하고, 이어서 특정된 형광체를 사용하여 상기 형광에서의 피크 분포를 얻도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  24. 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 장치로서,
    상기 시료에 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 조사하면서 당해 시료를 촬상한 결과를 수용하는 입력 장치와,
    상기 입력 장치에서 수용한 촬상 결과로부터 상기 복수의 여기광에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 분석 장치를
    구비하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  25. 제21항에 있어서.
    상기 조사 기구는 상기 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 순서대로 상기 시료에 조사하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 조사 기구는 상기 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광을 동시에 상기 시료에 조사하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  27. 제21항에 있어서.
    상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광은 하나 이상의 피크를 가지고,
    상기 분석 장치는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 각 피크의 파장 또는 주파수에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 분석 장치는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광의 각 피크의 파장 또는 주파수를 상기 여기광에 대응하여 사전에 정의되어 있는 판정 기준과 대조해서 상기 각 물체가 미생물인지 아닌지를 판정하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  29. 제21항에 있어서,
    상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광은 하나 이상의 피크를 가지고,
    상기 분석 장치는 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광 스펙트럼에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 분석 장치는 상기 각 물체로부터 얻어지는 형광 스펙트럼을 상기 여기광에 대응하여 사전에 정의되어 있는 판정용 형광 스펙트럼과 대조해서 상기 각 물체가 미생물인지 아닌지를 식별하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  31. 제21항에 있어서,
    상기 조사 기구와 상기 촬상 장치와 상기 분석 장치를 제어하는 제어 장치를 더 구비하고, 상기 제어 장치는 상기 조사 기구를 사용하여 상기 시료에 상기 여기광을 조사하면서 상기 시료의 모든 영역을 제1 배율로 상기 촬상 장치를 사용하여 촬상하고, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 상기 분석 장치를 사용하여 분석해서 상기 시료 중에 포함된 형광 물체를 특정하도록 제어하며,
    이어서 상기 특정된 각 형광 물체에 상기 조사 기구를 사용하여 상기 여기광을 조사하면서 상기 특정된 각 형광 물체만을 상기 제1 배율보다 높은 제2 배율로 상기 촬상 장치를 사용하여 촬상하고, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 상기 분석 장치를 사용하여 분석함으로써 상기 각 형광 물질의 형광에서의 피크 분포를 얻도록 제어하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  32. 제21항에 있어서,
    상기 조사 기구와 상기 촬상 장치와 상기 분석 장치를 제어하는 제어 장치를 더 구비하고,
    상기 제어 장치는 상기 조사 기구를 사용하여 상기 시료에 상기 여기광을 조사하면서 상기 시료의 모든 영역을 제1 배율로 상기 촬상 장치를 사용하여 촬상하고, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 상기 분석 장치를 사용하여 분석하여 상기 시료 중에 포함된 형광 물체 중 표적 미생물을 표적 이외의 미생물로부터 분리하여 추출하도록 제어하며,
    이어서 상기 추출된 각 표적 미생물을 상기 제1 배율보다 높은 제2 배율로 상기 촬상 장치를 사용하여 촬상하고, 상기 촬상 장치에 의한 촬상 결과를 상기 분석 장치를 사용하여 분석함으로써 상기 표적 미생물의 형광에서의 피크 분포를 얻도록 제어하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  33. 제21항에 있어서,
    상기 복수의 여기광에는 여기광의 최대 강도가 340nm~750nm 범위의 파장을 가지는 여기광 중에서 선택되는 2개 이상의 여기광이 사용되는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  34. 제32항에 있어서,
    상기 촬상 장치는 전동 스테이지를 더 구비하고,
    상기 제어 장치는 상기 전동 스테이지를 제어하여 상기 시료의 모든 영역을 주사하면서 상기 시료의 모든 영역을 촬상하도록 상기 촬상 장치를 제어하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 촬상 장치는 대물렌즈와, 상기 대물렌즈와 상기 필터 표면과의 거리를 일정하게 유지하도록 사전에 설정되어 있는 방정식을 구비하고, 상기 제어 장치는 상기 주사 시에 상기 방정식에 근거하여 초점의 어긋남이 생기지 않도록 상기 대물렌즈와 상기 필터 표면과의 거리를 일정하게 유지하면서 상기 시료의 모든 영역을 촬상하도록 상기 촬상 장치를 제어하는 것을 특징으로 하는 검사 장치.
  36. 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 장치를 제어하는 제어 프로그램으로서,
    상기 검사 장치로부터 상기 시료로 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광이 조사됐을 때에, 상기 복수의 여기광의 조사에 대응하여 상기 시료 중에 포함된 각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 식별 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 제어 프로그램.
  37. 시료 중에 포함된 미생물을 검사하는 검사 장치를 제어하는 제어 프로그램을 저장한 컴퓨터 가독 기억 매체로서,
    상기 제어 프로그램은,
    상기 검사 장치로부터 상기 시료로 서로 다른 파장을 가지는 복수의 여기광이 조사됐을 때에 상기 복수의 여기광의 조사에 대응하여 상기 시료 중에 포함된각 물체로부터 얻어지는 형광에서의 피크 분포에 근거하여 상기 시료 중에 포함된 미생물을 식별하는 식별 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터 가독 기억 매체.
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