CN1537171A - 微生物的检查装置及检查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明能够提供一种检查装置，特别是用过滤器捕集试样液中的微生物，由经荧光染色获得的试样来检测微生物相关信息的检查装置。对过滤器照射不同的激发光(1、2)，拍摄对应于各激发光在每个区域内获得的荧光的2值化图像(A、B、C)。然后，比较对应于各激发光(1、2)获得的2值化图像(A、B、C)，自动识别出仅对应于特定的激发光(例如1)发出荧光的2值化图像B为微生物的荧光像，对应于全部激发光发出荧光的2值化图像A、C为微生物之外的荧光像，由此能够简单且以无人的方式识别试样液中的微生物。

Description

微生物的检查装置及检查方法
技术领域
本发明涉及微生物的检查装置及检查方法，特别涉及例如用过滤器捕集试样液中所含的微生物等，对捕集的微生物进行荧光染色，使用显微镜将微生物从微生物之外的物质中自动识别并显示出来的微生物检查装置及检查方法。
背景技术
目前，微生物检查例如在啤酒等饮料、食品、医药品、化妆品等制造过程管理、产品品质管理等过程中的微生物检查通过必须使用各种培养基的培养检查来进行，到检查结束为止，需要花费相当长的天数。
因此，检查对象中是否存在微生物，或微生物的数量、或存在的微生物种类的鉴别等检查结果的判明较慢，在各领域的研究、开发、制造或产品发货阶段存在很大的制约。
基于这样的背景，至今为止提出了许多从含有微生物的液体试样等中迅速测定微生物的方法(例如，《微生物检查技术的最新动向》，食品与开发35(1)，P32～40(2000)等)。
已知的迅速测定微生物的方法，例如有阻抗法(Brown，D.、Warner，M.、Taylor，C.、Warren，R.、Clin.Pathol.、37、65～69(1984))、酶-荧光检测法(特开昭58-116700号公报)、PCR法、薄膜过滤器法与荧光显微镜法组合成的DEFT法(G.L.PETTIPHER，UBALDINAM.RODRIGUES，J.Appl.Bacteriol.53，323(1982))、或薄膜过滤器法与ATP法组合成的RMDS法(Takahashi，T.，Nakakita.Y.，Watari.J.，Shinotsuka.K.，Biosci.Biotechnol.Biochem.64(5)，P1032～1037(2000))等，市场上也在销售应用上述测定原理的机器。
但是，上述说明的方法中存在以下问题：1)精度不足，2)不适于迅速测定，3)定量性不足，4)包含人为误差的可能性高等多种问题。另外，也存在5)测定所必需的培养基或试剂等运转成本高的问题。
另一方面，已知有如下识别方法：过滤试样液中存在的微生物，将微生物等分离，对得到的含有微生物的试样进行荧光染色，观测者边用荧光显微镜对此试样进行目测观察，边识别微生物和微生物之外的物质。
但是，在上述方法中，由于观测者边目测观察经荧光染色的试样发出的荧光像，边识别微生物和微生物之外的物质，因此测定结果中有可能存在因测定者的误认等而产生的误差。另外，无法以无人的方式识别微生物和微生物之外的物质。
发明内容
本发明是为了解决上述说明的现有技术中存在的问题而完成的，其目的在于例如提供一种能够自动、迅速识别成为检查对象的试样中所含微生物的检查装置及检查方法。
用于实现上述目的的本发明的一个实施方案的检查方法具有如下构成。即，一种检查试样中所含微生物的检查方法，其特征在于所述检查方法包含如下步骤：用具有不同波长的多个激发光照射上述试样的照射步骤；基于对应于上述多个激发光的照射而由上述试样中所含各物体获得的荧光的峰分布，识别上述试样中所含微生物的识别步骤。
此处，例如，上述检查方法还具有基于由上述各物体获得的荧光体的荧光强度或形状，确定可能为微生物的荧光体的检查步骤，在上述识别步骤中，优选使用上述检查步骤中特定的荧光体，获得上述荧光的峰分布。
此处，例如，在上述照射步骤中，优选依次或同时对上述试样照射上述具有不同波长的多个激发光。
此处，例如，由上述试样中所含的各物体获得的荧光具有1个或1个以上的峰，在上述识别步骤中，优选基于由上述试样中所含的各物体所获荧光的各峰的波长或频率，识别上述试样中所含的微生物。
此处，例如，在上述识别步骤中，优选将由上述各物体获得的荧光的各峰的波长或频率与对应于上述多个激发光预先定义的判断基准相对照，判断上述各物体是否为微生物。
此处，例如，上述微生物优选为特定的微生物。
此处，例如，由上述试样中所含的各物体获得的荧光具有1个或1个以上的峰，在上述识别步骤中，优选基于由上述试样中所含各物体获得的荧光光谱，识别上述试样中所含的微生物。
此处，例如，在上述识别步骤中，优选将由上述各物体获得的荧光光谱与对应于上述多个激发光预先定义的判定用荧光光谱相对照，判定上述各物体是否为微生物。
此处，例如，上述微生物优选为特定的微生物。
此处，例如优选如下内容，上述检查方法包括1次检查步骤和2次检查步骤；在所述1次检查步骤中，边用上述激发光照射上述试样，边以第1倍率观察上述试样的整个区域，由此确定上述试样中所含的荧光物体；在上述2次检查步骤中，实施上述照射步骤及上述识别步骤，此时，边用高于上述第1倍率的第2倍率观察上述1次检查步骤中特定的各荧光物体，边获得上述各荧光物体的荧光的峰分布。
此处，例如优选如下内容，上述检查方法包括1次检查步骤和2次检查步骤；在上述1次检查步骤中，边用上述激发光照射上述试样，边以第1倍率观察上述试样的整个区域，由此从上述试样中所含的荧光物体中，将目标微生物从目标之外的微生物中分离并提取出来；在上述2次检查步骤中，实施上述照射步骤及上述识别步骤，此时，边用高于上述第1倍率的第2倍率观察上述1次检查步骤中提取出的各目标微生物，边获得上述各目标微生物的荧光的峰分布。
此处，例如，上述检查方法还优选包括将上述试样中所含的微生物捕集在过滤器上、使用荧光标记物质将捕集在此过滤器上的微生物染色的试样调制步骤。
此处，例如上述检查方法还优选包括用过滤器捕集上述试样中所含的微生物、使用荧光标记物质将捕集在此过滤器上的微生物染色的试样调制步骤，使得在用包括2个或2个以上波长的激发光照射时，捕集在过滤器上的微生物具有1个或1个以上的荧光的峰。
此处，例如，对于上述含有2个或2个以上波长的激发光而言，优选使用从激发光的最大强度具有340nm～750nm范围内的波长的激发光中选择的2种或2种以上的激发光。
此处，例如，在上述荧光标记物质中，优选使用德克萨斯红(texasred)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、Indo-carbocyanine色素、Alexa色素、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、碘化丙啶(providium iodide)、及异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)中的任意1种或1种以上的荧光标记物质。
此处，例如上述检查方法还优选包括用过滤器捕集上述试样中所含的微生物、用不同种类的荧光标记物质将捕集在此过滤器上的微生物染色的试样调制步骤，使得在用含有3个或3个以上波长的激发光照射此过滤器时，捕集在此过滤器上的微生物具有2个或2个以上的荧光的峰。
此处，例如，对于上述含有3个或3个以上波长的激发光而言，优选使用从激发光的最大强度具有340nm～750nm范围内的波长的激发光中选择的3个或3个以上的激发光。
此处，例如，在上述荧光标记物质中，优选使用德克萨斯红(texasred)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、Indo-carbocyanine色素、Alexa色素、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、碘化丙啶(providium iodide)、及异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)中的任意2种或2种以上的荧光标记物质。
用于实现上述目的的本发明的一个实施方案的检查装置具有如下构成。即，一种检查试样中所含微生物的检查装置，其特征在于所述检查装置具有对上述试样照射具有不同波长的多个激发光的照射装置，拍摄上述试样的拍摄装置和分析上述拍摄装置的拍摄结果的分析装置；上述分析装置构成为根据上述拍摄结果，基于对应于上述多个激发光而由上述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别上述试样中所含的微生物。
此处，例如，上述分析装置还具有基于由上述各物体获得的荧光体的荧光强度或形状，特定可能是微生物的荧光体的检查部；对于上述分析装置而言，在上述检查部，优选使用被特定的荧光体获得上述荧光的峰分布。
用于实现上述目的的本发明的一个实施方案的检查装置具有如下构成。即，一种检查试样中所含微生物的检查装置，其特征在于所述检查装置具有如下装置：边用具有不同波长的多个激发光照射上述试样，边输入此试样的拍摄结果的输入装置；和根据由上述输入装置获得的拍摄结果，基于对应于上述多个激发光而由上述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别上述试样中所含的微生物的分析装置。
此处，例如，上述照射装置优选依次或同时用上述具有不同波长的多个激发光照射上述试样。
此处，例如，由上述试样中所含的各物体获得的荧光具有1个或1个以上的峰，上述分析装置优选基于由上述试样中所含各物体获得的荧光的各峰的波长或频率，识别上述试样中所含的微生物。
此处，例如，上述分析装置优选将由上述各物体获得的荧光的各峰的波长或频率与对应于上述多个激发光预先定义的判断基准相对照，判断上述各物体是否为微生物。
此处，例如，对于上述检查装置而言，由上述试样中所含的各物体获得的荧光优选具有1个或1个以上的峰；对于上述分析装置而言，优选基于由上述试样中所含各物体获得的荧光光谱，识别上述试样中所含的微生物。
此处，例如，上述分析装置优选将由上述各物体获得的荧光光谱与对应于上述激发光预先定义的判定用荧光光谱相对照，识别上述各物体是否为微生物。
此处，例如，上述检查装置还具有控制上述照射装置、上述拍摄装置和上述分析装置的控制装置；所述控制装置优选进行如下控制：边使用上述照射装置以上述激发光照射上述试样，边使用上述拍摄装置以第1倍率拍摄上述试样的整个区域，使用上述分析装置分析上述拍摄装置的拍摄结果，特定上述试样中所含的荧光物体；然后，边使用上述照射装置以上述激发光照射上述被特定的各荧光物体，边使用上述拍摄装置以高于上述第1倍率的第2倍率仅拍摄上述被特定的各荧光物体，使用上述分析装置分析上述拍摄装置的拍摄结果，由此获得上述各荧光物质的荧光的峰分布。
此处，例如，上述检查装置还具有控制上述照射装置、上述拍摄装置和上述分析装置的控制装置；所述控制装置优选如下进行控制：边使用上述照射装置以上述激发光照射上述试样，边使用上述拍摄装置以第1倍率拍摄上述试样的整个区域，使用上述分析装置分析上述拍摄装置的拍摄结果，在上述试样中所含的荧光物体中，将目标微生物从目标之外的微生物中分离并提取出来；然后，使用上述拍摄装置以高于上述第1倍率的第2倍率拍摄上述提取出的各目标微生物，使用上述分析装置分析上述拍摄装置的拍摄结果，由此获得上述目标微生物的荧光的峰分布。
此处，例如，在上述多个激发光中，优选使用从激发光的最大强度具有340nm～750nm范围内的波长的激发光中选择的2种或2种以上的激发光。
此处，例如，上述拍摄装置还具有电动平台，上述控制装置边控制上述电动平台扫描上述试样的整个区域，边控制上述拍摄装置对上述试样的整个区域进行拍摄。
此处，例如，上述拍摄装置具有预先设定的方程式，以便确保对物透镜、和上述对物透镜与上述过滤器表面间的距离固定；上述控制装置在进行上述扫描时，基于上述方程式，边确保上述对物透镜与上述过滤器表面间的距离固定以防止发生焦点偏移，边控制上述拍摄装置以拍摄上述试样的整个区域。
用于实现上述目的的本发明的一个实施方案的控制程序具有如下构成。即，一种控制检查试样中所含微生物的检查装置的控制程序，其特征在于所述程序包括如下识别步骤：在用由上述检查装置发出的具有不同波长的多个激发光照射上述试样时，基于对应于上述多个激发光的照射而由上述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别上述试样中所含的微生物。
用于实现上述目的的本发明的一个实施方案的计算机可读记忆介质具有如下的构成。即，一种存储控制检查试样中所含微生物的检查装置的控制程序的计算机可读记忆介质，其特征在于所述控制程序包括如下识别步骤：在用由上述检查装置发出的具有不同波长的多个激发光照射上述试样时，基于对应于上述多个激发光的照射而由上述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别上述试样中所含的微生物。
利用具有上述构成的微生物检查方法及装置，用2波长、3波长或3波长以上的激发光照射试样，通过比较对应于各激发光而获得的多个荧光像，能够自动识别混入试样液中的微生物，因此能够缩短检查时间，也可以防止人为失误导致的测定误差。
附图说明
图1是本发明的一个实施方案的微生物检查装置。
图2是说明本发明的一个实施方案的微生物检查装置整体构成的图。
图3是表示荧光标记物质、激发光及荧光关系的图。
图4是说明结合成分的图。
图5是从试样整个区域提取荧光体所在位置的第1次自动识别处理的流程图。
图6是按1波长识别法识别微生物的第2次自动识别处理的流程图。
图7是按2波长识别法识别微生物的第2次自动识别处理的流程图。
图8是说明微生物的识别方法及其判定基准的图。
图9是说明由象素的结合成分计算曲线长度、曲线宽度及圆形度系数的方法的图。
图10是说明由象素的结合成分计算曲线长度、曲线宽度及圆形度系数的实例的图。
图11是说明按2波长识别法的第2次自动识别处理获得的各区域(field)的2值化图像(binary image)实例的图。
图12是说明在2波长识别法中，由各区域的2值化图像获得荧光光谱(或峰的波长)的顺序的图。
图13是表示2波长识别法中使用的判定用荧光光谱或判定基准之一例的图。
图14是由各区域的荧光体识别微生物的处理流程图。
图15是按3波长或3波长以上的识别法识别微生物的第2次自动识别处理的流程图。
图16是说明在3波长识别法的第1及第2次自动识别处理中获得的各区域的2值化图像实例的图。
图17是3波长识别法之一例，是说明由第2次自动识别处理获得的各区域的2值化图像得到荧光光谱的顺序的图。
图18是表示3波长识别法中使用的判定用荧光光谱或判定基准之一例的图。
图19是说明3波长识别法的第1及第2次自动识别处理中获得的各区域的2值化图像的其他例的图。
图20是表示图19的3波长识别法中使用的判定用荧光光谱的其他例的图。
具体实施方式
参照下列附图，说明本发明的优选实施方案。
[微生物的检查装置：图1、图2]
首先，使用图1及图2说明本发明的一个实施方案的微生物检查装置1。图1是说明微生物检查装置1整体构成的图，图2是说明微生物检查装置1的各部分控制的图。
在图1中，微生物检查装置1由荧光显微镜部2和图像解析部3构成。
荧光显微镜部2具有放大观察含有微生物的试样的荧光显微镜本体10，对被荧光显微镜本体10放大观察的试样像进行光电转换并将其图像化的图像获取部21(例如，冷却CCD照相机等单色或彩色的照相机)。图像获取部21由图像解析部3进行控制步骤23，将在图像获取部21处获得的图像数据22传送至图像解析部3。在运算部50或识别部44解析图像数据22，识别试样中所含的微生物。
此处，含有微生物的试样是指例如啤酒等饮料，本来不含有微生物或微生物之外的混入物的物质(检查试样液)，但在制造步骤等中，为了调查是否混入微生物或微生物之外的混入物而从检查试样液中取出的规定量的物质。另外，从检查试样液中取出用于微生物检查装置1的试样按如下顺序调制：利用使用薄膜过滤器的过滤器将检查试样液过滤，在薄膜过滤器上捕集微生物或微生物之外的混入物，然后将薄膜过滤器从过滤器上取出，使荧光标记物质作用于捕集了微生物或微生物之外的混入物的薄膜过滤器，用荧光标记物质将试样中的微生物染色。需要说明的是试样中微生物染色时使用的荧光标记物质可以根据需要使用1种或多种。
光学显微镜10具有如下部件：含有荧光染色后的微生物的试样的载置用显微镜电动平台16；电动聚焦马达17；用由高功率水银灯、氙灯等发出的激发光照射上述试样，对目标微生物进行强荧光标记的光源部18；荧光滤光块(filter block)转换部19，所述荧光滤光块(filterblock)转换部19设置在由光源部18射向显微镜电动平台16的光路中，具有选择激发光中的1个或多个的特定波长的滤光片及选择由激发光的照射而由试样发出的荧光中的1个或多个的特定波长的滤光片；及转换对物透镜的透镜转换部20。
光学显微镜10为了激发含有被荧光标记物质染色的微生物的试样，依次用具有不同特定波长的多个激发光照射此试样，依次转换荧光滤光块转换部19，由此可以分别检测对应于各激发光获得的荧光。另外，也可以同时用具有不同特定波长的多个激发光照射此试样。
由光学显微镜10，将现在的各条件例如透镜、滤光片、平台位置、聚焦位置等测定信息24传送至图像解析部3。
另外，图像解析部3具有如下部件：在显微镜电动平台16用的电动聚焦马达17的控制中进行必要的运算的控制部40；对获得的图像数据22进行适当的处理，基于后述各象素的结合成分，自动算出用于识别是否为微生物的特征信息的运算部50；由输入检查方法的定义或输入微生物判定中使用的阈值等的键盘72和平台聚焦移动用跟踪球71等构成的输入部70；及显示光学显微镜的拍摄结果或各解析结果等的显示部60。
需要说明的是由于每个激发光都进行图像解析部3的处理，因此使用具有不同波长的多个具有特定波长的激发光，能够在每个区域内获得荧光体产生的荧光像。另外，获得荧光像时，记忆由每个激发光获得的荧光像的同时，组合由每个激发光获得的荧光像，制成荧光光谱(或峰的波长)，将此荧光光谱与预先设定的判定用荧光光谱(或判定基准)进行比较，由此可以将荧光体识别为目标微生物、目标之外的微生物、非微生物的异物等。判定用荧光光谱(或判定基准)记忆在图像解析部3内。
图像解析部3具有控制由试样测定开始至识别微生物的解析完成为止的各步骤的自动荧光检查功能。此自动荧光检查功能是基于存储在图像解析部3的ROM中的自动荧光检查程序，图像解析部3的CPU使用RAM而实行的，具体包括如下各功能：驱动显微镜电动平台16以便扫描被荧光染色的试样(例如将微生物捕集在薄膜过滤器上，并将其荧光染色得到的试样)的整个面的功能；与试样的全面扫描连动，在每个测定视野内进行的焦点控制功能；预先记忆试样中荧光信号的检测部位，在扫描试样后，由显微镜观察再确认此部位的荧光体的功能(例如，使用高于1次整个区域检查时的高倍率透镜、或除了1次检查中使用的激发光之外，还照射1个或1个以上的不同激发光的方法，或将上述两者组合的方法，即无人自动及目视的确认功能)；或从所获图像中的各结合成分自动检测荧光强度或形状的特征量，确定可能为微生物的荧光体的功能；基于该被特定的可能为微生物的荧光体，自动制成荧光光谱或峰的波长，识别微生物的功能等。
需要说明的是控制部40具有如下部件：为了依次对薄膜过滤器的整个区域照射激发光，将薄膜过滤器的整个区域分割成一个个的规定区域，边追踪使试样台一个规定区域一个规定区域地移动的显微镜电动平台16的移动，边进行焦距控制，经常使焦点对光的电动调焦控制部41；驱动显微镜电动平台16，能够全面扫描含有微生物的试样的电动平台控制部42；显微镜及照相机控制部43；由从图像获取部21送出的图像数据22识别微生物的识别部44。显微镜及照相机控制部43进行光源快门、透镜转换、荧光滤光块转换、曝光开始时间、曝光时间的控制等。另外，使用控制部40可以进行各种控制，其具体例为如下进行控制：使用低倍率透镜，将光学显微镜10的倍率设置为低倍率，然后边对含有微生物的试样的各区域依次照射具有特定波长的激发光，边扫描含有微生物的试样的整个表面，由此检测并记忆荧光体(第1次自动识别)；接下来使用高倍率透镜，边仅对检测出荧光体的区域照射1种、2种或2种以上的多个具有特定波长的激发光，边进行各荧光体的详细识别。
在测定的荧光体最大径的定义区域内，计算试样扫描区域数的运算部50具有检查区域定义运算部51及通过控制显微镜电动平台16和电动调焦马达17，在全面扫描含有微生物的试样时，如果将焦点设定在含有微生物的试样的规定平面上，则可以经常地使焦点自动地在同一平面上对光(有时也称为预调焦法)的预调焦运算部52。
以下更详细地说明预调焦法。预调焦法是指在扫描定义范围(XY一定的范围)内，预先设定将试样面与对物透镜的距离(Z一定)保持一定的方程式(试样平面的式)，在测定扫描时，对应于扫描坐标，自动地按照试样平面方程式控制焦点位置的方法。
[微生物的检查方法]
接下来说明使用上述说明的微生物检查装置1的微生物自动识别方法。
即，首先参照图5说明由试样整个区域提取荧光体的所在位置的第1次自动识别处理；然后，就从第1次自动识别处理中提取出的荧光体来识别微生物的第2次自动识别处理，详细说明1波长识别法(图6)、2波长识别法(图7)、3波长识别法(图15)这样3种识别法。
需要说明的是第1次及第2次自动识别处理可以在透镜的任何倍率下进行。在下述说明中以使用低倍率透镜进行第1次自动识别处理，使用高倍率透镜进行第2次自动识别处理为例进行说明。
[第1次自动识别处理的概要：图5]
图5是说明用于由试样整个区域提取荧光体所在位置的第1次自动识别处理顺序的流程图。
需要说明的是步骤S91～S93为前处理，步骤S94～S99为第1次自动识别处理。此第1次自动识别处理基于自动荧光检查程序，在图像解析部3实行。
首先，在步骤S91中，以使用具有规定过滤器直径例如10～50mm直径的薄膜过滤器的过滤器过滤检查试样液，在薄膜过滤器上捕集微生物或微生物之外的混入物。
然后，在步骤S92中，用规定的荧光标记物质将在薄膜过滤器上捕集的微生物染色。例如，作为此染色方法有FISH法、荧光抗体法、核酸染色法及氧染色法等。
然后，在步骤S93中，将含有被染色的试样的薄膜过滤器固定在微生物检查装置1的显微镜电动平台16上，由此完成由检查试样液开始的试样调制。
然后，在步骤S94中，以具有对应于各荧光标记物质的特定波长的激发光照射固定在显微镜电动平台16上的含有被染色的试样的薄膜过滤器。需要说明的是将照射激发光的薄膜过滤器预先分割成具有规定尺寸的区域，用激发光照射每个被分割的区域。
然后，在步骤S95中，拍摄对应于照射的激发光、试样中各荧光标记物质被微生物吸收的部分发出的具有特定波长的荧光像。
然后，在步骤S96中，就获得的荧光像，使用2值化方法，获得1比特灰度的2值化图像数据，提取微生物识别处理所必要的结合成分。或者，也可以对获得的荧光像进行适当的图像处理，就此图像处理后的图像，使用2值化方法，获得1比特灰度的2值化图像数据，提取微生物识别处理所必要的结合成分。
然后，在步骤S97中，进行识别微生物和微生物之外的混入物的图像解析处理及由各结合成分构成的荧光体所在位置的确定。在试样的各区域内分别进行此一系列的有关1区域内的步骤S94的激发光照射至步骤97的微生物识别处理的步骤，扫描试样的整个区域，在每个区域内进行荧光体所在位置的确定及此荧光体是否为微生物的第1次判定。
然后，在步骤S98中，进行微生物和微生物之外的混入物所在位置图的生成处理，在显示画面上显示出被检测到的微生物。在显示画面中可以以3种识别显示方式显示微生物或微生物之外的混入物。
然后，在步骤S99中保存图像解析处理结果。
[检查试样液：图5]
接下来详细说明图5的第1次自动识别处理。此第1次自动识别处理使用低倍率透镜进行。
用微生物检查装置1测定的检查试样液是指例如啤酒等饮料，本来不含有微生物或微生物之外的混入物的物质。
但是，在制造步骤中有可能在饮料中混入上述说明的微生物或微生物之外的混入物。作为饮料中的微生物例如有细菌或酵母菌等。一个实例为作为啤酒中的有害细菌的梳状菌属(pectinatus)的细菌，宽为0.5～2μm、曲线长度为1.5～10μm。另一个实例为酵母菌，宽及曲线长度为3～10μm。据认为这种混入的对象物的尺寸为各种尺寸。因此，微生物检查装置1中使用的过滤器的孔径可以对应于混入对象物的尺寸进行适当改变后使用。
因此，将饮料的一部分适时地作为检查试样液取出，使用上述说明的微生物检查装置1进行分析，由此迅速且定量地自动识别饮料中是否含有微生物或微生物之外的混入物，将微生物和微生物之外的混入物分开显示，由此进行上述饮料的品质管理。
[由检查试样液调制试样：图5的步骤S91、S92]
使用微生物检查装置1，为了对检查试样液中的微生物进行定量分析，首先按如下顺序调制试样。
首先，由啤酒等饮料中采集规定量的检查试样液。然后，利用使用薄膜过滤器的过滤器将检查试样液过滤，由此使检查试样液中所含的全部微生物或微生物之外的混入物捕集在薄膜过滤器上。
使用微生物检查装置1计数捕集在薄膜过滤器上的微生物总数，由此可以定量分析检查试样液中所含的全部微生物及微生物之外的混入物个数。(详细内容如下所述)
然后，由过滤器中取出薄膜过滤器，使荧光标记物质作用于捕集在薄膜过滤器上的微生物或微生物以外的混入物(以下称为试样)，由此用荧光标记物质将试样中的微生物染色。此处，试样中微生物的染色例如使用选自图3中的1种或多种荧光标记物质进行。接下来，将含有被染色的试样的薄膜过滤器固定在微生物检查装置1的显微镜电动平台16上，由此完成由检查试样液来调制试样。
[薄膜过滤器：图5的步骤S91]
以下就上述说明的薄膜过滤器进行说明。该薄膜过滤器具有例如具有多孔的圆盘等的平板形状，过滤器直径为10～50mm左右，过滤器的孔径例如为0.2～50μm，孔数可以根据需要任意设定。因此，使用上述薄膜过滤器能够捕集比过滤器孔径大的微生物。
[使用荧光标记物质的染色法：图5的步骤S92]
下面，详细说明用荧光标记物质将上述说明的捕集在薄膜过滤器上的微生物染色的方法。作为用荧光标记物质将微生物染色的方法有如下说明的FISH法或荧光抗体法等。
首先说明FISH法。FISH法是使用核酸探针，以细胞内的核酸为目标，将微生物荧光染色并检测的方法。此方法不需要从微生物中提取核酸的步骤，而是直接将荧光标记后的核酸探针添加至经过前处理的微生物中，使其与微生物细胞内核酸中的rRNA或染色体DNA杂交。
一般而言，以微生物细胞内核酸中的rRNA作为探针的目标。由于rRNA在活的微生物细胞内存在数千至数十万个复制体，因此，探针的目标只存在与rRNA复制体数相当的量。因此，结合在核酸探针上的荧光标记物质大量存在于目标微生物细胞内，如果对所使用的荧光标记物质照射适当的激发光，则在荧光显微镜下，仅目标微生物细胞在保持形态的状态下发出荧光，能够进行观察。
另外，也可以将染色体DNA的菌种特异性区域的互补序列用于探针，同样可以将菌种特异性的微生物细胞进行荧光染色。
以下说明荧光抗体法。荧光抗体法是使用特异识别由目标微生物细胞的蛋白质、糖类或脂质等构成的抗原的抗体，将目标微生物选择性地染色的方法。此方法通常使用识别细胞表层上存在的抗原的抗体。对抗体进行直接荧光标记，或将结合在1次抗体上的2次抗体进行荧光标记，由此将具有1次抗体识别的表面抗原的微生物特异性荧光染色并检测。
需要说明的是使用FISH法或荧光抗体法将上述说明的捕集在薄膜过滤器上的微生物染色时，使用的荧光标记物质之一例如图3所示。图3是表示荧光标记物质与其激发光和荧光关系的图。
在图3中，如果照射具有对应于各荧光标记物质的特定波长的激发光，则发出具有对应于各荧光标记物质的特定波长的荧光。因此，使用图3，可以进行荧光标记物质的选择及激发光与荧光波长的选择。例如，作为荧光标记物质，选择indo-carbocyanine(Cy3)，照射具有550nm波长的激发光，则可以观测到具有570nm波长的荧光。另外，如果预先用图3所示的多个荧光标记物质将试样染色，用相应的激发光照射试样，则也可以观测到试样发出的具有不同波长的荧光。
[试样的全面分析与结合成分的提取：图5的步骤S95]
接下来，说明在图像解析部3进行的使用自动荧光检查功能的试样的全面分析。
在自动荧光检查功能中，首先确定试样整个区域的适当扫描范围。即，由作为测定对象的荧光体的最大径定义域例如1μm～20μm的范围，将对物透镜的倍率设定为例如10倍，由据此而被单值地确定的CCD照相机有效视野例如横轴方向1100μm、纵轴方向870μm，和作为测定对象的荧光体的最大径最大值20μm，自动地求出每个画面的扫描步幅(step)量(横轴方向：1060μm＝1100-20×2，纵轴方向：850μm＝870-20)。
另外，在图像解析部3，定义了每个画面中拍摄区域之外的测定区域，将其设定为与步幅量相同的值。即，进行设定使得在照相机拍摄范围的每1个视野中横轴方向两侧20μm和纵轴方向上方20μm因扫描摄影而与相邻的照相机拍摄范围视野相重叠。
在图像解析部3，由于以测定区域内存在结合成分终点(结合成分的占有面积中，画面上最右下方画面上的坐标)的结合成分为测定对象，因此，通过采用上述设定方法，能够不会过度不足且确实地测定对象荧光体。
用图4所示画面的测定区域80具体说明上述说明的内容。图4是下述的2值化图像，象素81中，用斜线表示具有规定辉度或规定辉度以上的“活化(active)”象素，将“活化”象素连接成的“块”定义为结合成分82。
另外，将图4的中央部分所示的结合成分82占有的面积称为结合成分的占有面积83，将结合成分的占有面积83中画面上最右下方画面上的象素称为结合成分终点84。
另外，在图像解析部3，通过同时控制显微镜电动平台16及电动聚焦马达17，自动地使焦点在与捕集试样的薄膜过滤器的同一平面上对焦。然后，由被控制的显微镜电动平台16的位置坐标(照相机拍摄范围视野的坐标)与在其画面上测定的结合成分的位置坐标，自动地确定作为对象的荧光体像在薄膜过滤器上的绝对位置坐标。
按此方法，可以以无人自动扫描的方式检测在试样整个区域上获得的荧光体像。然后，以各荧光体像的荧光强度或形状的特征量例如面积、曲线长度和曲线宽度等(详细内容如下所述)参数，预先设定用于微生物判定的阈值，通过比较由多个或1个荧光强度测定结果获得的上述特征量与各阈值，能够以无人的方式自动判定荧光体是否为微生物或微生物之外的混入物等。
需要说明的是因为需要薄膜过滤器上的位置坐标，所以就各荧光体像而言，将对物透镜的倍率从上述设定的10倍改变为例如20倍、40倍等后，依次进行扫描，由此能够更正确地以无人自动的方式测定各荧光体像(此操作称为确认(Validation)操作)。因此，能够更容易地进行微生物或微生物之外的混入物的判定。
需要说明的是由上述说明的方法获得的测定数据及各荧光体的图像在图像解析部3存档并保存，根据需要，此文件可以在图像解析部3的管理下任意提取并进行参照。
[利用荧光体的2值化方法进行的图像处理：图5的步骤S96]
下面，关于上述说明的在试样上整个区域内获得的荧光体像，就图像解析部3在图像解析前进行的图像处理(2值化方法)进行说明。
在图像解析部3处理的图像由多值的数字信息构成。例如，在单色图像中使用256级灰度(8比特灰度)等。
图像解析部3具有将摄入的图像数字化的功能，但是在本实施方案的情况下，由于图像获取部21使用数码相机，因此获得的图像全部被数字化，成为多级灰度图像(256级灰度(8比特灰度))。
然后，图像解析部3由2值化方法进行图像处理。即，2值化是指以任意范围的辉度为“活化”，其他辉度为“失活”，从而将由该多灰度图像构成图像的各象素进行“2值”化，将8比特灰度的图像转换为1比特灰度。
[结合成分的提取：图4]
接下来使用在薄膜过滤器的每个测定区域内获得的上述说明的1比特灰度的2值化图像，说明微生物的识别处理所必要的结合成分的提取方法。
图4是按上述说明的2值化方法对测定作为预定区域的测定区域80的图像进行图像处理的2值化图像之一例。
位于图4的中央部分的象素81中，将具有规定辉度或规定辉度以上的辉度的“活化”象素(斜线部)连接成的“块”定义为结合成分82，结合成分82占有的面积为结合成分的占有面积83，结合成分终点84为结合成分的占有面积中最右下方画面上的坐标。
在图4中，利用作为具有规定辉度或规定辉度以上的“活化”象素的集合体的结合成分82，使用下述的图像解析法，可以求出占有面积83占有的面积、平均辉度、曲线长度、曲线宽度、圆形度系数。
[第2次自动识别处理：1波长识别法：图6]
接下来，作为从在第1次自动识别处理中提取出的荧光体中识别微生物的第2次自动识别处理，详细说明1波长识别法(图6)、2波长识别法(图7)、3波长识别法(图12)这样3种识别法。
此第2次自动识别处理为了精度良好地识别微生物，使用高倍率的透镜进行。
首先，说明利用1波长识别法进行的第2次自动识别处理。
图6示出使用1波长的第2次自动识别处理的流程图。此处理基于自动荧光检查程序在图像解析部3进行。
图6中，在图5的步骤S99之后，进行步骤S195，由第1次自动识别处理，根据提取的荧光体的所在位置图移动平台。
然后，在进行步骤S95和步骤S96的处理后，进行步骤S196。需要说明的是图6的步骤S95和步骤S96与图5中同样符号表示的步骤的处理相同。因此，由于此说明为重复内容，此处将其省略。
步骤S196是表示使用1波长激发光的微生物自动识别处理的特征的步骤，作为微生物的自动识别处理，有基于荧光体像的荧光强度或形状来特定可能为微生物的荧光体的面积法、平均辉度法、曲线长度法等。下面，使用图8～图10进行详细地说明。
图8作为使用1波长激发光的微生物识别处理法之一例，给出了面积法、平均辉度法、曲线长度法、曲线宽度法及圆形度系数法和各方法中的微生物判定基准。
图9给出了图8所示的曲线长度法、曲线宽度法及圆形度系数法中曲线长度、曲线宽度及圆形度系数的计算式。
图10给出了由具体的荧光像利用曲线长度法、曲线宽度法及圆形度系数法计算曲线长度、曲线宽度及圆形度系数之一例。
[面积法：图8]
首先，说明面积法。
如图8所示，面积法是如下方法：求出结合成分的实际面积((μm)2)，该实际面积是由拍摄所得到的结合成分的总象素数(pix)与预先制成的每个单位象素实际面积的校准值((μm)2/pix)的乘积，然后，与预先设定的判定基准(图8)进行比较，识别结合成分是微生物还是微生物之外的混入物。作为判定基准(图8)的实例，例如结合成分的实际面积如果为5～200(μm)2，则将该结合成分识别为微生物。
[平均辉度法：图8]
下面说明平均辉度法。
如图8所示，平均辉度法是由构成结合成分的各象素的辉度(0～255)求出平均辉度的方法，用总象素数(pix)除合计各象素的辉度的总辉度得到的值。作为判定基准(图8)的实例，例如如果结合成分的平均辉度为10～255，则将该结合成分识别为微生物。
[曲线长度法：图8]
下面，说明曲线长度法。
如图8所示，曲线长度(CL：Curve Length)法是求出曲线长度的方法，曲线长度是具有与对象结合成分相同的面积及周长的长方形的最长象素边的长度(pix)与预先制成的作为单位象素长度的校准值(μm/pix)的乘积(μm)。
例如，图10A的对象结合成分的曲线长度为11(pix)，图10B的对象结合成分的曲线长度为5(pix)。
接下来，与预先设定的微生物判定基准(图8)进行比较，识别结合成分是微生物还是微生物之外的混入物。
需要说明的是具有与对象结合成分相同的面积及周长的长方形的最长象素边的长度使用图9所示的定义式进行计算。作为微生物判定基准(图8)的实例，例如，如果曲线长度为0.5～50μm，则将结合成分识别为微生物。需要说明的是曲线长度的值给出弯曲的微生物、纤维等的长度。
[曲线宽度法：图8]
下面，说明曲线宽度法。
如图8所示，曲线宽度(CW：Curve Width)法是求出曲线宽度的方法，所述曲线宽度是具有与对象结合成分相同的面积及周长的长方形的最短边长度(pix)与预先制成的单位象素长度校准值(μm/pix)的乘积(μm)。
例如，图10A的对象结合成分的曲线宽度为2(pix)，图10B的对象结合成分的曲线宽度为2(pix)。
接下来，与预先设定的微生物判定基准(图8)进行比较，识别结合成分是微生物还是微生物之外的混入物。
需要说明的是具有与对象结合成分相同的面积及周长的长方形最短边长度使用图9所示的定义式进行计算。作为微生物判定基准(图8)的实例，例如，如果曲线宽度为0.1～10μm，则将结合成分识别为微生物。需要说明的是曲线长度的值给出了弯曲的微生物、纤维等的宽度。
[圆形度系数法：图8]
下面说明圆形度系数法。
圆形度系数(R：Roundness)法为图9所示的定义式给出的量纲为1的数，在对象结合成分为圆时，最小值为1，在对象结合成分为圆以外的形状时，为大于1的值。
例如，图10A的对象结合成分的圆形度系数为2.3，图10B的对象结合成分的圆形度系数为1.5。
需要说明的是图9所示的定义式中，1.064为调整因数，用于订正因图像的数字化而在全周长上发生的死角误差。作为微生物判定基准(图8)的实例，例如，如果曲线宽度为1～10μm，则将结合成分识别为微生物。
接下来，在图6的步骤S197中，存在继续进行自动识别处理的荧光体时，回到步骤S195，重复进行上述步骤S195～S196的处理；在步骤S197中，不存在继续进行自动识别处理的荧光体时，进行步骤S198。
接下来，在步骤198中，对于步骤S99中提取出的各荧光体，基于步骤S196中的判定，进行微生物与微生物之外的混入物的所在位置图的生成处理，在显示画面上显示检测出的微生物。可以在显示画面中以3种识别显示方式显示微生物或微生物以外的混入物。
接下来，在步骤S199中，通过保存各荧光体经图像解析处理获得的微生物判定结果，完成使用1波长激发光的微生物自动识别处理。
由此，在1波长识别法中可以由荧光体的形状特征识别微生物。
[第2次自动识别处理：2波长识别法：图7]
接下来，详细说明作为从在第1次自动识别处理中提取的荧光体中识别微生物的第2次自动识别处理的第2个方法的使用2波长激发光的2波长识别法。
需要说明的是在2波长识别法中，预先使用图3所示的荧光标记物质将试样染色，以便用特定的激发光照射希望检测的微生物，即目标微生物时发出荧光，
首先说明2波长识别法的概要，使用1种荧光标记物质，将试样中含有的目标微生物染色，用对应于此荧光标记物质的激发光和除其之外的激发光依次照射此试样，与此相对应，依次检测各荧光体发出的荧光像，组合对应于各激发光获得的荧光像，制成每个荧光体的荧光光谱，将获得的荧光光谱与预先设定的判定基准用荧光光谱进行比较。根据此结果，分别识别各荧光体是目标微生物，还是目标微生物之外的混入物，能够识别试样中的目标微生物。
图7及图14中示出使用2波长的微生物自动识别处理的流程图。此处理基于自动荧光检查程序在图像解析部3进行。
在图7中，图5的步骤S99之后进行步骤S293，按照在第1次自动识别处理中提取的荧光体所在位置图移动平台。
接下来，使用具有第1波长的激发光，进行步骤S95、步骤S96、步骤S196的处理，由荧光体的形状等特征，根据图8所示的微生物判定基准，特定可能为目标微生物的荧光体后，进行步骤S294。需要说明的是图7的步骤S95、步骤S96及步骤S196的处理与图6中同样符号表示的步骤的处理相同。因此，由于此详细说明为重复内容，在此省略。
接下来，在步骤S294中，转换荧光滤光片后，进行步骤S295，使用具有第2波长的激发光，重复进行上述说明的步骤S95、步骤S96及步骤S196的处理。
然后，结束步骤S295的处理后，进行之后的步骤S296。在步骤S296中，从步骤S196中被特定的可能为各目标微生物的荧光体中识别目标微生物。步骤S296是表示使用2波长激发光的微生物自动识别处理的特征的步骤，其详细过程如图14所示。即，在步骤S200中，由对应于各激发光在每个区域中获得的荧光体制成荧光光谱或峰的波长；然后，在步骤S201中，将所获荧光光谱或峰的波长与判定用荧光光谱或判定基准相对照，从各区域的荧光体中识别微生物。
然后，在步骤S297中，存在继续进行自动识别处理的荧光体时，进行步骤S298，将荧光滤光片恢复到起始位置后，回到步骤S293，重复进行上述说明的步骤S293～步骤S296的处理；在步骤S297中，不存在继续进行自动识别处理的荧光体时，进行步骤S198，进行步骤S198和步骤S199的处理。
需要说明的是图7的步骤S198和步骤S199的处理与图6中同样符号表示的步骤的处理相同。因此，由于此说明为重复内容，在此省略。
以下参照图11～图13，具体说明上述说明的2波长识别法的第2次自动识别处理。此处理基于自动荧光检查程序在图像解析部3处进行。
在使用2波长激发光的第2次自动识别处理中，首先，在1波长识别法中说明的面积法、平均辉度法、曲线长度法等分别适用2波长激发光，由对应各激发光的荧光体的荧光强度或形状等特征，根据图8所示的微生物判定基准，确定可能为目标微生物的荧光体(步骤S196)；然后，利用对应各激发光获得的可能为目标微生物的荧光体的不同，识别微生物(步骤S296)。
图11是使用2波长激发光的第2次识别处理中获得的各区域的荧光体(2值化图像)实例的说明图。
在使用2波长激发光的第2次识别处理中，对薄膜过滤器上的试样照射不同的2个激发光，即激发光1(例如：Cy3检测用)及激发光2，例如图11所示，拍摄对应于各激发光在每个区域(此处为A、B、C3个区域)内获得的荧光体，得到荧光体(2值化图像)301～306。
然后，如图12所示，将对应于2个激发光，即激发光1及激发光2在区域A、B、C内分别获得的6个荧光体301～306组合，制成荧光光谱350、352、354或峰的波长351、353、355。
例如，在区域A内，将对应于2个激发光而分别获得的荧光体301和304组合，制成具有2个峰的荧光光谱350或峰的波长351。在区域B内，将对应于2个激发光而分别获得的荧光体302和305组合，制成具有1个峰的荧光光谱352或峰的波长353。在区域C内，也同样进行，制成荧光光谱354或峰的波长355。
然后，将制成的荧光光谱350、352、354或峰的波长351、353、355与图13所示实例中表示目标微生物的判定用荧光光谱360、表示异物的判定用荧光光谱361或判定基准(2波长用)362分别比较。判定用荧光光谱或判定基准由预先对应于各激发光而获得的荧光的峰分布，判定此荧光光谱或峰的波长是目标微生物，还是异物。例如，通过比较图11的每个区域内获得的荧光光谱350、352、354与表示目标微生物的判定用荧光光谱360、表示异物的判定用荧光光谱361，可以识别出在图11的3个区域内获得的荧光体中，仅区域B为目标微生物，区域A、C的荧光体为异物。需要说明的是异物的一个实例例如为对应于激发光无荧光选择性的自体荧光体等。另外，上述使用的判定用荧光光谱或判定基准对应于各激发光被预先记忆在图像解析部3。
由此，由荧光体(2值化图像)301～306制成荧光光谱或峰的波长等，通过与判定用荧光光谱或判定基准相比较，可以自动识别荧光体是目标微生物，还是异物。由此，可以简单且以无人的方式识别试样液中所含的目标微生物。
[第2次自动识别处理：3波长或3波长以上识别法：图15]
下面，以使用3波长激发光的3波长识别法为例详细说明作为从在第1次自动识别处理中提取的荧光体中识别微生物的第2次自动识别处理的第3个方法，即使用3波长或3波长以上的激发光的3波长或3波长以上识别法。此处理基于自动荧光检查程序在图像解析部3进行。
需要说明的是在使用3波长的识别法中，用2种荧光标记物质(例如Cy3，DAPI)将试样染色，以便能够识别预先包含在试样中的目标微生物或目标之外的微生物。其具体例为用2种荧光标记物质(Cy3，DAPI)将目标微生物(例如梳状菌)2次染色，仅用1种荧光标记物质(DAPI)将目标之外的微生物染色。
首先，说明3波长识别法的概要。使用2种荧光标记物质，将试样中所含的微生物染色，以便能够识别目标微生物和其他微生物，对此试样依次照射对应于此荧光标记物质的2种激发光和其他激发光，依次检测对应于上述激发光而由各荧光体发出的荧光像，组合对应于各激发光获得的荧光像，制成每个荧光体的荧光光谱，将获得的荧光光谱与预先设定的判定用荧光光谱进行比较。结果为能够分别识别各荧光体是目标微生物、其他微生物，或其他物体，能够识别试样中的目标微生物。
图15及图14中示出使用3波长的微生物自动识别处理的流程图。
在图15中，在图5的步骤S99之后，进行步骤S293，按照在第1次自动识别处理中提取的荧光体的所在位置图移动平台。
然后，使用具有第1波长的激发光，进行步骤S95、步骤S96及步骤S196的处理，由荧光体的荧光强度或形状等特征，按照图8所示的微生物判定基准，特定可能为目标微生物的荧光体后，进行步骤S294。需要说明的是，图15的步骤S95、步骤S96及步骤S196的处理与图6中相同符号表示的步骤的处理相同。因此，由于此说明为重复内容，在此省略。
然后，进行步骤S390，为了用下一个激发光进行照射，必须转换为下一个荧光滤光片时，进行步骤S294，转换荧光滤光片后，进行步骤S295，使用具有第2波长的激发光，重复进行上述说明的步骤S95和步骤S96的处理后，进行步骤S396。另一方面，在步骤S390中，结束全部的激发光照射，不必转换为下一个滤光片时，进行步骤S396。
在步骤S396中，从在步骤S196中分别特定的可能为目标微生物的荧光体中，识别目标微生物。步骤S396是表示使用3波长或3波长以上激发光的微生物自动识别处理的特征的步骤，详细内容如图14所述。即，在步骤S200中，由对应于各激发光而在每个区域内获得的荧光体，制成荧光光谱或峰的波长；然后，在步骤S201中，比较获得的荧光光谱或峰的波长与判定用荧光光谱或判定基准，从各区域的荧光体中识别微生物。
然后，在步骤S297中，存在继续进行自动识别处理的荧光体时，进行步骤S298，将荧光滤光片恢复到起始位置后，回到步骤S293，重复进行上述说明的步骤S293～步骤S396的处理；在步骤S297中，不存在继续进行自动识别处理的荧光体时，进行步骤S198，进行步骤S198和步骤S199的处理。
需要说明的是图12的步骤S198和步骤S199的处理与图6中相同符号表示的步骤的处理相同。因此，由于此说明为重复内容，在此省略。
然后，使用图16～图20，具体说明上述说明的3波长识别法的第2次自动识别处理。
在使用3波长激发光的第2次自动识别处理中，首先，在1波长识别法中说明的面积法、平均辉度法、曲线长度法等分别适用3波长激发光，由对应各激发光的荧光体的荧光强度或形状等特征，确定可能为目标微生物的荧光体(步骤S196)；然后，利用对应各激发光获得的可能为目标微生物的荧光体的不同，识别微生物(步骤S396)。
图16是使用3波长激发光的第1次及第2次识别处理中获得的各区域的荧光体(2值化图像)实例的说明图。
在使用3波长激发光的第1次识别处理中，使用低倍率透镜，例如对薄膜过滤器上的试样照射激发光2(DAPI检测用)，拍摄对应于激发光2在每个区域上获得的荧光体，获得荧光体(2值化图像)413～416。
然后，在使用3波长激发光的第2次识别处理中，仅对在第1次识别处理中检测出荧光体的区域依次照射不同的3种激发光，即激发光1～激发光3，例如图16所示，拍摄对应于各激发光在各区域(此处为A～D4个区域)内获得的荧光体，得到荧光体(2值化图像)401～412。
然后，如图17所示，将对应于3个激发光，即激发光1～激发光3在区域A～D内分别获得的3个荧光体401～412组合，制成荧光光谱451～454。需要说明的是虽然在图17中被省略，但是代替荧光光谱451～454，也可以制成如图12所示的峰的波长。
例如，在区域A内，将对应于3个激发光而分别获得的荧光体401、405及409组合，制成具有3个峰的荧光光谱451。在区域B内，将对应于3个激发光而分别获得的荧光体402、406及410组合，制成具有2个峰的荧光光谱452。在区域C及D内也同样进行，制成具有1个峰的荧光光谱453、454。
然后，将制成的荧光光谱451～454与图18所示实例的判定用荧光光谱460～463分别比较。对应于1次识别用激发光和2次识别用激发光的组合，分别准备判定用荧光光谱，从所获荧光的峰分布，判定此荧光光谱是目标微生物、目标之外的微生物，还是异物。
需要说明的是图18中示例的判定用荧光光谱461～463是就照射作为460表示的1次识别用激发光的激发光2时从试样中检测出的荧光体，使用激发光1～3进行2次识别时使用的3波长用判定用荧光光谱的实例，461表示异物，462表示目标微生物，463表示目标之外的微生物。
通过将图16的每个区域内获得的荧光光谱451～454与判定用荧光光谱461～463相比较，可以识别出在图16的4个区域内获得的荧光体中，仅区域B为目标微生物，区域C、D的荧光体为目标之外的微生物，区域A为异物。需要说明的是异物的一个实例例如为对应于激发光而无荧光选择性的自体荧光体。另外，上述使用的判定用荧光光谱对应于各激发光被预先记忆在图像解析部3。
另外，代替制成上述说明的荧光光谱，也可以制成图12所示的峰的波长。此时，取代判定用荧光光谱，只要使用预先记忆在图像解析部3的图13所示的3波长用判定基准即可。
由此，由荧光体(2值化图像)401～412制成荧光光谱或峰的波长等，通过与判定用荧光光谱或判定基准相比较，可以自动识别荧光体是目标微生物、目标之外的微生物，还是异物。由此，可以简单且以无人的方式识别试样液中所含的目标微生物。
[3波长识别法的其他例：图19]
图19是说明使用3波长激发光的第2次识别处理的其他例的图。用2种荧光标记物质(例如Cy3，DAPI)将试样染色，以便能够预先识别试样中所含的微生物是目标微生物，还是目标之外的微生物。
图19的实例与图16示例的不同点为：图16中，在第2次识别处理前，先以低倍率检测荧光体的第1次识别处理中使用的激发光为激发光2(DAPI检测用)；与此不同，在图19中，第1次识别处理中使用的激发光为激发光1(Cy3检测用)。
图19的501～505表示第1次识别处理中检测出的荧光体。即，对薄膜过滤器上的试样照射激发光1(Cy3检测用)，对应于激发光1，由各区域(此处为A～E5个区域)检测的荧光体的2值化图像。需要说明的是区域E表示未获得荧光体。
然后，如图19所示，将对应于3个激发光即激发光1～激发光3，在区域A～D内分别获得的3个荧光体506～517组合，虽然图中未示出，但是也制成与图17同样的荧光光谱或图12所示的峰的波长。
然后，将制成的荧光光谱与图20中示例的3波长用判定用荧光光谱471～474分别进行比较。需要说明的是图20的判定用荧光光谱为对应于470表示的1次识别用激发光与2次识别用激发光的组合分别进行准备的，由所获荧光的峰的分布判断此荧光光谱为目标微生物、目标之外的微生物，还是异物。
需要说明的是图20中示例的判定用荧光光谱471～474，是对照射作为470表示的1次识别用激发光的激发光1时从试样中检测出的荧光体，使用激发光1～3进行2次识别时使用的3波长用判定用荧光光谱的实例。471表示异物，472表示目标微生物，473、474表示异物。
通过比较图19的每个区域内获得的图中未示出的荧光光谱和判定用荧光光谱471～474，能够识别出图19的4个区域内获得的荧光体中，仅区域B为目标微生物，区域A、C、D的荧光体为异物。需要说明的是异物的一例例如为对应于激发光而无荧光选择性的自体荧光体等。另外，上述使用的判定用荧光光谱对应于各激发光被预先记忆在图像解析部3。
由此，由荧光体(2值化图像)506～517制成荧光光谱或峰的波长等，通过与判定用荧光光谱或判定基准比较，能够自动识别荧光体是目标微生物，还是异物。由此，能够简单地以无人方式识别试样液中所含的目标微生物等。
需要说明的是在图19中，由于第1次识别处理中使用的激发光是仅识别目标微生物的激发光1(Cy3检测用)，因此目标之外的微生物由第1次自动识别而被排除。因此，可以由第1次自动识别从试样中所含的微生物中仅识别目标微生物。另外，图19所示的识别法可以从在第1次自动识别中被识别的荧光体(区域A～D)中精度良好地识别目标微生物(区域B)及异物(区域A、C、D)。
如上述说明，由于本实施方案的微生物检查装置能够检测微量的荧光，因此，能够检测出试样中的1个目标微生物。因此，不必如现有技术所述为了制作含有大量微生物的试样而经过长期培养，使之形成菌群。
另外，由检测出的荧光体的图像，算出形状的特征量例如结合成分的平均荧光强度、面积、曲线长度和曲线宽度的比等各种参数，基于算出的各种参数，能够以无人自动的方式判断荧光体的图像是否为微生物。因此，由于不必如现有技术所述以肉眼识别微生物，因此能够高精度且迅速地自动检测微生物。
因此，本发明的测定装置能够应用于饮料、食品、医药、化妆品等的过程管理、产品品质管理等方面的微生物检查，另外，也可以用于排水、工业用水、环境取样、上下水道中的微生物检查，生命工学等各种研究领域中的微生物检查，而且可以用于具有自体荧光的微小碎片的检测及数量的检查等。
如上述说明，根据本发明，能够提供一种例如能够自动且迅速地获取成为检查对象的试样中所含微生物的相关信息的微生物检查装置及检查方法。

Claims (37)

1、一种检查试样中所含微生物的检查方法，其特征在于包括下述步骤：
用具有不同波长的多个激发光照射所述试样的照射步骤；
基于对应于所述多个激发光的照射而由所述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别所述试样中所含微生物的识别步骤。
2、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于所述检查方法还具有基于由所述各物体获得的荧光体的形状，特定可能为微生物的荧光体的检查步骤；在所述识别步骤中，使用在所述检查步骤中被特定的荧光体，获得所述荧光的峰分布。
3、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，所述检查方法还具有基于由所述各物体获得的荧光体的荧光强度，特定可能为微生物的荧光体的检查步骤；在所述识别步骤中，使用在所述检查步骤中被特定的荧光体，获得所述荧光的峰分布。
4、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，在所述照射步骤中，依次对所述试样照射所述具有不同波长的多个激发光。
5、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，在所述照射步骤中，同时对所述试样照射所述具有不同波长的多个激发光。
6、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，
由所述试样中所含的各物体获得的荧光具有1个或1个以上的峰，
在所述识别步骤中，基于由所述试样中所含各物体获得的荧光中各峰的波长或频率，识别所述试样中所含的微生物。
7、如权利要求6所述的检查方法，其特征在于，在所述识别步骤中，对照由所述各物体获得的荧光的各峰的波长或频率与对应于所述多个激发光预先定义的判断基准，判定所述各物体是否为微生物。
8、如权利要求7所述的检查方法，其特征在于，所述微生物为特定的微生物。
9、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，
由所述试样中所含的各物体获得的荧光具有1个或1个以上的峰，
在所述识别步骤中，基于由所述试样中所含各物体获得的荧光光谱，识别所述试样中所含的微生物。
10、如权利要求9所述的检查方法，其特征在于，在所述识别步骤中，对照由所述各物体获得的荧光光谱与对应于所述多个激发光预先定义的判定用荧光光谱，判定所述各物体是否为微生物。
11、如权利要求10所述的检查方法，其特征在于，所述微生物为特定的微生物。
12、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，
所述检查方法包括1次检查步骤和2次检查步骤；
在所述1次检查步骤中，边用所述激发光照射所述试样，边以第1倍率观察所述试样的整个区域，由此特定所述试样中所含的荧光物体；
在所述2次检查步骤中，实施所述照射步骤及所述识别步骤，此时，边用高于所述第1倍率的第2倍率观察所述1次检查步骤中特定的各荧光物体，边获得所述各荧光物体的荧光的峰分布。
13、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，
所述检查方法包括1次检查步骤和2次检查步骤；
在所述1次检查步骤中，边用所述激发光照射所述试样，边以第1倍率观察所述试样的整个区域，在所述试样中所含的荧光物体中，将目标微生物从目标之外的微生物中分离并提取出来；
在所述2次检查步骤中，实施所述照射步骤及所述识别步骤，此时，边用高于所述第1倍率的第2倍率观察所述1次检查步骤中提取出的各目标微生物，边获得所述各目标微生物荧光的峰分布。
14、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，所述检查方法还包括将所述试样中所含的微生物捕集在过滤器上，使用荧光标记物质将被捕集在此过滤器上的含有微生物的物体染色的试样调制步骤。
15、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，所述检查方法还包括用过滤器捕集所述试样中所含的微生物，使用荧光标记物质将被捕集在此过滤器上的微生物染色的试样调制步骤，以便用包括2个或2个以上波长的激发光照射时，捕集在过滤器上的微生物具有1个或1个以上的荧光峰。
16、如权利要求15所述的检查方法，其特征在于，在所述含有2个或2个以上波长的激发光中，使用从激发光的最大强度具有340nm～750nm范围内的波长的激发光中选择的2种或2种以上的激发光。
17、如权利要求15所述的检查方法，其特征在于，在所述荧光标记物质中，使用德克萨斯红(texas red)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、Indo-carbocyanine色素、Alexa色素、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、碘化丙啶(providium iodide)、及异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)中的任意1种或1种以上的荧光标记物质。
18、如权利要求1所述的检查方法，其特征在于，所述检查方法还包括将所述试样中所含的微生物捕集在过滤器上，用不同种类的荧光标记物质将捕集在此过滤器上的微生物染色的试样调制步骤，以便在用包括3个或3个以上波长的激发光照射此过滤器时，被捕集在此过滤器上的微生物具有2个或2个以上的荧光峰。
19、如权利要求18所述的检查方法，其特征在于，在所述包括3个或3个以上波长的激发光中，使用从激发光的最大强度具有340nm～750nm范围内的波长的激发光中选择的3个或3个以上的激发光。
20、如权利要求18所述的检查方法，其特征在于，在所述荧光标记物质中，使用德克萨斯红(texas red)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)、Indo-carbocyanine色素、Alexa色素、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、碘化丙啶(providium iodide)、及异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)中的任意2种或2种以上的荧光标记物质。
21、一种检查试样中所含微生物的检查装置，其特征在于，所述检查装置具有如下装置：
对所述试样照射具有不同波长的多个激发光的照射装置；
拍摄所述试样的拍摄装置；
分析所述拍摄装置的拍摄结果的分析装置；
所述分析装置构成为根据所述拍摄结果，基于对应于所述多个激发光而由所述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别所述试样中所含的微生物。
22、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，所述分析装置的构成为能够进行以下操作：首先基于由所述各物体获得的荧光体的形状特定可能是微生物的荧光体，然后使用被特定的荧光体，获得所述荧光的峰分布。
23、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，所述分析装置的构成为能够进行以下操作：首先基于由所述各物体获得的荧光体的荧光强度特定可能是微生物的荧光体，然后使用被特定的荧光体，获得所述荧光的峰分布。
24、一种检查试样中所含微生物的检查装置，其特征在于所述检查装置具有如下装置：
边用具有不同波长的多个激发光照射所述试样，边输入此试样的拍摄结果的输入装置；
根据由所述输入装置输入的拍摄结果，基于对应于所述多个激发光而由所述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别所述试样中含有的微生物的分析装置。
25、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，所述照射装置依次用所述具有不同波长的多个激发光照射所述试样。
26、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，所述照射装置同时用所述具有不同波长的多个激发光照射所述试样。
27、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，
由所述试样中所含的各物体获得的荧光具有1个或1个以上的峰，
所述分析装置基于由所述试样中所含各物体获得的荧光的各峰的波长或频率，识别所述试样中所含的微生物。
28、如权利要求27所述的检查装置，其特征在于，所述分析装置对照由所述各物体获得的荧光的各峰的波长或频率与对应于所述激发光预先定义的判定基准，判定所述各物体是否为微生物。
29、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，
由所述试样中所含的各物体获得的荧光具有1个或1个以上的峰，
所述分析装置基于由所述试样中所含各物体获得的荧光光谱，识别所述试样中含有的微生物。
30、如权利要求29所述的检查装置，其特征在于，所述分析装置对照由所述各物体获得的荧光光谱与对应于所述激发光预先定义的判定用荧光光谱，判定所述各物体是否为微生物。
31、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，
所述检查装置还具有控制所述照射装置、所述拍摄装置、所述分析装置的控制装置，所述控制装置如下进行控制：边使用所述照射装置以所述激发光照射所述试样，边使用所述拍摄装置以第1倍率拍摄所述试样的整个区域，使用所述分析装置分析所述拍摄装置的拍摄结果，特定所述试样中所含的荧光物体；
然后，边使用所述照射装置以所述激发光照射所述被特定的各荧光物体，边使用所述拍摄装置以高于所述第1倍率的第2倍率拍摄所述特定的各荧光物体，使用分析装置分析所述拍摄装置的拍摄结果，由此获得所述各荧光物质的荧光的峰分布。
32、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，
所述检查装置还具有控制所述照射装置、所述拍摄装置、所述分析装置的控制装置，
所述控制装置如下进行控制：边使用所述照射装置以所述激发光照射所述试样，边使用所述拍摄装置以第1倍率拍摄所述试样的整个区域，使用所述分析装置分析所述拍摄装置的拍摄结果，在所述试样中所含的荧光物体中，将目标微生物从目标之外的微生物中分离并提取出来；
然后，使用所述拍摄装置以高于所述第1倍率的第2倍率拍摄所述提取出的各目标微生物，使用所述分析装置分析所述拍摄装置的拍摄结果，由此获得所述目标微生物的荧光的峰分布。
33、如权利要求21所述的检查装置，其特征在于，在所述多个激发光中，使用从激发光的最大强度具有340nm～750nm范围的波长的激发光中选择的2种或2种以上的激发光。
34、如权利要求32所述的检查装置，其特征在于，
所述拍摄装置还具有电动平台，
所述控制装置如下进行控制：边控制所述电动平台扫描所述试样的整个区域，边控制所述拍摄装置以对所述试样的整个区域进行拍摄。
35、如权利要求34所述的检查装置，其特征在于，所述拍摄装置具有预先设定的方程式，以便将对物透镜、所述对物透镜与所述过滤器表面间的距离保持为一定，所述控制装置在进行所述扫描时，基于所述方程式，一边将所述对物透镜与所述过滤器表面间距离保持为一定以防止焦点发生偏移，一边控制所述拍摄装置拍摄所述试样的整个区域。
36、一种控制检查试样中所含微生物的检查装置的控制程序，其特征在于所述程序包含下述识别步骤：在用由所述检查装置发出的具有不同波长的多个激发光照射所述试样时，基于对应于所述多个激发光的照射而由所述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别所述试样中所含的微生物。
37、一种存储控制检查试样中所含微生物的检查装置的控制程序的计算机可读记忆介质，其特征在于，所述控制程序包含下述识别步骤：在用由所述检查装置发出的具有不同波长的多个激发光照射所述试样时，基于对应于所述多个激发光的照射而由所述试样中所含的各物体获得的荧光的峰分布，识别所述试样中含有的微生物。
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