CN1833257A - 用于分析生物组织的方法和设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于处理诸如尤其是人类或动物源性的生物样品之类的不规则形状对象的图像的方法和设备。借助于本发明的方法，还进行了生物体部分或组织的或者其中包含的任何源性的材料束点或集合体的度量量化。特别地，将本发明的方法应用于“共焦显微”技术。具体地，本发明涉及处理数字图像的方法，所述数字图像包括一个或多个要被量化的对象，所述方法包括以下主要阶段：数字图像的标准化；量化图像到一位，进一步包括以下阶段中的至少一个：从被量化到一位的所述图像计算要被量化的所述一个或多个对象的周长、面积和/或分形维数；从被量化到一位的所述图像重构要被量化的所述一个或多个对象的3D图像，和/或从所述标准化的图像计算总的图像的分形维数。

Description

用于分析生物组织的方法和设备

技术领域

本发明涉及用于处理诸如尤其是人类或动物源性的生物组织和制品制品之类的不规则形状对象的图像的方法和设备。借助于本发明的方法，还进行了生物体部分或组织的或者其中包含的任何源性的材料束点或集合体的度量量化。特别地，将本发明的方法应用于“共焦显微”技术。

背景技术

激光扫描共焦显微技术(LSCM)是用于获得生物样品的高分辨率图像和3D图像的已知技术。LSCM基于激光束，所述激光束借助于物镜被聚焦在荧光样品的点或小斑点上。通过x-y偏转机构使激光束扫描样品。经由混色镜(dicroic mirror)将反射的和发射的荧光都聚焦到光电倍增器上。混色镜让荧光朝着光电倍增器的方向穿过共焦孔径(针孔)。来自不在观察样品的焦平面之内的点的散焦光为针孔所阻止，而焦平面信息则被记录为数字图像。荧光强度对应于象素强度(通常为8位灰度)。通过上下移动显微镜载物台，实现z方向上的扫描，这允许观察制品的3D重构。然后数字图像由适当的图像数字滤波器处理(对比度和亮度调节、噪声去除、颜色添加等等)并最终被分析。

LSCM技术的进一步改进带来了激光扫描检眼术(SLO)，其通过扫描激光共焦显微镜经过直接观察患者的眼睛来提供视网膜成像，其中眼睛的光学系统具有和物镜相同的功能。

利用常规可见光而不是激光的共焦扫描显微镜同样是已知的，并且通常用于角膜成像。

共焦检眼术是用于研究活体人眼的有力工具，并且能够给予医生以重要的诊断信息。

然而在已知的设备中存在几种缺点。第一个问题是，像场之内将要被观察的对象(单个细胞或集合体等等)通常在遍及图像的整个区域并不呈现相同的亮度。这主要是由于它们关于图像中央占据的位置，所述图像中央具有较高的亮度，或者是检查中的眼睛的截面，其可能没有完全截取对象。

进一步的缺点涉及计算机处理获取的图像的方式。有时可能必须定量评估观察对象的物理和几何特征，以便取得较好的诊断信息。典型的例子是关于角膜细胞和角膜基质的其他成分的药理学试验的情况。在这样的情况下，已知的装置不允许进行请求的几何参数的正确量化，尤其是对于诸如在上面指出的那样的高度不规则形状的对象，结果是，分析的结果可能是不正确的，或者甚至是误导的。因此存在改进方法和设备的需要，所述改进的方法和设备允许正确量化任何制品的形态度量参数，其中，对于所述制品，这样的量化是需要的。

发明内容

本发明针对上述及其他问题，并且用如附加的权利要求中所述的那样的方法和设备解决它们。

附图说明

根据本发明的用于分析活体眼睛图像的方法和共焦显微设备的进一步的特征和优点，从参考附图的借助于非限制性例子给出的优选实施例的下述说明中，将会变得明显，其中：

图1是根据本发明的设备的示意图；

图2是图1的设备的光学组件的示意图；

图3是显示本发明的方法的流程图。

具体实施方式

本发明的方法允许分析并度量量化对象的图像，尤其是具有不规则轮廓的对象的图像，其欧几里得尺寸并不代表对象的实际尺寸。尽管下面在此显示的特定例子涉及通过LSO技术的直接活体眼睛的观察，但是当分析生物样品时，这种对象常常重复出现。

此处的术语“生物样品”是指取自能够借助于激光扫描共焦显微设备或激光扫描检眼设备进行分析的人、动物或植物体(诸如组织或细胞样品之类)的任何种类的生物样品。

在下文中将要说明的例子涉及包含共焦扫描显微镜2的用于获取并处理图像的系统1。显微镜2优选地为允许从50x直到1000x的放大率的类型。

显微镜2配备有物镜8、至少一个目镜4和至少一个用于摄影机附件的图片影像端口5。电子图像获取装置6，具体地即图片/影像摄影机，有效连接到后者。优选地，这样的电子图像获取装置6为数字摄影机，更加优选地具有至少1.3兆象素的分辨率。

共焦扫描显微镜2装备有能够是卤素灯或激光束源的光源3。在光源3和图片影像端口5之间，沿着光路，设置可移式缝隙系统9。第一缝隙9’安置在光源3和物镜8之间，以便将缝隙状光束投影到患者的角膜上。在光源和第一缝隙9’之间适当地插入第一会聚透镜10a，同时镜系统11a引导缝隙状光束穿过物镜8的第一半。

患者角膜反射的光穿过物镜8的第二半，然后通过第二缝隙9”到达图片影像端口5。再次适当地设置镜系统11b，以便将物镜8收集的反射光引导到第二缝隙9”，并且第二会聚透镜10b将收集的光会聚到所述图片影像端口5。

缝隙9’、9”在x-y平面上是可滑动的，以便实现角膜表面或截面的扫描。物镜8能够沿着z轴移动，以便沿着角膜的深度进行扫描。这允许获取患者角膜区域的3D图像。

电子图像获取装置6有效地和处理系统7连接。处理系统7可以借助于个人计算机(PC)实现，所述个人计算机包含总线，其使例如中央处理单元(CPU)的处理装置和存储装置相互连接，所述存储装置包括例如RAM工作存储器、只读存储器(ROM)——其包括用于启动计算机的基本程序、磁性硬盘、可选地用于读/写光盘(CD-RW)的驱动器(DRV)、可选地用于读/写软盘的驱动器。此外，处理系统7可选地包含：调制解调器或其他网络装置，用于控制和远程信息处理网络的通信；键盘控制器；鼠标控制器；以及视频控制器。键盘、鼠标和监视器12连接到各自的控制器。电子图像获取装置6借助于接口端口(ITF)连接到总线。缝隙系统9和物镜8同样借助于控制接口端口(CITF)连接到总线，由此支配缝隙系统和物镜沿着笛卡儿坐标轴的移动。同样可以提供操纵杆13，以便人工控制物镜8的定位。

在硬盘上存储程序(PRG)和各自的数据库，所述程序在执行阶段期间被装载到工作存储器中。典型地，程序(PRG)分布在用于在硬盘上安装的一个或多个光盘CD-ROM上。

如果处理系统7具有不同的结构，则类似的考虑适用，例如，如果它由连接各种终端的中央单元组成，或者由远程信息处理计算机网络(诸如因特网、内部网、VPN之类)组成，如果它具有其他单元(诸如打印机之类)，等等。可选择地，程序在软盘上提供，预先装载到硬盘上，或者存储在计算机能够读取的任何其他基片上，借助于远程信息处理网络发送到用户的计算机，通过无线电广播，或者，更加一般地，以能够直接装载到用户计算机的工作存储器中的任何形式提供。

现在来描述分析过程，在显微镜2的前面安置患者，以便患者的眼睛对准物镜8。在物镜上涂抹一滴适当的眼药凝胶，然后使物镜接近患者的角膜，直到这样的点，在所述点处，凝胶打湿眼睛，但是镜片不接触眼睛。在这个点处，能够启动扫描，直到整个获取过程结束为止。

一旦图像获取已完成，处理系统7就能够执行根据本发明的优选实施例的数据加工程序，如后面将描述的那样。

可以指出，通过执行程序PRG，计算机系统7能够执行本发明的方法的一些或全部步骤。

本发明的方法提供了能够具有关键临床意义的几个参数的计算。

总之，本发明的方法是处理数字图像的方法，所述数字图像包含一个或多个要被量化的对象，所述方法包含以下主要阶段：

——数字图像的标准化；

——量化图像到一位，进一步包含以下阶段中的至少一个：

——从被量化到一位的所述图像计算要被量化的所述一个或多个对象的周长、面积和/或分形维数；

——从被量化到一位的所述图像重构要被量化的所述一个或多个对象的3D图像，和/或

——从所述标准化的图像计算总的图像的分形维数。

现在来更加详细地说明作为本发明的方法的部分的阶段。

本发明的方法的第一个阶段是 图像标准化阶段。图像标准化是常常应用于数字图像的已知过程。然而，如上所述，当观察的眼睛的截面包含要被分析的几个对象(细胞等等)时，这些对象并不总是遍及图像呈现同样的亮度，图像的中央具有比轮廓更高的亮度。已发现，由于不同图像区域中亮度一致性的所述缺乏，已知的利用抛物线函数的标准化过程并不适合本发明的范围。因此本申请的发明人提供了叫做 改进的图像标准化(NORM阶段)的新程序。

在启动图像标准化程序之前，可能有必要向图像施加数字线性滤波器，以便去除背景噪声。这些滤波器为图像处理中传统使用的类型，并且能够用于去除孤立点。在更坏的情况下，能够使用高斯滤波器。

一旦必要时图像已从噪声中被清洗，就能够启动改进的图像标准化。

这个阶段是个反复的过程，其包含以下步骤：

1a)将图像分成象限(典型地为4个象限)；

2a)计算属于每个象限的象素强度的平均值；

3a)计算象限的强度的平均值，作为步骤2a)的计算的平均的平均；

4a)通过向象限里面的每个象素执行加上或减去相同的强度值中的一种，对于每个象限设置根据步骤3a)计算的强度的平均值，以便在相同象限里面的象素之间维持初始Δ_intensity；

5a)对于每个象限确定象素强度的最大和最小值，并且对于每个象素计算延伸的强度值(EI)，其源自可能的数字值的范围里面的数字值的扩展。可能的数字值的范围是0-256。通过整个0-256范围中的强度值的延伸，获得最大扩展。然而，中间的延伸是可能的。优选地，借助于以下算法计算所述EI值：

EI_pixel＝(I_pixel-I_min)×N/(I_max-I_min)

其中I_pixel是给定象限的每个象素的强度，I_min是所述象限里面的象素的强度的最小值，I_max是所述象限里面的象素的强度的最大值，而N是大于1直到255的整数，优选地为255；

6a)对于每个象素设置根据步骤5a)计算的EI_pixel；

7a)重复步骤1a)到6a)，直到预置的象限边长。

预置的象限边长取决于要被检测的对象的尺寸，优选地，近似为对象的较小边的一半长度。

步骤5a)还被称作象素强度向0-255尺度的延伸，并且对于改善图像里面的对比度是有帮助的。在一些实例中，能够跳过步骤5a)和6a)。

根据本发明的优选实施例，根据以下过程执行标准化阶段：

1b)将图像分成象限(典型地为4个象限)；

2b)对于每个象限确定象素强度的最大和最小值，并且对于每个象素计算延伸的强度值(EI)，其源自可能的数字值的范围里面的数字值的扩展。如前所述，借助于以下算法能够计算EI值：

EI_pixel＝(I_pixel-I_min)×N/(I_max-I_min)

其中I_pixel是给定象限的每个象素的强度，I_min是所述象限里面的象素的强度的最小值，I_max是所述象限里面的象素的强度的最大值，而N是大于1直到255的整数，优选地为255；

3b)对于每个象限的每个象素，将EI_pixel值存储在数据结构中；

4b)重复步骤1b)到3b)，直到预置的象限边长，以便对于每个象素在数据结构中获得一组强度值；

5b)对于每个象素计算数据结构中存储的组的强度值的平均，并且将计算的平均值设置到各个象素。

再次，预置的象限边长取决于要被检测的对象的尺寸，优选地，近似为对象的较小边的一半长度。

步骤1b)到5b)中描述的程序允许处理系统7更快地执行整个计算。

本发明的方法的第二阶段是 图像加工阶段(IMA-EL阶段)。通过将图像量化到“1位”以便选择在其上执行进一步计算的图像的区域，来执行这个阶段。根据以下步骤完成IMA-EL阶段：

1c)对于每个象素考虑参数；

2c)将所述象素的参数和用于所述参数的预置阈值或阈值范围进行比较；

3c)在所述比较的基础上选择一簇活动象素和一簇不活动象素。

所述象素的参数优选地为亮度强度(黑白图片)或数字颜色值。用于所述参数的所述预置阈值或范围将主要取决于应当检测的对象的种类。这样的阈值或范围的选择，在任何情况下都能由熟练人员进行，对于特殊的情况，不需要任何创造性技巧的训练。例如，如果图像必须获取的对象是角膜基质(B&W图像)，则强度值的范围是128-255。

一旦数字图像已被量化到1位，本发明的方法就提供图像的度量处理阶段，其按照下面描述的不同阶段的顺序进行。

这样本发明方法的下个阶段是 对象度量量化阶段(QUANT阶段)。

这个阶段已被提出用于改进通常的欧几里得几何不能度量的不规则形状对象的形态度量参数的度量量化。给定器官、尤其是眼睛的正常的或诸如病理的之类的异常的成分的微观观察，因为在任何放大率(观察的比例)下都出现的新的不规则而惹人注目。随着样品图像的延伸形式变化，新的不规则的细节被给出其测量和尺寸，它们在每种放大率下都是独立的，并且不能被安排在单个线性系统中。因为这种特性，所述特性是由于要被观察的对象的外表面的粗糙，所以可见的细节以及不能在视觉上识别的那些，使得具有不规则表面的所有对象借助于传统的计算机辅助形态测量学很难测量。

传统的形态测量学通过使自然对象的不规则轮廓和粗糙表面逼近直线轮廓和平表面来处理测量它们的问题。

由于尽管不规则对象的形状作为放大率的函数而变化的事实，但是它们在所有的空间尺度下都保持它们的不规则特征，所以BenoitMandelbrot将不规则对象规定为“分形”。尽管它们能被分成的片断(piece)(而不是碎片(fraction))并不相等，但是它们保持了它们不规则的相似性。这种不规则对象能被分成的部分的性质叫做“自相似性”。由于这样的对象的形状取决于观察它们的图像的放大率，所以对象尺寸的任何量化度量都是放大率比例的函数。因此分形维数指示了不规则物体的分形片断的“自相似性”，并且在每种尺度下，都规定了用于测量观察的不规则对象的物理和几何参数的参考手段的特性。

QUANT阶段的第一个步骤是计算检查中的对象的面积。测量的单位可以是μm²或象素。

通过计数属于根据先前的IMA-EL阶段选择的活动象素簇的象素的数目，从而计算检查中的对象的面积A。

QUANT阶段的第二个步骤是计算研究中的对象的周长P。通过以下执行这个步骤：i)选择对象轮廓的象素；以及ii)向这样选择的象素施加根据S.Prashker方法(Steve Prashker，An Improved Algorithmfor Calculating the Perimeter and Area of Raster Polygons，GeoComputation，1999，其在此并入作为参考)的周长计算的算法。根据Prashker的方法，每个活动象素的周围都被纳入考虑，亦即检查中的象素周围的8个象素。对于每个活动象素都给定“周长值”，其总数就是对象的总周长P。例如，如果考虑内部象素(亦即，完全由活动象素包围、从而不属于对象的周长的象素)，则对于这样的象素给定0的“周长值”。如果周长的象素通过沿着对角线的角和两个其他象素连接，则“周长值”为

象素。如果考虑的活动象素通过角连接到一个象素并且通过边连接到另一个象素，则“周长值”将为象素。如果活动象素通过它的边连接到两个相邻的象素，那么“周长值”将为1象素，等等。

考虑检查中的对象的周长的相当的不规则性，进行它的分形维数D_p的估计。类似地，选择的结构的面积的分形维数的估计由符号D_A指示。使用已知的“盒子计数”(box-counting)算法，能够自动确定这两个分形维数。

根据“盒子计数”方法，分形维数D由以下数学公式给出：

$\underset{\mathrm{\ϵ}\→0}{\lim }[\log N\left(\mathrm{\ϵ}\right)/\log (1/\mathrm{\ϵ})]$

其中ε是对象的图像已被分成的网格的盒子的边长，而N(ε)则是分别完全覆盖测量的对象的轮廓(D_p)或面积(D_A)所需的盒子的数目。长度ε用象素或μm表达，并且在当前的计算方法中，ε倾向于1象素。

本发明的方法的下个阶段是 尺寸计算阶段(DIM-CLC阶段)。

为了避免这样的计算中的困难，将分形维数D_p和D_A逼近为通过将参数logN(ε)比log(1/ε)放在笛卡儿坐标轴系统中获得的直线的斜率。

实际上，用于确定D_p的方法包含由处理系统7的CPU执行的以下步骤：

a)将对象的图像分成具有边长ε的多个网格的盒子，其中，ε从基本上对应于内接所述对象的盒子的边的第一值和作为所述第一值的分数的预定值中变化；

b)对于步骤a)的每个ε值，计算N(ε)的对数函数值，其中N(ε)是完全覆盖对象的周长(P)所需的盒子的数目，并且计算1/ε的对数函数值，从而获得对于所述N(ε)的对数函数的第一组值和对于所述1/ε的对数函数的第二组值；

c)将分形维数D_p计算为内插步骤b)的所述第一组值比所述第二组值的直线的斜率。

同样的方法适用于计算分形维数D_A，仅有的不同之处在于，在这种情况下，N(ε)是完全覆盖要被量化的对象的面积的边ε的盒子的数目。

单个对象的分形维数D_p和D_A是对象自己的不规则性、亦即对象是否或多或少不规则地成形的数字指标。这能够给临床医生关于患者的病理状况的有用指示。

由于基质的视觉图像证明了给出患者的病理程度的指示的小对象(细胞)的多样性，所以对于基质的度量分析而言，识别通过检眼镜观察的所有对象是很重要的。从而本发明的方法的进一步的阶段是 对 象分类阶段(SORT阶段)，其包括以下步骤：

1d)沿着x-y坐标轴系统上的预定方向扫描量化到“1位”的图像；

2d)沿着所述扫描方向选择第一活动象素，所述活动象素由第一组x、y值标识，所述第一活动象素属于第一对象的图像；

3d)在方向线上的紧接于所述选择的象素的位置中，在所述第一选择的活动象素上执行搜索程序；

4d)重复步骤3d)，直到发现不活动象素为止；

5d)赋予根据这样的步骤3d)和4d)选择的每个活动象素一组x、y值，将它们保存在处理系统7的存储装置中(所有的这样的象素都将具有相同的y值和按照渐进顺序的x值)，并且将所述象素在对象的图像中从活动的切换到不活动的；

6d)对于根据步骤3d)、4d)和5d)选择的每个象素，在正交于所述扫描方向的方向上估计下两个象素，并选择活动象素；

7d)对于根据步骤6d)选择的所述活动象素中的每一个，执行步骤3d)到5d)的程序；

8d)重复步骤6d)和7d)，直到属于相同对象的所有连接的象素都已被保存为止；

9d)重复步骤1d)和2d)，直到发现进一步的对象的图像的第一活动象素为止；

10d)重复步骤3d)到9d)，直到整个图像已被扫描为止。

步骤1d)中的所述预定方向优选地从左到右从上到下开始。

上面步骤1d)到10d)中描述的过程允许识别由4连接象素组成的对象，所述4连接象素亦即其中象素具有一个共同边。

为了还分类8连接象素对象，上述过程的步骤6d)修改如下：

6d)对于根据步骤3d)、4d)和5d)选择的每个象素，在正交于所述扫描方向的方向上估计下两个象素，并且在邻近于方向线的平行线上估计邻近于后者象素中每一个的两个象素，并选择活动象素。

然后根据步骤7d)到10d)执行过程。

上面描述的过程是半递归方法，相对于本领域的标准递归方法而言，所述半递归方法允许更短的执行时间和更少的存储器要求。事实上，考虑由N×M个活动象素组成的图像，仅M个递归调用是必须的，而根据现有技术的方法，递归调用的数目为N×M-1。

在SORT阶段之后，本发明的方法可以执行以下步骤：

1e)通过计数属于所述对象图像的象素的数目，并将其乘以每个象素的面积，计算根据SORT阶段识别的每个对象的面积；

2e)计数对象的数目并计算其密度；

3e)通过相加所有分类的对象的根据步骤1e)计算的面积，并且将总面积除以根据步骤2e)获得的对象的数目，计算对象的平均面积。

本发明的方法同样允许称作“粗糙度”的参数的计算，所述粗糙度给出了要被量化的对象(典型地为细胞结构)的表面不平坦的指示。借助于以下算法能够计算指示选择的对象的“粗糙度”程度的参数w：

$w=\mathrm{Pf}/2\sqrt{\mathrm{Af}\·\mathrm{\π}}-R---\left(\mathrm{III}\right)$

其中Pf是周长，Af是对象的面积，而R则是对象的“圆度系数”。R依次用以下算法计算：

$R=\mathrm{Pe}/2\sqrt{\mathrm{Ae}\·\mathrm{\π}}---\left(\mathrm{IV}\right)$

其中Pe是内接测量的对象的椭圆的周长，而Ae则是其面积。

本发明的方法的进一步的阶段是表面量化阶段(S-QUANT阶段)。

这个阶段提供了整个图像的“表面”的度量估计。这有助于得到角膜里面的各种单个对象(细胞等等)的分布和形状的更好图片，并从而改善诊断结果。

基础概念在于图像能被看作三维表面。图像中的象素的灰度值是观察的对象沿着正交于图像的坐标轴(z轴)延伸到什么程度的指标。换言之，数字图像显现为“山丘簇”(hill cluster)，其表面尺寸能够被计算为分形维数。因为这些原因，所以在根据上述程序标准化的图像上、但是在所述IMA-EL阶段之前执行S-QUANT阶段。

在这种情况下，通过使用“盒子计数”方法，同样能够计算表面的分形维数，然而所述方法适合于值x、y、z、亦即三维的组。

S-QUANT阶段包含以下步骤：

1f)在具有边1的n×n个盒子的x、y二维网孔中划分图像；

2f)将0-256灰度分成n个子区域，其每一个都具有256/n值；

3f)对于x、y二维网格的每个盒子，计算其中包含的象素的以及勾画盒子轮廓的象素的最小和最大值；

4f)计算在每个盒子的象素的最小和最大值之间包括多少256/n值的子区域；

5f)将截取图像表面的边1的三维盒子的数目N(1)计算为根据步骤4f)计算的所有盒子的子区域的总和；

6f)用小于1的边长1’重复步骤1f)到5f)；

7f)通过重复步骤6f)，生成1/1的对数函数的第一组值和N(1)的对数函数的第二组值；

8f)将图像表面的分形维数计算为内插步骤7f)的所述第一组值比所述第二组值的直线的斜率。

表面的分形维数的计算提供了图像的复杂性、亦即观察的组织中的细胞分布的数字指标，这能够和患者的病理状况联系起来。

如前所述，LSO技术提供了图像的3D重构，这通过在观察制品的z方向上的扫描而成为可能。在当前的特定例子中，取观察角膜的几个截面的图片，并重构几个获取的2D图像，以形成三维图像。这样重构的3D图像有助于得到观察组织的总的图片，并从而有助于识别其中包含的细胞的类型、数目和密度。

因此，本发明的方法同样包含 体积分析。

体积分析的第一个阶段是 3D重构阶段(3D-R阶段)。一旦图像已经经历了IMA-EL阶段，就在其上执行这个阶段。

根据本发明的过程，通过重叠对于检查组织的每个截面收集的2D图像来获得3D图像。然而，由于分析执行期间的观察眼睛的即使较小的移动，所以在扫描方向上的一个2D图像和随后的2D图像之间能够存在某种未对准。因而本发明的方法提供了重叠图像之间的偏移的调节。

3D-R阶段包含以下步骤：

1g)用沿着z轴的随后的图像重叠每个图像；

2g)通过沿着x轴和/或y轴相对彼此移动图像，使重叠象素之间的亮度和/或颜色强度的差最小化；

3g)对于每对相邻的图像重复步骤1g)和2g)。

在已重构3D图像之后，可以继续进行观察组织中包含的制品(典型地为细胞)数目的计数，以及它们密度的计算。这些参数对于得到有意义的诊断结果同样极端重要。

借助于 对象计数阶段(O-COUNT阶段)执行细胞的计数，所述阶段包含以下步骤：

1h)沿着x-y坐标轴系统上的预定方向扫描量化到“1位”的3D图像；

2h)沿着所述扫描方向选择第一活动象素，所述活动象素由第一组x、y值标识，所述第一活动象素属于第一对象的图像；

3h)在方向线上的紧接于所述选择的象素的位置中，在所述第一选择的活动象素上执行搜索程序；

4h)重复步骤3h)，直到发现不活动象素为止；

5h)赋予根据这样的步骤3h)和4h)选择的每个活动象素一组x、y值，将它们保存在处理系统7的存储装置中(所有的这样的象素都将具有相同的y值和按照渐进顺序的x值)，并且将所述象素在对象的图像中从活动的切换到不活动的；

6h)对于根据步骤3h)、4h)和5h)选择的每个象素，在正交于所述扫描方向的共面方向上估计下两个象素，并且在方向+z和-z上沿着z轴估计下两个象素，并选择活动象素；

7h)对于根据步骤6h)选择的所述活动象素中的每一个，执行步骤3h)到5h)的程序；

8h)重复步骤6h)和7h)，直到属于相同对象的所有连接的象素都已被保存为止；

9h)重复步骤1h)和2h)，直到发现进一步的对象图像的第一活动象素为止；

10h)重复步骤3h)到9h)，直到整个图像已被扫描为止；

11h)计数根据步骤1h)到10h)分类的对象的数目。

步骤1h)中的所述预定方向优选地从左到右从上到下开始。

通过按顺序重叠图像，执行方向+z和-z上的活动象素的搜索。

上面步骤1h)到10h)中描述的过程允许识别由4连接象素组成的对象，所述4连接象素亦即其中象素具有一个共同边。

为了还分类8连接象素对象，上述过程的步骤6h)修改如下：

6h)对于根据步骤3h)、4h)和5h)选择的每个象素，在正交于所述扫描方向的共面方向上估计下两个象素，并且在方向+z和-z上沿着z轴估计下两个象素，而且在邻近于方向线的平行线上估计邻近于这些象素中每一个的两个象素，并选择活动象素。

然后根据步骤7h)到10h)执行过程。

上面描述的过程是半递归方法，相对于本领域的标准递归方法而言，所述半递归方法允许更短的执行时间和更少的存储器要求。

一旦根据上述过程已确定检查组织中包含的对象、亦即细胞的数目，对象密度就容易地确定为整个3D图像体积之上的对象总数目：

d＝N_objects/V_image

其中图像体积被计算为截面的数目乘以截面之间的间隔厚度再乘以截面的延伸(面积)。

本发明的方法的下个阶段是 体积计算阶段(V-CLC阶段)。根据这个阶段确定检查组织中包含的对象的体积。

V-CLC阶段包含以下步骤：

1i)计算对应于第一对象的截面的第一2D图像中的每个对象的面积；

2i)将根据步骤1i)计算的面积乘以所述第一截面的图像和在扫描的z方向上取的随后的截面图像之间的距离，其中所述扫描包含了相同对象的图像；

3i)对于每个截面的图像依次重复步骤1i)和2i)。

检查组织中的对象的总体积被确定为根据上述过程计算的单个体积的总和。

优选地，通过计数属于相同对象的活动象素的数目，然后乘以象素的面积，来进行根据步骤1i)的面积计算。如O-COUNT阶段中描述的那样识别对象，以便给予每个对象一组x、y和z值。

每个截面的图像和随后一个之间的距离，在共焦显微技术中是已知参数。

通过将对象的体积逼近基本上圆柱形立体来计算上述体积。然而，通过将其逼近平截头圆锥体，体积计算如下：

$v=1/3d(A+a+\sqrt{A\·a})$

其中d是两个截面之间的已知距离，A是第一对象的截面面积，而a则是第二对象的截面面积。

通过如之前计算的那样将总体积除以对象的数目，最终给出对象的平均体积。

由上所述，很明显，如果和已知方法相比，则本发明的计算方法表现了改进。分形几何提供了源自微积分的数学模型，其中，当所述微积分应用于欧几里得几何时，积分自然的和不规则的对象的形态测量的测量结果的数字，从而使它们更接近于实际值。使用分形几何的尺寸计算，既给出了单个对象的数字指标(分形维数)(对象的面积/体积的空间分布的指标)，又给出了作为整体的图像的数字指标(观察组织中的对象的空间分布的指标)。这允许临床医生将患者的数字值和标准化值进行比较，从而立刻并可重复精确地得到患者病理状况的诊断。这被认为是现有技术诊断方法的显著改进，其中，在所述现有技术诊断方法中，只有患者眼睛图像的目视和定性分析是可得到的，以便进行诊断。

当然，只说明了根据本发明的用于分析生物组织样品的方法和设备的一些特定实施例，并且本领域技术人员将能够施加使其适合于特定应用所需的任何修改，而不背离本发明的保护范围。

Claims (30)

1.一种处理数字图像的方法，所述数字图像包括一个或多个要被量化的对象，所述方法包括以下主要阶段：

——数字图像的标准化；

——量化图像到一位，进一步包括以下阶段中的至少一个：

——从被量化到一位的所述图像计算要被量化的所述一个或多个对象的周长、面积和/或分形维数；

——从被量化到一位的所述图像重构要被量化的所述一个或多个对象的3D图像，和/或

——从所述标准化的图像计算总的图像的分形维数。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括的图像标准化(NORM)阶段包括以下步骤：

1)将图像分成象限；

2)计算属于每个象限的象素强度的平均值；

3)计算所有象限的强度的平均值，作为步骤2)的计算的平均的平均；

4)通过向象限里面的每个象素执行加上或减去相同的强度值中的一种，对于每个象限设置根据步骤3)计算的强度的平均值，以便在相同象限里面的象素之间维持初始Δ_intensity；

5)重复步骤1)到4)，直到预置的象限边长。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述预置的象限边长近似为要被量化的所述一个或多个对象的较小边的一半长度。

4.根据从权利要求1到3中任何一个所述的方法，其中，所述数字图像已由共焦显微术获取。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述共焦显微术是激光扫描共焦显微术(LSCM)或扫描检眼术。

6.根据从权利要求1到5中任何一个所述的方法，包括以下步骤：

1a)将图像分成4个象限；

2a)计算属于每个象限的象素强度的平均值；

3a)计算4个象限的强度的平均值，作为步骤2a)的4个计算的平均的平均；

4a)通过向象限里面的每个象素执行加上或减去相同的强度值中的一种，对于每个象限设置根据步骤3a)计算的强度的平均值，以便在相同象限里面的象素之间维持初始Δ_intensity；

5a)对于每个象限确定象素强度的最大和最小值，并且对于每个象素计算延伸的强度值(EI)，其源自可能的数字值的范围里面的数字值的扩展；

6a)对于每个象素设置根据步骤5a)计算的EI_pixel；

7a)重复步骤1a)到6a)，直到预置的象限边长。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，借助于以下算法执行计算象素的EI值的所述步骤5a)：

EI_pixel＝(I_pixel-I_min)×N/(I_max-I_min)

其中I_pixel是给定象限的每个象素的强度，I_mm是所述象限里面的象素的强度的最小值，I_max是所述象限里面的象素的强度的最大值，而N是大于1直到255的整数，优选地为255。

8.根据从权利要求1到5中任何一个所述的方法，其中，所述标准化阶段包括：

1b)将图像分成象限；

2b)对于每个象限确定象素强度的最大和最小值，并且对于每个象素计算延伸的强度值(EI)，其源自可能的数字值的范围里面的数字值的扩展；

3b)对于每个象限的每个象素，将EI_pixel值存储在数据结构中；

4b)重复步骤1b)到3b)，直到预置的象限边长，以便对于每个象素在数据结构中获得一组强度值；

5b)对于每个象素计算数据结构中存储的组的强度值的平均，并且将计算的平均值设置到各个象素。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，借助于以下算法执行计算象素的EI值的所述步骤5a)：

EI_pixel＝(I_pixel-I_min)×N/(I_max-I_min)

其中I_pixel是给定象限的每个象素的强度，I_min是所述象限里面的象素的强度的最小值，I_max是所述象限里面的象素的强度的最大值，而N是大于1直到255的整数，优选地为255。

10.根据从权利要求1到9中任何一个所述的方法，进一步包括将图像量化到“1位”的图像加工阶段(IMA-EL阶段)。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述IMA-EL阶段包括以下步骤：

1c)对于每个象素考虑参数；

2c)将所述象素的参数和用于所述参数的预置阈值或阈值范围进行比较；

3c)在所述比较的基础上选择一簇活动象素和一簇不活动象素，

其中所述象素的参数优选地为亮度强度(黑白图片)或数字颜色值。

12.根据从权利要求1到11中任何一个所述的方法，进一步包括图像量化阶段，其包括以下步骤中的至少一个：

——通过计数属于根据先前的IMA-EL阶段选择的活动象素簇的象素的数目，来计算检查中的对象的面积A；

——通过i)选择对象轮廓的象素，以及ii)向这样选择的象素施加周长计算的算法，来计算检查中的对象的周长P，其中，对于属于对象的每个活动象素都给定“周长值”，其为邻近于检查中的象素的活动象素的位置的函数，所述“周长值”的总数就是对象的总周长P。

13.根据从权利要求1到12中任何一个所述的方法，进一步包括用于识别由4连接象素组成的对象的对象分类(SORT)阶段，其包括以下步骤：

1d)沿着x-y坐标轴系统上的预定方向扫描量化到“1位”的图像；

2d)沿着所述扫描方向选择第一活动象素，所述活动象素由第一组x、y值标识，所述第一活动象素属于第一对象的图像；

3d)在方向线上的紧接于所述选择的象素的位置中，在所述第一选择的活动象素上执行搜索程序；

4d)重复步骤3d)，直到发现不活动象素为止；

5d)赋予根据这样的步骤3d)和4d)选择的每个活动象素一组x、y值，将它们保存在处理系统(7)的存储装置中，并且将所述象素在对象的图像中从活动的切换到不活动的；

6d)对于根据步骤3d)、4d)和5d)选择的每个象素，在正交于所述扫描方向的方向上估计下两个象素，并选择活动象素；

7d)对于根据步骤6d)选择的所述活动象素中的每一个，执行步骤3d)到5d)的程序；

8d)重复步骤6d)和7d)，直到属于相同对象的所有连接的象素都已被保存为止；

9d)重复步骤1d)和2d)，直到发现进一步的对象的图像的第一活动象素为止；

10d)重复步骤3d)到9d)，直到整个图像已被扫描为止。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，步骤1d)中的所述预定方向从左到右从上到下开始。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，根据步骤1d)到10d)的对象分类阶段同样用于执行识别由8连接象素组成的对象，在所述阶段中步骤6d)修改如下：

6d)对于根据步骤3d)、4d)和5d)选择的每个象素，在正交于所述扫描方向的方向上估计下两个象素，并且在邻近于方向线的平行线上估计邻近于后者象素中每一个的两个象素，并选择活动象素。

16.根据从权利要求13到15中任何一个所述的方法，进一步包括以下步骤中的至少一个：

1e)通过计数属于所述对象图像的象素的数目，并将其乘以每个象素的面积，来计算根据SORT阶段识别的每个对象的面积；和/或

2e)计数对象的数目并计算其密度；和/或

3e)通过相加所有分类的对象的根据步骤1e)计算的面积，并且将总面积除以根据步骤2e)获得的对象的数目，来计算对象的平均面积。

17.根据从权利要求1到16中任何一个所述的方法，进一步包括计算指示选择的对象的“粗糙度”程度的参数(w)的步骤，优选地，借助于以下算法计算所述(w)参数：

$w=\mathrm{Pf}/2\sqrt{\mathrm{Af}\·\mathrm{\π}}-R$

其中Pf是周长，Af是对象的面积，而R则是对象的“圆度系数”；其中R依次用以下算法计算：

$R=\mathrm{Pe}/2\sqrt{\mathrm{Ae}\·\mathrm{\π}}$

其中Pe是内接测量的对象的椭圆的周长，而Ae则是其面积。

18.根据从权利要求1到17中任何一个所述的方法，进一步包括用于计算观察对象的周长和面积的分形维数的尺寸计算(DIM-CLC)阶段，其中，根据以下步骤确定所述周长的分形维数(D_p)和所述面积的分形维数(D_A)：

a)将对象的图像分成具有边长ε的多个网格的盒子，其中，ε在基本上对应于内接所述对象的盒子的边的第一值和作为所述第一值的分数的预定值中变化；

b)对于步骤a)的每个ε值，计算N(ε)的对数函数值，其中N(ε)是分别完全覆盖对象的周长(P)或面积(A)所需的盒子的数目，并且计算1/的对数函数值，从而获得对于所述N(ε)的对数函数的第一组值和对于所述1/ε的对数函数的第二组值；

c)将分形维数(D_p)或(D_A)计算为内插步骤b)的分别用于周长(P)或面积(A)的所述N(ε)的对数函数的所述第一组值比所述第二组值的直线的斜率。

19.根据从权利要求1到18中任何一个所述的方法，进一步包括在根据NORM阶段标准化的图像上执行的表面量化(S-QUANT)阶段，所述阶段包括以下步骤：

1f)在具有边1的n×n个盒子的x、y二维网孔中划分图像；

2f)将0-256灰度分成n个子区域，其每一个都具有256/n值；

3f)对于x、y二维网格的每个盒子，计算其中包括的象素的以及勾画盒子轮廓的象素的最小和最大值；

4f)计算在每个盒子的象素的最小和最大值之间包括多少256/n值的子区域；

5f)将截取图像表面的边1的三维盒子的数目N(1)计算为根据步骤4f)计算的所有盒子的子区域的总和；

6f)用小于1的边长1’重复步骤1f)到5f)；

7f)通过重复步骤6f)，生成1/1的对数函数的第一组值和N(1)的对数函数的第二组值；

8f)将图像表面的分形维数计算为内插步骤7f)的所述第一组值比所述第二组值的直线的斜率。

20.根据从权利要求1到19中任何一个所述的方法，进一步包括在经受IMA-EL阶段的图像上执行的3D重构(3D-R)阶段，所述3D-R阶段包括以下步骤：

1g)用沿着z轴的随后的图像重叠每个图像；

2g)通过沿着x轴和/或y轴相对彼此移动图像，使重叠象素之间的亮度和/或颜色强度的差最小化；

3g)对于每对相邻的图像重复步骤1g)和2g)。

21.根据权利要求20所述的方法，进一步包括对象计数(O-COUNT)阶段，其包括以下步骤：

1h)沿着x-y坐标轴系统上的预定方向扫描量化到“1位”的3D图像；

2h)沿着所述扫描方向选择第一活动象素，所述活动象素由第一组x、y值标识，所述第一活动象素属于第一对象的图像；

3h)在方向线上的紧接于所述选择的象素的位置中，在所述第一选择的活动象素上执行搜索程序；

4h)重复步骤3h)，直到发现不活动象素为止；

5h)赋予根据这样的步骤3h)和4h)选择的每个活动象素一组x、y值，将它们保存在处理系统7的存储装置中(所有的这样的象素都将具有相同的y值和按照渐进顺序的x值)，并且将所述象素在对象的图像中从活动的切换到不活动的；

6h)对于根据步骤3h)、4h)和5h)选择的每个象素，在正交于所述扫描方向的共面方向上估计下两个象素，并且在方向+z和-z上沿着z轴估计下两个象素，并选择活动象素；

7h)对于根据步骤6h)选择的所述活动象素中的每一个，执行步骤3h)到5h)的程序；

8h)重复步骤6h)和7h)，直到属于相同对象的所有连接的象素都已被保存为止；

9h)重复步骤1h)和2h)，直到发现进一步的对象图像的第一活动象素为止；

10h)重复步骤3h)到9h)，直到整个图像已被扫描为止；

11h)计数根据步骤1h)到10h)分类的对象的数目。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，步骤1h)中的所述预定方向从左到右从上到下开始。

23.根据权利要求21或22所述的方法，还用于分类8连接象素对象，其中，权利要求21中描述的过程的步骤6h)修改如下：

6h)对于根据步骤3h)、4h)和5h)选择的每个象素，在正交于所述扫描方向的共面方向上估计下两个象素，并且在方向+z和-z上沿着z轴估计下两个象素，而且在邻近于方向线的平行线上估计邻近于这些象素中每一个的两个象素，并选择活动象素。

24.根据从权利要求1到23中任何一个所述的方法，进一步包括体积计算(V-CLC)阶段，其包括以下步骤：

1i)计算对应于第一对象的截面的第一2D图像中的每个对象的面积；

2i)将根据步骤1i)计算的面积乘以所述第一截面的图像和在扫描的z方向上取的随后的截面图像之间的距离，其中所述扫描包括了相同对象的图像；

3i)对于每个截面的图像依次重复步骤1i)和2i)。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，检查组织中的对象的总体积被确定为单个体积的总和。

26.根据权利要求24或25所述的方法，其中，计算体积如下：

$v=1/3d(A+a+\sqrt{A\·a})$

其中d是两个截面之间的已知距离，A是第一对象的截面面积，而a则是第二对象的截面面积。

27.一种用于获取并处理图像的系统(1)，包括：共焦扫描显微镜(2)；电子图像获取装置(6)，其有效连接到所述显微镜(2)；以及处理系统(7)，其与所述共焦扫描显微镜(2)和所述图像获取装置(6)有效连接，所述处理系统(7)包括：处理单元(CPU)以及存储装置，其包括RAM工作存储器和硬盘，所述处理系统(7)运行程序(PRG)以执行根据从权利要求1到26中任何一个所述的方法。

28.一种软件程序(PRG)，用于执行根据从权利要求1到26中任何一个所述的方法。

29.一种计算机可读载体，包括用于执行根据从权利要求1到26中任何一个所述的方法的程序(PRG)。

30.根据权利要求27或28的系统(1)的应用，用于执行如从权利要求1到26中任何一个所述的方法。

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