JP4146354B2 - 生物学的組織試料を解析する方法および装置 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的組織試料を解析する方法および装置に関する。

本発明は、生物学的試料、特に人間または動物の本体またはそのイメージのような不規則な形状のオブジェクトを処理するための方法および装置に関する。生物学的本体の一部分、または組織、または異常材料のスポット、またはそれを含む集合体の測定定量化もまた本発明の方法により行われることができる。

用語“異常材料スポット、または集合体”は病理的状態または病理的状態の前後の状態を生じる状態に関連した形態学的な材料スポット、または集合体を意味している。異常材料スポットまたは集合体の例としては腫瘍、アテローム斑点、水腫、血腫、急性または慢性炎症、傷害、傷跡およびコラーゲン疾患等であってもよい。

人間、動物、または植物の組織の観察および解析は通常顕微鏡によって行われる。顕微鏡がイメージを捕捉するカメラまたはビデオと接続され、また捕捉したイメージの可視解析およびエラボレーションのためのコンピュータに接続されているワークステーションが知られている。

他方で、病理診断で身体の一部分または組織の観察が必要になるとき、そのような観察は直接或いはレントゲン写真、コンピュータ化されたアキシアルトモグラフ、エコグラフ解析等のような間接的手段によって行われる。再び、観察される身体の一部分または組織のイメージ、すなわちデジタルイメージがコンピュータ単独またはコンピュータ／カメラシステムにより捕捉されて解析される。

しかしながら、いずれの場合でも、現在の既知の装置には幾つかの欠点があることが知られている。主要な欠点は、捕捉されたイメージがコンピュータにより処理される方法に関係している。事実、場合によっては、病理的展開を評価するために、観察される身体の部分または異常な材料スポットまたは集合体の物理的および幾何学的特性を評価することが必要である。典型的な例では、アテローマ性の動脈硬化プラークまたは腫瘍の拡大の評価である。そのような場合に既知の装置は、要求されるパラメータ（周辺部、面積等）の正確な量を得ることができず、特に、上述したような非常に不規則な形状に対しては困難であり、その結果、解析結果は不正確であり、誤りを生じる可能性がある。それ故、そのような定量化が要求される項目に対して形態学的パラメータの正確な定量化を可能にする改良された装置が必要である。

顕微鏡による観察の場合の別の典型的な問題は、イメージの自動フォーカスである。事実、解析すべき全体のイメージを観察して捕捉するために、高い倍率で、スライドを走査するとき、各走査された部分の迅速で正確なフォーカス動作を行うことは困難である。

上述の問題およびその他の問題は特許請求の範囲に記載された本発明の方法および装置によって解決される。
本発明の方法は、オブジェクトのイメージ，特に、ユークリッドディメンションがオブジェクトの実際の寸法を表していない不規則な形状を有するオブシェクトのイメージを解析し計測定量化することを可能にする。そのような種類のオブジェクトは生物学的試料を解析するときしばしば生じる。しかしながら、本発明の方法はそのような特定の分野に限定されるものではなく、種々の応用分野で使用されることが可能であり、顕微鏡によりイメージを観察し、或いは直接のイメージ観察により、或いは地勢学的または幾何学的調査の場合のような不規則なオブジェクトのイメージを観察するような種々の応用分野で使用されることが可能である。

さらに、本発明による不規則な形状の対象物（オブシェクト）のイメージを解析する方法および装置の特徴および利点は、添付図面を参照にした以下の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。しかしながら、これらの実施形態は本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。

ここで使用される用語“生物学的試料”は、人間、動物、または植物体（組織または細胞サンプル等）から採取した任意の種類の生物学的サンプル、或いは人間、動物、または植物体の任意のイメージ（レントゲン写真、エコグラフ、ＣＡＴ等）を表している。

以下説明する例は、イメージを捕捉して処理するシステム1 に関しており、それはデカルト座標軸ｘ，ｙ，ｚに沿って移動することのできるモータで動作する走査ステージ3 を有する顕微鏡2 を備えている。顕微鏡2 は５０倍乃至１００倍の倍率が可能な形式のものであることが好ましい。

顕微鏡2 は１以上の対物レンズ8 と、１以上の接眼レンズ4 と、カメラ取付けのための１以上の光学ビデオポート5 とを備えている。この後者の光学ビデオポート5 に、電子イメージ捕捉手段6 、特に光学／ビデオカメラが接続されて動作する。このような電子イメージ捕捉手段6 はデジタルカメラであることが好ましく、特に１．３メガ画素の解像度を有していることがさらに好ましい。

電子イメージ捕捉手段6 は処理システム7 に接続されて動作する。その処理システム7 は例えば中央処理装置（ＣＰＵ）のような処理手段と、コンピュータをスタートさせる基本的プログラムを含む例えばＲＡＭ動作メモリ、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）のようなメモリに接続されたバスを有するパーソナルコンピュータ（ＰＣ）により実現されることができる。前記メモリは磁気ハードディスク、随意的には光ディスク（ＣＤ−ＲＯＭ）を読取る駆動装置、随意的にフロッピーディスク（Ｒ）の読取り／書込みのための駆動装置を含んでいる。さらに、処理システム7 は随意的に通信ネットワークとの通信を制御するためのモデムその他のネットワーク手段、キーボード制御装置、マウス制御装置、およびビデオ制御装置を含んでいる。キーボード、マウス、およびモニタ8 はそれぞれ制御装置に接続されている。電子イメージ捕捉手段6 はインターフェースポート（ＩＴＦ）によりバスに接続されている。走査ステージ3 もまた制御インターフェースポート（ＣＩＴＦ）によりバスに接続され、それにより座標軸に沿ったステージの移動が制御される。

実行段階中にプログラム（ＰＲＧ）はメモリ中に負荷され、各データベースはハードディスクに記憶される。典型的に、プログラム（ＰＲＧ）はハードディスクにインストールするために１以上のＣＤ−ＲＯＭに分配される。

同様の考えは、処理システム7 が異なる構成を有する場合、例えば、種々の端子が接続されている中央装置により構成される場合または通信コンピュータネットワーク（インタネット、イントラネット、ＶＰＮのような）により構成される場合または他の装置（プリンタのような）等により構成される場合に、適用されることができる。その代わりにプログラムはフロッピーディスク（Ｒ）に供給され、またはハードディスクに予めロードされ、またはコンピュータにより読取り可能な任意の他の基板上に記憶され、通信ネットワークによりユーザのコンピュータに送られ、無線により放送され、またはさらに一般的にはユーザのコンピュータの動作メモリに直接負荷されることのできる任意の形態で供給されることができる。

以下、本発明による生物学的試料のイメージを捕捉して処理する方法について説明すると、まず、試料スライドは顕微鏡2 の走査ステージ3 上に置かれる。
本発明の方法のステップの幾つかのものはプログラムＰＲＧを実行することによりコンピュータシステム7 により行うことができることを指摘しておく。

本発明の方法の第１段階はイメージを捕捉して定量化しなければならないオブジェクトの識別の段階である（ＩＤ段階）。
関心のあるオブジェクトを識別するための以下の方法は、オブジェクトと背景との間の輝度の高いコントラストによりそのようなオブジェクトが明瞭に識別可能であるという仮定に基づいている。もしもそのような高いコントラストが観察している試料中に本来存在しない場合には、オブジェクトまたは背景をマークする適当な染料で試料を着色することにより強調されることができる。

ＩＤ段階の開始において、拡大率が、例えば２００倍のような所望の値に設定され、その方法は、
１ａ）イメージ上に重なるように複数のボックスにより形成されたグリッドを生成し、その後、
２ａ）モータで動作される走査ステージ3 に命令を送って、顕微鏡の対物レンズの位置をイメージが捕捉されるべきグリッドの第１のボックスと整列するための対応するｘ，ｙ軸上の第１の位置（スタート位置）に位置させ、電子イメージ捕捉手段に命令を送ってこの第１のボックスに対するデジタルイメージを捕捉させ、そのイメージは一時的に動作メモリ（ＲＡＭ）中に保存され、
３ａ）第１のボックス中の単一の画素の輝度をＣＰＵによって評価し、それを予め定められた値と比較し、ボックス内部の輝度コントラストを決定する。方法はさらに続き、
４ａ）モータで動作する走査ステージ3 に命令を送ってグリッドの第２のボックスに対応するｘ，ｙ軸上の次の位置（第２の位置）に位置させ、電子イメージ捕捉手段6 に命令を送って第２のボックスに対するデジタルイメージを捕捉して一時的にＲＡＭメモリ中に保存し、そのようなイメージについてステップ３）の動作を反復する。

それに続いて、方法は、
５ａ）全部のスライドが走査されてグリッドの各ボックスに対するイメージが処理されるまで、ステップ４）のルーチンを反復する。全ルーチンの実行中、予め定められた値よりも高い輝度コントラストを有するグリッドのボックスのｘ，ｙ位置がハードディスクメモリ中に保存される。

ＲＡＭメモリ中に一時的に保存されたボックスのグリッドのイメージの処理の前記ステップ３ａ）は、
ｉ）解析されたボックスの画素の輝度強度のヒストグラムを構築し、
ii）そのヒストグラムの平均値からの標準偏差を計算し、
iii)その計算された標準偏差の値を予め定められた値と比較する方法にしたがって実行される。

そのような予め定められた値より上の標準偏差を有するボックスの位置はハードディスクに保存される。標準偏差のそのような予め定められた値は検出されるべきオブジェクトの種類に依存し、それは組織構造の種類、その着色の程度等に依存している。

上記ｉ）、ii）、iii)で説明した手順は、他の方法も可能であるが、ステップ３）を実行することを可能にするだけではなく、ぼかされたイメージの場合にさえ信頼性のある結果が得られる利点を有している。この段階においてイメージのフォーカスはまだ普通には行われていないことに注目すべきである。観察すべきオブジェクトを識別する前に焦点を結ばせることは全体の手順に対して時間の消費を許容できないように増加させるであろう。

さらに好ましいのは、上述のＩＤ段階が識別のプレビュー（下見）段階（ＩＤ−ＰＲＥＶ）によって置換され、或いは先行され、このプレビュー段階においても同じステップ１乃至５が行われるが、それは顕微鏡2 を低い倍率（例えば２５倍乃至１００倍）に設定することにより行われる。この手順は反復するグリッドのボックスの数が少ないためにＩＤ段階の迅速な実行を許容する。この実施形態の場合には、ＩＤ−ＰＲＥＶ段階は先行するが、ＩＤ段階に置換していない。この後者は全体のイメージの領域でのみ行われ、それにおいてはオブジェクトの存在はＩＤ−ＰＲＥＶにより検出される。

上述のオブジェクト識別段階は、その方法の自動化と迅速な実行を可能にするものではあるが、本発明の方法を実行するために絶対に必要なものではないことを理解すべきである。ＩＤ段階および／またはＩＤ−ＰＲＥＶ段階が存在しない場合には、試料の識別は手作業で行われることができる。他方で、同じ手動識別段階はさらに長過ぎるイメージ捕捉段階を生じさせる。それは全部のスライドイメージが捕捉されるためである。

本発明の方法の第２段階は焦点設定段階（ＦＣＳ段階）である。この第２段階は、
１ｂ） 捕捉されるべきオブジェクトイメージ上の複数の焦点を選択し、
２ｂ）走査ステージ3 に命令を送って顕微鏡の対物レンズの下に焦点を位置させ、
３ｂ）手動で第１の焦点位置に焦点を結ばせ、その焦点パラメータを処理システムの記憶手段中に保存し、
４ｂ）各焦点位置に対してステップ２ｂ）および３ｂ）のルーチンを反復する。

ステップ１ｂ）で選択された焦点位置はオブジェクトの表面上に互いに等間隔で、或いは均一に分布されていてもよい。さらに、好ましくは９個の焦点位置が選択され、それらは検査下のオブジェクト中に形成された最大の平行六面体の４つのコーナーと、その中心と、および前記平行六面体の側面の中間点とにある。

方法の第３段階はホワイト較正（ＷＣＡＬ）段階である。この段階は、
１ｃ）電子イメージ補足手段6 によりスライドの試料のない領域（ブランク領域）のイメージを捕捉し、それを処理システム7 の記憶手段中に保存する。

このブランクイメージは次のイメージ捕捉段階で各イメージ領域の捕捉されたイメージにより減算される。これは捕捉されたイメージの境界線の影の効果を消去することを可能にする。

本発明の方法の第４段階はイメージ捕捉段階（ＩＭ−ＡＣＱ段階）であり、それは次のようなステップにしたがって行われる。

１ｄ）ＣＰＵは、顕微鏡の対物レンズと整列して前のステップ５ａ）にしたがって選択されたグリッドの第１の保存されたボックス位置にそれを移動するように走査ステージ3 に命令を送り、
２ｄ）前記第１のボックスに近接した２以上の焦点位置に対して前のステップ１ｂ）乃至４ｂ）にしたがって計算された焦点パラメータから補間することにより前記第１のボックスイメージに対する焦点パラメータを計算し、
３ｄ）前記イメージ捕捉手段6 により前記第１のボックスのイメージを捕捉し、
４ｄ）前記第１のボックスの捕捉されたイメージから上記ステップ１ｃ）にしたがって捕捉されたブランクイメージを減算し、
５ｄ）処理システム7 の記憶手段中にステップ４ｄ）によって生成されるイメージを保存し、
６ｄ）捕捉されるべき全体のオブジェクトが走査されるまでステップ１ｄ）乃至５ｄ）を反復し、
７ｄ）それらの最初の位置に関して単一ボックスのイメージを整列させ、処理システム7 の記憶手段中に前記全部のイメージを保存することによりオブジェクトの全イメージを再構成する。

オブジェクトの全イメージを再構成する前記ステップ７ｄ）は次のように行われる。

ｌ）整列方向にイメージの側面のエッジを重ねることにより隣接するボックスのイメージと各ボックスのイメージとを整列させ、
ｍ）重なった領域において、ボックスのイメージを互いにシフトすることにより重なった画素間の輝度とカラー強度の少なくとも一方の差を最小にし、
ｎ）隣接するボックスの各対に対してステップｌ）およびｍ）を反復する。

本発明の方法の次の段階はイメージエラボレーション段階（ＩＭ−ＥＬ段階）である。この段階は、計算がさらに行われるイメージの領域を選択するためにイメージを“１ビット”に量子化することによって行われる。ＩＭＡ−ＥＬ段階は次のように行われる。

１ｅ）各画素に対するパラメータを考慮し、
２ｅ）前記パラメータに対する予め設定されたしきい値またはしきい値範囲と前記画素のパラメータとを比較し、
３ｅ）その比較に基づいて、活性の画素のクラスタと不活性の画素のクラスタとを選択する。

前記画素のパラメータは輝度の強度（黒および白のイメージ）またはデジタルカラー値であることが好ましい。前記パラメータに対する前記予め設定されたしきい値または範囲は検出されるべきオブジェクトの種類に依存しており、それは組織構造の種類、それがどのように着色されているか等に依存し、或いはイメージが白と黒のイメージ（レントゲン写真のような）か、または任意の種類および素姓のカラーイメージであるかに依存している。そのようなしきい値または範囲の選択は、特定の場合に対して当業者が発明力を必要とする検討をすることなく当業者によって行われることができる。例えば、イメージが捕捉されるべきオブジェクトがシリウス赤で着色されたコラーゲン物質であれば、活性画素は０乃至２５５の範囲の赤と青に対するデジタル値と、０乃至１３０の範囲の緑に対するデジタル値とを有するものでよい。

デジタルイメージが１ビットに量子化されたならば、本発明の方法はイメージの計量処理段階を行い、それは以下説明するように異なった段階を行う。

したがって、本発明の方法の次の段階はオブジェクトの計量量子化段階（ＱＵＡＮＴ段階）である。
この段階は、不規則な形状のオブジェクトの外形測定パラメータの計量量子化を改善するために設定され、それは通常のユークリッド幾何学によっては測定されることができない。任意の有機体、特に肝臓から採取した正常または異常な、例えば病理学的な組織サンプルのコンポーネントの顕微鏡観察は、任意の倍率（観察のスケール）で現れる新しい不規則性のために驚かされている。試料のイメージの拡大形態が変化するので、新しい不規則な詳細部は各拡大率で独立しており、単一の線形システムで配置されない測定およびディメンションを与えられる。観察されるオブジェクトの外面の凹凸によるものであるこの特性のために、可視の詳細部および可視的に識別されることのできないものは不規則な表面（肝臓の組織のサンプルのようなもの）を有する全てのオブジェクトを通常の伝統的なコンピュータ支援外形計測により測定することを非常に困難にする。

古典的な外形計測は不規則な外形および粗い表面を直線の外形と平らな表面によって近似することにより自然のオブジェクトを測定する問題を捉えている。さらに、全体として組織中の傷害の分布の不均等のために傷害のある組織の小さい容積の部分だけを採取しても常に疾患を示すとは限らない。組織の小さい容積の部分の生体サンプルには表われない性質がその組織中に存在する可能性がある。隣接する組織と完全に異なる段階を示すサンプルを得るために採取される生体が、しばしば隣接する組織と十分異なるにもかかわらず僅かな差しか存在しないことも知られている。

形状が倍率の関数として変化する事実にもかかわらず、全ての空間的スケールにおいてそれらの不規則性の特徴を保持しているために、不規則なオブジェクトはBenoit Mandelbrot により“フラクタル”と定義されている。分割されることのできる部片（ピース；すなわち断片ではない）は等しくないが、それらはその不規則性の類似性を保持している。この分割されることのできる部分の特性は“自己類似性”と呼ばれている。そのようなオブジェクトの形状はそれらのイメージが観察される拡大率に依存しているから、オブジェクトのディメンションの量的測定は拡大スケールの関数である。それ故、フラクタルディメンションは不規則性の本体のフラクタル部片の“自己類似性”を示し、各スケールにおいて観察された不規則なオブジェクトの物理的および幾何学的パラメータを測定するために使用された基準手段の特性を規定している。

ＱＵＡＮＴ段階の第１のステップは検査しているオブジェクトの面積の計算である。測定の単位はμｍ² または画素であり、１．９画素側面＝１μｍであることを考慮に入れる（すなわち、倍率２００倍で１画素側面＝０．５２６μｍであり、１．３メガ画素のビデオカメラの解像度である）。したがって、検査しているオブジェクトの面積Ａは、前にＩＭＡ−ＥＬ段階にしたがって選択された活性画素のクラスタに属している画素の数を数えることによって計算される。

ＱＵＡＮＴ段階の第２のステップは検査しているオブジェクトの周辺Ｐの計算である。このステップは、ｉ）オブジェクトの輪郭の画素を選択し、ii) Ｓ．Ｐｒａｓｈｋｅｒ法（Steve Prashker,An Improved Algorithm for Calculating Polygona,GEOComputation，1999年、ここで参考文献とする）にしたがって周辺計算アルゴリズムをそのような選択された画素に適用することにより行われる。Ｐｒａｓｈｋｅｒ法によれば、各活性画素を囲んでいるものが考慮され、すなわち検査される画素の周囲の８個の画素が検討される。各活性画素に対して周辺値が与えられ、その合計がオブジェクトの全体の周辺Ｐである。例えば内部画素（すなわち活性画素により全体的に囲まれている画素、したがってオブジェクトの周辺に属していない画素）が検討される場合には、そのような画素に対して０の周辺値が与えられる。周辺の画素が対角線に沿ってコーナーを通って他の２つの画素と接続されている場合には周辺値は２^1/2 画素である。検討された活性画素がコーナーを通って１つの画素と接続され，側面で他の画素と接続されている場合には、“周辺値”は（０．５＋２^1/2 ／２）画素である。活性画素が側面を通って２つの隣接する画素と接続されている場合には、“周辺値”は１画素であり、以下同様である。

検査しているオブジェクトの周縁の考慮された不規則性を与え、具体的な項でそれを測定することができるために、そのフラクタルディメンションＤ_P の評価が行われる。同様に選択されたコラーゲン構造の面積のフラクタルディメンションの評価は記号Ｄ_A で示される。これら両方のフラクタルディメンションは既知の“ボックスカウント”アルゴリズムを使用して自動的に決定することができる。

ボックスカウント法ではフラクタルディメンションＤは次式により与えられる。
Ｄ＝ｌｉｍ（ε−＞０）［ｌｏｇＮ（ε）／ｌｏｇＮ（１／ε）］
ここで、εはグリッドのボックスの側面の長さであり、グリッドにおいてオブジェクトのイメージは分割されており、Ｎ（ε）は測定されたオブジェクトの輪郭（Ｄ_P ）または面積（Ｄ_A ）をそれぞれ完全にカバーするために必要なボックスの数である。長さεはこの明細書の計算方法では画素またはμｍで表され、εは１画素である。

したがって、本発明の方法の次の段階はディメンション計算段階（ＤＩＭ−ＣＬＣ段階）である。
このような計算における困難を避けるため、フラクタルディメンションＤ_P およびＤ_A は、ガウス座標軸系においてパラメータｌｏｇＮ（ε）対ｌｏｇ（１／ε）を置くことにより得られる直線の傾斜として近似される。

実際には、Ｄ_P を決定するために使用される方法は処理システム7 のＣＰＵによって行われ、次のようなステップを含んでいる。

ａ）オブジェクトのイメージを側面の長さεを有する複数のボックスのグリッドに分割し、それにおいてεはボックスの側面に実質上対応する第１の値から変化し、ボックス中に前記オブジェクトは形成され、前記第１の値の分数である予め定められた値を有しており、
ｂ）Ｎ（ε）の対数関数の値を計算し、それにおいてＮ（ε）の値はオブジェクトの周辺（Ｐ）を完全にカバーするために必要なボックスの数であり、ステップａ）の各εに対して１／εの対数関数であり、それによりＮ（ε）の対数関数に対する第１の値のセットおよび前記１／εの対数関数に対する第２の値のセットを獲得し、
ｃ）ステップｂ）の前記第１の値のセットに対する第２の値のセットを補間している直線の傾斜としてフラクタルディメンションＤ_P を計算する。

同じ方法はフラクタルディメンションＤ_A を計算するためにも適用され、相違点は、この場合にはＮ（ε）が量子化されるオブジェクトの面積を完全にカバーする側面εのボックスの数であることである。

次のステップは、
ｄ）次のアルゴリズムにしたがって補正されたパラメータＰｆを計算する。

Ｐｆ＝Ｐ．［１＋λ_P （Ｄ_P −Ｄ）］ （Ｉ）
ここで、Ｐｆはフラクタル補正された周辺であり、Ｐはユークリッド周辺であり、Ｄ_P はフラクタルディメンションであり、Ｄはユークリッドディメンション（周辺Ｄ＝１に対して）であり、λ_P は拡大係数である。λ_P の値は異なった倍率（例えば５×，１０×，２０×，４０×の対物倍率）で得られる組織構造断面を使用して経験的に決定され、評価対象オブジェクトの新しく明らかにされる詳細を観察する。λ_P の値は約４．５であることが認められた。

同様にＡｆ、すなわち、観察される不規則なオブジェクトの補正された面積は次のアルゴリズム（Ｉａ）によって処理システム7 のＣＰＵにより計算される。

Ａｆ＝Ａ＋［λ_A （Ｄ_A −Ｄ）］．（Ａ_P −Ａ） （Ｉａ）
ここで、Ａはユークリッド面積であり、Ｄはユークリッドディメンション（Ｄ＝２）であり、λ_A は拡大係数であり、ほぼ０．１であることが認められた。Ａ_P は量子化されるべきオブジェクトを含む領域の面積であり、外形計測面積Ａと同じ方法で特定のカラーしきい値により自動的に得られる。Ｄ_A は面積のフラクタルディメンションであり、それはボックスカウント法により計算される。

定量化されるべきオブジェクトが複数の小さいオブジェクトから構成されている場合には、Ａｆの計算は困難になり、特に、１６ミクロンより小さい直径を有するオブジェクトに対しては困難である。そのような場合には、小さいオブジェクトの面積の計算は、上述したＩＭＡ−ＥＬ段階にしたがって選択された活性画素についての標準的な外形計測評価によって行われる。すなわち、同じ領域に属する活性画素の数を数えることによって行われる。そのために、同じ領域に属する活性画素、すなわち同じ小さいオブジェクトに属する活性画素は最初に全てが識別され、その後、各領域の面積が計算される。それ故、本発明の方法は、オブジェクトのソートの段階（ＳＯＲＴ段階）を含み、それは以下のようなステップを含んでいる。

１ｆ）ｘ，ｙ座標系で予め定められた方向に沿って“１”ビットに量子化されたイメージを走査し、
２ｆ）前記走査方向に沿って第１のオブジェクトのイメージに属している第１の活性画素を選択し、前記活性画素はｘ，ｙ値の第１のセットにより識別され、前記第１の活性画素は第１のオブジェクトのイメージに属しており、
３ｆ）前記選択された第１の活性画素について方向の線上でその選択された第１の活性画素の次の位置においてサーチルーチンを行い、
４ｆ）不活性の画素が発見されるまでステップ３ｆ）を反復し、
５ｆ）ステップ３ｆ）および４ｆ）にしたがって選択された各活性画素に１組のｘ，ｙ値を割当て、それらを処理システムの記憶手段中に保存し（そのような全画素は進行順序で同じｙ値およびｘ値を有しており）、前記画素をオブジェクトイメージ中で活性から不活性に切替え、
６ｆ）ステップ３ｆ）、４ｆ）、５ｆ）にしたがって各画素に対して、前記走査方向に直交する方向において２つの次の画素を評価して、活性画素を選択し、
７ｆ）ステップ６ｆ）にしたがって選択された前記各活性画素に対してステップ３ｆ）乃至５ｆ）のルーチンを実行し、
８ｆ）同じオブジェクトに属する接続された全ての画素が保存されるまでステップ６ｆ）および７ｆ）を反復し、
９ｆ）別のオブジェクトのイメージの第１の活性画素が発見されるまでステップ１ｆ）および２ｆ）を反復し、
１０ｆ）全体のイメージが走査されるまでステップ３ｆ）乃至９ｆ）を反復する。

ステップ１ｆ）における前記予め定められた方向は左から右へスタートして上から下への方向であることが好ましい。

上記のステップ１ｆ）乃至１０ｆ）にしたがった手順により４つの接続された画素から形成されたオブジェクトを識別することが可能になる。すなわち、画素は共通の一方の側面を有している。

８つの接続された画素から形成されたオブジェクトをソートするために、前記ステップ６ｆ）は次のように変更される。

６ｆ）ステップ３ｆ）、４ｆ）、５ｆ）にしたがって選択された各画素に対して、前記走査方向に直交する方向においてその方向のラインに隣接する平行なライン上の後者の画素のそれぞれに隣接する２つの次の画素を評価して、活性画素を選択するように変更される。

手順はその後、ステップ７ｆ）乃至１０ｆ）にしたがって続行される。

ここで説明した手順は半循環的方法であり、技術的に知られている標準的な循環的方法に関して実行時間が短くなり、必要なメモリが少なくできる。事実、Ｎ×Ｍの活性画素から形成されたイメージを考慮に入れると、Ｍの循環的呼びしか必要がなく、一方従来の方法では、循環的呼びはＮ×Ｍ−１である。

ソート段階後、本発明の方法は次のステップを実行する。すなわち、
１ｇ）前記オブジェクトのイメージに属する画素の数をカウントし、前記各画素の面積に対してそれを乗算することによりソート段階にしたがって識別された各オブジェクトの面積を計算し（２００倍の倍率で、画素の側面＝０．５２６μｍ，ビデオカメラの解像度１．３メガ画素）、
２ｇ）オブジェクトの数をカウントし、その密度を計算するステップを含んでいる。

上述の説明から本発明の計算方法は既知の方法と比較して改善を表している。フラクタル形状は無限積分から導出された数学的モデルを提供し、それはユークリッド幾何学に適用されるとき自然の不規則なオブジェクトの外形測定の形状を積分し、したがってそれらを実際の値に近付ける。

上述の方法が顕微鏡による組織試料の検査のために構成された場合であっても、前述したように例えばレントゲン写真、コンピュータ化された軸上トモグラフ（ＣＡＴ），エコグラフ解析等のイメージのような人間または動物の本体またはその部分のイメージに適用できることは明らかである。このような場合には、イメージは直接ビデオカメラによりデジタル化され、コンピュータソフトウエアにより捕捉することができるから、顕微鏡の使用は必要ない。実質上同じ方法の段階がそのようなイメージにも適用でき、相違点は、イメージ捕捉手段6 が顕微鏡の挿入をしないで直接イメージを読取ることができることである。

そのような場合にはぼかされた形状を有する小さい１個または複数個のオブジェクトの識別が必要であり（レントゲン等の場合）、上述したような識別段階は効率のよい識別ができず、そのため異なった方法が使用されなければならない。

オブジェクトの識別の可能な手順はクァドツリー法と呼ばれるイメージ表示方法を使用する。このような既知の方法によれば、イメージは最初に４個のサブ象限に分割され、以下１画素の側面の象限に到達するまで分割が続けられる。イメージ情報は程度４のツリーに報告され、そこで親ノードは全ての子ノード（各親ノードが４個の子ノードを発生する）に共通である情報を含んでおり、それは親ノードが分割される４つの象限に対して参照される。

本発明の方法に適している第１の別の識別手順は、イメージ減算技術であり、それは以下のステップを含んでいる。
１ｈ）検査されるオブジェクトのぼかされたイメージを生成し、
２ｈ）イメージを得るために前記ぼかされたイメージをオブジェクトのイメージから減算し、それにおいて輝度の高いカラー領域は高いコントラストを有するイメージ領域に対応し、暗いカラー領域は低いコントラストを有するイメージ領域に対応し、
３ｈ）処理システム7 の記憶手段中にカラーまたは輝度値が予め定められたしきい値より上である領域のイメージを保存するステップを含んでいる。

ぼかされたイメージを生成する前記ステップ１ｈ）は、
- 予め定められた側面の長さ（好ましくは１画素の側面の象限）を有する象限までクァドツリー法にしたがってイメージを反復的に象限に分割し、
- 各象限に関連するために１組の値を画素の平均値を各分割スケールで各象限に対して計算し、
- カラーマップ（ＲＧＢイメージ）または強度マップ（グレースケールイメージ）を生成し、各ボイントの値は各象限の値のセットの平均を意味しており、前記カラーマップまたは強度マップは元のイメージのぼかされたイメージである。

上述した手順は小さいオブジェクトの検出の場合、或いは背景から前景中のオブジェクトを区別する場合に特に適している。

さらに、ぼかされる程度を変調することにより、異なったディメンションのオブジェクト間の弁別が可能になり、例えば予め定められた大きさより下のオブジェクトだけを選択することにより弁別が可能になる。事実、例えば１０画素の最小の大きさの象限に到達して（最小の１画素の大きさの代わりに）クァドツリー法が停止した場合には、ぼけの程度は高くなり、それはさらにぼけたイメージが得られることを意味している。もしもそのような、さらにぼけたイメージが上記のステップ２ｈによりオブジェクトイメージから減算されたならば、１０画素より大きい全てのオブジェクトは除外されて結果的に得られたイメージはそれより小さいオブジェクトを示す。

本発明の方法の識別段階に適している第２の別の識別手順は、以下のステップによる均一なマップの生成を含んでいる。
１ｌ）予め定められた側面の長さ（好ましくは１画素の側面の長さ）を有する象限までクァドツリー法にしたがって反復的にイメージを象限に分割し、
２ｌ）１組の相対分散（ＲＤ）の値を各象限に関連させるために画素の平均値により割算された標準偏差として得られた相対分散を各分割スケールで各象限に対して計算し、
３ｌ）グレースケールイメージとして均一なマップを生成し、各ポイントの輝度は各象限に対するＲＤの値のセットの平均により与えられ、高い輝度を有するイメージの領域は均一な領域に対応しており、
４ｌ）予め定められたしきい値よりも高い輝度強度を有する均一なマップの画素を選択し、それらの位置を処理システム7 の記憶手段中に保存する。

本発明による生物学的組織試料を解析するための方法および装置の特定の実施形態について説明したが、当業者は本発明の技術的範囲を逸脱することなく、特定の応用に対して必要な変更を適用できることは当然である。

本発明による装置の概略図。 本発明によるイメージを捕捉する方法を示すフロー図。 本発明による捕捉されたイメージを処理する方法を示すフロー図。

Claims (32)

1. 不規則な形状のオブジェクトのイメージを処理する方法において、
   前記オブジェクトのデジタルイメージの捕捉段階と、前記デジタルイメージを１ビットに量子化するイメージエラボレーション（ＩＭＡ−ＥＬ）段階と、前記１ビットの量子化されたイメージを計測処理する段階とを含み、
   前記計測処理する段階は、
   前記オブジェクトのユークリッド周辺長Ｐと面積Ａとの少なくとも一方を決定するためのオブジェクト計測量子化（ＱＵＡＮＴ）段階と、
   前記オブジェクトのフラクタル補正された周辺長Ｐｆおよび面積Ａｆの少なくとも一方を計算するためのディメンション計算段階とを含んでおり、
   前記フラクタル補正された周辺長Ｐｆは前記ユークリッド周辺長Ｐと周辺長のフラクタルディメンションＤ_P から計算され、前記フラクタル補正された面積Ａｆは前記ユークリッド面積Ａと面積のフラクタルディメンションＤ_A から計算されるイメージの処理方法。
2. 前記フラクタル補正された周辺長Ｐｆは、実質上次の式（Ｉ）にしたがって計算され、
   Ｐｆ＝Ｐ．［１＋λ_P （Ｄ_P −１）］ （Ｉ）
   ここで、Ｐはユークリッドの周辺長であり、Ｄ_P は周辺長のフラクタルディメンションであり、膨張係数λ_P はほぼ４．５である請求項１記載の方法。
3. 前記フラクタル補正された面積Ａｆは実質上次の式（Ｉａ）にしたがって計算され、
   Ａｆ＝Ａ＋［λ_A （Ｄ_A −２）］．（Ａ_P −Ａ） （Ｉａ）
   ここで、Ａはユークリッド面積であり、係数λ_A の拡大はほぼ０．１であり、Ａ_P は量子化されるべきオブジェクトを含む領域の面積であり、Ｄ_A は面積のフラクタルディメンションである請求項１または２記載の方法。
4. 前記周辺長のフラクタルディメンションＤ_P および前記面積のフラクタルディメンションＤ_A は、
   ａ）オブジェクトのイメージを側面の長さεを有する複数のボックスのグリッドに分割し、ここでεはボックスの側面に実質上対応する第１の値から変化し、そのボックス中に前記オブジェクトが内接され、前記第１の値の分数である予め定められた値を有しており、
   ｂ）オブジェクトの周辺長Ｐまたは面積Ａを完全にカバーするために必要なボックスの数であり、ステップａ）の各εに対して１／εの対数関数であるＮ（ε）の対数関数の値を計算して、それによりＮ（ε）の対数関数に対する第１の値のセットおよび前記１／εの対数関数に対する第２の値のセットを獲得し、
   ｃ）周辺長Ｐまたは面積Ａに対するＮ（ε）の対数関数に対する第１の値のセットに対するステップｂ）の第２の値のセットを補間した直線の傾斜としてフラクタルディメンションＤ_P またはＤ_A を計算するステップにしたがって決定される請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。
5. 前記イメージエラボレーション（ＩＭＡ−ＥＬ）段階は、
   １ｅ）各画素に対する周辺長を考慮し、
   ２ｅ）前記パラメータに対する予め設定されたしきい値またはしきい値範囲と前記画素のパラメータとを比較し、
   ３ｅ）その比較に基づいて、活性の画素のクラスタと不活性の画素のクラスタとを選択するステップにしたがって行われる請求項１乃至４のいずれか１項記載の方法。
6. 前記画素のパラメータは輝度の強度（黒および白のイメージ）またはデジタルカラー値である請求項５記載の方法。
7. 前記オブジェクト計測量子化（ＱＵＡＮＴ）段階において、オブジェクトの面積Ａは前のイメージエラボレーション（ＩＭＡ−ＥＬ）段階により選択された活性の画素のクラスタに属する画素の数をカウントし、オブジェクトの面積Ａとカウントされた活性の画素の数と相関させることにより計算される請求項１乃至６のいずれか１項記載の方法。
8. 前記オブジェクト計測量子化（ＱＵＡＮＴ）段階において、
   オブジェクトの周辺長Ｐはｉ）オブジェクト形状の画素を選択し、
   ii）そのようにして選択された画素に周辺長計算アルゴリズムを適用することによって計算される請求項１乃至３のいずれか１項記載の方法。
9. 前記周辺長計算アルゴリズムはS.Prashker法にしたがっており、オブジェクトに属する各活性画素に対して“周辺長値”が与えられ、それは検査している画素に隣接している活性画素の位置の関数であり、前記“周辺長値”の合計はオブジェクトの全体的な周辺長Ｐである請求項８記載の方法。
10. さらに、４つの接続された画素から形成されたオブジェクトを識別するためのオブジェクトソート（ＳＯＲＴ）段階を含み、その段階は、
    １ｆ）ｘ，ｙ座標系で予め定められた方向に沿って“１”ビットに量子化されたイメージを走査し、
    ２ｆ）前記走査方向に沿って第１のオブジェクトのイメージに属している第１の活性画素を選択し、
    ３ｆ）前記選択された第１の活性画素について、その方向の線上で前記選択された第１の活性画素の次の位置においてサーチルーチンを行い、
    ４ｆ）不活性の画素が発見されるまでステップ３ｆ）を反復し、
    ５ｆ）ステップ３ｆ）および４ｆ）にしたがって選択された各活性画素に１組のｘ，ｙ値を割当て、それらを処理システムの記憶手段中に保存し、前記画素をオブジェクトイメージ中で活性から不活性に切替え、
    ６ｆ）ステップ３ｆ）、４ｆ）、５ｆ）にしたがって選択された各画素に対して、前記走査方向に直交する方向において２つの次の画素を評価して、活性画素を選択し、
    ７ｆ）ステップ６ｆ）にしたがって選択された各活性画素に対してステップ３ｆ）乃至５ｆ）のルーチンを実行し、
    ８ｆ）同じオブジェクトに属する接続された全ての画素が保存されるまでステップ６ｆ）および７ｆ）を反復し、
    ９ｆ）別のオブジェクトのイメージの第１の活性画素が発見されるまでステップ１ｆ）および２ｆ）を反復し、
    １０ｆ）全体のイメージが走査されるまでステップ３ｆ）乃至９ｆ）を反復するステップを含んでいる請求項１乃至９のいずれか１項記載の方法。
11. 前記ステップ１ｆ）における前記予め定められた方向は左から右へスタートして上から下への方向である請求項１０記載の方法。
12. 前記請求項８のステップ１ｆ）乃至１０ｆ）にしたがってオブジェクトをソートする段階は、８つの接続された画素から形成されたオブジェクトもまた識別し、
    前記ステップ６ｆ）は、
    ６ｆ）ステップ３ｆ）、４ｆ）、５ｆ）にしたがって選択された各画素に対して、前記走査方向に直交する方向においてその方向のラインに隣接する平行なライン上の後者の画素のそれぞれに隣接する２つの次の画素を評価して、活性画素を選択するように変更される請求項１乃至１１のいずれか１項記載の方法。
13. １ｇ）前記オブジェクトのイメージに属する画素の数をカウントし、前記オブジェクトの面積とそれを相関させることによりソート段階にしたがって識別された各オブジェクトの面積を計算し、
    ２ｇ）随意的にオブジェクトの数をカウントし、その密度を計算するステップをさらに含んでいる請求項１乃至１１のいずれか１項記載の方法。
14. オブジェクトのデジタルイメージを捕捉する段階は、
    - ）デカルト座標軸ｘ，ｙ，ｚに沿って移動することのできるモータで動作する走査ステージを有する顕微鏡と、前記顕微鏡に接続されて動作する電子イメージ捕捉手段とを含み、前記モータで動作する走査ステージと前記電子イメージ捕捉手段は処理システムに接続されて動作し、その処理システムは処理装置（ＣＰＵ）と、ＲＡＭ動作メモリを含む記憶手段と、ハードディスクとを含んでいるシステムを提供する段階と、
    - ）オブジェクトのイメージのデカルトパラメータを保存するためのオブジェクトの識別（ＩＤ）段階と、
    - ）前記識別されたオブジェクトイメージ捕捉（ＩＭＡ−ＡＣＱ）段階とを備えている請求項１乃至１３のいずれか１項記載の方法。
15. 前記オブジェクトの識別（ＩＤ）段階は、
    １ａ）前記顕微鏡の予め設定された拡大率でイメージ上に重なるように複数のボックスにより形成されたグリッドを生成し、
    ２ａ）モータで動作される走査ステージに命令を送って、顕微鏡の対物レンズの位置をイメージが捕捉されるべきグリッドの第１のボックスと整列するための対応するｘ，ｙ軸上の第１の位置（スタート位置）に位置させ、電子イメージ捕捉手段に命令を送ってこの第１のボックスに対するデジタルイメージを捕捉させ、そのイメージは一時的に動作メモリ（ＲＡＭ）中に保存され、
    ３ａ）第１のボックス中の単一の画素の輝度を評価し、それを予め定められた値と比較し、ボックスの内部の輝度コントラストを決定し、
    ４ａ）モータで動作される走査ステージに命令を送ってグリッドの第２のボックスに対応するｘ，ｙ軸上の次の位置（第２の位置）に位置させ、電子イメージ捕捉手段に命令を送ってこの第２のボックスに対するデジタルイメージを捕捉して一時的に動作メモリ（ＲＡＭ）中に保存し、そのようなイメージに対してステップ３）を反復し、
    ５ａ）全部のスライドが走査されてグリッドの各ボックスに対するイメージが処理されるまで、ステップ４）のルーチンを反復し、全ルーチンの実行中、予め定められた値よりも高い輝度コントラストを有するグリッドのボックスのｘ，ｙ位置がハードディスクメモリ中に保存され、
    前記顕微鏡の前記拡大率は好ましくは２００倍である請求項１４記載の方法。
16. 前記動作メモリ中に一時的に保存されたグリッドのボックスのイメージの処理の前記ステップ３ａ）は、
    ｉ）解析されたボックスの画素の輝度強度のヒストグラムを構築し、
    ii）そのヒストグラムの平均値からの標準偏差を計算し、
    iii)その計算された標準偏差の値を予め定められた値と比較する方法にしたがって実行され、予め定められた値よりも上の標準偏差を有するボックスの位置はハードディスクに保存される請求項１５記載の方法。
17. 前記ＩＤ段階は識別子プレビュー（ＩＤ−ＰＲＥＶ）段階により置換または先行され、それは請求項１３に記載されているステップ１ａ）乃至５ａ）を含み、前記顕微鏡の予め設定された拡大率は２５倍乃至１００倍の範囲で選択される請求項１乃至１６のいずれか１項記載の方法。
18. １ｂ） 捕捉されるべきオブジェクトイメージ上の複数の焦点位置を選択し、
    ２ｂ）走査ステージに命令を送って顕微鏡ｋ対物レンズの下に第１の焦点位置を位置させ、
    ３ｂ）手動で第１の焦点位置に焦点を結ばせ、その焦点パラメータを処理システムの記憶手段中に保存し、
    ４ｂ）各焦点位置に対してステップ２ｂ）および３ｂ）のルーチンを反復する焦点設定段階をさらに含んでいる請求項１４乃至１７のいずれか１項記載の方法。
19. 前記選択された焦点位置はオブジェクトの表面上に互いに等間隔で、或いは均一に分布されている請求項１８記載の方法。
20. ９個の焦点位置が選択され、検査下のオブジェクト中に内接された最大の平行六面体の４つのコーナーと、その中心および前記平行六面体の中間点に位置されている請求項１９記載の方法。
21. さらに、白色較正（ＷＣＡＬ）の段階を含み、それは１ｃ）試料のない領域のイメージ（ブランクイメージ）を電子イメージ捕捉手段により捕捉し、それを処理システムの記憶手段に保存する請求項１４乃至２０のいずれか１項記載の方法。
22. 前記イメージ捕捉（ＩＭ−ＡＣＱ）段階は、
    １ｄ）請求項１３にしたがって前のステップ５ａ）にしたがって、顕微鏡の対物レンズと整列した選択されたグリッドの第１の保存されたボックス位置にそれを移動するように走査ステージに命令を送り、
    ２ｄ）前記第１のボックスに近接した２以上の焦点位置に対して前のステップ１ｂ）乃至４ｂ）にしたがって計算された焦点パラメータから補間することにより前記第１のボックスに対する焦点パラメータを計算し、
    ３ｄ）前記イメージ捕捉手段により前記第１のボックスのイメージを捕捉し、
    ４ｄ）前記第１のボックスの捕捉されたイメージから上記ステップ１ｃ）にしたがって捕捉されたブランクイメージを減算し、
    ５ｄ）処理システムの記憶手段中にステップ４ｄから生成されるイメージを保存し、
    ６ｄ）捕捉されるべき全体のオブジェクトが走査されるまでステップ１ｄ）乃至５ｄ）を反復し、
    ７ｄ）それらの最初の位置に関して単一のボックスのイメージを整列させ、処理システムの記憶手段中に前記全イメージを保存することによりオブジェクトの全イメージを再構成するステップを含んでいる請求項１８乃至２１のいずれか１項記載の方法。
23. 前記オブジェクトの全イメージを再構成するステップ７ｄ）は、
    ｌ）整列方向にイメージの側面のエッジを重ねることにより隣接するボックスのイメージと各ボックスのイメージとを整列させ、
    ｍ）重なった領域において、ボックスのイメージを互いに関してシフトすることにより重なった画素間の輝度とカラー強度の少なくとも一方の差を最小にし、
    ｎ）隣接するボックスの各対に対してステップｌ）およびｍ）を反復するステップを含んでいる請求項２２項記載の方法。
24. 前記ＩＤ段階は、
    １ｈ）検査されるオブジェクトのぼけたイメージを生成し、
    ２ｈ）イメージを得るために前記ぼけたイメージをオブジェクトのイメージから減算し、それにおいて輝度の高いカラー領域は高いコントラストを有するイメージ領域に対応し、暗いカラーの領域は低いコントラストを有するイメージ領域に対応し、
    ３ｈ）処理システムの記憶手段中にカラーまたは輝度値が予め定められたしきい値より上である領域のイメージを保存するように動作する請求項１４乃至２３のいずれか１項記載の方法。
25. 前記ぼけたイメージを生成するステップ１ｈ）は、
    - ）予め定められた側面の長さを有する象限までクァドツリー法にしたがって反復的にイメージを象限に分割し、
    - ）１組の値を各象限に関連させるために画素の平均値を分割スケールで各象限に対して計算し、
    - ）カラーマップ（ＲＧＢイメージ）または強度マップ（グレースケールイメージ）を生成し、
    各ボイントの値は各象限の値のセットの平均であり、前記カラーマップまたは強度マップは元のイメージのぼかされたイメージである請求項２４項記載の方法。
26. 前記ＩＤ段階は、
    １ｌ）予め定められた側面の長さを有する象限までクァドツリー法にしたがって反復的にイメージを象限に分割し、
    ２ｌ）１組の相対分散（ＲＤ）の値を各象限に関連させるために画素の平均値により割算された標準偏差として得られた相対分散を各分割スケールで各象限に対して計算し、
    ３ｌ）グレースケールイメージとして均一なマップを生成し、各焦点位置の輝度は各象限に対するＲＤの値のセットの平均により与えられ、高い輝度を有するイメージの領域は均一な領域に対応しており、
    ４ｌ）予め定められたしきい値よりも高い輝度強度を有する均一なマップの画素を選択し、それらの位置を処理システムの記憶手段中に保存する請求項１４乃至２３のいずれか１項記載の方法。
27. 前記システムは、デカルト座標軸ｘ，ｙ，ｚに沿って移動することのできるモータで動作する走査ステージと、前記モータで動作する走査ステージ顕微鏡と整列して動作する電子イメージ捕捉手段とを含み、
    前記モータで動作する走査ステージと前記電子イメージ捕捉手段は処理システムに接続されて動作し、前記処理システムは処理装置（ＣＰＵ）と、ＲＡＭ動作メモリを含む記憶手段と、ハードディスクとを含んでいる請求項１４乃至２３のいずれか１項記載の方法。
28. 請求項１４乃至２７のいずれか１項記載の段階を含んでいるオブジェクトのデジタルイメージを捕捉する方法。
29. イメージを捕捉して処理するシステムにおいて、
    デカルト座標軸ｘ，ｙ，ｚに沿って移動することのできるモータで動作する走査ステージを有する顕微鏡と、前記顕微鏡に接続されて動作する電子イメージ捕捉手段とを含み、前記モータで動作する走査ステージと前記電子イメージ捕捉手段は処理システムに接続されて動作し、その処理システムは処理装置（ＣＰＵ）と、ＲＡＭ動作メモリを含む記憶手段と、ハードディスクとを含んでおり、前記処理システムは請求項１乃至２８のいずれか１項記載の方法を実行するようにプログラムを動作させるシステム。
30. イメージを捕捉して処理するシステムにおいて、
    デカルト座標軸ｘ，ｙ，ｚに沿って移動することのできるモータで動作する走査ステージと、前記モータで動作する走査ステージと整列されて動作する電子イメージ捕捉手段とを含み、前記モータで動作する走査ステージと前記電子イメージ捕捉手段は処理システムに接続されて動作し、その処理システムは処理装置（ＣＰＵ）と、ＲＡＭ動作メモリを含む記憶手段と、ハードディスクとを含んでおり、前記処理システムは請求項１乃至２８のいずれか１項記載の方法を実行するようにプログラムを動作させるシステム。
31. 請求項１乃至２８のいずれか１項記載の方法を実行させるソフトウエアプログラム。
32. 請求項１乃至２８のいずれか１項記載の方法を実行するプログラムを含んでいるコンピュータ読取り可能な記憶媒体。

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