JP4810871B2 - 微生物検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、エマルジョン粒子を含みうる検体において、例えば生乳や牛乳中の微生物検査を行うための微生物検出方法および微生物計量装置に関する。
従来この種の微生物検査方法は、スライドガラスに生乳を定量滴下し、１ｃｍ2に塗布し、メチレンブルーを主成分とした染色試薬で微生物を染色するブリード法が用いられている。ブリード法での検査は迅速であるが、顕微鏡を長時間使用するため観察担当者への負担が大きく、微生物以外の成分識別にも熟練した技能が必要である。
また、検体が微量であるため再現性が低くバラツキも大きい。さらに検出感度においては、顕微鏡倍率の限界により、微生物数が１０6個／ｍｌ以下の生乳を計測する場合には精度に課題がある。従って微生物数が１０4個／ｍｌ以下の生乳の場合は染色する前に少なくとも１００倍以上の濃縮が必要である。
あるいは、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｍ Ｃｏｕｓｉｎｓ（非特許文献１参照）らは、遠心分離機と非イオン性界面活性剤（Ｔｒｉｔｔｏｎ Ｘ−１００）と酵素（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）を利用し、カゼインや脂肪を分離、分解することで生乳を０．６μｍのメンブレンフィルタでろ過できるようにし、フィルタ上に捕集した微生物を蛍光染色することで生乳中の微生物を検知することを可能にした。
また、この種の生乳から微生物検査方法は生乳にトリトンとトリプシンを混合し、０．６μｍの孔を有する膜でろ過しているものもある（例えば、特許文献１参照）。
特表平９―５１２７１３号公報
Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｍ Ｃｏｕｓｉｎｓら著「Ｄａｉｒｙ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ」出版、１９７９年４月、２７−３１頁
このような従来の微生物検査法であるブリード法は、顕微鏡を長時間使用するため観察担当者の肉眼への負担が大きく、微生物以外の成分識別には熟練した技能が必要という課題があり、迅速・高精度・簡単に微生物数を計量することが要求されている。
また、検体が微量であるため同一の検体から採取しても、安定した検査結果が得られずバラツキも大きい。
さらに検出感度においては、顕微鏡倍率の限界により、微生物数が１０6個／ｍｌ以下の生乳を計測する場合には精度に課題がある。従って微生物数が１０4個／ｍｌ以下の生乳の場合は染色する前に少なくとも１００倍以上の濃縮が必要という課題があり、安定した検査結果が得られ、１０4個／ｍｌまで微生物を計量することが要求されている。
また、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｍ Ｃｏｕｓｉｎｓ（非特許文献１参照）らの検出方法は、遠心分離機を使用して上澄みだけを採取しているため菌の回収率に課題があり、回収率が安定しない場合は成分の分解が不十分になるという課題があり、高い微生物の回収性能を持ち安定した成分分解を可能にすることが要求されている。
また、成分処理時間においても検体処理で約１時間程度必要という課題があり、処理時間を迅速化することが要求されている。
また、界面活性剤の影響により暗色フィルタの脱色や劣化などで顕微鏡観察時に影響を与えるという課題があり、脱色や劣化しないフィルタにすることが要求されている。
また、乳成分を分離、分解し０．６μｍでろ過できるようにしているが、乳成分に含まれる微生物には、０．６μｍ以下の微生物も存在するため、メンブレンフィルタ捕集時に微生物が通過してしまうという課題があり、微生物の捕集性がより高い孔径のフィルタにすることが要求されている。
また、乳成分の分離、分解後の成分が０．６μｍ以下であるため、微生物より大きな成分が残留しており、十分な処理がされていないという課題があり、微生物がフィルタで捕集でき、且つ乳成分がフィルタを通過し残留しないようにすることが要求されている。
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、乳製品中の乳成分およびエマルジョン粒子を前処理にて微粒子にすることで、熟練した技能を必要とせず微生物を迅速・高精度・簡単に計量することができ、測定に影響を与えないフィルタを用い、安定した再現性のある計量をすることのできる微生物検出方法および微生物計量装置を提供することを目的としている。
また、生乳中の連鎖菌や体細胞といった微生物および細胞を評価し、乳製品材料としての生乳の品質や乳牛の健康を管理することが要望されている。
本発明は、このような従来課題を解決するものであり、乳牛の体調まで計測をすることのできる微生物検出方法および微生物計量装置を提供することを目的としている。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、エマルジョン粒子と微生物を含みうる生乳または乳製品中の微生物検査を行うための微生物検出方法において、前記生乳または乳製品にアミド系非イオン性界面活性剤のアミゾールを添加する工程と、この工程後にタンパク分解酵素を添加する工程を含み、前記エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも微粒子化して微生物をろ過抽出することにより微生物を検出するようにしたことを特徴とする微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、エマルジョン粒子を微粒子化した後に凝集を防止する微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、凝集を防止するためにキレート剤を添加する微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、キレート剤として微生物に影響を与えないヘキタメタリン酸水溶液を添加することを特徴とする微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、ヘキタメタリン酸の濃度をエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体に対して０．０１〜１０％を添加する微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、アミド系非イオン性界面活性剤の溶媒として分散性を高める有機系の溶剤を用いたとする微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、０．２μｍ以下の微粒子にするためにエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体の粘度を低下させる温度を与えることを特徴とする微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、アミド系非イオン性界面活性剤とタンパク分解酵素を添加後に、分解を促進する加温手段を用いることを特徴とする微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、前記加温手段の温度を４０〜７０℃にすることを特徴とする微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、アミド系非イオン性界面活性剤とタンパク分解酵素に１種類あるいは複数種類の粘性を下げるイオン系界面活性剤を添加する微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するためにアミド系非イオン性界面活性剤とイオン系界面活性剤の溶媒として水分を低減した脂肪酸エステル類の溶媒としたことを特徴とする微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために、微生物をろ過抽出するため微生物採取用フィルタを備え、フィルタ表面上で微生物の性質が変化しないように、ｐＨを調整する手段を備える微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために微生物をろ過抽出するため微生物採取用フィルタを備え、前記フィルタが表面形状の変形しないフィルタである微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために微生物採取用フィルタが色落ちしないフィルタである微生物検出方法としたものである。
本発明の乳製品中の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために微生物採取フィルタ上に顔料を担持した微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために微生物採取用フィルタが暗色のフィルタである微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために微生物採取フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成された微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために微生物採取フィルタに上に捕捉した微生物を染色法で検知あるいはカウントする微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物検出方法は上記目的を達成するために前記染色法が蛍光染色法である微生物検出方法としたものである。
本発明の微生物迅速検出方法は上記目的を達成するために前記染色法が生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞のみと反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来物質のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を用いた微生物検出方法としたものである。
本発明によれば、エマルジョン粒子を含む検体において、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも微粒子化することで、微生物をフィルタ上で捕集することでき、エマルジョン粒子が微粒子化されているためフィルタろ過が可能になる。また、エマルジョン粒子を０．２μｍ以下の微粒子にすることで精度および感度が向上した微生物検出および微生物計量装置を提供できる。
また、エマルジョン粒子が０．２μｍ以下になるため、微生物との区別が容易になり、顕微鏡を長時間使用する作業が減らせ観察担当者の肉眼への負担を軽減することができ、安定した結果を得ることができる。
また、染色法あるいは蛍光染色法で微生物を検出することで、熟練した技能は必要なくなり、誰でも迅速に高精度で簡単に微生物の検出および計量ができる。
また、ろ過が簡単にできるため、多量の検体をろ過が可能になり、単位量あたりの微生物の測定感度が向上し、且つ、同一の検体から採取しても、バラツキが小さく安定した微生物の検出および計量ができる。
また、遠心分離する方法とは異なり、検体を全量ろ過するため、検体からの微生物の回収率が非常に高い微生物の検出および計量ができる。
また、エマルジョン粒子を短時間で微粒子化できるため、より迅速に微生物の検出および計量ができる。
また、検体に界面活性剤を添加してもフィルタ形状を変形や脱色しないフィルタであるため、染色法あるいは蛍光染色法での測定であっても、微生物の検出および計量に影響を与えず精度良く微生物検出および計量ができる。
また、生乳の検査サンプルにより乳牛の健康を評価できる微生物検出および計量ができる。
本発明の請求項１記載の発明は、エマルジョン粒子と微生物を含みうる生乳または乳製品中の微生物検査を行うための微生物検出方法において、前記生乳または乳製品にアミド系非イオン性界面活性剤のアミゾールを添加する工程と、この工程後にタンパク分解酵素を添加する工程を含み、前記エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも微粒子化して微生物をろ過抽出することにより、乳製品中の微粒子化したエマルジョンを濾液中に濾出し、排出し、乳製品中に含まれる微生物をフィルタ上で捕集し、微生物を検出することを特徴とする微生物検出方法としたものであり、効率良く簡単な構成で微生物を検出するという作用を有する。エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも小さく微粒子化するということは、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも大きい微粒子を分離、溶解し、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも小さく微粒子化することをいい、微粒子の周囲を溶かして微粒子を小さくしたり、凝集した微粒子を分散させ微粒子の固まりを小さくしたり、再凝集によるエマルジョン粒子が微生物の大きさよりも大きくなるのを防止する等、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも小さくすれば良く、液化でも良い。また、ろ過することで、検体量中の微生物の個数を計測することができるという作用を有する。また、夾雑物を除去し精度良く検体量中の微生物の個数を計測することができるという作用を有する。また、生乳中の微生物以外の成分を微粒子化させるという作用を有する。また、微生物以外のタンパク質を分解し、更に微生物のみを選別することができるという作用を有する。
また、エマルジョン粒子を微粒子化した後に凝集を防止する微生物検出方法としたものであり、微粒子化した測定検体を長時間放置しても計測することができるという作用を有する。
また、凝集を防止するためにキレート剤を添加する微生物検出方法としたものであり、
微粒子化した測定検体に性状を変化させず、長時間放置しても計測することができるという作用を有する。
微粒子化した測定検体に性状を変化させず、長時間放置しても計測することができるという作用を有する。
また、キレート剤として微生物に影響を与えないヘキタメタリン酸水溶液を添加することを特徴とする微生物検出方法としたものであり、微粒子化した測定検体に性状を変化させず、さらに検体中のカルシウムを特定してキレート化することで検体に含まれる微生物の形状の変化も抑え、長時間放置しても計測するという作用を有する。
また、ヘキタメタリン酸の濃度をエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体に対して０．０１〜１０％を添加する微生物検出方法としたものであり、生乳中のカルシウムを特定してキレート化することで生乳検体に含まれる微生物の形状の変化も抑え、長時間放置しても計測するという作用を有する。
また、アミド系非イオン性界面活性剤の溶媒として分散性を高める有機系の溶剤を用いた微生物検出方法としたものであり、検体との反応性を高め、微粒子化する時間を短縮できるという作用を有する。
また、０．２μｍ以下の微粒子にするために エマルジョン粒子と微生物を含みうる検体の粘度を低下させる温度を与えることを特徴とする微生物検出方法としたものであり、検体との反応性を更に高め、短時間で処理できるという作用を有する。
また、アミド系非イオン性界面活性剤とタンパク分解酵素を添加後に、分解を促進する加温手段を用いることを特徴とする微生物検出方法としたものであり、検体との反応性を高め、微粒子化は勿論、微生物以外のタンパク質の分解を促進し、短時間で計測状態にするという作用を有する。
また、加温手段の温度を４０〜７０℃にすることを特徴とする微生物検出方法としたものであり、酵素反応を高め、タンパク質の分解および溶解を促進し、計測検体の粘度を低下させ、ハンドリングを含め、検体の取扱いを容易にするという作用を有する。
また、界面活性剤と１種類あるいは複数種類の粘性を下げるイオン系界面活性剤を
添加した微生物検出方法であり、前記検体の粘性を下げるという作用を有する。
添加した微生物検出方法であり、前記検体の粘性を下げるという作用を有する。
また、アミド系非イオン性界面活性剤とイオン系界面活性剤の溶媒として水分を低減した脂肪酸エステル類の溶媒としたことを特徴とする微生物検出方法としたものであり、検体中の水分との反応を低下させ、様々な検体に対応することができるという作用を有する。
また、微生物をろ過抽出するため微生物採取用フィルタを備え、フィルタ表面上で微生物の性質が変化しないように、ｐＨを調整する手段を備える微生物検出方法としたものであり、検出時の染色性を高め、感度良く微生物を検出することができるという作用を有する。
また、微生物をろ過抽出するため微生物採取用フィルタを備え、前記フィルタが表面形状の変形しないフィルタである微生物検出方法としたものであり、フィルタ表面の平面性を高め、微生物の検出位置を明確にし、検出・計測時の装置構成を簡略にすることができるという作用を有する。
また、微生物採取用フィルタが、色落ちしない暗色のフィルタとした微生物検出方法であり、蛍光検出時バックグランドの輝度を抑え、感度を高くするという作用を有する。
また、微生物採取用フィルタ上に、金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成されたものである微生物検出方法であり、微
生物検出時に励起光を照射した際の光の反射を防止することができ、微生物の検出および計量を妨害することなく、正確に微生物の検出および計量するという作用を有する。
生物検出時に励起光を照射した際の光の反射を防止することができ、微生物の検出および計量を妨害することなく、正確に微生物の検出および計量するという作用を有する。
また、微生物採取用フィルタ上に捕捉した、微生物を染色法あるいは蛍光染色法で検知あるいはカウントする微生物検出方法であり、発光した微生物を光学的に計量するという作用を有する。
また、染色法が生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞のみと反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来物質のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を検体に接触させ、その波長差および発色量から生細胞と死細胞の両方またはいずれか一方を検出するという作用を有する。
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
例えば牛乳、生乳などの乳製品やまた、それを原料に含むミルクコーヒーや各種食品があるが、乳製品に含まれるエマルジョン粒子などの成分がフィルタでのろ過を行う場合にフィルタ細孔をふさぎろ過を阻害している。また、タンパク質などはそれ自体が蛍光物質となり、顕微鏡で観察する場合も、微生物との区別が難しく、また微生物を観察する上でも妨害をする。通常、微生物をメンブレンフィルタ法で測定するためには、０．２〜０．４μｍのフィルタでろ過を行い、フィルタ上に捕集された微生物を顕微鏡で観察、あるいは、そのフィルタを培地上に載せて培養する。また、食品分野においては、目的とする微生物を捕集でき、且つ、ろ過に影響が少ない０．４μｍの孔径を持つフィルタを用いられることが多い。つまり、乳製品をろ過するためには、乳製品に含まれるエマルジョン粒子を細分化し０．４μｍ以下の微細な粒子あるいは、完全に溶かし（イオン状）微生物をろ過抽出することが必要になってくる。
例えば牛乳、生乳などの乳製品やまた、それを原料に含むミルクコーヒーや各種食品があるが、乳製品に含まれるエマルジョン粒子などの成分がフィルタでのろ過を行う場合にフィルタ細孔をふさぎろ過を阻害している。また、タンパク質などはそれ自体が蛍光物質となり、顕微鏡で観察する場合も、微生物との区別が難しく、また微生物を観察する上でも妨害をする。通常、微生物をメンブレンフィルタ法で測定するためには、０．２〜０．４μｍのフィルタでろ過を行い、フィルタ上に捕集された微生物を顕微鏡で観察、あるいは、そのフィルタを培地上に載せて培養する。また、食品分野においては、目的とする微生物を捕集でき、且つ、ろ過に影響が少ない０．４μｍの孔径を持つフィルタを用いられることが多い。つまり、乳製品をろ過するためには、乳製品に含まれるエマルジョン粒子を細分化し０．４μｍ以下の微細な粒子あるいは、完全に溶かし（イオン状）微生物をろ過抽出することが必要になってくる。
０．４μｍのフィルタでろ過を行う場合、生乳の成分、エマルジョン状の粒子を０．４μｍ以下にする必要があり、少なくとも０．２μｍ以下で、好ましくは０．１μｍ以下にする必要がある。もちろん、実際には粒子が一様に０．２μｍになるわけでなく、ある正規分布を持って細かくなるため、少なくとも粒子の中心値が、０．２μｍ程度になることが望ましい。最大の粒径が０．２μｍ以下になれば、ほとんどのフィルタに対応できるため、中心値が０．１μｍ程度であれば、より望ましい。
また、フィルタの種類はＰＰ（Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ＰＶＣ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ） ＰＣ（Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＴＦＥ（Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ＭＣＥ（Ｍｉｘｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｓｔｅｒｓ）、ＰＥＳ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＮＹＬ（Ｎｙｌｏｎ）などがあり、これらのフィルタによっては、必ず０．４μｍ以下にしなければろ過ができないという訳でもなく、例えばＭＣＥなどは細孔に柔軟性があるため、ろ過性能を良くするためにある種の界面活性剤だけを予めフィルタに滴下してろ過を行い、その後で加温（５０℃）した生乳をろ過することで、ろ過が可能になる。しかし、この方法の場合ＭＣＥの表面は凹凸していたり、細孔に微生物が埋まっていたりするため顕微鏡で観察する場合に正確さに欠ける。
例えばＰＣの材質のように表面がフラット（±２μｍ以下、好ましくは±１μ以下）で、しかも、放射線を用いて穴をあけており、非常に均一な細孔があいているために、微生物がフィルタ上の表面に埋まることなく捕集されるため、通常用いられている。このようなフィルタは、細孔の柔軟性も悪く、かつ開口率も低いために、細孔以上の粒径の粒子があると、ろ過が困難である。但し、微生物以外の物質や成分を細孔以下の粒径の粒子にすればろ過が可能になり、表面の凹凸も少なく細孔に微生物が埋まることが無い為、その後の顕微鏡観察や特に自動化して機械的に測定する場合においても望ましい。
また、乳製品の成分には、染色試薬や蛍光染色試薬と反応しやすい成分も含まれており、顕微鏡などで観察する場合、非常に難しく、熟練を要する。これらの成分も０．２μｍ以下にすることで、微生物との区別が可能になる。一般的な大腸菌や黄色ブドウ球菌などは０．５μｍ程度の大きさであるため、乳製品の成分、エマルジョン粒子を０．２μｍ以下にすることで、それらの粒子が染色されても大きさで区別が可能になる。０．１μｍにすれば更に簡単に区別することが可能になる。但し、０．１μｍ以下にしても、それらの成分がフィルタ上に覆ってしまうとフィルタ全体が染色されたようになり、染色された微生物を探すのが難しい場合もあり、より正確に測定するためには、それらの成分を分解することが望ましい。
また、０．４μｍのフィルタを使用することで大腸菌や黄色ブドウ球菌が採取されることを顕微鏡観察にて確認した。その他セルチア菌のような小さな菌が存在する場合においては孔径０．２μｍのフィルタを用いることで捕集が可能となる。
そこで、エマルジョン粒子を微粒子化するために各種界面活性剤を生乳と混合しＰＣフィルタの孔径０．４μｍを用いて、ろ過性能および微粒子化の確認と各種界面活性剤に関して、計測を妨害するような成分が残存するかを確認した。その確認した結果を図１に示す。Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００においては、反応処理後の液が有色透明な液になる場合と、ならない場合があることから安定した処理が行えない、また十分な反応が得られない場合においては、ろ過も困難になり処理液についても白濁した液となり大きな粒子が存在していると推測される。ＭＥＧＡ８、リポラン、ＲＤＡ、ＳＤＳ、においては、反応処理後の液が白濁し、ろ過も困難な状態であり成分の残留影響が大きく、計測に大きく影響してしまうことを確認した。アミド系非イオン界面活性剤においては安定して、ろ過が可能で、反応処理後の液も安定して透明な液に処理され、かつ計測を阻害するような物質がなくなることを確認し、乳製品中の成分を微粒子化するための界面活性剤として有効であることを見出した。通常、生乳は白濁しているが、アミド系非イオン性界面活性剤と混合すると目視では透明になった。一般的にエマルジョン粒子が混在している場合、その粒子が小さくなるほど透明になる。粒子の量によっても変わるが、少なくとも０．２μｍ以下になっていると判断され、目視ではかなり透明になっているために、０．１μｍ程度まで微粒子されていると思われる。乳製品に含まれる成分は、エマルジョンになっていることが多く、本発明では、エマルジョン粒子を破壊したり、小さくする方法として界面活性剤を用いたが、ホモジナイズ、超音波などの物理的手段やｐＨ変化などをさせる各種化学的な手法であっても、微生物を溶かしたり溶菌しない方法であれば良い。溶菌すると核酸が細胞膜や細胞壁より溶出し、検出することはできないことが有るためである。もちろん、微生物を損傷させない、影響を与えない方法が最良の方法であれば、染色あるいは蛍光染色する方法は、微生物の生死を判別する染め分けができるため、微生物の形を保持でき微生物表面を溶かしたり、溶菌しない方法であれば、測定することが可能である。
また、アミド系非イオン界面活性剤は計測を妨害する成分はなく、且つ、微生物表面が溶けたり、溶菌しないことも確認できた。これは、エマルジョン粒子の粒径が０．２μｍ以下になっており、顕微鏡下の目視で確認しても微生物とそれ以外の粒子と区別がつきやすいためである。
また、アミド系イオン界面活性剤と反応した後に放置していると生乳成分内の脂肪酸がカルシウムと再結合し、カルシウムを核として再凝集し、半透明に変化する場合があり、アミド系イオン界面活性剤と生乳が反応させると共にもしくは反応前後にカルシウムをキレートするキレート剤を添加することで、反応後も透明を維持することができる。キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸系（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリウム塩（ＧＬＤＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、アミノエチルエチレングルコール（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡヘキサメタリン酸等があり、生乳内の微生物に影響を与えない濃度として生乳液量の０．０１〜１０％程度の濃度を使用すると良い。
但し、生乳とキレート剤を反応した後にアミド系イオン界面活性剤と反応させても、生乳中のたんぱく質が多い場合は、たんぱく質が残存し、計測するための微生物採取フィルタ上を覆う場合があり、蛍光染色を行うとタンパク質に蛍光試薬が残存し薄くではあるが発光する。微生物採取フィルタ上を覆う場合には、さらに酵素などでタンパク質を分解する手段を用いる場合もある。分解することでより精度良く測定することが可能である。
タンパク分解酵素としては、プロテナーゼ、ペプチターゼ、トリプシノーゲン 、キモトリプシノーゲン等があり、活性点は異なるが、温度を与えタンパク質を分解することができる。
タンパク分解酵素としては、プロテナーゼ、ペプチターゼ、トリプシノーゲン 、キモトリプシノーゲン等があり、活性点は異なるが、温度を与えタンパク質を分解することができる。
また、生乳にＴｒｉｔｔｏｎ Ｘ−１００やその他の界面活性剤を使用した場合は、顕微鏡で形状判断すると微生物以外と思われる発光物が多数見られ、微生物との区別がつきにくく正確に微生物を検出計量することが難しいこともある。
また、アミド系非イオン性界面活性剤の種類によっては、粘度が高いために乳製品の成分を微粒子にしてもろ過に時間がかかることがある。水では粘度が小さくならず、かえって白濁してろ過を困難にすることがある。その場合は、イオン系界面活性剤を更に加えることで粘性が低下してろ過性能が向上する。イオン系界面活性剤としては、５つに系別され、１）脂肪酸系（陰イオン）として、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、２）直鎖アルキルベンゼン系として、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、３）高級アルコール系（陰イオン）として、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、４）アルファオレフィン
系として、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、５）ノルマルパラフィン系として
アルキルスルホン酸ナトリウムなどが挙げられるが、アミド系非イオン性界面活性剤と化学反応などを起こさず、微生物を溶かしたり溶菌しない試薬であれば良い。
系として、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム、５）ノルマルパラフィン系として
アルキルスルホン酸ナトリウムなどが挙げられるが、アミド系非イオン性界面活性剤と化学反応などを起こさず、微生物を溶かしたり溶菌しない試薬であれば良い。
また、生乳内の水分の量により、アミド系非界面活性剤とイオン系界面活性剤の水溶液を混合すると再凝集を促進し白濁する場合があり、アミド系非界面活性剤とイオン系界面活性剤の水溶液量を低下させる必要がある。水溶液の代わりに脂肪酸エステルのグリセリンやプロピレングルコール等を用いることで、水分影響を低減し、再凝集を防止し白濁を防止することができる。
ろ過した後、染色あるいは蛍光染色した微生物を顕微鏡で観察、自動化した装置で測定する場合、色落ちしない暗色のフィルタを用いることで、精度良く測定することが可能である。暗色とは、黒色あるいはそれに近い色であるが、顕微鏡で観察するときに白色光あるいは紫外光など試薬の特性に応じた特定の波長の光を照射した際に照射した光を吸収しない色であることを示している。上記に示したフィルタの材質は、白または白に近いものが多く、特に紫外線を照射したときに反射あるいは自家蛍光して測定が困難になることがある。フィルタは、水に濡れることで、反射は起こしにくくなるが、水に濡れた状態で反射が防止できていることが、フィルタの色としては重要である。通常フィルタの材料は、暗色であることが少ないため、黒または黒に近い灰色で着色が必要で、その方法としては、色落ちがしにくい顔料や墨汁などが望ましい。
エマルジョン粒子を微粒子化する際に界面活性剤を用いると、界面活性剤の影響で色が落ちやすくなり、結果、フィルタの材料部分が露出して測定できなくなる。金、銅、クロム、白金、パラジウムなどから選ばれた金属の薄膜をフィルタ表面に蒸着などで被覆することで、反射を防止することができる。特に金は紫外線の反射率が低い。つまり、暗色とは、黒に近い色を示すとともに光の反射が少ないことを示す。また、界面活性剤のように溶かすような溶剤を用いても、上記金属が溶けてフィルタの材料が露出することもなく、従って、計測を妨害することがない。
微生物を染色する方法としては、細胞若しくは微生物が付着した検体に第1の試薬である４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の試薬であるプロピュームイオダイドと第３の試薬である６−カルボキシフルオレセインジアセテートと第４の試薬である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドをそれぞれ混合した試薬を接触させる。生死細胞の核酸と結合した４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長を発し生死細胞の発色させる。また死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時、励起波長の光量を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に変え死細胞のみを発色させる。
また、他の蛍光試薬として生死細胞用蛍光発光試薬では、例えばＹＴＯ１１〜ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２０〜ＳＹＴＯ２５、ＳＹＴＯ４０〜ＳＹＴＯ４５、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ５９〜ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８０〜ＳＹＴＯ８５、ＤＡＰＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＹＴＯ９とがある。また、死細胞細胞用蛍光発光試薬では例えばＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ３、ＳＹＴＯＸＢｌｕｅ、ＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅとがある。蛍光試薬によって、それぞれ励起光の波長を設定することで、試薬と反応した生死細胞、死細胞を蛍光発光することができる。
また、生菌だけが有しているエステラーゼと反応するものや呼吸活性を検知できる試薬を用いて生菌だけを染色するもの、細胞膜を透過しないために細胞膜が損傷を受けて死んだ場合に、そこから透過してＤＮＡなどの核酸と結合して染色することで死菌だけを染色するもの、同様にＤＮＡなどの核酸と結合するもので、細胞膜を透過する性質であるため、生菌と死菌の両方を染色するもの、特定の微生物だけが代謝する特定微生物由来物質と反応することや特定の微生物とのみ反応する蛍光ラベルを有した抗体やマイクロファージで特定の微生物のみを染色するものなどがある。
乳製品などの微生物検査を行う場合、サンプル量は多いほど良い。従来のブリード法では、０．０１ｍｌが最大であるため、ろ過ができることでサンプル量を０．１ｍｌあるいは１ｍｌ以上が可能になり、菌濃度は１ｍｌ当たりの個数として測定するため、サンプル量が多ければ多いほど感度、精度が向上する。
（実施の形態２）
図２は微生物計量装置の一態様を示す構成図である。この微生物計量装置は、光源集光手段としてのレンズ１、受光部２を含む。光源３から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ４で分光する。分光された励起光はプリズム５を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１を経て検査台６に設置された微生物採取用フィルタ７を含む部位、即ち、微生物採取用フィルタ７と台座８からなる組合せ体の微生物採取用フィルタ７の表面に集光される。そこで励起光によって励起された微生物が有する蛍光は、再びプリズム５を透過し、受光部２に到達する。受光部２に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ９を経て、受光部に内蔵された光電変換素子１０に到達し、信号化され、認識される。また、図に示していないが、この微生物計量装置は検査台６を移動する手段を備えており、微生物採取用フィルタ７の表面の蛍光発光を全て、若しくは一部を受光することができる。
図２は微生物計量装置の一態様を示す構成図である。この微生物計量装置は、光源集光手段としてのレンズ１、受光部２を含む。光源３から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ４で分光する。分光された励起光はプリズム５を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１を経て検査台６に設置された微生物採取用フィルタ７を含む部位、即ち、微生物採取用フィルタ７と台座８からなる組合せ体の微生物採取用フィルタ７の表面に集光される。そこで励起光によって励起された微生物が有する蛍光は、再びプリズム５を透過し、受光部２に到達する。受光部２に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ９を経て、受光部に内蔵された光電変換素子１０に到達し、信号化され、認識される。また、図に示していないが、この微生物計量装置は検査台６を移動する手段を備えており、微生物採取用フィルタ７の表面の蛍光発光を全て、若しくは一部を受光することができる。
光電変換素子１０に到達した４６１ｎｍと６１７ｎｍの蛍光において、生菌と死菌は４６１ｎｍの蛍光発光しており、更に死菌は６１７ｎｍでも蛍光発光しているので、微生物判断手段１１により、微生物若しくは異物と光の波長の違いを蛍光分光フィルタ９で分光後目的の蛍光波長のみが取り出され光電変換素子１０に到達し、励起波長３５９ｎｍを吸収し励起されて４６１ｎｍで蛍光発光しているものは生菌と死菌を含む微生物と判断され、励起波長５３５ｎｍを吸収し励起され６１７ｎｍで蛍光発光しているものは死菌と判断され、４６１ｎｍと６１７ｎｍの両方で蛍光発光してないものは異物と判断され、微生物と判断された蛍光は積算されて、その数量が計量される。微生物判断手段１１としては、上記判断手順、判断方法をプログラミングされたマイコン等がある。
光源３より発生した励起光は、レンズ１によって集光されるが、その際レンズ１によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。つまり微小な一定面積とは、微生物判断手段１１にて大きさで微生物と認識できる大きさである。受光部２は、複数の光電変換素子１０でフィルタ全体を一度で画像として撮影しても良いし、微小（一辺が１０μｍ以下）で１個の光電変換素子１０で撮影後、ひとつひとつの画像を組合わせて、最終的に微生物の大きさを認識しても良い。
レンズ１によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する試薬の消光時間と励起光強度に依存する。試薬の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。
発光を検出する際、光源３の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルタ４によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルタ４は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光を発する試薬に対応できる。
また、同時に、発光した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発光を検出するために蛍光分光フィルタ９を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光を発する試薬に対応できる。
光源３としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち、最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルタ４および蛍光分光フィルタ９を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルタ４および蛍光分光フィルタ９を使用する必要がある場合がある。
プリズム５およびレンズ１は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される試薬などにも対応できる。微生物採取用フィルタ７を含む部位を設置する検査台６は回転能を有する。レンズ１により集光された励起光は、微生物採取用フィルタ７の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ１により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときで検査台６の回転速度を変化させることによって、レンズ１により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときで励起された試薬が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。
図２に示したように検査台６は微生物採取用フィルタ７を含む部位を嵌合させるための陥没部分（装置溝）を有し、ここに微生物採取用フィルタ７を含む部位をそのまま組み込むことができる形状としてある。なお、この際、例えば、検査台６に、微生物採取用フィルタ７がその上に位置するように金属平板を設け、微生物採取用フィルタ７が金属平板に押し付けられるような状態で組み込まれるようにすることで、検査台６上で微生物採取用フィルタ７が凹凸なく平滑に保持されるようにすれば、微生物採取用フィルタ７に捕集された微生物の定量をより確実なものにすることができる。
なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ１によって集光された励起光
の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すよ
うに設定されるものである。
の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すよ
うに設定されるものである。
なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円
形などでも可能であり、検体を照射できるものであればよい。
形などでも可能であり、検体を照射できるものであればよい。
なお、励起光もしくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能で
ある。
ある。
なお、検査台６の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐこととした
が、励起光を照射するレンズ１の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも
可能である。
が、励起光を照射するレンズ１の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも
可能である。
なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要
は無く、微生物採取用フィルタ７上の軌道を把握するものであればよい。
は無く、微生物採取用フィルタ７上の軌道を把握するものであればよい。
（実施例１）
図３は、本発明のエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体において、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも微粒子化するためのフローチャートである。エマルジョン粒子と微生物を含みうる検体として生乳を用いた。
図３は、本発明のエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体において、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも微粒子化するためのフローチャートである。エマルジョン粒子と微生物を含みうる検体として生乳を用いた。
生乳のエマルジョン粒子を微粒子化する方法として、ステップ1）にて生乳を０．１ｍｌ採取し反応容器に抽入する。更に試薬Ａを０．５ｍｌ添加する。試薬Ａはアミド系非イオン性界面活性剤のアミゾールを用いた。アミゾールの試薬は、生乳に対して３％程度を混合した。ステップ２）として液中で生乳とアミゾールの接触が十分に行なわれるように液全体を撹拌器にて混合状態にする。ステップ３）として、アミゾールによる成分の微粒子化反応を高めるため、インキュベートを一定温度、時間にて行う。この時の温度は４０℃〜６０℃とするが５０℃前後が好ましい。また、処理時間は５〜２０分間とするが１０分前後が好ましい。ステップにより、生乳中の成分が微粒子化され白濁していたステップ１）の液体が透明に近い液体となる。ステップ４）として、更に微粒子化するための試薬Ｂを前記処理液に１ｍｌ添加する。試薬Ｂはタンパク分解酵素のプロテアーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）を用いた。プロテアーゼ濃度は、１０％水溶液を用いる。ステップ５）として、前記処理液（ステップ３）処理液）とプロテアーゼの接触が十分に行われるように液全体を撹拌器にて混合状態にする。ステップ６）として、プロテアーゼによる反応を活性させるためインキュベートを一定温度、時間にて行う。この時の温度は４０℃〜６０℃とするが、５０℃前後が好ましい。また、処理時間においては５〜１０分とするが５分前後が好ましい。ステップ７）として、微生物採取用フィルタ７のろ過性を上げるため、試薬Ｃを２ｍｌ添加する。試薬Ｃはイオン系界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍｕ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ／ＳＤＳ）を用いた。ステップ８）として、前記処理液を撹拌器にて混合し微粒子化処理完了となる。また、前記構成により白濁していた液体は黄色透明な液となり、生乳成分が微粒子化されたこととなる。
検体染色においては、ステップ９）にて微生物採取用フィルタ７で前記処理液３．６ｍｌを全量ろ過する。ステップ１０）にて微生物採取用フィルタ７表面の微生物以外の残留成分をろ過滅菌水５ｍｌにて洗浄除去する。ステップ１１）にて、微生物採取用フィルタ７にて捕集された微生物を染色する蛍光染色試薬である試薬Ｄを０．１ｍｌ滴下し微生物採取用フィルタ７全面に試薬Ｄを広げて２分間染色を行う。試薬Ｄは微生物のＤＮＡに結合し染色される試薬を用いた。ステップ１２）にて試薬Ｄの余剰試薬をろ過滅菌水にて０．１ｍｌ洗浄を行い検体染色完了となる。
測定においては、ステップ１３）で微生物採取用フィルタ７を計測装置の台にセットする。この台については、微生物採取用フィルタ７を計測面にセットすることで平面になる状態に構成されており、それにより安定した計測が可能とすることができる。ステップ１４）にて微生物計量装置により、採取された乳製品中の微生物の計量が行われ計量完了となる。
図４に図２の微生物検査装置で撮影した１視野の画像について、微生物を計量するフローを示す。多数の視野を計測する場合には、このフローを繰り返し、フィルタ全体の面積と測定した面積（視野面積×視野数）の比に計測した微生物数を乗じることでフィルタ全体の微生物と算出することができる。
本実施例の結果を図５に示す。従来法と本発明法との間に相関性があることが認められた。
なお、実施例ではアミゾールと生乳を混ぜた濃度を３％にしたが、０．０３％から６％の範囲で使用しても、同様効果が得られる。
なお、インキュベートについての加温方法については、本実施例では、記載していないが、恒温器、ヒータ、超音波や電子線等により、試薬と生乳を加温できるものであれば、特に問題なく使用できる。
なお、処理時間は１０分程度が望ましいと記載したが、長時間処理しても特に混合物との性状を変化させることはない。
なお、透明に近い液と記載したが、目視レベルにて青白いもしくは透き通ったものであり、０．２μｍ以下の微粒子となったものを示す。
なお、実施例では、プロテアーゼの濃度を１０％の水溶液を用いたが、１％〜１５％の濃度を用いることでもよい。
なお、実施例では、プロテアーゼの水溶液を用いたが、ｐＨを４〜８にした溶液に溶かした溶媒を用いてよい。
なお、実施例では、プロテアーゼの水溶液を用いたが、有機系溶媒として、プロピレングリコールや、グリセリンを用いても、性能に差異は与えない。
なお、実施例では、ステップ１０）で洗浄除去を実施したが、特に微生物の計測の精度を低く設定する場合には、洗浄除去工程を省くことができる。
なお、試薬Ｄは、微生物のＤＮＡに結合し染色される試薬を用いたが、抗体反応や代謝酵素反応や呼吸器系の反応試薬を用いてもよい。
なお、実施例では、試薬Ｄとして、単一の染色を実施したが、二重染色することもできる。
なお、実施例では、余剰試薬の洗浄工程を記載したが、計測時のバックグランドに影響がなければ、余剰試薬を洗浄する工程を除くことができる。
なお、実施例では、検体に生乳を用いたが、牛乳や乳製品の水溶液も使用することができる。
なお、混合時に撹拌器を用いて撹拌したが、試薬と検体が撹拌できれば特に差異はない。
（実施例２）
図６は、本発明のエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体において、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも迅速に微粒子化するためのフローチャートである。エマルジョン粒子と微生物を含みうる検体として前記同様に生乳を用いた。
図６は、本発明のエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体において、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも迅速に微粒子化するためのフローチャートである。エマルジョン粒子と微生物を含みうる検体として前記同様に生乳を用いた。
生乳のエマルジョン粒子を微粒子化する方法として、ステップ１）にて生乳を０．１ｍｌ採取し反応容器に抽入し、キレート剤として蒸留水で希釈したヘキタメタリン酸の水溶液試薬Ｅを生乳量に対し１％濃度を混入しステップ２）にて撹拌する。
更にステップ３）で試薬Ａを脂肪酸エステル系のグリセリン水溶液で溶解し、生乳と試薬を混合した溶液０．１ｍｌに０．９ｍｌ添加する。ステップ４として液全体を撹拌器にて混合状態にする。
ステップ４）終了時には、生乳中の成分が微粒子化され白濁していた液体が透明に近い液体となる。
ステップ５）として、更に微粒子化するための試薬Ｂを前記処理液に１ｍｌ添加する。試薬Ｂはタンパク分解酵素のプロテアーゼを用いた。プロテアーゼの接触が十分に行われるように液全体を撹拌器にて混合状態にする。前記構成により白濁していた液体は黄色透明な液となり、生乳成分が微粒子化されたこととなる。
ステップ６）として、プロテアーゼによる反応を活性させるためインキュベートを一定温度、時間にて行う。この時の温度は６０℃とする。
また、処理時間においては３〜１０分とするが５分前後が好ましい。
また、ステップ５）として、前記処理液を撹拌器にて混合し微粒子化処理完了となる。
前処理完了後に蛍光染色して蛍光発光した画像を図７に示す。図に示すように、蛍光発光点の大きさは様々あり、微小な大きさは、顕微鏡にて観察した結果、菌体が１つのものであることが確認できた。中くらいの蛍光発光点は、菌体の固まった連鎖菌であることも確認できた。さらには、更に大きな蛍光発光点は、体細胞であることが確認できた。前処理完了後に微生物採取用フィルタの捕捉したものが、乳牛および生乳中の汚染を指標とできる項目を計測できることが、明確になった。
図８に図２の微生物検査装置で撮影した１視野の画像について、微生物を計量するフローを示す。多数の視野を計測する場合には、このフローを繰り返し、フィルタ全体の面積と測定した面積（視野面積×視野数）の比に計測した微生物数を乗じることでフィルタ全体の微生物と算出することができる。さらに、大きさ微生物判断手段１１を用いることで、微生物と体細胞を分け、計測することが可能となる。
なお、図には示していないが、中くらいの蛍光点は、微生物と判断した後に中くらいの大きさの微生物数とカウントを実施し、中くらいの蛍光点における微生物濃度を換算し微生物数に変換することで、連鎖菌のような菌の固まりの微生物数を計測することができる。
なお、実施例では、ヘキタメタリン酸の水溶液試薬Ｅを生乳量に対し１％濃度に設定したが、０．１％から１０％の濃度であれば問題はない。
さらに本実施例の結果は図示しないが、図４と同様な結果であった。実施例１同様に従来の方法と同様に本発明法との間に相関性があることが認められた。
本発明の、エマルジョン粒子と微生物を含みうる検体において、エマルジョン粒子を微生物の大きさよりも微粒子化して微生物の検出を行う、微生物検出方法および微生物計量装置は、熟練した技能の必要がなく、誰でも容易に計測ができるため、より乳製品の生産現場に近い所での品質管理に適用できる。また、近年、乳製品の原料である生乳においては、品質レベルが向上しており、低い菌数レベルを、より迅速・高精度・簡単に微生物数を計量できる装置が求められており、従来の検査にかわる方法としても適用できる。
１ レンズ
２ 受光部
３ 光源
４ 励起光分光フィルタ
５ プリズム
６ 検査台
７ 微生物採取用フィルタ
８ 台座
９ 蛍光分光フィルタ
１０ 光電変換素子
１１ 微生物判断手段
２ 受光部
３ 光源
４ 励起光分光フィルタ
５ プリズム
６ 検査台
７ 微生物採取用フィルタ
８ 台座
９ 蛍光分光フィルタ
１０ 光電変換素子
１１ 微生物判断手段
Claims (20)
- エマルジョン粒子と微生物を含みうる生乳または乳製品中の微生物検査を行うための微生物検出方法において、前記生乳または乳製品にアミド系非イオン性界面活性剤のアミゾールを添加する工程と、この工程後にタンパク分解酵素を添加する工程を含み、前記エマルジョン粒子を０．２μｍ以下で微生物の大きさよりも微粒子化して微生物をろ過抽出することにより微生物を検出するようにしたことを特徴とする微生物検出方法。
- エマルジョン粒子を微粒子化した後に凝集を防止する請求項１記載の微生物検出方法。
- 凝集を防止するためにキレート剤を添加する請求項１または２に記載の微生物検出方法。
- キレート剤として微生物に影響を与えないヘキタメタリン酸水溶液を添加することを特徴とする請求項３記載の微生物検出方法。
- ヘキタメタリン酸の濃度をエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体に対して０．０１〜１０％を添加する請求項４記載の微生物検出方法。
- アミド系非イオン性界面活性剤の溶媒として分散性を高める有機系の溶剤を用いた請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物検出方法。
- ０．２μｍ以下の微粒子にするためにエマルジョン粒子と微生物を含みうる検体の粘度を低下させる温度を与えることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の微生物検出方法。
- アミゾールとタンパク分解酵素を添加後に、分解を促進する加温手段を用いることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の微生物検出方法。
- 加温手段の温度を４０〜７０℃にすることを特徴とする請求項８記載の微生物検出方法。
- アミゾールとタンパク分解酵素に１種類あるいは複数種類の粘性を下げるイオン系界面活性剤を添加する請求項１乃至９のいずれかに記載の微生物検出方法。
- アミゾールとイオン系界面活性剤の溶媒として水分を低減した脂肪酸エステル類の溶媒としたことを特徴とする請求項１０記載の微生物検出方法。
- 微生物をろ過抽出するため微生物採取用フィルタを備え、フィルタ表面上で微生物の性質が変化しないように、ｐＨを調整する手段を備える請求項１乃至１１のいずれかに記載の微生物検出方法。
- 微生物をろ過抽出するため微生物採取用フィルタを備え、前記フィルタが表面形状の変形しないフィルタである請求項１２記載の微生物検出方法。
- 微生物をろ過抽出するため微生物採取用フィルタを備え、前記フィルタが色落ちしないフィルタである請求項１２または１３記載の微生物検出方法。
- 微生物採取用フィルタ上に顔料を担持した請求項１３または１４記載の微生物検出方法。
- 微生物をろ過抽出する微生物採取用フィルタを備え、前記フィルタが暗色のフィルタである請求項１３乃至１５のいずれかに記載の微生物検出方法。
- 微生物採取フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成された請求項１３乃至１６のいずれかに記載の微生物検出方法。
- 微生物採取フィルタ上に捕捉した微生物を染色法で検知あるいはカウントする請求項１２乃至１７のいずれかに記載の微生物検出方法。
- 染色法が蛍光染色法である請求項１８記載の微生物検出方法。
- 染色法が生細胞とのみ反応して生細胞のみを発色させる第１の試薬と、死細胞のみと反応して死細胞のみを前記発色と異なる波長で発色させる第２の試薬と、生死細胞のいずれとも反応して生死細胞のいずれも前記発色と異なる波長で発色させる第３の試薬と、微生物由来物質のその微生物に固有の物質と反応することで前記発色と異なる波長で発色する少なくとも１種類以上の第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を用いた請求項１８または１９記載の微生物検出方法。
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