JPH04228097A - ミルク試料からの細胞分離および濃縮方法とそのキット - Google Patents
ミルク試料からの細胞分離および濃縮方法とそのキットInfo
- Publication number
- JPH04228097A JPH04228097A JP3181799A JP18179991A JPH04228097A JP H04228097 A JPH04228097 A JP H04228097A JP 3181799 A JP3181799 A JP 3181799A JP 18179991 A JP18179991 A JP 18179991A JP H04228097 A JPH04228097 A JP H04228097A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- cells
- milk
- pellet
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 132
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 title claims abstract description 122
- 239000008267 milk Substances 0.000 title claims abstract description 122
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 title claims abstract description 122
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims abstract description 79
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims abstract description 64
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 143
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 78
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 60
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 42
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 16
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 13
- 239000008395 clarifying agent Substances 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 238000011120 smear test Methods 0.000 claims description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 2
- 238000003672 processing method Methods 0.000 claims description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 10
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 69
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 58
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 25
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical class OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 8
- 229950007919 egtazic acid Drugs 0.000 description 8
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 7
- XXAXVMUWHZHZMJ-UHFFFAOYSA-N Chymopapain Chemical compound OC1=CC(S(O)(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1O XXAXVMUWHZHZMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000003983 crown ethers Chemical class 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 235000020191 long-life milk Nutrition 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical class OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 235000020200 pasteurised milk Nutrition 0.000 description 5
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 5
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 4
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 3
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 108010027597 alpha-chymotrypsin Proteins 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 3
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 3
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 235000008476 powdered milk Nutrition 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- RNMCCPMYXUKHAZ-UHFFFAOYSA-N 2-[3,3-diamino-1,2,2-tris(carboxymethyl)cyclohexyl]acetic acid Chemical compound NC1(N)CCCC(CC(O)=O)(CC(O)=O)C1(CC(O)=O)CC(O)=O RNMCCPMYXUKHAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGUKYHHAGPFJMC-UHFFFAOYSA-N 4-[3-(4-hydroxy-2,5-dimethylphenyl)-1,1-dioxo-2,1$l^{6}-benzoxathiol-3-yl]-2,5-dimethylphenol Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C(=CC(O)=C(C)C=2)C)=C1C MGUKYHHAGPFJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 2
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(O)=O XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000582 ATP assay Toxicity 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 235000021537 Beetroot Nutrition 0.000 description 1
- 208000031462 Bovine Mastitis Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FCKYPQBAHLOOJQ-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane-1,2-diaminetetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C1CCCCC1N(CC(O)=O)CC(O)=O FCKYPQBAHLOOJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000131360 Morinda citrifolia Species 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000388 Polyphosphate Polymers 0.000 description 1
- 241000607717 Serratia liquefaciens Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- MNZHBXZOPHQGMD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;azane Chemical compound N.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O MNZHBXZOPHQGMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 229910001423 beryllium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002715 bioenergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+) Chemical compound [Cd+2] WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- HJMZMZRCABDKKV-UHFFFAOYSA-N carbonocyanidic acid Chemical compound OC(=O)C#N HJMZMZRCABDKKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000020243 first infant milk formula Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002847 impedance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 238000011093 media selection Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017524 noni Nutrition 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 239000001205 polyphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011176 polyphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013322 soy milk Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
- C12Q2304/60—Chemiluminescent detection using ATP-luciferin-luciferase system
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
- Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生ミルク、殺菌ミルク
および液状に戻した粉末ミルクのようなミルク試料中の
非細胞成分からの細胞分離および濃縮に関する。
および液状に戻した粉末ミルクのようなミルク試料中の
非細胞成分からの細胞分離および濃縮に関する。
【０００２】
【従来の技術】ミルク試料中の細胞計数および計量方法
は、２つのカテゴリーのいずれかに属する。第１のカテ
ゴリーでは、生ミルク試料中のウシの体細胞を、種々の
手段により、感染動物におけるミルク生産の質量を制限
する望ましくない条件、ウシの乳腺炎を有するかも知れ
ないミルク生産動物を識別するために計数する。乳腺炎
の試験方法は、細胞のアデノシン３リン酸塩（ＡＴＰ）
を放出する洗浄剤のような薬剤での細胞溶解を伴う自動
機器および生物発光する体細胞ＡＴＰ定量を使用して、
直接細胞を計数する。元々試料中に存在する体細胞の数
は、放出されたＡＴＰの測定により算定される。
は、２つのカテゴリーのいずれかに属する。第１のカテ
ゴリーでは、生ミルク試料中のウシの体細胞を、種々の
手段により、感染動物におけるミルク生産の質量を制限
する望ましくない条件、ウシの乳腺炎を有するかも知れ
ないミルク生産動物を識別するために計数する。乳腺炎
の試験方法は、細胞のアデノシン３リン酸塩（ＡＴＰ）
を放出する洗浄剤のような薬剤での細胞溶解を伴う自動
機器および生物発光する体細胞ＡＴＰ定量を使用して、
直接細胞を計数する。元々試料中に存在する体細胞の数
は、放出されたＡＴＰの測定により算定される。
【０００３】第２のカテゴリーでは、菌類およびバクテ
リアのような原核生物体が、種々の計数方法を用いてミ
ルク試料中で計数される。これらの方法は、ミルク品質
の評価に、特に全体として汚染されたミルク試料をふる
いにかけるために使用される。
リアのような原核生物体が、種々の計数方法を用いてミ
ルク試料中で計数される。これらの方法は、ミルク品質
の評価に、特に全体として汚染されたミルク試料をふる
いにかけるために使用される。
【０００４】微生物検出用の方法では、Ｂｒｅｅｄ
Ｓｍｅａｒ（Ｂｒｅｅｄ， Ｒ．Ｓ．， Ｚｂｌ． Ｂ
ａｋｔ．Ｉｌｔｅ． Ａｂｒ．３０：３３７、１９１１
）が一般には最も速い方法である。この技術では、ミル
ク試料をスライド上になすりつけ、乾燥し、染色し、そ
してバクテリアを顕微鏡検査を用いて計数する。この方
法の欠点は、生存生物体、非生存生物体の両者ともに計
数されること、およびミルク試料が１０５生物体／ｍｌ
よりも少ない生物体を含むときには、十分有効な結果を
得るためには多数の顕微鏡視野で計数しなければならな
いということにある。顕微鏡検査は、退屈であり、操作
者を疲労させる。
Ｓｍｅａｒ（Ｂｒｅｅｄ， Ｒ．Ｓ．， Ｚｂｌ． Ｂ
ａｋｔ．Ｉｌｔｅ． Ａｂｒ．３０：３３７、１９１１
）が一般には最も速い方法である。この技術では、ミル
ク試料をスライド上になすりつけ、乾燥し、染色し、そ
してバクテリアを顕微鏡検査を用いて計数する。この方
法の欠点は、生存生物体、非生存生物体の両者ともに計
数されること、およびミルク試料が１０５生物体／ｍｌ
よりも少ない生物体を含むときには、十分有効な結果を
得るためには多数の顕微鏡視野で計数しなければならな
いということにある。顕微鏡検査は、退屈であり、操作
者を疲労させる。
【０００５】最も広く利用されるミルク微生物の検出方
法は、成長培地中あるいは上に接種した後、直接コロニ
ーを計数する標準プレート法である。標準方法（Ｓｔａ
ｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘａ
ｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ， １５ｔｈ Ｅｄ．， １９８５， Ｒｅｃｈａｒ
ｄｓｏｎ， Ｇ．Ｈ．， Ｅｄ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇ． Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）は、ミルク試料用に発展し、
多数の工場が手動または自動の接種方法を使用してミル
ク試料を検査している。これらの方法は全世界的に利用
されているが、利用に当たりある種の欠点がある。第１
に、手動接種方法では、統計的意味のあるプレート数を
得るためにミルク試料の２つまたはそれ以上の希釈液を
接種しなければならないことである。第２に、手動およ
び自動接種方法用プレートは、通常昇温下でインキュベ
ートされ（即ち、米国では３５℃：日本では３２℃）、
これらの温度で好低温性生物体は抑制され、人工的に低
いプレート計数値が提供される。最終的に、約４８時間
というインキュベーション期間が、バクテリアプレート
の計数前に必要であり、菌類に対しては、より長いプレ
ート期間が必要である。このインキュベーション期間中
に、試料が採取された原ミルク中でバクテリア数が増加
し、そして得られた結果は、試験後にミルク中のコロニ
ーを形成する生物体の実際数を過小評価することとなる
。このインキュベーション期間に対応する生ミルク処理
の遅延は、生ミルクの品質を下げ、最終製品の商品寿命
を短くすることとなる。
法は、成長培地中あるいは上に接種した後、直接コロニ
ーを計数する標準プレート法である。標準方法（Ｓｔａ
ｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘａ
ｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ， １５ｔｈ Ｅｄ．， １９８５， Ｒｅｃｈａｒ
ｄｓｏｎ， Ｇ．Ｈ．， Ｅｄ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇ． Ｗａｓｈｉ
ｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）は、ミルク試料用に発展し、
多数の工場が手動または自動の接種方法を使用してミル
ク試料を検査している。これらの方法は全世界的に利用
されているが、利用に当たりある種の欠点がある。第１
に、手動接種方法では、統計的意味のあるプレート数を
得るためにミルク試料の２つまたはそれ以上の希釈液を
接種しなければならないことである。第２に、手動およ
び自動接種方法用プレートは、通常昇温下でインキュベ
ートされ（即ち、米国では３５℃：日本では３２℃）、
これらの温度で好低温性生物体は抑制され、人工的に低
いプレート計数値が提供される。最終的に、約４８時間
というインキュベーション期間が、バクテリアプレート
の計数前に必要であり、菌類に対しては、より長いプレ
ート期間が必要である。このインキュベーション期間中
に、試料が採取された原ミルク中でバクテリア数が増加
し、そして得られた結果は、試験後にミルク中のコロニ
ーを形成する生物体の実際数を過小評価することとなる
。このインキュベーション期間に対応する生ミルク処理
の遅延は、生ミルクの品質を下げ、最終製品の商品寿命
を短くすることとなる。
【０００６】プレーティングあるいはコロニー計数方法
は、手動でも自動でもよい。自動方法は、プレートルー
プ方法（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｄ． Ｉ． Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｍｉｌｋ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ３０， Ｐ． ２７３， １９６７）およ
び標準プレート計数（上記参照）を含む。
は、手動でも自動でもよい。自動方法は、プレートルー
プ方法（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｄ． Ｉ． Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｍｉｌｋ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ３０， Ｐ． ２７３， １９６７）およ
び標準プレート計数（上記参照）を含む。
【０００７】半自動あるいは自動コロニー計数方法は、
Ｓｐｉｒａｌプレーティング方法（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ
， Ｊ． Ｅ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏ． ２５，
ｐ２４４， １９７３）および電子コロニー計数器（Ｆ
ｌｅｍｉｎｇ， Ｍ．Ｇ． Ｉｒ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ
． Ｒｅｓ． １４， ｐ．２１， １９７５）により
実施される方法を含む。Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｐｉ−Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ技術（ＤＥＦＴ）は、手動により、
あるいは自動機器により実施できる蛍光識別技術である
。他の技術は、ミルク生物体の成長後のインピーダンス
測定および放射性グルコースを利用した放射測定法を含
む。
Ｓｐｉｒａｌプレーティング方法（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ
， Ｊ． Ｅ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏ． ２５，
ｐ２４４， １９７３）および電子コロニー計数器（Ｆ
ｌｅｍｉｎｇ， Ｍ．Ｇ． Ｉｒ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ
． Ｒｅｓ． １４， ｐ．２１， １９７５）により
実施される方法を含む。Ｄｉｒｅｃｔ Ｅｐｉ−Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ技術（ＤＥＦＴ）は、手動により、
あるいは自動機器により実施できる蛍光識別技術である
。他の技術は、ミルク生物体の成長後のインピーダンス
測定および放射性グルコースを利用した放射測定法を含
む。
【０００８】微生物評価への他のアプローチは、蛍ルシ
フェラーゼ（Ｌｕｍａｃ（商標）ｂｖ、オランダ）を用
いたミルク中の生細胞からのＡＴＰの生物発光の利用で
あった。この方法では、生ミルク中のウシの体細胞をウ
シの細胞ＡＴＰを放出する薬剤で溶解し、このＡＴＰお
よび他の非微生物ＡＴＰをＡＴＰアーゼ、普通ポテトア
ピラーゼで分解する。最終的には、バクテリアの溶解剤
を加えそしてバクテリアＡＴＰを蛍ルシフェラーゼで測
定する。多くのデータが、これらの方法に関し文献で蓄
積されているが、ルシフェラーゼ反応のミルクおよび溶
媒阻害、非バクテリアＡＴＰの不完全な除去、バクテリ
ア細胞溶解の前および後におけるバクテリア検出に関す
るアピラーゼの有害作用（Ｔｈｅｒｏｎ， Ｄ．Ｎ．，
Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ． ４９：４−７， １９
８６）、およびバクテリアＡＴＰの非効率的な抽出によ
り、感度は日常のミルク試験に対しては不充分であった
。このタイプの分析に対する文献値（Ｗｅｂｓｔｅｒ，
Ｊ． Ａ．Ｊ．，Ｈａｌｌ， Ｍ．Ｓ．， Ｒｉｃｈ，
Ｃ．Ｎ．， Ｇｉｌｌｉｌｉａｒ， Ｓ．Ｅ．，Ｆｏ
ｒ， Ｓ．Ｒ．，Ｌｅａｃｈ、 Ｆ．Ｒ．， Ｊ．
ＦｏｏｄＰｒｏｄｕｃｔｓ ５１： ９４９−９５４，
１９８８）は、細胞感度は約１×１０６細胞／ｍｌで
あり、グレードＡの生ミルクに対する受容カットオフは
１×１０５細胞／ｍｌであるから、この分析は米国では
利用できない。
フェラーゼ（Ｌｕｍａｃ（商標）ｂｖ、オランダ）を用
いたミルク中の生細胞からのＡＴＰの生物発光の利用で
あった。この方法では、生ミルク中のウシの体細胞をウ
シの細胞ＡＴＰを放出する薬剤で溶解し、このＡＴＰお
よび他の非微生物ＡＴＰをＡＴＰアーゼ、普通ポテトア
ピラーゼで分解する。最終的には、バクテリアの溶解剤
を加えそしてバクテリアＡＴＰを蛍ルシフェラーゼで測
定する。多くのデータが、これらの方法に関し文献で蓄
積されているが、ルシフェラーゼ反応のミルクおよび溶
媒阻害、非バクテリアＡＴＰの不完全な除去、バクテリ
ア細胞溶解の前および後におけるバクテリア検出に関す
るアピラーゼの有害作用（Ｔｈｅｒｏｎ， Ｄ．Ｎ．，
Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ． ４９：４−７， １９
８６）、およびバクテリアＡＴＰの非効率的な抽出によ
り、感度は日常のミルク試験に対しては不充分であった
。このタイプの分析に対する文献値（Ｗｅｂｓｔｅｒ，
Ｊ． Ａ．Ｊ．，Ｈａｌｌ， Ｍ．Ｓ．， Ｒｉｃｈ，
Ｃ．Ｎ．， Ｇｉｌｌｉｌｉａｒ， Ｓ．Ｅ．，Ｆｏ
ｒ， Ｓ．Ｒ．，Ｌｅａｃｈ、 Ｆ．Ｒ．， Ｊ．
ＦｏｏｄＰｒｏｄｕｃｔｓ ５１： ９４９−９５４，
１９８８）は、細胞感度は約１×１０６細胞／ｍｌで
あり、グレードＡの生ミルクに対する受容カットオフは
１×１０５細胞／ｍｌであるから、この分析は米国では
利用できない。
【０００９】試みられてきたこの方法の論理的な改良は
、ＡＴＰ分析の前にミルクバクテリアを濃縮することで
ある。細胞濾過濃縮を利用する種々の技術が文献に報告
されているが（Ｐｅｔｅｒｋｉｎ， Ｐ．Ｉ．， Ｓｈ
ａｒｐｅ， Ａ．Ｎ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ．， ３９：１１３８−１
１４３， １９８０）、これらの技術は全く煩わしく、
遅く、そしてまだ上記した技術的問題の多くが残ってい
る。
、ＡＴＰ分析の前にミルクバクテリアを濃縮することで
ある。細胞濾過濃縮を利用する種々の技術が文献に報告
されているが（Ｐｅｔｅｒｋｉｎ， Ｐ．Ｉ．， Ｓｈ
ａｒｐｅ， Ａ．Ｎ．， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ．， ３９：１１３８−１
１４３， １９８０）、これらの技術は全く煩わしく、
遅く、そしてまだ上記した技術的問題の多くが残ってい
る。
【００１０】上記技術の全てはある程度成功したが、日
常の試験に満足裡に使用できる試験のタイプをミルク工
業に提供できるに充分な安価さ、簡単さ、正確さ、迅速
さを提供するものではなかった。
常の試験に満足裡に使用できる試験のタイプをミルク工
業に提供できるに充分な安価さ、簡単さ、正確さ、迅速
さを提供するものではなかった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡単かつ信
頼できる方法で実施できる、液状ミルク試料からの真核
あるいは原核細胞の濃縮方法を提供する。本発明は、生
ミルク、殺菌されたミルク、液状に戻した乾燥ミルク、
クリーム、アイスクリームおよび他のミルク製品および
誘導体を含む種々のタイプの液状ミルク製品の分析に使
用できる。
頼できる方法で実施できる、液状ミルク試料からの真核
あるいは原核細胞の濃縮方法を提供する。本発明は、生
ミルク、殺菌されたミルク、液状に戻した乾燥ミルク、
クリーム、アイスクリームおよび他のミルク製品および
誘導体を含む種々のタイプの液状ミルク製品の分析に使
用できる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明は、ミルク試料に
キレート化剤含有透明化溶液を加え、ついで試料を短時
間遠心分離にかける等により他のミルク成分から細胞成
分を分離し、そして細胞ペレットから非細胞ミルク成分
を分離あるいはデカントする方法を提供する。細胞ペレ
ットの成分は、ミルク成分を汚染することに起因する干
渉がないような種々の分析を受けることができる。体細
胞および微生物の両者を含有してもよい細胞ペレットは
、それぞれの相対的濃度を顕微鏡的に検査して決定する
ことができる。体細胞は、体細胞のみを溶解するように
選ばれた洗浄剤のような溶解剤を透明化液中のキレート
剤と共に試料へ加えて除去してもよい。遠心分離後に残
っているペレットは、ほとんど微生物細胞だけを含有し
、これは微生物溶解のようなＡＴＰ抽出後のＡＴＰ濃縮
用分析を含む種々の方法で分析できる。濾過は、透明化
液が加えられたミルク試料中での他のミルク成分からの
細胞成分の分離にも利用できる。生ミルク試料でのウシ
体細胞のような真核細胞の存在もまた、迅速かつ簡単な
方法で測定できる。本発明は、バクテリア、イーストお
よびカビのような種々の生物体、およびバクテリア、イ
ーストおよびカビからの種々の胞子によるミルク試料の
汚染分析にも適している。
キレート化剤含有透明化溶液を加え、ついで試料を短時
間遠心分離にかける等により他のミルク成分から細胞成
分を分離し、そして細胞ペレットから非細胞ミルク成分
を分離あるいはデカントする方法を提供する。細胞ペレ
ットの成分は、ミルク成分を汚染することに起因する干
渉がないような種々の分析を受けることができる。体細
胞および微生物の両者を含有してもよい細胞ペレットは
、それぞれの相対的濃度を顕微鏡的に検査して決定する
ことができる。体細胞は、体細胞のみを溶解するように
選ばれた洗浄剤のような溶解剤を透明化液中のキレート
剤と共に試料へ加えて除去してもよい。遠心分離後に残
っているペレットは、ほとんど微生物細胞だけを含有し
、これは微生物溶解のようなＡＴＰ抽出後のＡＴＰ濃縮
用分析を含む種々の方法で分析できる。濾過は、透明化
液が加えられたミルク試料中での他のミルク成分からの
細胞成分の分離にも利用できる。生ミルク試料でのウシ
体細胞のような真核細胞の存在もまた、迅速かつ簡単な
方法で測定できる。本発明は、バクテリア、イーストお
よびカビのような種々の生物体、およびバクテリア、イ
ーストおよびカビからの種々の胞子によるミルク試料の
汚染分析にも適している。
【００１３】本発明はまた、ミルクから分離された濃縮
細胞材料を、染料または着色を伴う顕微鏡検査、あるい
は色素産生バクテリア（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）、蛍
光、化学発光あるいは他の検出可能なリポーター分子を
含む他の種々のタイプの分析に利用できる。本発明はさ
らに、濃縮細胞材料のプレーティング用、微生物の広い
スペクトルあるいは特殊なプレーティング用、あるいは
通常使用されるミルク試験方法のいずれにも向く試料の
調整用にも関する。
細胞材料を、染料または着色を伴う顕微鏡検査、あるい
は色素産生バクテリア（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ）、蛍
光、化学発光あるいは他の検出可能なリポーター分子を
含む他の種々のタイプの分析に利用できる。本発明はさ
らに、濃縮細胞材料のプレーティング用、微生物の広い
スペクトルあるいは特殊なプレーティング用、あるいは
通常使用されるミルク試験方法のいずれにも向く試料の
調整用にも関する。
【００１４】本発明では、ビートルルシフェラーゼＡＴ
Ｐの定量方法（ＤｅＬｕｃａ， Ｍ．Ａ．， Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｍｅｉｓｔ
ｅｒ， Ａ．， ｅｄｉｔｏｒ， ４４， ３７−６８
， １９７６）は、原液状ミルク試料中の細胞数の定量
用に利用できる。このＡＴＰ定量方法は、真核あるいは
原核細胞数のいずれの定量化にも適用できる。分離され
た細胞材料は、酵素、免疫、あるいは液状ミルク試料中
の特殊生物体タイプを定量あるいは同定する分子生物学
的試験方法のいずれのタイプにも利用できる。
Ｐの定量方法（ＤｅＬｕｃａ， Ｍ．Ａ．， Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｍｅｉｓｔ
ｅｒ， Ａ．， ｅｄｉｔｏｒ， ４４， ３７−６８
， １９７６）は、原液状ミルク試料中の細胞数の定量
用に利用できる。このＡＴＰ定量方法は、真核あるいは
原核細胞数のいずれの定量化にも適用できる。分離され
た細胞材料は、酵素、免疫、あるいは液状ミルク試料中
の特殊生物体タイプを定量あるいは同定する分子生物学
的試験方法のいずれのタイプにも利用できる。
【００１５】本発明の方法は、膜、中空繊維あるいは遠
心分離型フィルターのような種々のタイプの濾過マトリ
ックスにおける濾過用種々の試料の前処理方法としても
使用できる。
心分離型フィルターのような種々のタイプの濾過マトリ
ックスにおける濾過用種々の試料の前処理方法としても
使用できる。
【００１６】本発明は、本発明方法の実施に使用する新
規なキットをも包含する。このキットは、キレート化剤
および場合によっては体細胞溶解剤を含有する透明化溶
液、細胞ペレット洗浄用溶液、および、ＡＴＰ検出用に
、微生物細胞ＡＴＰ抽出剤あるいは溶解剤、緩衝液およ
び蛍ルシフェリンのようなＡＴＰ検出剤を含む。キット
は、Ｂｒｅｅｄ Ｓｍｅａｒ試験あるいは直接の微生
物検査方法の他のタイプ用の試料を調整するための成分
を含んでいてもよい。
規なキットをも包含する。このキットは、キレート化剤
および場合によっては体細胞溶解剤を含有する透明化溶
液、細胞ペレット洗浄用溶液、および、ＡＴＰ検出用に
、微生物細胞ＡＴＰ抽出剤あるいは溶解剤、緩衝液およ
び蛍ルシフェリンのようなＡＴＰ検出剤を含む。キット
は、Ｂｒｅｅｄ Ｓｍｅａｒ試験あるいは直接の微生
物検査方法の他のタイプ用の試料を調整するための成分
を含んでいてもよい。
【００１７】本発明の他の目的、特徴および利益は添付
図面と共になされる下記の詳細な説明から明らかになる
であろう。
図面と共になされる下記の詳細な説明から明らかになる
であろう。
【００１８】総括的には、本発明は液状ミルク試料から
の細胞材料の分離および濃縮方法に関する。細胞は、キ
レート化剤、および場合によっては洗浄剤のような体細
胞溶解剤を含有する透明化溶液をミルク試料に加え、そ
して細胞成分を非細胞成分から、試料を遠心分離にかけ
、そして細胞ペレットから非細胞上澄みを吸引あるいは
デカンティングすることによって細胞成分から非細胞成
分を分離して、ミルク試料から除去される。
の細胞材料の分離および濃縮方法に関する。細胞は、キ
レート化剤、および場合によっては洗浄剤のような体細
胞溶解剤を含有する透明化溶液をミルク試料に加え、そ
して細胞成分を非細胞成分から、試料を遠心分離にかけ
、そして細胞ペレットから非細胞上澄みを吸引あるいは
デカンティングすることによって細胞成分から非細胞成
分を分離して、ミルク試料から除去される。
【００１９】定義：
用語“バクテリア”は、単細胞の原核生物を含むことを
意味する。“微生物”あるいは“非真核細胞”という用
語に入れ換えることもまた本発明の範囲に属する。
意味する。“微生物”あるいは“非真核細胞”という用
語に入れ換えることもまた本発明の範囲に属する。
【００２０】用語“真核細胞”は、遺伝材料が核により
囲まれている生物体を表示することを意図する。
囲まれている生物体を表示することを意図する。
【００２１】用語“アデノシン−５’−３リン酸塩”（
ＡＴＰ）は、アデニン、Ｄ−リボースおよび３個のリン
酸塩基からなるヌクレオチドを表示するように使用され
る。ＡＴＰは、呼吸、醗酵および光合成におけるリン酸
化反応によって生成され、生物エネルギー代謝において
重要である。全ての生細胞は、ＡＴＰを含有する。
ＡＴＰ）は、アデニン、Ｄ−リボースおよび３個のリン
酸塩基からなるヌクレオチドを表示するように使用され
る。ＡＴＰは、呼吸、醗酵および光合成におけるリン酸
化反応によって生成され、生物エネルギー代謝において
重要である。全ての生細胞は、ＡＴＰを含有する。
【００２２】用語“液状ミルク試料”は、生ミルク、超
高温殺菌ミルク、低温長時間殺菌ミルク、液状に戻した
粉末ミルク、クリーム、スキムミルク、液化されたアイ
スクリームあるいはアイスミルクあるいは関連製品、豆
乳、および液状試料中のミルクあるいは乳製品の懸濁液
を包含する乳の生材料あるいはコーヒー等との混合液、
ミルクの培養液（増菌培養液）等の乳製品を起原とする
全ての液状溶液を含むことを意味する。
高温殺菌ミルク、低温長時間殺菌ミルク、液状に戻した
粉末ミルク、クリーム、スキムミルク、液化されたアイ
スクリームあるいはアイスミルクあるいは関連製品、豆
乳、および液状試料中のミルクあるいは乳製品の懸濁液
を包含する乳の生材料あるいはコーヒー等との混合液、
ミルクの培養液（増菌培養液）等の乳製品を起原とする
全ての液状溶液を含むことを意味する。
【００２３】用語“キレーター”あるいは“キレート化
剤”は、カルシウムイオンと結合しあるいは化合し、そ
してマグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、カド
ミウムイオン、ベリリュームイオン、コバルトイオン、
ニッケルイオン、銅イオン、鉛イオンを包含する他の二
価金属イオン、および他の金属イオンと結合してもよい
全ての分子あるいは巨大分子を含むことを意味する。 “キレーター”あるいは“キレート化剤”は、これらの
イオンと結合すべく知られている全ての合成あるいは天
然の有機化合物、および上記タイプのイオンに結合でき
る蛋白質、糖あるいは炭水化物、リピッドおよび核酸、
およびこれらの組合わせを含む生物起原のいかなる分子
あるいは生物起原分子の副製品あるいは修飾製品を含む
。“キレーター”あるいは“キレート化剤”は、カルシ
ウムと結合し、そしてより少ない程度でマグネシウムお
よび多分上記イオンの１つ以上と結合する天然産あるい
は合成起原のいかなる固体材料をも含有する。
剤”は、カルシウムイオンと結合しあるいは化合し、そ
してマグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、カド
ミウムイオン、ベリリュームイオン、コバルトイオン、
ニッケルイオン、銅イオン、鉛イオンを包含する他の二
価金属イオン、および他の金属イオンと結合してもよい
全ての分子あるいは巨大分子を含むことを意味する。 “キレーター”あるいは“キレート化剤”は、これらの
イオンと結合すべく知られている全ての合成あるいは天
然の有機化合物、および上記タイプのイオンに結合でき
る蛋白質、糖あるいは炭水化物、リピッドおよび核酸、
およびこれらの組合わせを含む生物起原のいかなる分子
あるいは生物起原分子の副製品あるいは修飾製品を含む
。“キレーター”あるいは“キレート化剤”は、カルシ
ウムと結合し、そしてより少ない程度でマグネシウムお
よび多分上記イオンの１つ以上と結合する天然産あるい
は合成起原のいかなる固体材料をも含有する。
【００２４】本発明で利用される種々の方法は、当業者
に知られたものであるが、本発明に従うこれらの方法の
組合わせは予測されたものではない。本発明の検定技術
の一部を担う従来知られた一般的な方法は、乳製品から
の微生物の標準プレーティング技術、微生物用染色およ
び同定方法、バクテリア抽出方法、他の方法における分
離、濃縮細胞材料の使用、および一般的キレート化学を
含有する。上記技術の一つあるいはそれ以上の論考は下
記の文献に記載され、これらは本発明の記載として引用
する： Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｉｒｙ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， １５ｔｈ Ｅｄ．， １９８５，
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｇ．Ｈ．， Ｅｄ．； Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓ
ｏｃ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．，； Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｍａｎｕａｌ， ６ｔｈ．， ＵＳＤＡ， １９８４
， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ； Ｓａｍｂｒｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．
， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ
Ｅｄ．， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｍ．，Ｅｄ．， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９； Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，
Ｆ．， Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ． Ｄａｉｒｙ
Ｔｅｃｈ．， Ｊｕｎｅ １９８４， ｐｐ．６１−６
５， １９８４（この文献は、微生物学的ミルク試験方
法および各方法の関連文献を含んでいる。）；Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４， ７
３９−７６９， Ｋａｒｌ， Ｄ．Ｍ．， １９８０；
Ｍａｒｔｅｌｌ， Ａ．Ｅ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｌａｔｅ Ｃｏｍｐ
ｏｕｎｄｓ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， １９５２。
に知られたものであるが、本発明に従うこれらの方法の
組合わせは予測されたものではない。本発明の検定技術
の一部を担う従来知られた一般的な方法は、乳製品から
の微生物の標準プレーティング技術、微生物用染色およ
び同定方法、バクテリア抽出方法、他の方法における分
離、濃縮細胞材料の使用、および一般的キレート化学を
含有する。上記技術の一つあるいはそれ以上の論考は下
記の文献に記載され、これらは本発明の記載として引用
する： Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄａｉｒｙ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， １５ｔｈ Ｅｄ．， １９８５，
Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｇ．Ｈ．， Ｅｄ．； Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓ
ｏｃ．， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．，； Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ
Ｍａｎｕａｌ， ６ｔｈ．， ＵＳＤＡ， １９８４
， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ； Ｓａｍｂｒｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ， Ｅ．Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．
， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ
Ｅｄ．， Ｆｅｒｇｕｓｏｎ， Ｍ．，Ｅｄ．， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９； Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，
Ｆ．， Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｊ． Ｄａｉｒｙ
Ｔｅｃｈ．， Ｊｕｎｅ １９８４， ｐｐ．６１−６
５， １９８４（この文献は、微生物学的ミルク試験方
法および各方法の関連文献を含んでいる。）；Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４４， ７
３９−７６９， Ｋａｒｌ， Ｄ．Ｍ．， １９８０；
Ｍａｒｔｅｌｌ， Ａ．Ｅ．， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｔａｌ Ｃｈｅｌａｔｅ Ｃｏｍｐ
ｏｕｎｄｓ， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ， １９５２。
【００２５】本発明は、液状ミルク試料からの細胞材料
除去用の分離および濃縮技術を包含する。この技術を実
施するには、分析されるミルク試料を図１の１０に示す
ような適当な大きさの遠心分離容器に入れ、そしてミル
クにキレート化剤を加える。キレート化剤は上記した種
々のタイプのいずれでもよく、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ビス−（Ｏ−ア
ミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢
酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（β−
アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（
ＥＧＴＡ）、ニトリロ酢酸（トリグリシン、アンモニア
三酢酸塩、トリロンＡ）、トランス−１，２−ジアミノ
シクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレントリア
ミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸塩、アルギニン
、ハイポザンチン、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１
，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス（ｇ
ｌａｓｓ）あるいは“ガラス”またはポリリン酸塩にお
ける分子のいずれか、クラウンエーテルタイプ化合物お
よびこれら分子の全ての誘導体および前駆体を含むこと
ができる。キレート化剤、例えばＥＤＴＡは、好ましく
は液状のミルク試料に透明化溶液として添加し、そして
混合物に蓋をし、反転あるいは旋回して混合する。 試料は、ついで適当な大きさの遠心分離器に入れ、最小
限５分間１０，０００×ｇ（最小相対遠心力）で遠心分
離する。遠心分離後、３つの層に分離する。最上層は図
１の１５で示されるようなクリームおよびミルク蛋白質
“パッド”（ｐａｄ）であり、そしてこのパッドは、液
状試料の上側に浮動する。パッドの下側には、図１の１
６で示されるような第２の“透明”（ｃｌｅａｒ）液領
域があり、これはミルク試料とは異なり、非不透明およ
び半透明である。最後に、遠心分離管の底部には、細胞
ペレット１７があり、これの大きさは原ミルク試料の細
胞数およびキレート化剤および／または洗浄剤のタイプ
に依存する。ペレットは少量の細胞と会合した他のミル
ク成分を含んでもよい。代表的な１．０ｍｌの生ミルク
試料の透明化後には、ペレットは約１０〜４０μｌの容
積であり、外観は白色または灰色がかった白色である。
除去用の分離および濃縮技術を包含する。この技術を実
施するには、分析されるミルク試料を図１の１０に示す
ような適当な大きさの遠心分離容器に入れ、そしてミル
クにキレート化剤を加える。キレート化剤は上記した種
々のタイプのいずれでもよく、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）、ビス−（Ｏ−ア
ミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢
酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（β−
アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（
ＥＧＴＡ）、ニトリロ酢酸（トリグリシン、アンモニア
三酢酸塩、トリロンＡ）、トランス−１，２−ジアミノ
シクロヘキサン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ジエチレントリア
ミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、クエン酸塩、アルギニン
、ハイポザンチン、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１
，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス（ｇ
ｌａｓｓ）あるいは“ガラス”またはポリリン酸塩にお
ける分子のいずれか、クラウンエーテルタイプ化合物お
よびこれら分子の全ての誘導体および前駆体を含むこと
ができる。キレート化剤、例えばＥＤＴＡは、好ましく
は液状のミルク試料に透明化溶液として添加し、そして
混合物に蓋をし、反転あるいは旋回して混合する。 試料は、ついで適当な大きさの遠心分離器に入れ、最小
限５分間１０，０００×ｇ（最小相対遠心力）で遠心分
離する。遠心分離後、３つの層に分離する。最上層は図
１の１５で示されるようなクリームおよびミルク蛋白質
“パッド”（ｐａｄ）であり、そしてこのパッドは、液
状試料の上側に浮動する。パッドの下側には、図１の１
６で示されるような第２の“透明”（ｃｌｅａｒ）液領
域があり、これはミルク試料とは異なり、非不透明およ
び半透明である。最後に、遠心分離管の底部には、細胞
ペレット１７があり、これの大きさは原ミルク試料の細
胞数およびキレート化剤および／または洗浄剤のタイプ
に依存する。ペレットは少量の細胞と会合した他のミル
ク成分を含んでもよい。代表的な１．０ｍｌの生ミルク
試料の透明化後には、ペレットは約１０〜４０μｌの容
積であり、外観は白色または灰色がかった白色である。
【００２６】本発明におけるキレート化剤の作用は、ミ
ルク試料中におけるカゼインミセルのサブミセルへの解
離である（Ｌ．Ｃ． Ｃｈａｐｌｉｎ， Ｊ． Ｄａｉ
ｒｙ Ｒｅｓ． ５１： ２５１−２５７， １９８４
）。キレート処理後には、キレーターの無い状態でペレ
ット化した場合とは反対にミセル状ミルク蛋白質材料は
遠心分離管の上側に登りあるいは溶液中に残存する。キ
レーターは、ミセル構造に寄与する主成分であるカルシ
ウムイオンを結合する（Ｓ．Ｈ．Ｃ． Ｌｉａ， Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１： １８１８−１８２１，
１９７２）。 従って、本発明ではカルシウムイオ
ンを特によく結合するキレート化剤が好ましい。
ルク試料中におけるカゼインミセルのサブミセルへの解
離である（Ｌ．Ｃ． Ｃｈａｐｌｉｎ， Ｊ． Ｄａｉ
ｒｙ Ｒｅｓ． ５１： ２５１−２５７， １９８４
）。キレート処理後には、キレーターの無い状態でペレ
ット化した場合とは反対にミセル状ミルク蛋白質材料は
遠心分離管の上側に登りあるいは溶液中に残存する。キ
レーターは、ミセル構造に寄与する主成分であるカルシ
ウムイオンを結合する（Ｓ．Ｈ．Ｃ． Ｌｉａ， Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１： １８１８−１８２１，
１９７２）。 従って、本発明ではカルシウムイオ
ンを特によく結合するキレート化剤が好ましい。
【００２７】本発明の分離方法では、キレート化剤がミ
ルクミセルに作用し、一方検査すべき細胞にはネガティ
ブで作用しないことが非常に重要である。例えば、ビー
トルルシフェラーゼのような微生物ＡＴＰを測定する検
定方法の場合に、ミルクを透明にするが、微生物細胞Ａ
ＴＰあるいは生存度を除き、低めあるいは消失するキレ
ート化剤は検定方法用候補としては好ましくない。この
理由により、あるタイプの適用に対して、ある種のキレ
ート化剤が他のキレート化剤よりも優れている。特に適
していると見いだされたキレート化剤は、ニトリロトリ
酢酸およびエチレンジアミン四酢酸である。
ルクミセルに作用し、一方検査すべき細胞にはネガティ
ブで作用しないことが非常に重要である。例えば、ビー
トルルシフェラーゼのような微生物ＡＴＰを測定する検
定方法の場合に、ミルクを透明にするが、微生物細胞Ａ
ＴＰあるいは生存度を除き、低めあるいは消失するキレ
ート化剤は検定方法用候補としては好ましくない。この
理由により、あるタイプの適用に対して、ある種のキレ
ート化剤が他のキレート化剤よりも優れている。特に適
していると見いだされたキレート化剤は、ニトリロトリ
酢酸およびエチレンジアミン四酢酸である。
【００２８】生ミルク試料から体細胞を除去分離し、微
生物細胞のみを分離濃縮する場合には、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００あるいはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｎ
Ｐ−４０）のような非イオン性洗浄剤をキレート化剤と
共にミルク試料に加えてもよい。このような洗浄剤は特
に微生物細胞を溶解することなく体細胞を溶解する。何
故なら、体細胞は遠心分離前の処理で溶解され、遠心分
離後にはそのままの体細胞は本質的に残存しない。引き
続くこれらのペレット上でなされるＡＴＰ定量は、バク
テリア細胞あるいは微生物細胞のみを検出する。
生物細胞のみを分離濃縮する場合には、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００あるいはＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（Ｎ
Ｐ−４０）のような非イオン性洗浄剤をキレート化剤と
共にミルク試料に加えてもよい。このような洗浄剤は特
に微生物細胞を溶解することなく体細胞を溶解する。何
故なら、体細胞は遠心分離前の処理で溶解され、遠心分
離後にはそのままの体細胞は本質的に残存しない。引き
続くこれらのペレット上でなされるＡＴＰ定量は、バク
テリア細胞あるいは微生物細胞のみを検出する。
【００２９】他方、ミルク試料中の体細胞数を測定ある
いは定量する場合には、上記洗浄剤を細胞ペレットに添
加し、そして体細胞のみを溶解する。体細胞中に含有さ
れるＡＴＰのような細胞代謝生成物は、洗浄剤で抽出で
きない微生物ＡＴＰにより結果の上昇を伴うことなく、
容易に測定される。試料中に存在する体細胞数は、測定
された既知量のＡＴＰおよび体細胞中に存在すると知ら
れたＡＴＰの平均量を使用して計算される。この方法は
従来知られた方法の改良である（Ｒ． Ｂｏｓｓｕｙｔ
， Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ ３３： １
１−１３， １９７８）。
いは定量する場合には、上記洗浄剤を細胞ペレットに添
加し、そして体細胞のみを溶解する。体細胞中に含有さ
れるＡＴＰのような細胞代謝生成物は、洗浄剤で抽出で
きない微生物ＡＴＰにより結果の上昇を伴うことなく、
容易に測定される。試料中に存在する体細胞数は、測定
された既知量のＡＴＰおよび体細胞中に存在すると知ら
れたＡＴＰの平均量を使用して計算される。この方法は
従来知られた方法の改良である（Ｒ． Ｂｏｓｓｕｙｔ
， Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ ３３： １
１−１３， １９７８）。
【００３０】本方法は、細胞の濃縮およびカゼインおよ
びカゼインミセル、親油性成分、および塩のようなバッ
クグラウンドのミルク汚染物を除去する有用な方法を提
供する。この濃縮を実施するには、例えばミルク１ｍｌ
をキレート化剤と共に遠心分離により透明化し、得られ
たペレットを非常に少量（例えば１０μｌ）の適当な緩
衝液または液体で再度懸濁させる。この例では、全部の
細胞成分がミルク汚染物から除去され、そして１００倍
に濃縮される。この濃縮試料は、所望の他の分析に利用
される。
びカゼインミセル、親油性成分、および塩のようなバッ
クグラウンドのミルク汚染物を除去する有用な方法を提
供する。この濃縮を実施するには、例えばミルク１ｍｌ
をキレート化剤と共に遠心分離により透明化し、得られ
たペレットを非常に少量（例えば１０μｌ）の適当な緩
衝液または液体で再度懸濁させる。この例では、全部の
細胞成分がミルク汚染物から除去され、そして１００倍
に濃縮される。この濃縮試料は、所望の他の分析に利用
される。
【００３１】この方法の有用性の一例は、生ミルクから
の微生物を染色し計数することにある。ミルク試料がｍ
ｌ当たり１×１０５よりも少ない生物体を含有し、１０
μｌのミルクが顕微鏡用スライドに載置され、染色され
た場合には、統計的に意味のある計数値を集めるため多
くの視野の染色標本を観察せねばならない。視野は、他
のミルク成分がバックグラウンドで染色されているため
、計数することが難しい。Ｂｒｅｅｄ Ｓｍｅａｒ法
は、生ミルク品質検定のために広く、特に日本で広く使
用されている。前記濃縮工程（１００倍に濃縮）を利用
することにより、計数用視野はより少ない数でよく、そ
して視野はバックグラウンドがより奇麗なので計数はよ
り容易である。このことは、標本作成を迅速にしかつ操
作者の疲労および誤りを減少する。
の微生物を染色し計数することにある。ミルク試料がｍ
ｌ当たり１×１０５よりも少ない生物体を含有し、１０
μｌのミルクが顕微鏡用スライドに載置され、染色され
た場合には、統計的に意味のある計数値を集めるため多
くの視野の染色標本を観察せねばならない。視野は、他
のミルク成分がバックグラウンドで染色されているため
、計数することが難しい。Ｂｒｅｅｄ Ｓｍｅａｒ法
は、生ミルク品質検定のために広く、特に日本で広く使
用されている。前記濃縮工程（１００倍に濃縮）を利用
することにより、計数用視野はより少ない数でよく、そ
して視野はバックグラウンドがより奇麗なので計数はよ
り容易である。このことは、標本作成を迅速にしかつ操
作者の疲労および誤りを減少する。
【００３２】ミルクの種々の他の成分から全細胞を分離
し、かつ本発明の方法に従って細胞を濃縮することによ
り、標本中の体細胞数を決めることができる。
し、かつ本発明の方法に従って細胞を濃縮することによ
り、標本中の体細胞数を決めることができる。
【００３３】汚染する体細胞がないペレット中の微生物
細胞を、微生物抽出剤で溶解し、ＡＴＰを検定できる。 微生物細胞の数は、ＡＴＰ測定および微生物細胞、ある
いは特にミルク微生物細胞に存在すると知られている平
均量を用いて算定される。このタイプの方法は、標準プ
レーティングおよびスパイラルプレーティングのような
他の方法に比して数多くの利点を提供する。第１に、他
の２つの方法の４８時間という時間構成とは反対に１時
間という短時間で結果が利用できる。第２に、ＡＴＰ測
定は、細胞凝集によって影響されることのない結果が得
られる。即ち、ＡＴＰは全ての細胞から測定される。；
プレーティング方法では、細胞の対あるいは細胞のグル
ープが１つのコロニーを形成するため、単一の細胞とし
て計数される。第３には、ＡＴＰ方法では、３０℃より
上の温度で培養するプレート計数法では測定されない好
低温性生物体からのＡＴＰを測定する。
細胞を、微生物抽出剤で溶解し、ＡＴＰを検定できる。 微生物細胞の数は、ＡＴＰ測定および微生物細胞、ある
いは特にミルク微生物細胞に存在すると知られている平
均量を用いて算定される。このタイプの方法は、標準プ
レーティングおよびスパイラルプレーティングのような
他の方法に比して数多くの利点を提供する。第１に、他
の２つの方法の４８時間という時間構成とは反対に１時
間という短時間で結果が利用できる。第２に、ＡＴＰ測
定は、細胞凝集によって影響されることのない結果が得
られる。即ち、ＡＴＰは全ての細胞から測定される。；
プレーティング方法では、細胞の対あるいは細胞のグル
ープが１つのコロニーを形成するため、単一の細胞とし
て計数される。第３には、ＡＴＰ方法では、３０℃より
上の温度で培養するプレート計数法では測定されない好
低温性生物体からのＡＴＰを測定する。
【００３４】先述したように、本発明を用いて分離濃縮
された細胞には、バックグラウンドを大きく減少し、濃
縮により細胞数を非常に増大することで、他の種々の方
法が適用できる。このことはより大きな感度の可能性と
、バックグラウンドの減少による信頼できかつ再現でき
る結果とを提供する。
された細胞には、バックグラウンドを大きく減少し、濃
縮により細胞数を非常に増大することで、他の種々の方
法が適用できる。このことはより大きな感度の可能性と
、バックグラウンドの減少による信頼できかつ再現でき
る結果とを提供する。
【００３５】本発明の方法は、感度、細胞数、あるいは
細胞耐久性を改良する透明化遠心分離の前または後の細
胞濃厚化あるいは細胞増強化（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ
）技術を含んでもよい。例えば、細胞を細胞ＡＴＰを増
加する処理法（ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）（Ｄ．Ｐ． Ｔ
ｅｒｏｎ，Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ． ４６： １９
６−１９８， １９８３）あるいは処理剤（Ｋ．Ｍ．
Ｏｘｌｅｙ， Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎ
ｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ， Ｅｄ．
Ｊ． Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．，ｐｐ． ４９５−１９
８， １９８６）で処理することにより、本方法の感度
は増強される。このタイプの方法は、培地の選択、ある
いはポリクローナルまたはモノクローナルでさえも使用
して、特殊な試料中における特殊なタイプの細胞の検出
にも適用できる。
細胞耐久性を改良する透明化遠心分離の前または後の細
胞濃厚化あるいは細胞増強化（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ
）技術を含んでもよい。例えば、細胞を細胞ＡＴＰを増
加する処理法（ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）（Ｄ．Ｐ． Ｔ
ｅｒｏｎ，Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ． ４６： １９
６−１９８， １９８３）あるいは処理剤（Ｋ．Ｍ．
Ｏｘｌｅｙ， Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎ
ｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ， Ｅｄ．
Ｊ． Ｓｃｈｏｌｍｅｒｉｃｈ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．，ｐｐ． ４９５−１９
８， １９８６）で処理することにより、本方法の感度
は増強される。このタイプの方法は、培地の選択、ある
いはポリクローナルまたはモノクローナルでさえも使用
して、特殊な試料中における特殊なタイプの細胞の検出
にも適用できる。
【００３６】図１を参照して本発明を説明する。この方
法では、ミルク試料をまず遠心分離容器１０に入れる。 次にキレート化剤場合により洗浄剤をも加える。内容物
を混合した容器を遠心分離器にかけると得られた試料は
いわゆる透明化される。もしキレート化剤無しのミルク
試料を同様にして遠心分離にかけると、透明化せず、大
きな、拡散したミルク蛋白質および細胞ペレットが管の
底部にたまる。
法では、ミルク試料をまず遠心分離容器１０に入れる。 次にキレート化剤場合により洗浄剤をも加える。内容物
を混合した容器を遠心分離器にかけると得られた試料は
いわゆる透明化される。もしキレート化剤無しのミルク
試料を同様にして遠心分離にかけると、透明化せず、大
きな、拡散したミルク蛋白質および細胞ペレットが管の
底部にたまる。
【００３７】本発明は、好ましくは液状ミルク試料から
の細胞分離および濃縮に関する。本発明を下記の実施例
によりさらに詳細に説明する。
の細胞分離および濃縮に関する。本発明を下記の実施例
によりさらに詳細に説明する。
【００３８】実施例１
この実施例は、人工的に接種されたミルク試料からの微
生物細胞の分離を開示する。加えて、この検定を市販の
利用できるミルクＡＴＰ検定と比感度について比較した
。
生物細胞の分離を開示する。加えて、この検定を市販の
利用できるミルクＡＴＰ検定と比感度について比較した
。
【００３９】生ミルクを地方の乳牛場から得、そしてそ
の生ミルクを標準方法の寒天で画線培養して、個々のコ
ロニーを分離した（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ Ｄａ
ｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， 上記参照）。１１個の視
覚的に異なるコロニーのタイプを取り上げ、標準方法の
ブイヨンで成長させ、生ミルク中で見いだされる異なる
種の代表的試料を得るように試みた。これらの分離物か
ら一細胞タイプ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）を実験用に選んだ。
の生ミルクを標準方法の寒天で画線培養して、個々のコ
ロニーを分離した（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｏｆ Ｄａ
ｉｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， 上記参照）。１１個の視
覚的に異なるコロニーのタイプを取り上げ、標準方法の
ブイヨンで成長させ、生ミルク中で見いだされる異なる
種の代表的試料を得るように試みた。これらの分離物か
ら一細胞タイプ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）を実験用に選んだ。
【００４０】殺菌ミルク試料を陰性対照として使用した
。殺菌ミルクの１ｍｌに、１０μｌの一夜（２３℃）成
長させたミルク分離バクテリアを添加した。この人工的
に接種したミルク試料および未接種殺菌ミルクを使用し
て、多数の接種ミルク試料を下記表に示すように調整し
た。
。殺菌ミルクの１ｍｌに、１０μｌの一夜（２３℃）成
長させたミルク分離バクテリアを添加した。この人工的
に接種したミルク試料および未接種殺菌ミルクを使用し
て、多数の接種ミルク試料を下記表に示すように調整し
た。
【００４１】
試験管
殺菌ミルク 接種ミルク
（μｌ） （μｌ）
１
１０００
０ ２
９９９
１ ３
９９８
２ ４
９９５
５ ５
９９０
１０
６ ９８０
２０
７ ９５０
５０
８ ９００
１００
９ ８０
０ ２００
１０ ５０
０ ５００
１１
０ １０００接種ミルク試
料中の生物体数を計数するため、一夜細胞懸濁後の１０
０μｌの一連の希釈液（１０−３，１０−４，１０−５
，１０−６，１０−７および１０−８）を標準方法寒天
上におき、３７℃で一夜インキュベートした。データを
計数する得られたコロニーは、試験管２−１１のバクテ
リア数を計数するために使用した。
殺菌ミルク 接種ミルク
（μｌ） （μｌ）
１
１０００
０ ２
９９９
１ ３
９９８
２ ４
９９５
５ ５
９９０
１０
６ ９８０
２０
７ ９５０
５０
８ ９００
１００
９ ８０
０ ２００
１０ ５０
０ ５００
１１
０ １０００接種ミルク試
料中の生物体数を計数するため、一夜細胞懸濁後の１０
０μｌの一連の希釈液（１０−３，１０−４，１０−５
，１０−６，１０−７および１０−８）を標準方法寒天
上におき、３７℃で一夜インキュベートした。データを
計数する得られたコロニーは、試験管２−１１のバクテ
リア数を計数するために使用した。
【００４２】一連の８個の１．５ｍｌマイクロ遠心分離
管を試験管立におき、番号を付けた。そして１．０ｍｌ
の上表の各試料１−８を各試験管に入れた。ミルクを室
温（２２℃）で１０時間インキュベートし、５００μｌ
の０．２５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．５％Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）溶液を各試験管に加
えた。試験管に蓋をし、１０回逆転して混合し、そして
試験管のヒンジが外側を向くように注意しながら、アン
グルヘッドマイクロ遠心分離器（Ｗｈｅａｔｏｎ）のロ
ーターにおいた。試験管を１２，０００ｇで１０分間遠
心分離し、上澄みをフォーシットアスピレーターについ
ている使い捨て式の１０００μｌピペットチップを使用
して除去した。試験管を僅かに傾けて、得られたペレッ
トを吸引もしくは破壊しないように、最後の残っている
上澄みをアスピレーターに注いだ。
管を試験管立におき、番号を付けた。そして１．０ｍｌ
の上表の各試料１−８を各試験管に入れた。ミルクを室
温（２２℃）で１０時間インキュベートし、５００μｌ
の０．２５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．５％Ｎｏｎｉ
ｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）溶液を各試験管に加
えた。試験管に蓋をし、１０回逆転して混合し、そして
試験管のヒンジが外側を向くように注意しながら、アン
グルヘッドマイクロ遠心分離器（Ｗｈｅａｔｏｎ）のロ
ーターにおいた。試験管を１２，０００ｇで１０分間遠
心分離し、上澄みをフォーシットアスピレーターについ
ている使い捨て式の１０００μｌピペットチップを使用
して除去した。試験管を僅かに傾けて、得られたペレッ
トを吸引もしくは破壊しないように、最後の残っている
上澄みをアスピレーターに注いだ。
【００４３】各ペレットに５００μｌの０．１ＭＭｇＣ
ｌ２、０．２％ＮＰ−４０溶液を加え、試験管に蓋をし
、細胞がペレットに再懸濁するように旋回し、次いで試
験管を前と同じように遠心分離した。遠心分離後、上澄
みを再度吸引し、次いで５００μｌの０．１ＭＭｇＣｌ
２、０．２％ＮＰ−４０を各試験管に加えた。試験管に
蓋をし、遠心分離し、前と同じように吸引した。
ｌ２、０．２％ＮＰ−４０溶液を加え、試験管に蓋をし
、細胞がペレットに再懸濁するように旋回し、次いで試
験管を前と同じように遠心分離した。遠心分離後、上澄
みを再度吸引し、次いで５００μｌの０．１ＭＭｇＣｌ
２、０．２％ＮＰ−４０を各試験管に加えた。試験管に
蓋をし、遠心分離し、前と同じように吸引した。
【００４４】各試験管に、細胞ＡＴＰを抽出するため、
５０μｌの１％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．０００５％キシレノールブルー溶液を加えた
。試験管を旋回し、室温で１０分間インキュベートした
。
５０μｌの１％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．０００５％キシレノールブルー溶液を加えた
。試験管を旋回し、室温で１０分間インキュベートした
。
【００４５】使い捨てのピペットチップを使用して、Ｔ
ＣＡ抽出物をルミノメーターキュヴェット（Ｓａｒｓｔ
ｅｄｔ）に移し、４００μｌの０．１Ｍのトリス−酢酸
緩衝液、ｐＨ７．７５で中和した。ルシフェラーゼ反応
を開始するため、１００μｌのルシフェラーゼ−ルシフ
ェリン試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗ
Ｉ）を加え、次いで１０秒のインテグレーション時間を
用いるＢｅｒｔｈｏｌｄ ９５０１ ルミノメータ
ー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ， Ｍｕ
ｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて放出光を測定し
た。放出光の結果は、相対的光単位（ＲＬＵ）として、
記録された。
ＣＡ抽出物をルミノメーターキュヴェット（Ｓａｒｓｔ
ｅｄｔ）に移し、４００μｌの０．１Ｍのトリス−酢酸
緩衝液、ｐＨ７．７５で中和した。ルシフェラーゼ反応
を開始するため、１００μｌのルシフェラーゼ−ルシフ
ェリン試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗ
Ｉ）を加え、次いで１０秒のインテグレーション時間を
用いるＢｅｒｔｈｏｌｄ ９５０１ ルミノメータ
ー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ， Ｍｕ
ｎｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて放出光を測定し
た。放出光の結果は、相対的光単位（ＲＬＵ）として、
記録された。
【００４６】同様に調整された汚染ミルク試料（試験管
１−１１）を用いて、各ミルク試料の５０μｌを市販の
利用できるミルクバクテリア検出キット（商品名Ｌｕｍ
ａｃ ｂｖ， オランダ）を使用し、製造者のプロトコ
ルに従い分析した。
１−１１）を用いて、各ミルク試料の５０μｌを市販の
利用できるミルクバクテリア検出キット（商品名Ｌｕｍ
ａｃ ｂｖ， オランダ）を使用し、製造者のプロトコ
ルに従い分析した。
【００４７】これらの検定結果を図２に要約した。本発
明および市販の利用できるミルク検定キットに対して、
ＲＬＵ（ｙ軸）をミリリットル当たりのコロニー形成単
位（ＣＦＵ）におけるバクテリア数（ｘ軸）に対してプ
ロットした。本発明の感度は、１×１０４細胞／ｍｌよ
りも小さく、一方Ｌｕｍａｃ検定の感度は約１×１０６
細胞／ｍｌであることが見いだされた。
明および市販の利用できるミルク検定キットに対して、
ＲＬＵ（ｙ軸）をミリリットル当たりのコロニー形成単
位（ＣＦＵ）におけるバクテリア数（ｘ軸）に対してプ
ロットした。本発明の感度は、１×１０４細胞／ｍｌよ
りも小さく、一方Ｌｕｍａｃ検定の感度は約１×１０６
細胞／ｍｌであることが見いだされた。
【００４８】実施例２
この実施例は、１１個の生ミルク試料および１個の殺菌
ミルク試料からの微生物細胞の分離を開示する。
ミルク試料からの微生物細胞の分離を開示する。
【００４９】生ミルク試料を地方の乳牛場から受け取り
、４℃で貯蔵した。殺菌ミルクもまた本検査に含まれる
。各ミルク試料１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフ試
験管にピペットで入れた。この操作をそれぞれについて
２回繰り返した。ミルク試料を室温で１０分間インキュ
ベートし、次いで０．５ｍｌの０．５％ＮＰ−４０、３
％ニトリロトリ酢酸（ナトリウム塩）を各試験管に加え
た。試験管に蓋をし、１０回逆転して混合した。
、４℃で貯蔵した。殺菌ミルクもまた本検査に含まれる
。各ミルク試料１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフ試
験管にピペットで入れた。この操作をそれぞれについて
２回繰り返した。ミルク試料を室温で１０分間インキュ
ベートし、次いで０．５ｍｌの０．５％ＮＰ−４０、３
％ニトリロトリ酢酸（ナトリウム塩）を各試験管に加え
た。試験管に蓋をし、１０回逆転して混合した。
【００５０】試験管を１２，０００ｇで５分間室温で遠
心分離し、上澄みを実施例１と同様にして吸引した。各
ペレットに０．５ｍｌの０．０５ｍＭＭｇＣｌ２、０．
２％ＮＰ−４０溶液を加え、試験管に蓋をし、旋回し、
上記と同じように５分間遠心分離した。遠心分離後、上
澄みを再吸引し、そして洗浄、遠心分離および吸引をも
う一度繰り返した。
心分離し、上澄みを実施例１と同様にして吸引した。各
ペレットに０．５ｍｌの０．０５ｍＭＭｇＣｌ２、０．
２％ＮＰ−４０溶液を加え、試験管に蓋をし、旋回し、
上記と同じように５分間遠心分離した。遠心分離後、上
澄みを再吸引し、そして洗浄、遠心分離および吸引をも
う一度繰り返した。
【００５１】得られたペレットをＴＣＡ溶液で処理し、
実施例１と同様に操作してルミノメーターで測定した。 各試料の結果は、測定を２度繰り返した結果の平均であ
る。各ミルク試料をもまた、無菌の０．８％ＮａＣｌで
希釈し、１．０ｍｌの１０倍希釈液をペトリ皿にピペッ
トで加えた。この操作もそれぞれについて２回繰り返し
た。約２０ｍｌの無菌標準法寒天を各皿に加え、混合し
た。プレートを２３℃で４８時間インキュベートし、コ
ロニーを計数した。結果は２回繰り返したプレート計数
値の平均である。
実施例１と同様に操作してルミノメーターで測定した。 各試料の結果は、測定を２度繰り返した結果の平均であ
る。各ミルク試料をもまた、無菌の０．８％ＮａＣｌで
希釈し、１．０ｍｌの１０倍希釈液をペトリ皿にピペッ
トで加えた。この操作もそれぞれについて２回繰り返し
た。約２０ｍｌの無菌標準法寒天を各皿に加え、混合し
た。プレートを２３℃で４８時間インキュベートし、コ
ロニーを計数した。結果は２回繰り返したプレート計数
値の平均である。
【００５２】本実施例の結果を図３に示す。コロニー形
成単位（ＣＦＵ）とＲＬＵとの間には、検査範囲にわた
る直線状の対応が認められた。本データの相間計数は０
．９９４であり、２つの方法の間に有意の相間関係があ
ることを示す。
成単位（ＣＦＵ）とＲＬＵとの間には、検査範囲にわた
る直線状の対応が認められた。本データの相間計数は０
．９９４であり、２つの方法の間に有意の相間関係があ
ることを示す。
【００５３】実施例３
本実施例は、実施例２の方法を変更した方法を使用した
６５個の生ミルクからの微生物細胞の分離を開示する。
６５個の生ミルクからの微生物細胞の分離を開示する。
【００５４】ミルク試料を、微生物ペレットの処理にプ
ロテアーゼ処理を加えた外は実施例２と同様に処理した
。
ロテアーゼ処理を加えた外は実施例２と同様に処理した
。
【００５５】第１の遠心分離工程の後に、得られたペレ
ットを５００μｌの０．０５ＭＭｇＣｌ２、０．２％Ｎ
Ｐ−４０、および３０μｇのα−キモトリプシン（Ｓｉ
ｇｍａ， Ｃａｔ． Ｃ７７６２）に溶解した。ペレッ
トを２秒間で３回逆転し、そして試験管を室温で２０分
間インキュベートした。残りの工程は実施例２と同様に
操作した。
ットを５００μｌの０．０５ＭＭｇＣｌ２、０．２％Ｎ
Ｐ−４０、および３０μｇのα−キモトリプシン（Ｓｉ
ｇｍａ， Ｃａｔ． Ｃ７７６２）に溶解した。ペレッ
トを２秒間で３回逆転し、そして試験管を室温で２０分
間インキュベートした。残りの工程は実施例２と同様に
操作した。
【００５６】図４は、この方法による６５個の生ミルク
におけるＣＦＵ／ｍｌとＲＬＵとの相関関係を示す。２
つの方法の間に正の相関関係があることを示している。
におけるＣＦＵ／ｍｌとＲＬＵとの相関関係を示す。２
つの方法の間に正の相関関係があることを示している。
【００５７】実施例４
本実施例は、実施例３の方法を変更した方法を使用した
８８個の生ミルクからの微生物細胞の分離を開示する。
８８個の生ミルクからの微生物細胞の分離を開示する。
【００５８】各生ミルク試料１．０ｍｌに５００μｌの
３％ニトリロトリ酢酸（ナトリウム塩）溶液、０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、ついで実施例３と
同様に処理した。第１の遠心分離工程からの上澄みを吸
引した後、０．０５ｍＭＭｇＣｌ２、０．０１％ポリス
チレン粒子（０．９８４μｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｓ，
Ｃａｒｍｅｌ）を含有する０．２％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００および６０μｇ／ｍｌのα−キモトリプシン
の溶液を加えた。ポリスチレン粒子は、遠心分離により
細胞と共に除去された。 試料をインキュベートし、遠心分離し、実施例３と同様
にして吸引し、そしてペレットを０．０５ｍＭＭｇＣｌ
２、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に再懸濁し、
逆転し、再度遠心分離を実施した。残りの工程は、実施
例３と同様に実施した。本実施例の結果を、図５に示す
。 ２つの方法間に正の相関関係が認められた。
３％ニトリロトリ酢酸（ナトリウム塩）溶液、０．５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、ついで実施例３と
同様に処理した。第１の遠心分離工程からの上澄みを吸
引した後、０．０５ｍＭＭｇＣｌ２、０．０１％ポリス
チレン粒子（０．９８４μｍ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｓ，
Ｃａｒｍｅｌ）を含有する０．２％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００および６０μｇ／ｍｌのα−キモトリプシン
の溶液を加えた。ポリスチレン粒子は、遠心分離により
細胞と共に除去された。 試料をインキュベートし、遠心分離し、実施例３と同様
にして吸引し、そしてペレットを０．０５ｍＭＭｇＣｌ
２、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に再懸濁し、
逆転し、再度遠心分離を実施した。残りの工程は、実施
例３と同様に実施した。本実施例の結果を、図５に示す
。 ２つの方法間に正の相関関係が認められた。
【００５９】実施例５
本実施例は、実施例４の方法を変更した方法を使用して
、１８個の生ミルクからの微生物細胞の分離を開示する
。
、１８個の生ミルクからの微生物細胞の分離を開示する
。
【００６０】本実施例では、第１のミルク処理工程で担
体ポリスチレン粒子（実施例４と同じ）の等量を３％ニ
トリロトリ酢酸（ナトリウム塩）、０．５％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００溶液に加えた。担体は次からの工程では加
えなかった。さらにα−キモトリプシンを第１の洗浄溶
液における１５０μｍ／ｍｌの第１の濃縮として使用し
た。残りの方法は、実施例４と同様に操作した。
体ポリスチレン粒子（実施例４と同じ）の等量を３％ニ
トリロトリ酢酸（ナトリウム塩）、０．５％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００溶液に加えた。担体は次からの工程では加
えなかった。さらにα−キモトリプシンを第１の洗浄溶
液における１５０μｍ／ｍｌの第１の濃縮として使用し
た。残りの方法は、実施例４と同様に操作した。
【００６１】図６に相関関係の結果を示す。２つの方法
の間に相関関係が認められた。
の間に相関関係が認められた。
【００６２】実施例６
本実施例は、濾過装置を使用する本発明の有用性を開示
する。
する。
【００６３】１組の接種された殺菌ミルク試料を実施例
１と同様にして調製した。実施例１における試験管１ー
１１に対応する試料を使用した。
１と同様にして調製した。実施例１における試験管１ー
１１に対応する試料を使用した。
【００６４】各試料に、３００μｌの０．５ＭのＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０、および３００μｌの１％ＮＰ−４０を
加えた。試験管に蓋をし、混合するために１０Ｘ旋回し
、そして１２，０００ｇで１０分間遠心分離した。上澄
みを吸引により除去し、ペレットを２００μｌの０．１
ＭＭｇＣｌ２、０．２％ＮＰ−４０中に再懸濁するため
に旋回して懸濁させた。細胞懸濁液をスピン濾過装置（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ＵｌｔｒａｆｒｅｅＭＣ， ０
．４５μｍ）に入れ、１２，０００ｇで１０分間遠心分
離した。遠心分離後、フィルターインサートを蓋の無い
無菌のマイクロ遠心分離管に入れ、５０μｌの１％ＴＣ
Ａを加え、室温で１０分間インキュベートした。フィル
ターおよびホールダーを１０分間再度遠心分離してＴＣ
Ａ抽出物を集め、実施例１と同様に操作して分析した。
Ａ、ｐＨ８．０、および３００μｌの１％ＮＰ−４０を
加えた。試験管に蓋をし、混合するために１０Ｘ旋回し
、そして１２，０００ｇで１０分間遠心分離した。上澄
みを吸引により除去し、ペレットを２００μｌの０．１
ＭＭｇＣｌ２、０．２％ＮＰ−４０中に再懸濁するため
に旋回して懸濁させた。細胞懸濁液をスピン濾過装置（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， ＵｌｔｒａｆｒｅｅＭＣ， ０
．４５μｍ）に入れ、１２，０００ｇで１０分間遠心分
離した。遠心分離後、フィルターインサートを蓋の無い
無菌のマイクロ遠心分離管に入れ、５０μｌの１％ＴＣ
Ａを加え、室温で１０分間インキュベートした。フィル
ターおよびホールダーを１０分間再度遠心分離してＴＣ
Ａ抽出物を集め、実施例１と同様に操作して分析した。
【００６５】本実施例の結果を図７に、そして濾過タイ
プフォーマットにおける本発明の有用性を示す。本実施
例で検査した細胞範囲にわたって、ＲＬＵが投与量と良
い応答を示した。
プフォーマットにおける本発明の有用性を示す。本実施
例で検査した細胞範囲にわたって、ＲＬＵが投与量と良
い応答を示した。
【００６６】液状ミルク試料からの細胞成分分析用キッ
トは、下記の成分からなる：ＡＴＰ検出に使用する微生
物試験キットは、 （ａ） キレート化剤含有透明化溶液およびキレート
化剤および下記洗浄剤のような体細胞溶解洗浄剤、（ｂ
） 場合により、細胞ペレット洗浄用溶液、（ｃ）
微生物細胞放出用の上記したような細胞溶解溶液のよ
うなＡＴＰ抽出剤、 （ｄ） 場合により、緩衝液、 （ｅ） ルシフェラーゼ−ルシフェリンのようなＡＴ
Ｐ検出剤からなる。
トは、下記の成分からなる：ＡＴＰ検出に使用する微生
物試験キットは、 （ａ） キレート化剤含有透明化溶液およびキレート
化剤および下記洗浄剤のような体細胞溶解洗浄剤、（ｂ
） 場合により、細胞ペレット洗浄用溶液、（ｃ）
微生物細胞放出用の上記したような細胞溶解溶液のよ
うなＡＴＰ抽出剤、 （ｄ） 場合により、緩衝液、 （ｅ） ルシフェラーゼ−ルシフェリンのようなＡＴ
Ｐ検出剤からなる。
【００６７】Ｂｒｅｅｄ Ｓｍｅａｒを使用する微生
物検出キレートは、 （ａ） キレート化剤含有透明化溶液および上記した
ような体細胞溶解洗浄剤、 （ｂ） 場合により、細胞洗浄用の溶液、（ｃ）
細胞染色用溶液からなる。
物検出キレートは、 （ａ） キレート化剤含有透明化溶液および上記した
ような体細胞溶解洗浄剤、 （ｂ） 場合により、細胞洗浄用の溶液、（ｃ）
細胞染色用溶液からなる。
【００６８】ＡＴＰ検出を使用するウシ体細胞試験キッ
トは、 （ａ） 上記したようなキレート化剤を含有する透明
化溶液、 （ｂ） 微生物細胞を溶解しない体細胞溶解溶液、（
ｃ） ルシフェラーゼ−ルシフェリンのようなＡＴＰ
検出試薬からなる。
トは、 （ａ） 上記したようなキレート化剤を含有する透明
化溶液、 （ｂ） 微生物細胞を溶解しない体細胞溶解溶液、（
ｃ） ルシフェラーゼ−ルシフェリンのようなＡＴＰ
検出試薬からなる。
【００６９】上記キットのそれぞれは、実施例６に述べ
たようなフィルターを場合により含んでいてもよい。
たようなフィルターを場合により含んでいてもよい。
【００７０】本発明は、開示した具体例に限定されるも
のではなく、本発明の範囲に入る各種の変形を包含する
。
のではなく、本発明の範囲に入る各種の変形を包含する
。
【００７１】本発明の実施態様を次に示す。
【００７２】
【請求項１】 下記工程からなる液状ミルク試料から
細胞を分離濃縮する方法、 （ａ） キレート化剤をミルク試料と混合する工程、
（ｂ） 試料を遠心分離して、他のミルク成分から遠
心分離により除かれるペレット中の細胞成分を分離する
工程。
細胞を分離濃縮する方法、 （ａ） キレート化剤をミルク試料と混合する工程、
（ｂ） 試料を遠心分離して、他のミルク成分から遠
心分離により除かれるペレット中の細胞成分を分離する
工程。
【００７３】
【請求項２】 おもに細胞成分を含有する遠心分離で
除かれるペレットから上澄みを除去する工程をさらに含
む請求項１記載の方法。
除かれるペレットから上澄みを除去する工程をさらに含
む請求項１記載の方法。
【００７４】
【請求項３】 ペレットを液中に再懸濁し、懸濁液を
試験して微生物細胞の濃度を測定する工程をさらに含む
請求項２記載の方法。
試験して微生物細胞の濃度を測定する工程をさらに含む
請求項２記載の方法。
【００７５】
【請求項４】 細胞ペレットから上澄みを除去する工
程が、ペレット上の液体を吸引することにより実施され
る請求項２記載の方法。
程が、ペレット上の液体を吸引することにより実施され
る請求項２記載の方法。
【００７６】
【請求項５】 遠心分離工程の前に、体細胞を溶解す
るが微生物細胞を溶解しない溶解剤を試料と混合する工
程をさらに含む請求項１記載の方法。
るが微生物細胞を溶解しない溶解剤を試料と混合する工
程をさらに含む請求項１記載の方法。
【００７７】
【請求項６】 溶解剤が、非イオン性洗浄剤である請
求項５記載の方法。
求項５記載の方法。
【００７８】
【請求項７】 キレート化剤が、エチレンジアミン四
酢酸である請求項１記載の方法。
酢酸である請求項１記載の方法。
【００７９】
【請求項８】 キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸で
ある請求項１記載の方法。
ある請求項１記載の方法。
【００８０】
【請求項９】 キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミノ
フェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、
エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテ
ル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２−
ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミノ
ペンタ酢酸、クエン酸塩、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項１記載の方法。
フェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、
エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテ
ル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２−
ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミノ
ペンタ酢酸、クエン酸塩、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項１記載の方法。
【００８１】
【請求項１０】 再懸濁されたペレットを試験して、
細胞タイターを測定する請求項３記載の方法。
細胞タイターを測定する請求項３記載の方法。
【００８２】
【請求項１１】 試験が、ブリードスミアー試験であ
る請求項１０記載の方法。
る請求項１０記載の方法。
【００８３】
【請求項１２】 ペレットから上澄みを除去する工程
が、ペレットを液体中に再懸濁して再懸濁されたペレッ
トにブリードスミアー試験を実施して、細胞タイターを
測定する工程をさらに含む請求項５記載の方法。
が、ペレットを液体中に再懸濁して再懸濁されたペレッ
トにブリードスミアー試験を実施して、細胞タイターを
測定する工程をさらに含む請求項５記載の方法。
【００８４】
【請求項１３】 ペレットから上澄みを除去する工程
が、細胞ペレットに溶解剤を加えて細胞を溶解し、溶解
した試料を試験して試料中に存在するＡＴＰの相対的量
を測定する工程をさらに含む請求項５記載の方法。
が、細胞ペレットに溶解剤を加えて細胞を溶解し、溶解
した試料を試験して試料中に存在するＡＴＰの相対的量
を測定する工程をさらに含む請求項５記載の方法。
【００８５】
【請求項１４】 溶解試料を試験する工程が、試料に
ルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬を加え、試料から放
出された相対的光放出量を測定する工程を含む請求項１
３記載の方法。
ルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬を加え、試料から放
出された相対的光放出量を測定する工程を含む請求項１
３記載の方法。
【００８６】
【請求項１５】 液体中に細胞ペレットを懸濁し、体
細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない溶解剤を懸濁
液中に混合する工程をさらに含む請求項２記載の方法。
細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない溶解剤を懸濁
液中に混合する工程をさらに含む請求項２記載の方法。
【００８７】
【請求項１６】 溶解剤との混合後試料を遠心分離し
、上澄みを除去し、残りのペレットを液体中に再懸濁し
、細胞ペレットに微生物細胞からのＡＴＰ抽出剤を添加
し、そして試料のＡＴＰを定量的に試験する工程をさら
に含む請求項１５記載の方法。
、上澄みを除去し、残りのペレットを液体中に再懸濁し
、細胞ペレットに微生物細胞からのＡＴＰ抽出剤を添加
し、そして試料のＡＴＰを定量的に試験する工程をさら
に含む請求項１５記載の方法。
【００８８】
【請求項１７】 ＡＴＰ抽出工程が、試料にルシフェ
ラーゼ−ルシフェリン試薬を加え、試料から放出された
光の相対的量を測定する請求項１６記載の方法。
ラーゼ−ルシフェリン試薬を加え、試料から放出された
光の相対的量を測定する請求項１６記載の方法。
【００８９】
【請求項１８】 ＡＴＰ抽出剤が、微生物細胞を溶解
する溶解剤である請求項１６記載の方法。
する溶解剤である請求項１６記載の方法。
【００９０】
【請求項１９】 懸濁液を遠心分離し、おもに微生物
細胞であるペレット中の細胞から上澄みを分離する工程
をさらに含む請求項１５記載の方法。
細胞であるペレット中の細胞から上澄みを分離する工程
をさらに含む請求項１５記載の方法。
【００９１】
【請求項２０】 ペレットから分離された上澄み液を
試験してＡＴＰ濃度を測定する工程をさらに含む請求項
１９記載の方法。
試験してＡＴＰ濃度を測定する工程をさらに含む請求項
１９記載の方法。
【００９２】
【請求項２１】 ＡＴＰの試験工程が、上澄みにルシ
フェラーゼ−ルシフェリン試薬を添加し、試料から放出
された相対的光を測定する工程を含む請求項２０記載の
方法。
フェラーゼ−ルシフェリン試薬を添加し、試料から放出
された相対的光を測定する工程を含む請求項２０記載の
方法。
【００９３】
【請求項２２】 微生物細胞からＡＴＰを抽出する薬
剤を、ペレット中の細胞に加え、ついでＡＴＰの量的水
準を測定する工程をさらに含む請求項１９記載の方法。
剤を、ペレット中の細胞に加え、ついでＡＴＰの量的水
準を測定する工程をさらに含む請求項１９記載の方法。
【００９４】
【請求項２３】 ＡＴＰ抽出剤が、溶解剤である請求
項２２記載の方法。
項２２記載の方法。
【００９５】
【請求項２４】 ＡＴＰ水準の試験工程が、試料にル
シフェラーゼ−ルシフェリン試薬を加え、試料から放出
された相対的光を測定する工程からなる請求項２２記載
の方法。
シフェラーゼ−ルシフェリン試薬を加え、試料から放出
された相対的光を測定する工程からなる請求項２２記載
の方法。
【００９６】
【請求項２５】 ペレットから上澄みを除去し、体細
胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない溶解剤とペレッ
ト中の細胞を混合し、試料を遠心分離し、上澄み液を除
去し、得られたペレット中の細胞に再度体細胞を溶解す
るが微生物細胞を溶解しない溶解剤を添加し、上澄みを
除去し、次いで得られたペレットを微生物細胞の相対的
濃度測定のために試験する工程をさらに含む請求項５記
載の方法。
胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない溶解剤とペレッ
ト中の細胞を混合し、試料を遠心分離し、上澄み液を除
去し、得られたペレット中の細胞に再度体細胞を溶解す
るが微生物細胞を溶解しない溶解剤を添加し、上澄みを
除去し、次いで得られたペレットを微生物細胞の相対的
濃度測定のために試験する工程をさらに含む請求項５記
載の方法。
【００９７】
【請求項２６】 バクテリア細胞を安定化し細胞代謝
物の損失を防止する溶液中に遠心分離されたペレットを
再懸濁する工程をさらに含む請求項２５記載の方法。
物の損失を防止する溶液中に遠心分離されたペレットを
再懸濁する工程をさらに含む請求項２５記載の方法。
【００９８】
【請求項２７】 安定化溶液が、マグネシウムイオン
を含有する請求項２６記載の方法。
を含有する請求項２６記載の方法。
【００９９】
【請求項２８】 安定化溶液が、プロテアーゼを含有
する請求項２６記載の方法。
する請求項２６記載の方法。
【０１００】
【請求項２９】 プロテアーゼ含有溶液に遠心分離さ
れたペレットを再懸濁する工程をさらに含む請求項２記
載の方法。
れたペレットを再懸濁する工程をさらに含む請求項２記
載の方法。
【０１０１】
【請求項３０】 （ａ） キレート化剤および体細
胞溶解剤を含有する透明化剤； （ｂ） 微生物細胞ＡＴＰを放出するＡＴＰ抽出剤を
含有する溶液； （ｃ） ＡＴＰ検出試薬 からなるミルク試料の試験に用いる微生物試験キット。
胞溶解剤を含有する透明化剤； （ｂ） 微生物細胞ＡＴＰを放出するＡＴＰ抽出剤を
含有する溶液； （ｃ） ＡＴＰ検出試薬 からなるミルク試料の試験に用いる微生物試験キット。
【０１０２】
【請求項３１】 （１）遠心分離により得られた細胞
ペレットの洗浄用溶液および（２）緩衝液を含む請求項
３０の試験キット。
ペレットの洗浄用溶液および（２）緩衝液を含む請求項
３０の試験キット。
【０１０３】
【請求項３２】 ＡＴＰ検出試薬がルシフェラーゼ−
ルシフェリンである請求項３０記載の試験キット。
ルシフェリンである請求項３０記載の試験キット。
【０１０４】
【請求項３３】 ＡＴＰ抽出剤が微生物細胞を溶解す
る溶解剤である請求項３０記載の試験キット。
る溶解剤である請求項３０記載の試験キット。
【０１０５】
【請求項３４】 体細胞溶解剤が非イオン性洗浄剤で
ある請求項３０記載の試験キット。
ある請求項３０記載の試験キット。
【０１０６】
【請求項３５】 キレート化剤がエチレンジアミン四
酢酸である請求項３０記載の試験キット。
酢酸である請求項３０記載の試験キット。
【０１０７】
【請求項３６】 キレート化剤がニトリロトリ酢酸で
ある請求項３０記載の試験キット。
ある請求項３０記載の試験キット。
【０１０８】
【請求項３７】 キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミ
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸塩、アルギニン、ハイポザンチ
ン、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフ
ォン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテル
タイプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からな
る群から選ばれたものである請求項３０記載の試験キッ
ト。
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸塩、アルギニン、ハイポザンチ
ン、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフ
ォン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテル
タイプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からな
る群から選ばれたものである請求項３０記載の試験キッ
ト。
【０１０９】
【請求項３８】 ＡＴＰ抽出剤が、トリクロロ酢酸溶
液である請求項３０記載の試験キット。
液である請求項３０記載の試験キット。
【０１１０】
【請求項３９】 ＡＴＰ抽出剤溶液が、エチレンジア
ミン四酢酸およびキシレノールブルーをも含有する請求
項３８記載の試験キット。
ミン四酢酸およびキシレノールブルーをも含有する請求
項３８記載の試験キット。
【０１１１】
【請求項４０】 ミルク成分から細胞を濾過するため
のフィルターをさらに含有する請求項３０記載の試験キ
ット。
のフィルターをさらに含有する請求項３０記載の試験キ
ット。
【０１１２】
【請求項４１】 （ａ） キレート化剤および体細
胞溶解剤を含有する透明化剤； （ｂ） 細胞染色用溶液 とからなるブリードスミアーのような細胞計数試験と協
力してミルク試料を試験するための微生物試験キット。
胞溶解剤を含有する透明化剤； （ｂ） 細胞染色用溶液 とからなるブリードスミアーのような細胞計数試験と協
力してミルク試料を試験するための微生物試験キット。
【０１１３】
【請求項４２】 遠心分離から得られた細胞ペレット
の洗浄溶液をさらに含有する請求項４１記載の試験キッ
ト。
の洗浄溶液をさらに含有する請求項４１記載の試験キッ
ト。
【０１１４】
【請求項４３】 体細胞溶解剤が、非イオン性洗浄剤
である請求項４１記載の試験キット。
である請求項４１記載の試験キット。
【０１１５】
【請求項４４】 透明化剤が、エチレンジアミン四酢
酸である請求項４１記載の試験キット。
酸である請求項４１記載の試験キット。
【０１１６】
【請求項４５】 キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸
である請求項４１記載の試験キット。
である請求項４１記載の試験キット。
【０１１７】
【請求項４６】 キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミ
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項３０記載の試験キット
。
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項３０記載の試験キット
。
【請求項４７】 ミルク成分からの細胞濾過用フィル
ターをさらに含む請求項４１記載の試験キット。
ターをさらに含む請求項４１記載の試験キット。
【０１１８】
【請求項４８】 （ａ） キレート化剤を含有する
透明化剤； （ｂ） 体細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない
剤を含有する溶液； （ｃ） ＡＴＰ検出試薬からなるミルク試料の体細胞
試験用に使用する試験キット。
透明化剤； （ｂ） 体細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない
剤を含有する溶液； （ｃ） ＡＴＰ検出試薬からなるミルク試料の体細胞
試験用に使用する試験キット。
【０１１９】
【請求項４９】 ＡＴＰ検出試薬が、ルシフェラーゼ
−ルシフェリンである請求項４８記載の試験キット。
−ルシフェリンである請求項４８記載の試験キット。
【０１２０】
【請求項５０】 体細胞溶解剤が、非イオン性洗浄剤
である請求項４８記載の試験キット。
である請求項４８記載の試験キット。
【０１２１】
【請求項５１】 キレート化剤が、エチレンジアミン
四酢酸である請求項４８記載の試験キット。
四酢酸である請求項４８記載の試験キット。
【０１２２】
【請求項５２】 キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸
である請求項４８記載の試験キット。
である請求項４８記載の試験キット。
【０１２３】
【請求項５３】 キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミ
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項４８記載の試験キット
。
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項４８記載の試験キット
。
【請求項５４】 ミルク成分からの細胞濾過用のフィ
ルターをさらに含む請求項４８記載の試験キット。
ルターをさらに含む請求項４８記載の試験キット。
【０１２４】
【請求項５５】 （ａ） キレート化剤をミルク試
料と混合する工程； （ｂ） ミルク成分から試料中の細胞を分離する工程
、とからなる他のミルク成分から試料中の細胞を分離濃
縮するための液状ミルク試料の処理方法。
料と混合する工程； （ｂ） ミルク成分から試料中の細胞を分離する工程
、とからなる他のミルク成分から試料中の細胞を分離濃
縮するための液状ミルク試料の処理方法。
【０１２５】
【請求項５６】 分離工程が、試料の遠心分離を実施
して、他のミルク成分から遠心分離により除去されるペ
レット中の細胞成分を分離する請求項５５記載の処理方
法。
して、他のミルク成分から遠心分離により除去されるペ
レット中の細胞成分を分離する請求項５５記載の処理方
法。
【０１２６】
【請求項５７】 細胞の分離工程が、細胞をブロック
し、キレート化剤と結合した他のミルク成分を通過する
フィルターで試料を濾過する工程を含む請求項５５記載
の処理方法。
し、キレート化剤と結合した他のミルク成分を通過する
フィルターで試料を濾過する工程を含む請求項５５記載
の処理方法。
【０１２７】
【請求項５８】 おもに細胞成分を含有するペレット
から上澄みを除去する工程をさらに含む請求項５６記載
の処理方法。
から上澄みを除去する工程をさらに含む請求項５６記載
の処理方法。
【０１２８】
【請求項５９】 キレート化剤が、エチレンジアミン
四酢酸である請求項５５記載の処理方法。
四酢酸である請求項５５記載の処理方法。
【０１２９】
【請求項６０】 キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸
である請求項５５記載の処理方法。
である請求項５５記載の処理方法。
【０１３０】
【請求項６１】 キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミ
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項５５記載の処理方法。
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項５５記載の処理方法。
【０１３１】
【請求項６２】 キレート化剤および体細胞溶解剤が
、液体中における溶液であることからなるミルク試料に
使用するための透明化剤。
、液体中における溶液であることからなるミルク試料に
使用するための透明化剤。
【０１３２】
【請求項６３】 体細胞溶解剤が、非イオン性洗浄剤
である請求項６２記載の透明化剤。
である請求項６２記載の透明化剤。
【０１３３】
【請求項６４】 キレート化剤が、エチレンジアミン
四酢酸である請求項６２記載の透明化剤。
四酢酸である請求項６２記載の透明化剤。
【０１３４】
【請求項６５】 キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸
である請求項６２記載の透明化剤。
である請求項６２記載の透明化剤。
【０１３５】
【請求項６６】 キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミ
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項６２記載の透明化剤。
ノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸
、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエー
テル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２
−ジアミノシクロヘキサン四酢酸、ジエチレントリアミ
ンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン
、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォ
ン酸、ナトリウムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタ
イプ化合物および誘導体およびこれらの前駆体からなる
群から選ばれたものである請求項６２記載の透明化剤。
【図１】 液状ミルク試料を使用する本発明の一般的
工程を示す。
工程を示す。
【図２】 実施例１の試料中の微生物濃度に対して本
発明の方法および他の方法に従って分析された試料中の
相対的光単位（ＲＬＵ）を示すグラフである。
発明の方法および他の方法に従って分析された試料中の
相対的光単位（ＲＬＵ）を示すグラフである。
【図３】 実施例２におけるミルクからの微生物細胞
の分離に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）とＲＬＵと
の相間関係を示すグラフである。
の分離に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）とＲＬＵと
の相間関係を示すグラフである。
【図４】 実施例３における微生物細胞の分離に対す
るＣＦＵとＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。
るＣＦＵとＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。
【図５】 実施例４における微生物細胞の分離に対す
るＣＦＵとＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。
るＣＦＵとＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。
【図６】 実施例５における微生物細胞の分離に対す
るＣＦＵとＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。
るＣＦＵとＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。
【図７】 実施例６で試験された試料中における人工
的に接種された量とＲＬＵとの相間関係を示すグラフで
ある。
的に接種された量とＲＬＵとの相間関係を示すグラフで
ある。
１０：遠心分離容器
１５：パッド
１６：透明液領域
１７：細胞ペレット
Claims (27)
- 【請求項１】 下記工程からなる液状ミルク試料から
細胞を分離濃縮する方法、 （ａ） キレート化剤をミルク試料と混合する工程、
（ｂ） 試料を遠心分離して、他のミルク成分から遠
心分離により区分されたペレット中の細胞成分を分離す
る工程。 - 【請求項２】 おもに細胞成分を含有する遠心分離で
区分されたペレットから上澄みを除去する工程をさらに
含む請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ペレットを液中に再懸濁し、懸濁液を
試験して微生物細胞の濃度を測定する工程をさらに含む
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 細胞ペレットから上澄みを除去する工
程が、ペレット上の液体を吸引することにより実施され
る請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 遠心分離工程の前に、体細胞を溶解す
るが微生物細胞を溶解しない溶解剤を試料と混合する工
程をさらに含む請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 再懸濁されたペレットを試験して、細
胞タイターを測定する請求項３記載の方法。 - 【請求項７】 試験が、ブリードスミアー試験である
請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 ペレットから上澄みを除去する工程が
、ペレットを液体中に再懸濁して再懸濁されたペレット
にブリードスミアー試験を実施して、細胞タイターを測
定する工程をさらに含む請求項５記載の方法。 - 【請求項９】 ペレットから上澄みを除去する工程が
、細胞ペレットに溶解剤を加えて細胞を溶解し、溶解し
た試料を試験して試料中に存在するＡＴＰの相対的量を
測定する工程をさらに含む請求項５記載の方法。 - 【請求項１０】 溶解試料を試験する工程が、試料に
ルシフェラーゼ−ルシフェリン試薬を加え、試料から放
出された相対的光放出量を測定する工程を含む請求項９
記載の方法。 - 【請求項１１】 液体中に細胞ペレットを懸濁し、体
細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない溶解剤を懸濁
液中に混合する工程をさらに含む請求項２記載の方法。 - 【請求項１２】 溶解剤との混合後試料を遠心分離し
、上澄みを除去し、残りのペレットを液体中に再懸濁し
、細胞ペレットに微生物細胞からのＡＴＰ抽出剤を添加
し、そして試料のＡＴＰを定量的に試験する工程をさら
に含む請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 ＡＴＰ抽出工程が、試料にルシフェ
ラーゼ−ルシフェリン試薬を加え、試料から放出された
光の相対的量を測定する請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 ＡＴＰ抽出剤が、微生物細胞を溶解
する溶解剤である請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 懸濁液を遠心分離し、おもに微生物
細胞であるペレット中の細胞から上澄みを分離する工程
をさらに含む請求項１１記載の方法。 - 【請求項１６】 ペレットから分離された上澄み液を
試験してＡＴＰ濃度を測定する工程をさらに含む請求項
１５記載の方法。 - 【請求項１７】 微生物細胞からＡＴＰを抽出する薬
剤を、ペレット中の細胞に加え、ついでＡＴＰの量的水
準を測定する工程をさらに含む請求項１５記載の方法。 - 【請求項１８】 ペレットから上澄みを除去し、体細
胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない溶解剤とペレッ
ト中の細胞を混合し、試料を遠心分離し、上澄み液を除
去し、得られたペレット中の細胞に再度体細胞を溶解す
るが微生物細胞を溶解しない溶解剤を添加し、上澄みを
除去し、次いで得られたペレットを微生物細胞の相対的
濃度測定のために試験する工程をさらに含む請求項５記
載の方法。 - 【請求項１９】 バクテリア細胞を安定化し細胞代謝
物の損失を防止する溶液中に遠心分離されたペレットを
再懸濁する工程をさらに含む請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 （ａ） キレート化剤および体細
胞溶解剤を含有する透明化剤； （ｂ） 微生物細胞ＡＴＰを放出するＡＴＰ抽出剤を
含有する溶液； （ｃ） ＡＴＰ検出試薬からなるミルク試料の試験に
用いる微生物試験キット。 - 【請求項２１】 （１）遠心分離により得られた細胞
ペレットの洗浄用溶液および（２）緩衝液を含む請求項
２０の試験キット。 - 【請求項２２】 ミルク成分から細胞を濾過するため
のフィルターをさらに含有する請求項２０記載の試験キ
ット。 - 【請求項２３】 （ａ） キレート化剤および体細
胞溶解剤を含有する透明化剤； （ｂ） 細胞染色用溶液とからなるブリードスミアー
のような細胞計数試験と協力してミルク試料を試験する
ための微生物試験キット。 - 【請求項２４】 ミルク成分からの細胞濾過用フィル
ターをさらに含む請求項２３記載の試験キット。 - 【請求項２５】 （ａ） キレート化剤を含有する
透明化剤； （ｂ） 体細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない
剤を含有する溶液； （ｃ） ＡＴＰ検出試薬からなるミルク試料の体細胞
試験用に使用する試験キット。 - 【請求項２６】 （ａ） キレート化剤をミルク試
料と混合する工程； （ｂ） ミルク成分から試料中の細胞を分離する工程
、とからなる他のミルク成分から試料中の細胞を分離濃
縮するための液状ミルク試料の処理方法。 - 【請求項２７】 分離工程が、試料の遠心分離を実施
して、他のミルク成分から遠心分離により除去されるペ
レット中の細胞成分を分離する請求項２６記載の処理方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54798190A | 1990-07-02 | 1990-07-02 | |
| US547,981 | 1990-07-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04228097A true JPH04228097A (ja) | 1992-08-18 |
Family
ID=24186943
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3181799A Pending JPH04228097A (ja) | 1990-07-02 | 1991-06-26 | ミルク試料からの細胞分離および濃縮方法とそのキット |
| JP3513059A Expired - Fee Related JP2867181B2 (ja) | 1990-07-02 | 1991-07-02 | 細胞の分離、濃縮および分析方法およびキット |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3513059A Expired - Fee Related JP2867181B2 (ja) | 1990-07-02 | 1991-07-02 | 細胞の分離、濃縮および分析方法およびキット |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5587286A (ja) |
| EP (1) | EP0542790B1 (ja) |
| JP (2) | JPH04228097A (ja) |
| AT (1) | ATE161015T1 (ja) |
| AU (1) | AU8296691A (ja) |
| DE (1) | DE69128425T2 (ja) |
| ES (1) | ES2110446T3 (ja) |
| WO (1) | WO1992000317A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007014255A (ja) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Nisshin Seifun Group Inc | 微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法 |
| JP2015116140A (ja) * | 2013-12-17 | 2015-06-25 | 株式会社ヤクルト本社 | 微生物の回収方法 |
Families Citing this family (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04228097A (ja) * | 1990-07-02 | 1992-08-18 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | ミルク試料からの細胞分離および濃縮方法とそのキット |
| DE9304954U1 (de) * | 1992-04-13 | 1993-08-12 | Biolac GmbH Gesellschaft für industrielle Nutzung von Milchinhaltsstoffen, 31097 Harbarnsen | Analyse-Kit zur Bestimmung der bakteriellen Keimzahl in Molke und Molkeninhaltsstoffen |
| US5646263A (en) * | 1994-09-19 | 1997-07-08 | Promega Corporation | High efficiency method for isolating target substances using a multisample separation device |
| GB9522679D0 (en) * | 1995-11-06 | 1996-01-10 | Celsis Int Plc | Assay for microrganisms and device for use therein |
| US5849488A (en) * | 1996-02-27 | 1998-12-15 | Oulutech Ltd. | DNA-sequence-based diagnosis of mastitis from a milk sample |
| US5908751A (en) * | 1996-04-26 | 1999-06-01 | Toyo Ink Mfg. Co., Ltd. | Method for detecting and/or determining ATP from microorganism cells in a sample |
| US5902722A (en) * | 1997-12-05 | 1999-05-11 | The Perkin-Elmer Corporation | Method of detecting organisms in a sample |
| EP1123501A4 (en) * | 1998-10-19 | 2005-04-13 | Cbd Technologies Ltd | METHOD FOR CONCENTRATING MICROORGANISMS USING AFFINITY SEPARATION |
| DE19904057C2 (de) * | 1999-02-02 | 2003-01-30 | Omya Ag Oftringen | Verfahren zur Bestimmung der mikrobiellen Kontamination |
| BR7901407U (pt) * | 1999-07-16 | 2001-02-28 | Andre Fernando Alves De Olivei | Tubo com escala especial destinado a teste para análise da quantidade de células |
| GB2352652A (en) * | 1999-08-06 | 2001-02-07 | Fsm Technologies Ltd | Pre-treating hollow fibre membranes for micro-organism detection |
| US7241566B2 (en) * | 2001-06-22 | 2007-07-10 | Marshfield Clinic | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella sp., E. coli O157:H7, and Listeria monocytogenes |
| US7268229B2 (en) * | 2001-11-02 | 2007-09-11 | Promega Corporation | Compounds to co-localize luminophores with luminescent proteins |
| US20040028665A1 (en) | 2002-01-08 | 2004-02-12 | Garner Bryan E. | Compositions and methods for inhibiting pathogenic growth |
| US6709868B2 (en) * | 2002-05-20 | 2004-03-23 | Portascience Inc. | Method and apparatus for measuring white blood cell count |
| KR100473703B1 (ko) * | 2002-08-23 | 2005-03-10 | 한미약품 주식회사 | 형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는단백질의 정제 방법 |
| KR20040022903A (ko) * | 2002-09-10 | 2004-03-18 | 에스케이케미칼주식회사 | 견섬유의 정련방법 |
| AU2003300008B2 (en) | 2002-12-23 | 2007-04-05 | Promega Corporation | Improved luciferase-based assays |
| AU2003300208A1 (en) | 2003-01-06 | 2004-08-10 | Nutrition Physiology Corporation | Compositions and methods for reducing the pathogen content of meat and meat products |
| US7132249B1 (en) | 2003-05-12 | 2006-11-07 | Charm Sciences, Inc. | Method of determining allergenic food on surfaces |
| US7494781B1 (en) | 2003-05-12 | 2009-02-24 | Charm Sciences, Inc. | Sensitive method for detecting low levels of ATP |
| TW200506345A (en) * | 2003-08-14 | 2005-02-16 | Au Optronics Corp | Water quality analysis method using potassium permanganate |
| AU2004269388B2 (en) * | 2003-08-29 | 2009-09-17 | Nutrition Physiology Company, Llc. | Methods for detecting and quantifying specific microorganisms |
| US20050048515A1 (en) * | 2003-08-29 | 2005-03-03 | Garner Bryan E. | Methods for detecting and quantifying specific probiotic microorganisms in animal feed |
| MXPA06002784A (es) * | 2003-09-12 | 2006-06-14 | Biocontrol Systems Inc | Metodos, composiciones y equipos para la concentracion y deteccion de microorganismos. |
| JP4810871B2 (ja) * | 2004-09-03 | 2011-11-09 | パナソニック株式会社 | 微生物検出方法 |
| US20060223071A1 (en) * | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Wisniewski Michele E | Methods, compositions, and kits for detecting nucleic acids in a single vessel |
| US20060240442A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-26 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| US20060246463A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-11-02 | Vevea Dirk N | Methods and oligonucleotides for the detection of Salmonella SP., E coli 0157:H7, and Listeria monocytogenes |
| WO2008045121A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-04-17 | Charm Sciences, Inc. | Method and apparatus for reducing luminescent test result interferences |
| EP2853587B1 (en) * | 2009-06-18 | 2017-10-11 | Merck Patent GmbH | Method for isolating cells |
| DE102011077238B4 (de) * | 2011-06-09 | 2016-03-31 | Bayerische Motoren Werke Aktiengesellschaft | Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel |
| US9932620B2 (en) | 2012-05-21 | 2018-04-03 | Celsis Ltd. | Methods, devices, and systems of detecting microorganisms |
| USD809475S1 (en) * | 2016-04-01 | 2018-02-06 | Bose Corporation | Set of headphones |
| GB201617713D0 (en) | 2016-10-19 | 2016-11-30 | Q-Linea Ab | Method for recovering microbial cells |
| CN109580928A (zh) * | 2017-09-28 | 2019-04-05 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 原料奶三种快速前处理方法 |
| WO2020160257A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Transformative Technologies | A stall side method for the detection of bacteria in dairy cattle |
| CN110437983A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-11-12 | 南京格致医学检验有限公司 | 一种基于尿液沉淀煮沸的dna提取装置及方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO146616C (no) * | 1979-10-04 | 1982-11-03 | Ken Heimreid | Fremgangsmaate og anordning ved preparering til undersoekelse av ukoagulert blod. |
| US4622362A (en) * | 1981-03-30 | 1986-11-11 | California Institute Of Technology | Polyacrolein microspheres |
| US4508625A (en) * | 1982-10-18 | 1985-04-02 | Graham Marshall D | Magnetic separation using chelated magnetic ions |
| DK258787D0 (da) * | 1987-05-21 | 1987-05-21 | Foss Electric As N | Fremgangsmaade til bestemmelse af bakteriekoncentration i en proeve |
| JPH04228097A (ja) * | 1990-07-02 | 1992-08-18 | Toyo Ink Mfg Co Ltd | ミルク試料からの細胞分離および濃縮方法とそのキット |
-
1991
- 1991-06-26 JP JP3181799A patent/JPH04228097A/ja active Pending
- 1991-07-02 EP EP91913748A patent/EP0542790B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-02 DE DE69128425T patent/DE69128425T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-02 JP JP3513059A patent/JP2867181B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-02 AT AT91913748T patent/ATE161015T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-07-02 ES ES91913748T patent/ES2110446T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-07-02 WO PCT/US1991/004727 patent/WO1992000317A1/en active IP Right Grant
- 1991-07-02 AU AU82966/91A patent/AU8296691A/en not_active Abandoned
-
1993
- 1993-01-11 US US08/003,242 patent/US5587286A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-07 US US08/485,428 patent/US5700645A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007014255A (ja) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Nisshin Seifun Group Inc | 微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法 |
| JP2015116140A (ja) * | 2013-12-17 | 2015-06-25 | 株式会社ヤクルト本社 | 微生物の回収方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0542790B1 (en) | 1997-12-10 |
| JPH06500462A (ja) | 1994-01-20 |
| US5587286A (en) | 1996-12-24 |
| EP0542790A1 (en) | 1993-05-26 |
| ES2110446T3 (es) | 1998-02-16 |
| DE69128425T2 (de) | 1998-04-09 |
| US5700645A (en) | 1997-12-23 |
| AU8296691A (en) | 1992-01-23 |
| EP0542790A4 (ja) | 1995-02-08 |
| JP2867181B2 (ja) | 1999-03-08 |
| WO1992000317A1 (en) | 1992-01-09 |
| ATE161015T1 (de) | 1997-12-15 |
| DE69128425D1 (de) | 1998-01-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH04228097A (ja) | ミルク試料からの細胞分離および濃縮方法とそのキット | |
| US20210017568A1 (en) | Device for determining antimicrobial susceptibility of a microorganism | |
| Gunasekera et al. | A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milk | |
| Ahmed et al. | Comparison of current methods used to detect Cryptosporidium oocysts in stools | |
| FI83539B (fi) | Foerfarande foer detektering av mikroorganismer i ett kroppsvaetskeprov. | |
| DE69122385T2 (de) | Neues und verbessertes verfahren zur bestimmung von e. coli in wasser | |
| JP2005503803A (ja) | 血液製剤及び／又はその派生物からの病原菌の濃縮及び検出装置及び方法 | |
| US20200299748A1 (en) | Method for determining the concentration of intact microorganisms in a sample | |
| Perry et al. | Evaluation of leukocyte esterase activity as a rapid screening technique for bacteriuria | |
| KR20200111720A (ko) | 미생물 농도를 결정하기 위한 방법 | |
| US6803208B2 (en) | Automated epifluorescence microscopy for detection of bacterial contamination in platelets | |
| CN110229918A (zh) | 一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒 | |
| NL1002744C1 (nl) | Analyse-kit voor de bepaling van het kiemgetalniveau in wei. | |
| CN110596383A (zh) | 基于荧光染色的通用型病原微生物快速磁分离鉴别方法及试剂盒 | |
| Hutcheson et al. | Evaluation of the stain Viablue for the rapid estimation of viable yeast cells | |
| US20200347432A1 (en) | Rapid methods for determining microorganism growth in samples of human origin | |
| US9169508B2 (en) | Method for real-time detection of microorganisms in a liquid culture medium using cellular lysis | |
| EP3740585B1 (en) | Improving detection of microorganisms | |
| JPH0975098A (ja) | 植物飲料中の生菌数の測定方法 | |
| JP2001004631A (ja) | 磁気ビーズ固定化抗体を用いた微生物の迅速検定法 | |
| MXPA01001873A (es) | Metodo y dispositivo para concentrar grupos selectos de microorganismos. | |
| Deak | Testing methods in food microbiology | |
| Arai et al. | Mutual and directional allogeneic cytotoxic reaction of hemocytes in the solitary ascidian Halocynthia roretzi revealed by one-step quantitative fluorimetric assay | |
| Kroll | The direct epifluorescent filter technique (DEFT) | |
| Bernaitis et al. | International Journal of Modern Pharmaceutical Research |