KR100473703B1 - 형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는단백질의 정제 방법 - Google Patents

형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는단백질의 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는 단백질을 정제하는 방법에 관한 것으로, a) 재조합 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 젖을 분비하도록 형질전환된 동물의 젖을 1차 원심분리한 후, 분리된 상층액에 유지방 및 지질을 흡착할 수 있는 비드를 가하고 2차 원심분리하여 상층액인 조단백질 분획을 획득하는 단계, b) 조단백질 분획의 pH를 4.0 에서 6.0 범위로 조절하여 재조합 펩타이드 또는 단백질을 가용화된 상태로 유지하는 단계, 및 c) pH가 조절된 조단백질 분획으로 연속적인 컬럼 크로마토그라피를 실시하여 순수하게 정제된 재조합 펩타이드 또는 단백질을 얻는 단계를 포함하는 본 발명의 방법을 사용하면 간단하고 효율적으로 재조합 펩타이드 또는 단백질을 정제할 수 있다.

Description

형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는 단백질의 정제 방법 {PROCESS FOR THE PURIFICATION OF A RECOMBINANT PEPTIDE OR PROTEIN FROM THE MILK OF A TRANSFORMED ANIMAL}
본 발명은 재조합 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 젖을 분비하도록 형질전환된 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질 유전자로 형질전환된 동물의 젖으로부터 발현된 펩타이드 또는 단백질을 정제하는 방법에 대한 보고는 많지 않고, 형질전환 흑염소의 경우는 더욱 보고된 바가 없다. 이러한 재조합 단백질은 발현량이 적기 때문에 정제 수율이 매우 중요하다. 형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 단백질을 정제하기 위해서는 유지방, 지질과 약 3 %에 달하는 카제인(casein) 단백질의 제거가 가장 중요하다. 유지방은 점도를 증가시키고 이후 컬럼 정제 단계에서 간섭현상을 유발할 수 있다. 유지방 및 지질의 제거를 위해서는 주로 원심분리 방법을 사용하나, 완벽한 제거가 불가능하고 시간이 많이 소요되며 수율이 낮은 단점이 있다. 카제인 단백질은 칼슘이온을 매개로 해서 미셀(micelle)을 형성하고 있어서 킬레이트제(chelating agent)를 첨가하여 미셀을 약화시킨 후 산 침전법으로 어느 정도 제거 가능하지만 정제하고자 하는 단백질의 특성에 따라 침전이 동시에 생길 수도 있어서 침전으로 인한 수율 저하의 단점이 있다.
미국특허 제 5,721,342 호에서는 염소 젖(goat milk)로부터 특정 펩타이드 정제를 위해 원심분리(2500 g X 20 분) 방법으로 1차 유지방 및 고형물을 제거하고 유리섬유(glass wool)에 통과시켜 추가로 유지방 및 지질을 제거하였다. 그리고 다시 80,000 g 에서 2 시간동안 원심분리하여 잔류 유지방을 제거하였는데, 수율이 낮고 소요시간이 긴 단점이 있다.
미국특허 제 6,268,487 호에서는 형질전환 염소 젖으로부터 펩타이드 정제시 유지방 제거를 위해 원심분리 방법을 사용하지 않고 탄젠셜 플로우(tangential flow) 여과 방법을 사용하여 높은 수율(75-90 %)과 정제 효율을 얻었다. 여러 포어 사이즈의 멤브레인을 사용하여 정제 효과도 있고, 원심분리법을 사용하지 않아 간편하다. 그러나 이 방법도 수율의 향상은 가능하지만 유지방 및 지질을 완전히 제거하기는 어렵다.
형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 단백질을 정제하기 위해서는 컬럼 정제시 높은 점도로 인해 간섭현상을 유발하는 유지방 및 지질의 제거가 선행되어야 한다. 그러나, 기존의 원심분리 및 여과 방법은 유지방 및 지질을 완전히 제거하지 못하고 장시간이 소요되며 효율도 떨어지기 때문에 개선이 필요하였다.
본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 노력한 결과, 형질전환 동물의 젖에서 발현된 목적 단백질을 정제하는데 있어서 젖에 포함된 유지방 및 지질을 제거하기 위해 원심분리 방법과 유지방 및 지질을 흡착할 수 있는 비드를 이용한 흡착방법을 병행함으로써 간단하고 완전하게 유지방 및 지질을 제거할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 재조합 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 젖을 분비하도록 형질전환된 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는 단백질을 간단하고 효율적으로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는
a) 재조합 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 젖을 분비하도록 형질전환된 동물의 젖을 1차 원심분리한 후 상층액에 유지방 및 지질을 흡착할 수 있는 비드를 가하고 2차 원심분리하여 상층액인 조단백질 분획을 획득하는 단계,
b) 조단백질 분획의 pH를 4.0 에서 6.0 범위로 조절하여 재조합 펩타이드 또는 단백질을 가용화된 상태로 유지하는 단계, 및
c) pH가 조절된 조단백질 분획으로 연속적인 컬럼 크로마토그라피를 실시하여 순수하게 정제된 재조합 펩타이드 또는 단백질을 얻는 단계를 포함하는, 형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는 단백질을 정제하는 방법이 제공된다.
상기 a) 단계는 젖에 포함된 유지방 및 지질을 제거하기 위한 전처리 단계로서, 여기에서 유지방 및 지질을 흡착하기 위해 사용할 수 있는 비드는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 안정성을 고려하여 선택되고, 교차결합 덱스트란(cross-linked Dextran) 비드를 예로 들 수 있으며, 특히, 세파덱스(SephadexR, 파마시아사) LH 20 비드(하이드록시 프로필화된 교차결합 덱스트란(hydroxypropylated, cross-linked dextran beads))를 사용하는 것이 바람직하다. 본 공정에서는 기존에 사용하던 원심분리 방법에 비드 흡착 방법을 추가로 사용함으로써 간단하고 완전하게 유지방 및 지질을 제거할 수 있으므로, 후속하는 컬럼 정제 단계에서 유발될 수 있는 간섭현상이 전혀 발생하지 않고 여과 공정도 용이한 장점이 있다.
또한, 단계 a)에서는 카제인 단백질로 형성된 미셀 파괴와 비드 흡착효율을 높이기 위한 목적으로 1차 원심분리 후 얻어진 상층액에 계면활성제를 첨가할 수 있으며, 계면활성제로는 트라이톤 X-100, 트윈 80, 트리부틸 포스페이트(Tributyl phosphate) 및 옥틸 글루코사이드(Octyl glucoside)로 이루어진 그룹에서 선택된 계면활성제를 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
b) 단계에서 조단백질 분획의 pH는 특히 재조합 펩타이드 또는 단백질의 등전점 이하로 조절하는 것이 바람직한데, 인간 과립구 콜로니 자극인자(human granulocyte colony stimulating factor: 이하 hG-CSF)를 예로 들자면 pH 4.0 내지 5.0 의 범위가 가장 바람직하다.
c) 단계의 연속적인 컬럼 크로마토그라피에서는 소수성 컬럼 크로마토그라피, 음이온 교환 크로마토그라피 및 젤 여과 크로마토그라피를 순차적으로 실시할 수 있다.
상기 크로마토그라피 단계에서, 소수성 컬럼으로는 페닐 세파로즈 컬럼(Phenyl Sepharose, 파마시아사), 옥틸 세파로즈 컬럼(Octyl Sepharose, 파마시아사)을 사용할 수 있다. 음이온 교환 수지로서는 DEAE 세파로즈(파마시아사), Q 세파로즈(파마시아사) 등을 사용할 수 있으며, 젤 여과 수지로서는 슈퍼덱스(Superdex, 파마시아사)(교차결합된 아가로즈 및 덱스트란(cross-linked agarose and dextran)), 세파덱스(Sephadex, 파마시아사)(교차결합된 덱스트란(cross-linked dextran))등을 사용할 수 있다.
각 크로마토그라피에서 용출액은 목적하는 재조합 펩타이드 또는 단백질의 성질에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있으며, 대표적인 것으로 트리스-염산 완충액, 인산나트륨 완충액 등을 예시할 수 있다. 용출액의 pH 역시 재조합 펩타이드 또는 단백질의 성질에 따라 적절히 조절하여 사용할 수 있으며, 일반적으로 pH 6 내지 8 범위 내에서 선택할 수 있다. 또한, 용출시 용출액에 염 농도구배를 도입함으로써 재조합 펩타이드 또는 단백질을 보다 순수하게 분리 정제할 수 있다.
본 발명의 정제 방법은 재조합 방법에 의해 포유동물의 젖에서 발현된 모든 펩타이드 또는 단백질의 정제에 적용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 인간 과립구 콜로니 자극 인자(hG-CSF)를 포함하는 젖을 분비하도록 형질전환된 흑염소의 젖으로부터 hG-CSF를 정제하는 경우를 예로 들어 본 발명의 방법을 상세히 설명한다. 형질전환된 흑염소의 젖에 포함된 인간 과립구 콜로니 자극 인자는 기존의 동물세포에서 발현된 hG-CSF 와 다른 당쇄화 형태를 보이는 5종의 이성체로 이루어져 있으며, 이를 정제하기 위해서는 상기의 크로마토그라피 과정에서 젤 여과 크로마토그라피 후에 고압 음이온 교환 크로마토그라피를 추가로 실시하는 것이 바람직하다.
고압 음이온 교환 크로마토그라피시 사용가능한 음이온 수지로는 폴리왁스 LP(PolyWAX LP, PolyLC), DEAE 5 PW(Waters) 등을 예시할 수 있으며, 용출액의 종류 및 pH는 상기에서 다른 크로마토그라피와 관련하여 설명한 범위내에서 선택할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 흑염소의 젖으로부터 최종 정제된 hG-CSF는 당쇄화 정도에 따라 다양한 분자량을 나타내는 5종류의 이성체로 분리되었다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예: 형질전환 흑염소 젖으로부터 hG-CSF의 정제
(단계 1) 형질전환 흑염소 젖의 전처리
대한민국 특허공개 제 2001-73966 호의 방법으로 얻어진 형질전환 흑염소로부터 착유하여 -70℃에 보관한 흑염소의 젖(입수처: 한미약품공업주식회사) 1 리터(L)를 상온에서 녹인 후, 100 mM 에틸렌디아민 테트라아세트산 (Ethylenediamine tetra acetate, EDTA)을 함유하는 최종 2 리터 용액으로 만들기 위해 증류수 600 ml 과 0.5 M EDTA 400 ml을 넣어 2배 희석한 후, 상온에서 20분간 서서히 교반시켰다. 용액을 15,000 g 에서 40 분간 원심분리하여 상층액만 회수하였다. 회수한 상층액에 계면활성제인 트라이톤 엑스-100(Triton X-100)과 트윈 80(Tween 80)이 각각 최종 0.5 %, 0.2 %(v/v) 되게 첨가한 다음 4 ℃에서 2 시간 동안 천천히 교반하였다. 유지방과 지질(lipid) 제거를 위해 세파덱스(Sephadex) LH 20(파마시아) 50 g 을 넣고 다시 상온에서 2 시간 동안 서서히 반응시킨 후, 5000 g 에서 10 분 동안 원심분리하여 상층액만 회수하였다. 남아있는 세파덱스 LH 20은 0.45 ㎛ 포아 사이즈(pore size)를 갖는 멤브레인으로 여과하여 완전히 제거하였다. 이렇게 회수된 상층액에 최종 10 mM 되게 초산나트륨(sodium acetate)을 첨가한 다음 2 % 초산(acetic acid)을 이용하여 pH를 4.5 로 조절한 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 천천히 교반시켰다. 침전물은 원심분리하여 제거하고 상층액만 회수하여 100 mM 트리스 염산(Tris-HCl, pH 7.5)이 되도록 만들었다.
(단계 2) 소수성 컬럼 크로마토그래피
단계 1에서 얻은 상층액에 염화나트륨(sodium chloride)을 최종 2 M 농도가 되게 가한 후 10 mM 트리스 염산(pH 7.5)과 2 M 염화나트륨 완충액으로 평형화 된 페닐 세파로즈(Phenyl sepharose) 컬럼(5 X 20 cm, 파마시아)에 흘려주어 결합시킨 다음, 상기 평형화 완충액을 컬럼에 충분히 흘려주어 결합하지 않은 불순물을 제거하였다. 10 mM 트리스 염산(pH 7.5) 완충액을 직선 농도구배 방법(완충액 중 NaCl 농도: 2 -> 0 M)으로 흘려주어 분획을 회수하였다.
(단계 3) 음이온 교환 크로마토그라피
단계 2의 페닐 세파로즈 컬럼 크로마토그라피에서 얻은 분획들로부터 hG-CSF ELISA 키트(R&D system사, 미국)를 이용하여 hG-CSF가 포함된 분획을 선별하였고, 제한크기가 5,000인 멤브레인을 사용하여 농축한 후 탈염 컬럼(desalting column, 2.6 x 10 cm, 파마시아)으로 용액에 존재하는 염을 완전히 제거하였다. 이 농축액을 10 mM 트리스 염산(pH 7.5) 완충액으로 평형화된 DEAE 세파로즈 컬럼(파마시아)에 흘려주어 결합시킨 후, 10 mM 트리스 염산(pH 7.5) 완충액을 직선 농도구배 방법(완충액 중 NaCl 농도: 1 -> 0 M)으로 흘려주어 단백질을 용출하였다. 용출된 분획들로부터 상기와 같은 ELISA 키트를 사용하여 hG-CSF 활성 분획을 선별하여 총 6개의 분획을 얻었다.
(단계 4) 겔 여과 크로마토그라피
단계 3의 DEAE 세파로즈 컬럼 크로마토그라피에서 얻은 6개의 분획을 분자량 제한크기가 5,000인 멤브레인을 사용하여 1 ml이 되도록 농축하여, 각각 10 mM 트리스 염산(pH 7.5)으로 평형화된 슈퍼덱스(Superdex) G-75 컬럼(1.6 X 60 cm, 파마시아)에 흘려준 후, 1 ml/분의 유속을 유지하며 분자량 17,000-30,000 달톤에 해당하는 분획을 얻었다.
(단계 5) 이온교환 고속 액체 크로마토그라피
10 mM 트리스 염산(pH 7.5) 완충액으로 평형화된 PolyWAX LP(0.46 X 20 cm, PolyLC) 컬럼에 단계 4의 겔 여과 크로마토그라피에서 나온 6개 분획을 각각 흘려 결합시킨 후, 10 mM 트리스 염산(pH 7.5) 완충액을 직선 농도구배 방법(완충액 중 NaCl 농도: 1 -> 0 M)으로 흘려주어 용출하였다. 용출되는 염 농도에 따라 5개의 다른 분획을 얻었으며, 분자량이 작은 것부터 각각을 G1, G2, G3, G4, G5라 명명하였다.
시험예 1: 확인시험
(1-1) 전기영동시험(SDS-PAGE)
상기 실시예의 방법에 따라 정제된 hG-CSF와, 대조구로서 대장균에서 생산된 비당쇄화된 G-CSF인 필그라스팀(Filgrastim, 분자량: 18.7 kDa, Amgen사) 및 CHO 세포에서 생산된 당쇄화된 G-CSF인 레노그라스팀(Lenograstim, 분자량: 19.6 kDa, Chugai사)을 15 % 폴리아크릴아미드 겔(Biorad사, 미국)을 사용하여 180 V 로 1시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 후 겔을 코마씨 블루 염색법에 의해 염색하여 얻은 결과는 도 1과 같다.
도 1에서 보듯이, G2는 상대적으로 소량이고 G1 과 완전한 분리가 어려웠고, G5는 레노그라스팀보다 크기가 큰 이성체로 보여지는데 크기가 다른 것은 당쇄화 정도의 차이로 인한 것으로 판단된다. G1은 필그라스팀보다 약간 크고, G3 와 G4는 동물세포에서 발현된 레노그라스팀과 일치하지는 않지만 비슷한 크기로 보인다. 즉, 형질전환 흑염소의 젖으로부터 당쇄 크기가 다른 hG-CSF 이성체를 5종류 확인할 수 있었다.
(1-2) 웨스턴 블라팅(Western blotting)
시험예 1-1과 동일하게 전기영동을 실시한 후, 블라팅용 완충액 (170 mM 글리신(glycine), 25 mM 트리스 염산(pH 8), 20 % 메탄올)에 충분히 적셔준 나이트로셀룰로스 막(Biorad사, 미국)을 이용하여 블라팅 키트(R&D사, 미국)로 1시간 가량 블라팅을 수행하였다. 그 후 나이트로셀룰로스 막을 1 % 카제인 용액에 1시간동안 방치하고 0.05 % 트윈 20을 포함하는 PBST 용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 염소 항-G-CSF 항체(RD system사, 미국)를 PBS로 1000 배 희석하여 가한 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완결된 후 PBST 용액으로 3회 세척하여 반응하지 않은 항체를 제거하였다. 여기에 HRP(horseradish peroxiase)-콘쥬게이트된 토끼 항-염소 IgG(Biorad사, 미국) 용액을 PBS에 2500 배 희석하여 가한 후 상온에서 2시간 동안 더 반응시켰다. 그 후 PBST로 세척하고 퍼옥시다아제 기질 키트(Biorad사, 미국) 용액을 가하여 발색시켰다. 결과는 도 1과 같다.
상기 웨스턴 블라팅 결과로부터 시험예 1-1의 전기영동에서 나타난 5 종류의 이성체는 모두 당쇄화 차이에 의해 생긴 hG-CSF의 이성체들임을 알 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하면 형질전환 동물의 젖으로부터 목적 펩타이드 또는 단백질을 정제하는데 있어서, 젖에 함유된 과량의 유지방 및 지질을 용이하게 제거하여 높은 효율로 목적 펩타이드 또는 단백질을 정제할 수 있다.
도 1은 정제된 hG-CSF 이성체의 분자량과 순도를 확인한 SDS-PAGE 결과 및 정제된 단백질이 hG-CSF임을 확인한 웨스턴 블라팅 결과를 나타낸 것이다.

Claims (13)

  1. a) 재조합 펩타이드 또는 단백질을 포함하는 젖을 분비하도록 형질전환된 동물의 젖을 1차 원심분리한 후, 분리된 상층액에 유지방 및 지질을 흡착할 수 있는 비드를 가하고 2차 원심분리하여 상층액인 조단백질 분획을 획득하는 단계,
    b) 조단백질 분획의 pH를 4.0 에서 6.0 범위로 조절하여 재조합 펩타이드 또는 단백질을 가용화된 상태로 유지하는 단계, 및
    c) pH가 조절된 조단백질 분획으로 연속적인 컬럼 크로마토그라피를 실시하여 순수하게 정제된 재조합 펩타이드 또는 단백질을 얻는 단계를 포함하는,
    형질전환 동물의 젖으로부터 재조합 펩타이드 또는 단백질을 정제하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    단계 a)의 비드가 교차결합 덱스트란 비드(cross-linked dextran beads)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    단계 a)의 비드가 하이드록시 프로필화된 교차결합 덱스트란 비드(hydroxypropylated, cross-linked dextran beads)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    단계 a)에서 1차 원심분리 후 얻어진 상층액에 계면활성제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    계면활성제는 트라이톤 X-100, 트윈 80, 트리부틸 포스페이트 및 옥틸 글루코사이드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    b) 단계에서 조단백질 분획의 pH를 pH 4.0 내지 6.0 범위 내에서 재조합 펩타이드 또는 단백질의 등전점 이하로 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    c) 단계의 컬럼 크로마토그라피는 소수성 컬럼 크로마토그라피, 음이온 교환 크로마토그라피 및 젤 여과 크로마토그라피를 순차적으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    소수성 컬럼이 페닐 세파로즈(Phenyl Sepharose) 컬럼인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    음이온 교환 컬럼이 DEAE 세파로즈 컬럼인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    젤 여과 컬럼이 교차결합된 아가로즈 및 덱스트란(cross-linked agarose and dextran) 젤로 충전된 컬럼인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서,
    크로마토그라피시 용출액의 pH 를 6 내지 8 범위로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    재조합 단백질이 인간 과립구 콜로니 자극 인자(hG-CSF)인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    인간 과립구 콜로니 자극 인자의 각 이성체를 정제하기 위해 c) 단계의 컬럼 크로마토그라피는 소수성 컬럼 크로마토그라피, 음이온 교환 크로마토그라피, 젤 여과 크로마토그라피 및 고압 음이온 교환 크로마토그라피를 순차적으로 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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