MXPA02006303A - Proceso para la purificacion de proteinas farmacologicamente activas a traves de cromografia del intercambio cationico. - Google Patents

Abstract

El objeto de la invencion es un proceso para la purificacion de proteinas farmacologicamente activas, basado en el uso de la cromatografia de intercambio cationico sobre una matriz solida, llevado a cabo a un pH mas basico, es decir, mayor, con respecto al pH correspondiente al punto isoelectrico, pI, de las proteinas a ser purificadas, pH al cual, sin embargo, las proteinas permanecen absorbidas. Son utilizadas soluciones amortiguadoras con valores de pH y de fuerza ionica ajustada de vez en vez al tipo de proteina farmacologicamente activa a ser purificada para obtener tal resultado. El proceso esta dirigido principalmente a la purificacion del interferon y proteinas de albumina.

Description

PROCESO PARA LA PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS FARMACOLÓGICAMENTE ACTIVAS A TRAVÉS DE CROMATOGRAFÍA DEL INTERCAMBIO CATIONICO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una parte amplia de las ciencias biomédicas se basa en sí en el uso de proteínas farmacológicamente activas tanto de origen natural, obtenidas por medio de técnicas extractivas, como de origen sintético, obtenidas por medio de técnicas de ADN recombinante. El nivel de pureza . de los productos de interés es importante en ambos casos, debido a que la comprensión de su actividad es determinada por la posibilidad de unir estrictamente el efecto biológico con la presencia de una cantidad fija de proteína. En este contacto el proceso de purificación de proteínas farmacológicamente activas ha ganado una parte importante debido a que la pureza de la proteína manufacturada asume un significado notable cuando los principios activos son excipientes contenidos en especialidades medicinales están implicados. La posibilidad de causar efectos tóxicos y/o producir efectos adversos durante la terapia han impulsado en efecto a las autoridades responsables del registro y autorización de la comercialización de medicinas basadas en proteínas a introducir reglas aún más estrictas para determinar la REF: 139757 calidad y consistencia de manufactura de principios activos de origen proteico contenidos en medicinas comercializadas. De lo anterior aparece claramente la importancia de los procesos de purificación de las proteínas en los cuales las principales dificultades residen en el hecho de que las proteínas farmacológicamente activas están siempre en mezclas compuestas junto con muchas otras proteínas. Este hecho es cierto tanto en el caso de las fuentes naturales que son utilizadas para extraer la proteína farmacológicamente activa, como por ejemplo la sangre, extractos de órganos animales o vegetales, y en el caso de las técnicas de ADN recombinante que son utilizadas debido a que las proteínas muestran propiedades fisicoquímicas similares entre ellas independientemente de su origen. Por lo tanto de lo anterior se deriva que, en el caso de purificaciones de proteínas farmacológicamente activas, una proteína mezclada junto con otras proteínas con propiedades similares y que con frecuencia excede de manera abundante la cantidad de la proteína deseada tiene que ser aislada con un alto grado de pureza. La tarea es exigente y normalmente se utilizan varios pasos de purificación para obtenerlos niveles de pureza deseados. Los procesos de purificación se vuelven de esta manera muy complejos y el éxito de una manufactura industrial de una proteína está unido esencialmente a la eficacia en el proceso de purificación debido a que este último determina ampliamente los costos de manufactura. Son utilizadas muchas técnicas para purificar proteínas, tales como, por ejemplo, precipitaciones selectivas en solventes acuosos y orgánicos o con agentes caotrópicos; separaciones por medio de filtraciones y/o diálisis; procesos de inmunoprecipitación con anticuerpos adecuados; procesos cromatográficos. Esos últimos han ganado en años recientes mucho más importancia principalmente debido a que permiten obtener el grado de pureza solicitado, de acuerdo a lo reportado por Regnier F.E. en J. Chromatogr. 418, 115-143, (1987). Muchas técnicas son citadas en la literatura científica y pueden ser citadas sobre la base del mecanismo de acción aplicado para separar las proteínas tales como, por ejemplo, separación sobre la base del peso molecular, absorción sobre matrices polares, también llamadas fases estacionarias normales, absorción sobre matrices polares, llamadas fases estacionarias invertidas, absorción por afinidad selectiva con unión de ligandos a matrices inertes, tales como metales pesados como el cobre, zinc, hierro y platino, tintes químicos tales como el azul brillante, proteínas tales como la proteína A y la proteína G, carbohidratos tales como los polisacáridos y glucosaminoglicanos, absorción por inmunoafinidad con anticuerpos espac?f as unidas sobre matrices inertes, absorción por interacción iónica con ligandos cargados electrostáticamente unidos sobre matrices inertes. La selectividad, es decir la capacidad de reconocer selectivamente la proteína deseada, el costo y la posibilidad de ser utilizada a nivel industrial son utilizadas como parámetros para evaluar los desempeños de las diferentes técnicas cromatográficas . Sobre la base de esos parámetros, se considera que la cromatografía de inmunoafinidad es la que garantiza una mayor selectividad, pero muestra desventajas tales como los altos costos de uso, riesgos de desnaturalización del anticuerpo y riesgos relacionados con la seguridad final del producto purificado debido a que el anticuerpo es de origen animal. La cromatografía que utiliza la interacción iónica, también llamada cromatografía de intercambio iónico, es considerada la técnica menos riesgosa para considerar la actividad farmacológica de las proteínas y la más fácil de llevar a cabo de manera industrial con bajos costos de manejo pero muestra la desventaja de ser pobremente selectiva. Por lo tanto, sería muy ventajoso encontrar en condiciones de ejecución de una cromatografía de intercambio iónico que incremente su selectividad, de modo que se vuelva competitiva con las otras técnicas desde el punto de vista de la pureza del producto obtenido. La cromatografía de intercambio iónico usualmente se lleva a cabo utilizando columnas de varios tamaños, llenas con matrices sólidas que contienen grupos químicos los cuales, permanentemente o bajo condiciones particulares, son cargadas electrostáticamente. Un compuesto colocado en una columna de intercambio iónico interactúa por medio de una atracción/repulsión ló bica con las cargas unidas a la matriz. Los diferentes compuestos contenidos en una mezcla serán capaces de unirse por sí mismo a la fase estacionaria en función de la cantidad de carga que posea, y en consecuencia se mantendrán más o menos, definiendo de este modo su separación en la salida de la columna. La cromatografía es llamada cromatografía de intercambio catiónico cuando las cargas de la matriz son negativas, debido a que son retenidos los cationes, mientras que se llama cromatografía de intercambio aniónico cuando las cargas de la matriz son positivas. Las proteínas son compuestos que tienen un peso molecular alto, mayor de 10,000 Daltons, constituidas por polímeros heterogéneos de aminoácidos; algunos aminoácidos tienen en su cadena lateral grupos funcionales que pueden ser ionizados en función del pH de la solución de manera negativa, aminoácidos ácidos, o en una forma positiva, aminoácidos básicos, y por lo tanto todas las proteínas poseen un gran número de cargas negativas y positivas. El punto isoeléctrico, pl, de una proteína es el pH al cual la proteína es neutra debido a que la contribución de las cargas negativas es igual a la de las cargas positivas: una proteína colocada en un campo eléctrico pl no es atraída por ninguna de las polaridades del campo eléctrico. El número de cargas negativas se incrementa a un pH mayor que el pl y la proteína gana una carga negativa neta cuando ocurre lo contrario a un pH menor que el pl y la proteína gana una carga positiva neta. Cada proteína tiene su propio pl característico el cual la distingue de las otras y algunas proteínas vuelven a ser insolubles en el punto isoeléctrico. Cuando una proteína está en una solución a un pH menor que el pl tiene una carga positiva neta y por lo tanto puede interactuar con una matriz cargada negativamente y puede ser sometida a una cromatografía de intercambio catiónico, mientras que la proteína puede ser sometida a una cromatografía de intercambio aniónico a un pH mayor que su pl, de acuerdo a lo reportado por Regnier F.E., Science, 238, 319-323 (1987) y por Yamamoto S. et al., Chromatographic Science Series, 3_, (1988), Marcel Dekker, Inc. Publisher, New York.

Por el contrario se ha encontrado de manera inesperada, y sobre este hecho se basa en sí el objeto de la presente invención, que es posible encontrar un intervalo de valores de pH mayor que el pl correspondiente de la proteína pH al cual las proteínas permanecen aún absorbidas sobre matrices de cromatografía de intercambio catiónico, de modo que aún es posible llevar a cabo cromatografías de intercambio catiónico. Tal situación es particularmente importante debido a que se gana una alta selectividad entre proteínas bajo esas condiciones, debido también a que diferencias muy pequeñas del pl entre las proteínas se vuelven suficientes para obtener separaciones significativas para dar una alta eficiencia de producción. Este ultimo aspecto es particularmente importante en el proceso de purificación de proteinas recombinantes, donde el producto deseado con frecuencia está acompañado de impurezas correlacionadas, es decir constituido de cambios estructurales muy pequeños del producto tales como, por ejemplo, diferentes estados de oxidación, acetilaciones, pérdida de funciones amídicas y así sucesivamente. Este tipo de impurezas es muy difícil de eliminar también por medio de cromatografías de inmunoafinidad debido a que en la mayoría de los casos los anticuerpos no son capaces de distinguirlas.

El mecanismo que puede explicar el fenómeno encontrado se basa en sí en el hecho de que la distribución de las cargas a lo largo de la superficie externa de las proteínas no es uniforme, de modo que también cuando el pH es un poco mayor que el pl y la proteína tiene una carga negativa neta total, existen aún algunas cargas positivas localizadas en la molécula que pueden interactuar con una fase estacionaria negativa. Para hacer efectivo este mecanismo es importante que el exceso de cargas negativas no sea demasiado acentuado, de otro modo el campo eléctrico creado a partir de las cargas negativas sería tan alto que prevendría la interacción de toda la proteína con la matriz crómat gráfica cargada negativamente . Además es necesario que la fuerza iónica de las soluciones utilizadas como eluyentes sea controlada de manera adecuada debido a que una fuerza iónica alta tendría el efecto de proteger a la proteína de modo que evite su interacción con la fase estacionaria. ' Lampson G. P. et al., Anal. Biochem., _1_1 374-377, (1965), en confirmación reportan el caso de proteínas tales como la globulina gamma humana, ribonucleasa, hemoglobina, delta quimotripsina, globina y lisozima en las cuales hacer pequeñas variaciones de pH pero mantener una fuerza iónica muy alta, dada por una solución de fosfato 0.1 M, la elución en las cromatografías de intercambio catiónico ha ocurrido a un pH de caso 0.4 unidades menor que el pl. El principio mencionado anteriormente, en el cual se basa la presente invención en sí, no ha sido utilizado nunca, hasta donde saben los inventores, para llevar a cabo procesos eficientes para la purificación de proteínas. La posibilidad de utilizar las diferencias del punto isoeléctrico de proteínas para optimizar los procesos de purificación descritos por Kontturi A. K: et al., Acta Chem. Scand., 50 (2) , 102-106, (1996) en efecto se refiere a un uso convencional de la cromatografía de intercambio iónico, donde la cromatografía de intercambio catiónico se lleva a cabo siempre a un pH menor que el punto isoeléctrico, mientras que la cromatografía de intercambio aniónico se lleva a cabo a un pH mayor que el punto isoeléctrico. El proceso descrito en la presente solicitud de patente es tal que las cromatografías de intercambio catiónico se llevan a cabo por el contrario a un punto mayor que el pH que el punto isoeléctrico de la proteína. El proceso descrito en la presente solicitud de patente puede ser considerado de naturaleza general como se muestra en los ejemplos reportados, donde se ha demostrado como éste es aplicable exitosamente tanto a una proteína de origen natural como a una proteína de ADN recombinante. La diferencia entre proteína y proteína es el grado de alcance del campo del pH, mayor que el pl, utiliza la purificación de la proteína de interés. En efecto, por ejemplo, como se mostrará en los siguientes ejemplos, tal intervalo es de aproximadamente 0.2 unidades de pH en el caso de las proteínas de interferon donde este es de aproximadamente 1 unidad de pH en el caso de la albúmina. La aplicación de la presente invención a la purificación de un alfa interferon recombinante (rIFNa) cuyo punto isoeléctrico es de 5.9, de acuerdo a lo reportado por Thatcher D. y Panayotatos N., Methods Enzymol. 119, 166-177, (1986), será reportado entre los ejemplos y se mostrará como es posible y ventajoso purificar éste en intercambio catiónico a un pH de 6.1. Además se mostrará el ejemplo de la albúmina sérica humana cuyo pl es de 4.9, de acuerdo a lo reportado por Rylatt D. B. et al., J. Chromatogr., 865, 145-153, (1999) , y se demostrará como es posible ventajoso purificar esta por intercambio catiónico a un pH de 6.0. Las ventajas en el proceso objeto de la presente invención son muy notables si se comparan con los resultados de los procesos descritos en publicaciones científicas y/o patentes dirigidas a la purificación del a interferon y de la albúmina sérica humana, procesos que usualmente requieren tres o más tratamientos subsecuentes, hecho que produce un alto costo industrial y un menor rendimiento. Thatcher D. y Panayotatos N. describen la purificación del alfa interferón recombinante humano rIFN-a2, Methods Enzymol., 119, 166-177, (1986) a través de cinco tratamientos subsecuentes: a) cromatografía de intercambio catiónico; b) cromatografía de intercambio aniónico; c) cromatografía de afinidad para metales pesados; d) tratamiento con una solución saturada de sulfato de amonio; e) cromatografía de extrusión molecular. La Patente Estadounidense 0108585 describe la purificación del interferon mediante el uso subsecuente de tres tipos de cromatografía: a) inmuno-afinidad; b) intercambio catiónico; c) exclusión molecular. La Patente Estadounidense 4765903 sobre la purificación del interferon describe el uso secuencial de cuatro tipos de cromatografía: a) inmunoafinidad con un anticuerpo monoclonal; b) fase invertida; c) intercambio catiónico; d) exclusión molecular. La Patente Europea 0679718 describe un proceso para la producción de alfa interferon que contempla los siguientes cuatro pasos cromatográficos: a) metal quelante; b) intercambio catiónico; c) intercambio aniónico; d) filtración en gel. Otras publicaciones y patentes describen tres o más tratamientos necesarios para la purificación de proteínas de interferon, por ejemplo la Patente Estadounidense 4732683, la Solicitud de Patente Internacional WO 8604067 y la publicación de Khan F. R. y Rai V. R. , Bioprocess Technol . , 7, 1611-169, (1990) . Los ejemplos citados cubren la materia más relevante reportada cerca de la purificación del interferon en general y del alfa interferon en particular. Ellos muestran como la purificación de este último es particularmente difícil y requiere muchos pasos de purificación. Además tiene que subrayarse como se obtienen altos niveles de purificación en particular por medio de las cromatografías de inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales de origen murino. Sin embargo la presencia de tal técnica cromatográfica dentro de los procesos de producción industrial dirigidos a la manufactura de principios activos para uso farmacéutico en humanos tiene el riesgo de posibles contaminaciones virales de virus de origen murino debido a la presencia de posibles fragmentos inmunogénicos provenientes de las inmunoglobulinas murinas en el producto final y debido a las dificultades para validar las matrices cromatográficas desde el punto de vista industrial. Además de los ejemplos ilustrados brevemente, la cromatografía de intercambio catiónico resulta ser ampliamente utilizada pero nunca como una técnica de separación única debido a que su desempeño es limitado con respecto al incremento de los niveles de pureza.

Las publicaciones de Babu K. R. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 53 (6), 655-660, (2000) y Bouyoon R. et al., Biotecnología Aplicada, 1 , 189-192, (1997), describen procesos de alfa interferon en un paso por medio de cromatografía de intercambio iónico en gradiente salino. Sin embargo en ambos casos para obtener un producto suficientemente puro los autores han aislado únicamente algunas de las fracciones cromatográficas en las cuales el alfa interferon está contenido para obtener rendimientos muy bajos, hasta un mínimo de 7.5%. Además los procesos de purificación cromatográficos descritos en gradientes salinos no son aptos para ser utilizados a nivel industrial. También son descritas muchas técnicas de purificación cromatográfica en el caso de la albúmina partiendo de preparaciones de albúmina obtenida fraccionando suero humano o por medio de técnicas de ADN recombinantes, técnicas complejas y escasamente transferibles a nivel industrial que confirman como aún existe el problema de una purificación efectiva de la albúmina humana, tanto de origen natural como recombinante. Las Patentes Estadounidenses 6150504 y 5521287 describen la purificación de la albúmina por medio de cromatografía de intercambio iónico e interacción hidrofóbica. El esquema de purificación descrito en la Patente Estadounidense 6034221 contempla la purificación de la albúmina por medio de dos pasos cromatográficos, un proceso de ultrafiltración y dos pasos adicionales de purificación cromatográfica. Son utilizados métodos menos convencionales de purificación de albúmina en los cuales las cromatografías de intercambio aniónico en lecho fluido o cromatografías de afinidad que interactúan con matrices comercialmente disponibles tales como aquellas de Streamline®, o preparadas de manera adecuada, tales como partículas de circonio modificadas o emulsiones de perfluorohidrocarburos, son descritas en la Patente Estadounidense 5962649 y en las publicaciones de Sumi A. et al., Bioseparation, 8 (1-5) , 195-200. (1999), Mullick A. y Flickinger M. C, Biotechnol. Bioeng., 65(3) , 282-290, (1999) y Me Creath G. E. et al., J. Chromatogr., 597 (1-2), 189-196, (1992). Finalmente también han sido descritas técnicas de purificación de albúmina sobre metales pesados según Yang L. et al., Sheng Wu Kung Cheng Hsueh Pao, 16 (1) , 74-77, (2000) y han sido descritas técnicas de afinidad sobre matrices a las cuales son unidos tintes tales como el Azul de Cibacron F3G según Compagnini A. et al . , J. Chromatogr. A, 736 ( 1-2) , 115, (1996) . Todas esas técnicas muestran de varias formas los problemas de complejidad de realización y de altos costos, de modo que no se resuelve el problema de individualizar procesos de purificación de proteínas farmacológicamente activas tanto feasibilidad como factibilidad industrial eficiente y económicamente ventajosos. La invención descrita más adelante da una respuesta a esos requerimientos importantes proporcionando un proceso para la purificación de proteínas farmacológicamente activas de fácil explotación industrial y de bajo costo con ventajas económicas notables .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un proceso para la purificación de proteínas farmacológicamente activas basado en el uso de la cromatografía de intercambio catiónico sobre una matriz sólida bajo condiciones peculiares, las cuales comprenden, después de cargar la muestra, acondicionar la columna con eluyentes de pH y fuerza iónica adecuadas, de modo que la columna presente uniformemente un pH más básico, es decir, mayor, que el punto isoeléctrico correspondiente, pl, de la proteína farmacológicamente activa, pH al cual, sin embargo, la proteína permanece aún absorbida sobre la matriz sólida utilizada para la cromatografía de intercambio catiónico. Después de esta fase de acondicionamiento, las proteínas farmacológicamente activas son eluidas de la columna incrementando la fuerza iónica y/o el pH de los eluyentes.

El desempeño efectivo de la presente invención requiere la individualización de la combinación correcta entre la matriz cromatográfica a ser utilizada, el valor de pH mayor que el pl y la fuerza iónica a ser utilizada en los eluyentes cromatográficos debido a que, una vez definida la matriz cromatográfica, pueden obtenerse purificaciones eficientes haciendo variaciones limitadas de pH y/o fuerza iónica, con frecuencia décimas de unidades de pH y/o de variaciones en la fuerza iónica de unos cuantos cientos de µS. Todas las matrices funcionalizadas comúnmente utilizadas como fases estacionarias para cromatografías de intercambio catiónico pueden ser utilizadas, en particular, sin embargo, las fases estacionarias conocidas como de intercambio catiónico fuerte tienen que ser preferidas cuando el pl de la proteína a ser purificada sea menor de 6, mientras que las fases estacionarias con intercambio catiónico tanto fuerte como débil pueden ser utilizadas sin excepción para proteínas que tengan pl mayor de 6. Las fases estacionarias pueden tener una matriz silicia o polimérica, funcionalizada por medio de grupos sulfónicos o carboxílicos bajo formas de protón o sales alcalinas. Las fases estacionarias comercialmente disponibles, tales como, por ejemplo, Source® S (Pharmacia Biotech) . Sepharose® SP-Fast Flow, Sepharose® SP-High Performance, SP Sepharose XL (Pharmacia Biotech) , Fractogel® S (Merck, Darmstadt; Mustang S (Pall Corporate) , CM Sepharose FF (Pharmacia Biotech), Dowex , Bio-Rad AG (Bio-Rad), Poros (PerSeptive Biosystems) , Shodex®-S, Toyopearl® SP (Tosohass) pueden ser utilizadas exitosamente. El intervalo de valores de pH al cual la presente puede ser llevada a cabo eficientemente, es muy amplio, dependiendo de los puntos isoeléctricos de las proteínas farmacológicamente activas que tienen que ser purificadas, y está comprendido entre 2 y 11, de manera preferible entre 4 y 8.5. La extensión del intervalo de los valores de pH mayor que el pl dentro del cual el proceso descrito en la presente invención es aplicable, puede variar de valores de pH correspondientes al pl de las proteínas farmacológicamente activas a una unidad de pH sobre el pl, mostrando diferencias notables de proteína a proteína. Por ejemplo se ha encontrado que en el caso del alfa 2b interferón recombinante (rIFNa-2b) es posible obtener la absorción de la proteína sobre una matriz de intercambio catiónico hasta 0.2 unidades de pH sobre su pl de 5.9 y, en consecuencia, es posible llevar a cabo su purificación por medio de una cromatografía de intercambio catiónico, mientras que se ha encontrado que en el caso de la seroalbúmina humana que la proteína permanece unida hasta una unidad de pH por encima de su pl. El intervalo de concentraciones salinas de las soluciones acuosas empleadas como eluyentes eficientemente útiles depende del tipo de proteína farmacológicamente activa a ser purificada, y se ha encontrado que está comprendido entre valores de 1 mM y 100 mM, de manera preferible entre 1 mM y 30 mM. Por ejemplo, en el caso de la purificación del alfa 2b interferón recombinante (rIFNa-2b) la concentración de solución acuosa salina está comprendida entre 1 mM y 30 mM, de manera preferible entre 5 y 15 mM. La necesidad de tener fijos y estables los valores de pH de los eluyentes utilizados para las cromatografías objeto de la presente invención, hace muy útil, sino es que absolutamente necesario, emplear soluciones acuosas amortiguadas adecuadamente, que contienen de 5 a 100 mM, de manera preferible, de 10 a 20 mM de las mezclas amortiguadas.

Cada sustancia química o mezcla de sustancias químicas que tenga una potencia amortiguadora en el intervalo de pH entre 2 y 11, puede ser empleada de manera ventajosa debido a que los valores de pH de los eluyentes que pueden ser utilizados están comprendidos entre 2 y 11. Muchas soluciones amortiguadoras que pueden ser utilizadas de manera ventajosa para llevar a cabo la presente invención, comprenden a aquellas que contiene: glicina y cloruro de sodio, ácido maleico e hidróxido de sodio, ácido malónico e hidróxido de sodio, ácido láctico e hidróxido de sodio, ácido fórmico e hidróxido de sodio o litio, ácido succínico e hidróxido de sodio, N-metilpiperacina y ácido clorhídrico, piperacina y ácido clorhídrico o acético, L-histidina y ácido clorhídrico, ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperacinetansulfónico e hidróxido de sodio o litio, N-metildietanolamina y ácido sulfúrico, N-metildietanolamina y ácido clorhídrico o acético, piridina y ácido fórmico, citrato de sodio dibásico e hidróxido de sodio, ftalato de potasio monobásico y ácido clorhídrico, ftalato de potasio monobásico e hidróxido de sodio, fosfato de potasio monobásico y fosfato de sodio dibásico, bicina e hidróxido de sodio, barbital sódico y ácido clorhídrico, borato de sodio y ácido clorhídrico, borato de sodio e hidróxido de sodio, 1,3-diaminopropano y ácido clorhídrico, ácido cítrico y fosfato de sodio dibásico, acetato de sodio y ácido acético, imidazol y ácido clorhídrico, trietanolamina u ácido clorhídrico o acético, tris (hidroximetilaminometano) y ácido clorhídrico, carbonato de sodio y carbonato ácido de sodio, etanolamina y ácido clorhídrico, piperidina y ácido clorhídrico, trimetilamina y ácido fórmico, piridina y ácido acético, trimetilamina y ácido acético, trimetilamina y ácido clorhídrico, hidróxido de amonio y ácido fórmico, hidróxido de amonio y ácido acético, trimetilamina y carbonato de sodio, carbonato de amonio e hidróxido de amonio. En particular, en el caso de la purificación del alfa 2b interferón recombinante (rIFNa-2b) , todas las soluciones amortiguadoras que muestren una potencia amortiguadora al pH comprendido entre 5.9 y 6.1 pueden ser utilizadas, de manera preferible soluciones amortiguadoras a un pH entre 5.9 y 6.1 que contengan fosfatos de potasio monobásico y fosfato de sodio dibásico, ftalato de potasio monobásico e hidróxido de sodio, citrato de sodio dibásico, hidróxido de sodio, ácido cítrico y fosfato de sodio dibásico, imidazol y ácido clorhídrico, aunque en el caso de la purificación de la seroalbúmina, pueden ser utilizadas soluciones amortiguadoras que contengan las mismas mezclas de compuestos químicos que muestren una potencia amortiguadora del pH comprendido entre 4.9 y 6.0. Las soluciones acuosas utilizadas como eluyentes pueden contener, además de las sustancias químicas utilizadas para amortigurar el pH, también sustancias químicas que tengan la tarea de modificar la fuerza iónica de la solución. Hasta este punto, ambas sales orgánicas, tales como por ejemplo, carboxilatos, alquilsulfonatos, ftalatos o sales orgánicas, tales como por ejemplo, sulfatos, cloruros, fosfatos que pueden ser salificadas con sodio, potasio, amonio, aminas primarias, secundarias, terciarias o aromáticas, pueden ser utilizadas ventajosamente. Esos compuestos pueden ser utilizados de manera ventajosa a una concentración comprendida entre valores de 1 mM a 100 mM, de manera preferible entre 1 mM y 30 mM. Por ejemplo, en el caso de la purificación del alfa 2b interferón recombinante (rIFNa-2b) , la concentración de esos compuestos puede variar entre 1 mM y 30 mM, de manera preferible de entre 2 y 20 mM. La eficiencia de la purificación puede incrementarse, antes de la elución de las proteínas farmacológicamente activas, por medio de uno o más lavados llevados a cabo con eluyentes que tengan pH y fuerza iónica adecuadas, de modo que la columna siempre este a un pH mayor que el pl. Por ejemplo, en el caso de la seroalbúmina humana, cuyo pl es de 4.9, puede llevarse a cabo un lavado con soluciones amortiguadoras a pH comprendidos entre 5.5 y 5.8, mientras que en el caso del alfa 2b interferón recombinante (rIFNa-2b) cuyo pl es de 5.9, pueden llevarse a cabo con soluciones amortiguadoras de un pH comprendido entre 6.0 y 6.1. La cantidad de eluyente pasado a través durante esos lavados es variable, normalmente comprendida entre 5 y 100 volúmenes de la columna (CV) .

Por ejemplo, en el caso de la seroalbúmina humana, los lavados ejecutados están comprendidos entre 20 y 40 CV, mientras que en el caso del alfa 2b interferón recombinante (rIFNa-2b) entre 10 y 80 CV. La cantidad de producto a ser purificada que puede ser colocada en la columna depende de las matrices cromatográficas utilizadas, y puede arribar hasta un máximo de 100 miligramos de proteínas totales por cada mililitro de fase estacionaria aún si se utilizan cantidades usualmente menores, comprendidas entre 5 y 20 mg/ml. Los eluyentes pueden pasar a través de la columna a una velocidad lineal compatible con la fase estacionaria hasta un valor máximo igual a 10 cm/min. El proceso de purificación ilustrado anteriormente, puede ser aplicado a todas las proteínas farmacológicamente activas; la purificación de las proteínas de interferón con relación particular a los interferones alfa, beta, gama, delta, omega, tau, al alfa interferón natural de los leucocitos, al alfa 2b recombinante e interferones de consenso y la purificación de la albúmina con relación particular a la albúmina humana tanto de origen natural como recombinante, son las preferidas para la ejecución de la presente invención. El alcance del proceso de purificación descrito anteriormente, es el de obtener proteínas farmacológicamente activas de manera industrial y económica a un grado de pureza tal que sea utilizado directamente para la manufactura de especialidades médicas que las contengan. En particular, las especialidades medicinales preferidas dentro del alcance de la presente invención, son aquellas que contienen interferón, de manera aún más preferible alfa 2b interferón recombinante (rIFNa-2b) , y albúmina, de manera aún más preferible albúmina humana, tanto de origen natural como recombinante. Algunos ejemplos ilustrativos del proceso objeto de la presente invención son reportados aquí posteriormente con el único propósito de hacer más clara la invención, pero no tienen que ser considerados de ninguna manera como restrictivos de la invención en sí.

EJEMPLO 1 Producción del alfa 2b interferón recombina e (rIFNa-2b) Una parte de las células de la cepa BL21 DE3 de Escherichia coli ha sido transformada con 5 ng del plásmido pET9a-IFNa-2b, obtenido mediante la clonación de un gen sintético que reproduce la secuencia del gen humano del IFNcc- 2b, modificado de manera adecuada para determinar la secuencia de los codones más frecuentes en Escherichia coli, en el plásmido pET9a (Novagen) .

La secuencia proteica expresada de las células de Escherichia coli modificadas como se mostró anteriormente, es igual a la reportada en Métodos en Enzimología, Interferones, parte C, del editor Pestka S., 119, 3-14 (1986), publicada por Academic Press Inc. La cepa BL21 DE3 de Escherichia coli transformada por medio del plásmido pET9a-IFN -2b ha sido colocada en cultivo en un frasco en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo una solución con un contenido de 12 g/1 de fitopeptona (Phyto peptoton, BBL) , 24 g/1 de extractos de levadura (extracto de Levadura, DIFCO) , 4 g/1 de glicerol (BDH) y neomicina a 37 °C, durante un tiempo suficiente para arribar a un valor de densidad óptima a 600 nm igual a 0.6-0.8, usualmente 7-9 horas. El cultivo así obtenido es entonces utilizado a la dilución de 1 a 100 para inocular un fermentador de 5 1 donde estaba contenido un medio de cultivo igual al del matraz, previamente descrito. El cultivo se mantiene 14 horas a 37 °C con aireación igual a un volumen de aire cada minuto con respecto al volumen de cultivo. Las células bacterianas son recolectadas por centrifugación a 6000 revoluciones por minuto (rpm) al final del cultivo, ellas son suspendidas en una solución acuosa adecuada con un contenido de 1 mM de ditiotreitol (DTT) en una cantidad no mayor de 6 ml por cada gramo de peso húmedo de las bacterias centrifugadas. La suspensión bacteriana es sometida a lisis celular por medio de técnicas consolidadas y descritas, tales como por ejemplo, rompimiento por ultrasonido o ultrapresión hidráulica. La suspensión resultante es recuperada por centrifugación y la parte sólida es suspendida en una solución salina de 50 ml con un contenido de 1 mM de DTT y nuevamente centrifugada. El componente sólido, que contiene los cuerpos incluidos, recolectado y suspendido bajo agitación vigorosa a temperatura ambiente en 450 ml de una solución que contiene 6 M de cloruro de guanidina, 50 mM de Tris-HCl a pH 8 y 0.1 mM de EDTA. La suspensión es centrifugada y los sobrenadantes diluidos en la relación de 1 a 100 a l a 200 en una solución salina que contiene 50 mM de Tris-HCl a pH 8 y 0.1 mM de EDTA a pH 8 adecuado para la renaturalización de la proteína. La solución para renaturalización puede contener aminoácidos, tales como, por ejemplo glicina o arginina; mezclas de compuestos que contienen sulfuros en forma oxidada y reducida con el puente disulfuro formado, tales como por ejemplo, glutationa, etanolamina, cistidina. La renaturalización se lleva a cabo bajo agitación vigorosa a 4°C durante casi 72 horas, y a continuación la solución es filtrada y a continuación concentrada por medio de un proceso de diafiltración contra un amortiguador constituido por 40 mM de Tris-HCl a pH 8 hasta un factor de concentración final de 5 a 10 veces. La concentración final de la solución está usualmente comprendida entre 0.4 y 1.0 mg/ml.

EJEMPLO 2 Purificación del alfa 2b interferón recombinante (rIFNa-2b) Se agrego una solución 1 M de acetato de sodio hasta la concentración final de 20 mM a la mezcla proteica que contenía rIFN-2b proveniente del ejemplo 1, y la mezcla se llevo a pH 5.5 con ácido acético. La solución así obtenida es cargada sobre una columna de intercambio catiónico fuerte que contiene la matriz cromatográfica comercialmente disponible Mustang® S (Pall Corporate) . La columna de intercambio catiónico es acondicionada, antes de la carga de la solución proteica, por medio de una solución de acetato de sodio 20 mM a pH 5.5 en una cantidad igual a 20 volúmenes de la columna (CV) . La solución proteica es entonces cargada en una cantidad tal que no se exceda el valor de 10 mg de proteína cargada por cada mililitro de fase estacionaria, de manera preferible en cantidades comprendidas entre 6 y 8 mg/ml. Después de la carga, los productos unidos a la fase estacionaria son sometidos a un primer ciclo de lavado por medio de una solución salina a pH 6.1 hecha por medio de una mezcla de fosfato de potasio monobásico y fosfato de sodio dibásico a una concentración total comprendida entre 5 y 15 mM. La concentración óptima de la solución es fijada de cualquiera manera por el hecho de que la conductividad no tiene que exceder de aproximadamente 1800 µS. Se utiliza una cantidad total de solución comprendida entre 5 y 60 CV, de manera preferible entre 25 y 35 CV. Se lleva entonces a cabo un segundo ciclo de lavado utilizando la misma solución del primer ciclo de lavado a la cual se agregó una cantidad de cloruro de potasio igual a una concentración final que no excede de 3 mM, de manera preferible 2 mM; se utiliza una cantidad total de solución comprendida entre 10 y 100 CV, de manera preferible entre 30 y 60 CV. Después de los ciclos de lavado, se lleva a cabo una fase de elución, utilizando una solución similar a la del primer ciclo de lavado con una cantidad final de cloruro de potasio a una concentración no menor de 10 mM, de manera preferible a una concentración comprendida entre 15 y 25 mM. Se utiliza una cantidad total de solución comprendida entre 15 y 40 CV, de manera preferible entre 20 y 30 CV para la elución. Todas las soluciones y la muestra cargada pasan a través de la columna a una velocidad lineal comprendida entre 0.1 y 1 cm/min., de manera preferible entre 0.4 y 0.7 cm/min. Bajo esas condiciones, es eluida el rIFNa-2b de la columna con un grado de pureza mayor del 98%, mientras que en la solución inicial el grado de pureza era de aproximadamente 40%, con un rendimiento de recuperación del producto deseado mayor del 80%. Los perfiles cromatográficos antes y después de la purificación cromatográfica se muestran en las figuras la y Ib. La Figura la muestra el perfil cromatográfico de la solución de interferón antes de la purificación y la Figura lb el perfil cromatográfico antes de la purificación. Los perfiles cromatográficos han sido llevados a cabo en CLAP por medio de un cromatógrafo de líquidos HP 1090, utilizando una columna Vydac C18 y un detector de UV calibrado a 214 nm. La elución se ha llevado a cabo a un flujo de 1 ml/min utilizando una mezcla constituida de dos eluyentes, eluyente A constituido de 700 ml de agua, 298 ml de acetonitrilo y 2 ml de ácido trifluoroacético y eluyente B constituido de 198 ml de agua, 800 ml de acetonitrilo y 2 ml de ácido trifluoroacético. Los dos eluyentes han sido mezclados durante la elución de acuerdo a la siguiente tabla: EJEMPLO 3 El proceso se llevó a cabo de acuerdo a la descripción del ejemplo 2 utilizando una solución amortiguadora constituida de ftalato de potasio monobásico y de hidróxido de sodio.

EJEMPLO 4 El proceso se llevó a cabo de acuerdo a la descripción del ejemplo 2 utilizando una solución amortiguadora constituida de citrato de sodio dibásico e hidróxido de sodio.

EJEMPLO 5 El proceso se llevó a cabo de acuerdo a la descripción del ejemplo 2 utilizando una solución amortiguadora constituida de ácido cítrico y fosfato de sodio dibásico .

EJEMPLO 6 El proceso se llevó a cabo de acuerdo a la descripción del ejemplo 2 utilizando una solución amortiguadora constituida de imidazol y ácido clorhídrico.

EJEMPLO 7 Purificación de la seroalbúmina humana . La seroalbúmina humana (HSA) ha sido comprada de Sigma (número de catálogo AS1653 del año 2000) . El título nominal de esta preparación de albúmina se estableció como el 99.6%, pero el análisis por RP-CLAP mostró un título real igual al 88% si los productos similares a la albúmina son considerados como impurezas. La solución de HSA ha sido preparada en una solución de ácido cítrico 20 mM pH 3 a una concentración final igual a 1 mg/ml y ha sido cargada sobre una columna de intercambio catiónico fuerte que contiene matrices cromatográficas Mustang S (Pall Corporate) comercialmente disponible. La columna de intercambio catiónico es acondicionada antes de la carga con solución de ácido cítrico 20 mM a pH 3.0 en cantidades iguales a 20 volúmenes de columna (CV) . La cantidad de la solución cargada es tal que no se excede el valor de 10 mg de proteínas cargadas por cada mililitro de fase estacionaria, de manera preferible cantidades comprendidas entre 6 y 8 mg/ml.

Después de la carga, los productos unidos a la fase estacionaria son sometidos a los siguientes ciclos de lavado: 1. ciclo de lavado - 40 CV con solución 20 mM de acetato de sodio a pH 5.5; 2. ciclo de lavado - 30 CV con solución 20 mM de acetato de sodio a pH 5.8. La elusión del producto deseado de la columna se llevó a cabo por medio de una solución salina a pH 6.0 constituida de una mezcla de fosfato de potasio monobásico y fosfato de sodio dibásico a una concentración comprendida entre 5 y 100 mM dependiendo de la composición de la mezcla. Sin embargo la conductividad de la solución no ha excedido 140 µS . Se utilizó una cantidad total de solución comprendida entre 25 y 35 CV. Todas las soluciones y las muestras cargadas pasan a través de la columna a una velocidad lineal comprendida entre 0.1 y 1 cm/min, de manera preferible entre 0.4 y 0.7 cm/min . Bajo esas condiciones el HSA es eluido de la columna con una pureza mayor a 99% con un rendimiento de recuperación del producto deseado mayor del 56%. Las Figuras 2a y 2b muestran los perfiles cromatográficos de CLAP de HSA antes y después de la purificación. El análisis ha sido llevado a cabo con los mismos instrumentos utilizados para las Figuras ÍA y IB utilizando una mezcla de dos eluyentes, eluente A constituido de 950 ml de ácido trifluoroacético al 0.1% y 50 ml de acetonitrilo y eluyente B constituido de 950 ml de acetonitrilo y 50 ml de ácido trifluoroacético al 0.1%. La elusión ha sido llevada a cabo con un flujo de 1 ml/min utilizando un gradiente lineal de una mezcla de eluyentes A y B que comienza con 20% de B y arriba hasta 60% de B en 20 minutos . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un proceso para la purificación de proteínas farmacológicamente activas, caracterizado porque comprende llevar a cabo una cromatografía de intercambio catiónica sobre una matriz sólida a un pH más básico que el pH correspondiente al punto isoeléctrico, pl, de las proteínas a ser purificadas, pH al cual las proteínas permanecen aún absorbidas, y eluir las proteínas incrementando la fuerza iónica y/o el pH de los eluyentes.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los eluyentes utilizados para la cromatografía de intercambio catiónico están constituidos de soluciones amortiguadoras acuosas cuyo pH está comprendido entre 2 y 11.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el pH de la solución amortiguadora acuosa está comprendido entre 4 y 8.5.

4. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 2 y 3, caracterizado porque la solución amortiguadora acuosa contiene de 5 a 100 mm de las siguientes mezclas amortiguadoras: fosfato de potasio monobásico y fosfato de sodio dibásico, ftalato de potasio monobásico e hidróxido de sodio, citrato de sodio dibásico e hidróxido de sodio, ácido cítrico y fosfato de sodio dibásico, imidazol y ácido clorhídrico.

5. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado porque las soluciones amortiguadoras pueden contener de 1 a 100 mM de sales orgánicas o inorgánicas aptas para modificar la fuerza iónica de la solución.

6. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las proteínas farmacológicamente activas son el interferón y proteínas de albúmina.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las proteínas de interferón son alfa, beta, gama, delta, omega, tau, alfa natural de leucocitos, alfa-2b recombinante e interferones de consenso y las proteínas de albúmina son albúmina humana natural y recombinante.

8. Un proceso para la purificación del alfa-2b interferón recombinante, rIFNa-2b, caracterizado porque comprende cargar una mezcla proteica proveniente de la manufactura por fermentación del rIFNa-2b adicionada con solución a 1 mM de acetato de sodio y llevada a pH 5.5 con ácido acético, sobre una columna llenada con resina de intercambio catiónico fuerte acondicionada a pH 5.5 por medio de una solución 20 mM de acetato de sodio de modo que estén presentes entre 6 y 8 mg de proteína por cada ml de fase estacionaria, someter la columna a dos ciclos de lavado, primero con una solución amortiguadora a pH 6.1 a una concentración entre 5 y 15 mM, a continuación con la misma solución amortiguadora adicionada con 2 mM de cloruro de potasio y finalmente eluir el rIFNa-2b puro de la columna utilizando una solución amortiguadora a pH 6.1 a una concentración de entre 5 y 15 mM que contiene cloruro de potasio a una concentración comprendida entre 15 y 25 mM.

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la resina empleada es Mustang® Sy las mezclas amortiguadoras son seleccionadas de aquellas constituidas de fosfato de potasio monobásico y fosfato de sodio dibásico, ftalato de potasio monobásico e hidróxido de sodio, citrato de sodio dibásico, e hidróxido de sodio, ácido cítrico y fosfato de sodio dibásico, imidazol y ácido clorhídrico .

10. Un proceso para la purificación de seroalbúmina humana, caracterizado porque comprende una solución que contiene seroalbúmina humana llevada a pH 3 cm medio de ácido cítrico sobre una columna llena con resina de intercambio catiónico fuerte condicionada a pH por una solución 20 mM de ácido cítrico, de modo que estén presentes entre 6 y 8 mg de proteína presente en cada ml de fase estacionaria, someter la columna a dos ciclos de lavado con soluciones 20 mM de citrato de sodio llevado, posteriormente a valores de pH de 5.5 y 5.8 y a continuación eluyendo entre la columna la seroalbúmina humana pura por medio de una solución amortiguadora a pH 6.0 constituida de una mezcla de fosfato de potasio monobásico y fosfato de sodio dibásico a una concentración de entre 5 y 100 mM.

11. El uso del proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la manufactura de principios activos contenidos en especialidades medicinales basadas en proteínas farmacológicamente activas.

12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los principios activos son proteínas de interferón.

13. El uso de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la proteína de interferon es el alfa-2b recombinante.

14. El uso de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los principios activos son proteínas de albúmina.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las proteínas de albúmina son seroalbúmina humana natural o recombinante.