JPS6317898A - リンホトキシン類の精製法 - Google Patents
リンホトキシン類の精製法Info
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- JPS6317898A JPS6317898A JP61163413A JP16341386A JPS6317898A JP S6317898 A JPS6317898 A JP S6317898A JP 61163413 A JP61163413 A JP 61163413A JP 16341386 A JP16341386 A JP 16341386A JP S6317898 A JPS6317898 A JP S6317898A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はリンホトキシン(以下LTと略記する)および
LTポリペプチド誘導体の精製方法に閲すLTは活性化
されたリンパ球により産生されるリンホカインである。
LTポリペプチド誘導体の精製方法に閲すLTは活性化
されたリンパ球により産生されるリンホカインである。
LTはある種のガン細胞に対して強力な細胞障害活性を
示すが、正常細胞には作用しないと報告されており、制
ガン剤としての臨床応用が期待されている。またLTを
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミドを保有する
微生物を培養して得られるLTおよびLTポリペプチド
誘導体〔ネイチャー(Natl、Ire) 312.7
21゜(1984)、特願昭61−23319〕もLT
活性を有しており、LTと同様医薬としての利用が期待
される。
示すが、正常細胞には作用しないと報告されており、制
ガン剤としての臨床応用が期待されている。またLTを
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミドを保有する
微生物を培養して得られるLTおよびLTポリペプチド
誘導体〔ネイチャー(Natl、Ire) 312.7
21゜(1984)、特願昭61−23319〕もLT
活性を有しており、LTと同様医薬としての利用が期待
される。
従来の技術
今日、ヒ)LTは動物細胞大予培養技術および組換えD
N A技術の進歩により大量に入手することができる
。特に後者では前者に比し非常に多量のLTを入手する
ことができる。
N A技術の進歩により大量に入手することができる
。特に後者では前者に比し非常に多量のLTを入手する
ことができる。
動物細胞培養上清には、ウシ血清をはじめとする多種の
異種蛋白質が存在する。また組換えLTは微生物由来で
あるので、微生物または培地からの初期抽出物は一連の
微生物不純蛋白を含んでいる。
異種蛋白質が存在する。また組換えLTは微生物由来で
あるので、微生物または培地からの初期抽出物は一連の
微生物不純蛋白を含んでいる。
従っていずれの生産法でも治療用医薬品として使用する
ためにはLTを高度に精製する必要がある。従来、LT
の精製においては、主にクロマトグラフィー法が使用さ
れてきた〔たとえば、e、 e。
ためにはLTを高度に精製する必要がある。従来、LT
の精製においては、主にクロマトグラフィー法が使用さ
れてきた〔たとえば、e、 e。
Aggarwal et al、 : ジャーナ/L、
−オブ /<イオロジカルーケミストリイ(J、Bio
l、Chei、 ) 259 。
−オブ /<イオロジカルーケミストリイ(J、Bio
l、Chei、 ) 259 。
686 (1984):]。なかでも、免疫吸着剤(i
mmuno−adsOrbents) 、すなわち抗L
T抗体を用いるクロマトグラフィー法は有効である(P
、W、Grayetal :ネイチャー(Nature
) 312.72H1984) 〕。
mmuno−adsOrbents) 、すなわち抗L
T抗体を用いるクロマトグラフィー法は有効である(P
、W、Grayetal :ネイチャー(Nature
) 312.72H1984) 〕。
一方、金属キレートクロマトグラフィーは、β−インタ
ーフェロンの有効な精、製手法として知られている。(
V、G、Edy、et al、 : ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリイ(J、Biol、
Chem、 )■、 5934 (1977) E。
ーフェロンの有効な精、製手法として知られている。(
V、G、Edy、et al、 : ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリイ(J、Biol、
Chem、 )■、 5934 (1977) E。
発明が解決しようとする問題点
抗体クロマトグラフィー法は一段階での高度精製は期待
できるが、精製コストが高い点、溶出液中に抗体および
その分解物が混入する可能性がある点などの問題がある
。また種々のクロマトグラフィーなどの組合せは収率の
低下、工程の煩雑さなどから、工業化に不向きである。
できるが、精製コストが高い点、溶出液中に抗体および
その分解物が混入する可能性がある点などの問題がある
。また種々のクロマトグラフィーなどの組合せは収率の
低下、工程の煩雑さなどから、工業化に不向きである。
従って本発明の目的は、比較的安価なりロマトグラフィ
ー担体を用い、−段階で効率よ<LTを精製する手法を
提供することにある。
ー担体を用い、−段階で効率よ<LTを精製する手法を
提供することにある。
問題点を解決するための手段
本発明者は各種クロマトグラフィーを検討した。
その結果金属キレートクロマトグラフィーにより、LT
を高純度に精製できることを見出し、本発明を完成する
に至った。
を高純度に精製できることを見出し、本発明を完成する
に至った。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明は、リンホトキシン類を含む溶液を銅(Cu)、
亜鉛(Zn)、コバルト(Go)およびニッケル(N1
)からなる群から選ばれる少なくとも一つの遷移金属を
キレート化させたキレート基結合担体と接触させ、該担
体に該リンホトキシン類を吸着させた後、溶出液を用い
て該リンホトキシン類を溶出させ回収することを特徴と
するリンホトキシン類の精製法を提供する。
亜鉛(Zn)、コバルト(Go)およびニッケル(N1
)からなる群から選ばれる少なくとも一つの遷移金属を
キレート化させたキレート基結合担体と接触させ、該担
体に該リンホトキシン類を吸着させた後、溶出液を用い
て該リンホトキシン類を溶出させ回収することを特徴と
するリンホトキシン類の精製法を提供する。
本発明に用いられるLT類はいかなる起源のものでもよ
いが、リンパ芽球細胞系の産生ずるもの〔B、Y、Ru
bin et al、ニブロン−ディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc
、 Natl、Acad、Sci、) 82 、66
37(1985)、 8.B。
いが、リンパ芽球細胞系の産生ずるもの〔B、Y、Ru
bin et al、ニブロン−ディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc
、 Natl、Acad、Sci、) 82 、66
37(1985)、 8.B。
Aggarwai et al、 :ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリイ(J、 Biol、C
hem、 ) 2¥L。
・バイオロジカル・ケミストリイ(J、 Biol、C
hem、 ) 2¥L。
686(1984> )や組換えD N A技術を用い
て生産されたヒ)LTポリペプチドおよびその誘導体〔
ネイチar −(Nature) 、312 、721
(1984) 、特願昭61−233191などがあげ
られる。
て生産されたヒ)LTポリペプチドおよびその誘導体〔
ネイチar −(Nature) 、312 、721
(1984) 、特願昭61−233191などがあげ
られる。
本発明に用いられるキレート基結合担体としては、キレ
ート化能を有する交換基、たとえばビスカルボキンメチ
ルイミノ基[ニーN (CHzCO○H)2〕が結合し
たキレート基を有する不溶性多糖類系担体または三次元
架橋したポリオレフィン系担体などかあげられる。好ま
しくはビスカルボキシメチルイミノ基を有する不溶性多
糖類系担体が用いられる。たとえば、エポキシ活性化セ
ファローズか:)誘導され、下記の化学構造を持つもの
がこれに該当する(J、Porath et al、
:ネイチャ(Nature)ユ、 59g (1975
) 〕。
ート化能を有する交換基、たとえばビスカルボキンメチ
ルイミノ基[ニーN (CHzCO○H)2〕が結合し
たキレート基を有する不溶性多糖類系担体または三次元
架橋したポリオレフィン系担体などかあげられる。好ま
しくはビスカルボキシメチルイミノ基を有する不溶性多
糖類系担体が用いられる。たとえば、エポキシ活性化セ
ファローズか:)誘導され、下記の化学構造を持つもの
がこれに該当する(J、Porath et al、
:ネイチャ(Nature)ユ、 59g (1975
) 〕。
OHC)+2COD−
(Me=遷移金属)
また本発明で用いられる遷移金属はコバルト(co)、
二7ケ/l/(Nl)、銅(Cu)および亜鉛(Zn)
からなる群から選ばれた少な(とも一つの遷移金属かあ
げられる。
二7ケ/l/(Nl)、銅(Cu)および亜鉛(Zn)
からなる群から選ばれた少な(とも一つの遷移金属かあ
げられる。
遷移金属キレート担体はJ、 Porath らの方法
に準じて調製することができる( J、Porath
et al、 ネイチャー(Nature )258
、598 (1975))。
に準じて調製することができる( J、Porath
et al、 ネイチャー(Nature )258
、598 (1975))。
本発明で用いられる吸着方法としては、pH5〜10、
好ましくはpH7〜8に調整したLT溶液を遷移金属キ
レート担体にカラム方式あるいはバッチ方式にて吸着さ
せる方法が用いられる。
好ましくはpH7〜8に調整したLT溶液を遷移金属キ
レート担体にカラム方式あるいはバッチ方式にて吸着さ
せる方法が用いられる。
本発明で用いられる溶出方法には、溶出液のpHを酸a
(pH3〜6)にして溶出する方法および溶出液にキレ
ート化剤を用いて溶出する方法とがある。溶出液のpH
を酸性にして溶出する方法においては、LTが失活しな
い範囲でいかなる酸を用いてもよいが、通常酢酸緩衝液
を用いて行う。好ましくは、最1pHが7前後になるよ
う調整されたリン酸1m液などに滴下し、溶出後すぐに
中和する。また、溶出液にキレート化剤を用いる方法に
おいては、キレート化剤として、遷移金属に対してキレ
ート能を有する物質、たとえば、エチレンジアミン四酢
酸、ヒスチジン、−3H化合物、イミノジ酢酸などを5
mM〜IMの範囲で用いるのがよく、好ましくはヒスチ
ジンが用いられる。
(pH3〜6)にして溶出する方法および溶出液にキレ
ート化剤を用いて溶出する方法とがある。溶出液のpH
を酸性にして溶出する方法においては、LTが失活しな
い範囲でいかなる酸を用いてもよいが、通常酢酸緩衝液
を用いて行う。好ましくは、最1pHが7前後になるよ
う調整されたリン酸1m液などに滴下し、溶出後すぐに
中和する。また、溶出液にキレート化剤を用いる方法に
おいては、キレート化剤として、遷移金属に対してキレ
ート能を有する物質、たとえば、エチレンジアミン四酢
酸、ヒスチジン、−3H化合物、イミノジ酢酸などを5
mM〜IMの範囲で用いるのがよく、好ましくはヒスチ
ジンが用いられる。
LT溶液を遷移金属キレート担体に吸着させた後、LT
を溶出する前に、キレート担体に吸着した不純物を除去
するために洗浄剤で洗浄する必要がある。洗浄剤として
は、溶出方法により異なるが、溶出液に用いることがで
きるものはすべて用いることができる。溶出液のpHを
酸性にして溶出する方法では、溶出液よりもpHが高い
もの(たとえば、溶出液のpHが4の場合洗浄液のpH
は5)を用い、溶出液にキレート化剤を用いる方法では
、溶出液よりも濃度が低いもの(たとえば、溶出液のキ
レート他剤濃度が100mMの場合、洗浄液のキレート
他剤濃度はlQmM)を用いる。洗浄剤と溶出液は同じ
もので、pHまたは濃度をかえただけのものを用いるの
が好ましい。
を溶出する前に、キレート担体に吸着した不純物を除去
するために洗浄剤で洗浄する必要がある。洗浄剤として
は、溶出方法により異なるが、溶出液に用いることがで
きるものはすべて用いることができる。溶出液のpHを
酸性にして溶出する方法では、溶出液よりもpHが高い
もの(たとえば、溶出液のpHが4の場合洗浄液のpH
は5)を用い、溶出液にキレート化剤を用いる方法では
、溶出液よりも濃度が低いもの(たとえば、溶出液のキ
レート他剤濃度が100mMの場合、洗浄液のキレート
他剤濃度はlQmM)を用いる。洗浄剤と溶出液は同じ
もので、pHまたは濃度をかえただけのものを用いるの
が好ましい。
本発明においてキレート他系水溶液を用いて回収したL
T温溶液はキレート化剤、および遷移金属が混入してく
るが、これらは通常の低分子成分と高分子成分を分離す
る方法、即ち、水、希薄塩または希薄酸溶液中にて透析
、またはセファデックスなどを用いるゲル濾過法によっ
て脱塩または減塩することによって除去される。
T温溶液はキレート化剤、および遷移金属が混入してく
るが、これらは通常の低分子成分と高分子成分を分離す
る方法、即ち、水、希薄塩または希薄酸溶液中にて透析
、またはセファデックスなどを用いるゲル濾過法によっ
て脱塩または減塩することによって除去される。
精製されたLTは失活しやすいので、通常、上記の脱塩
または減塩化に先立ち、ヒトアルブミンなどを安定化剤
として添加することが好ましい。実用上、前もって回収
剤にヒトアルブミンなどを添加しておいてもよい。脱塩
または減塩化されたLT温溶液場合によって中性にpH
調整し、必要に応じ添加物を加えた後、無菌濾過し、さ
らに分注、凍結乾燥して注射用製側などにすることがで
きる。
または減塩化に先立ち、ヒトアルブミンなどを安定化剤
として添加することが好ましい。実用上、前もって回収
剤にヒトアルブミンなどを添加しておいてもよい。脱塩
または減塩化されたLT温溶液場合によって中性にpH
調整し、必要に応じ添加物を加えた後、無菌濾過し、さ
らに分注、凍結乾燥して注射用製側などにすることがで
きる。
本発明で使用された金属キレート担体カラムは、通常使
用後、0.IM NaOHを通液し、不可逆的に吸着
した不純物を除去するとともに滅菌し、ついで遷移金属
キレートを形成させることにより繰り返し使用できる。
用後、0.IM NaOHを通液し、不可逆的に吸着
した不純物を除去するとともに滅菌し、ついで遷移金属
キレートを形成させることにより繰り返し使用できる。
LT温溶液該吸着体と直接接触させてもよいが、好まし
くは硫安分画などの簡便な前処理を行った後に接触させ
るのがよい。
くは硫安分画などの簡便な前処理を行った後に接触させ
るのがよい。
本発明における総蛋白質量、LT蛋白質量、細胞障害活
性は以下に記載する実験方法1〜3によって測定する。
性は以下に記載する実験方法1〜3によって測定する。
実験方法1 蛋白質の測定はエム・エム・ブラブドフォ
ードの方法CM、M、Bradford : 7ナリ
テイカル・バイオケミストリ4 (Anal、Bioc
hem、)72.248(19’!6) 〕により行う
。
ードの方法CM、M、Bradford : 7ナリ
テイカル・バイオケミストリ4 (Anal、Bioc
hem、)72.248(19’!6) 〕により行う
。
実験方法2 LT蛋白質量はレムリの方法C1,に、
Laemml r :ネイチャー(Nature)
227.680<1970) 〕により〕5DS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳を行った後、クロマトスキャ
ナー(C3−930高滓製作所)で測定する。
Laemml r :ネイチャー(Nature)
227.680<1970) 〕により〕5DS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳を行った後、クロマトスキャ
ナー(C3−930高滓製作所)で測定する。
実験方法3 細胞障害活性の測定は、ミュリン フィブ
ロプラスト上929アフセイ法CB、B、Aggarw
al etal、 : ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ(J、 Biol、 Chem、
) 260 、2345(1985) )により行う。
ロプラスト上929アフセイ法CB、B、Aggarw
al etal、 : ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ(J、 Biol、 Chem、
) 260 、2345(1985) )により行う。
本発明の精製法を以下の実施例でより詳細に説明するが
、これは本発明を限定するものではない。
、これは本発明を限定するものではない。
実施例1
組換えDNA技術を用いて生産されたLT抽出液20m
1を硫安塩析し、40%飽和硫安沈殿を得た。得られた
硫安沈澱を0.IM NaC1を含む20mMリン酸
緩衝液(pH7,4)80mlに溶解し、5ml/hr
の流速で、亜鉛キレート担体カラム(1,5x5.7c
m)に通塔した。
1を硫安塩析し、40%飽和硫安沈殿を得た。得られた
硫安沈澱を0.IM NaC1を含む20mMリン酸
緩衝液(pH7,4)80mlに溶解し、5ml/hr
の流速で、亜鉛キレート担体カラム(1,5x5.7c
m)に通塔した。
亜鉛キレート担体は、イミノジ酢酸の2ナトリウム塩(
2g)を10m1の2M Na2co3+=溶解、し
、エポキシ活性化セファローズ6B 15m1と65
℃、24時間反応させることにより、ビスカルボキシメ
チルアミノアガロース15mlを調製し、次いで、亜鉛
イオンを導入することによって得た。亜鉛イオンの導入
は、ビスカルボキシメチルアミノアガロース15m1を
、lQmM ZnC1zおよびIM NaC1を含
む100mM酢酸緩衝液(pH4,0) 150ml中
で2時間攪拌することによって行い、さらにI MN
a C1を含む100mM酢酸緩衝液(pH4,0)
75mlで洗浄後、0.IM Na(lを含む20
m Mリン酸緩衝液(pH7,4)で平衡化した〔J、
Porath et al、: ネイチ+ −(Nat
ure)韮、 598(1975) 〕。
2g)を10m1の2M Na2co3+=溶解、し
、エポキシ活性化セファローズ6B 15m1と65
℃、24時間反応させることにより、ビスカルボキシメ
チルアミノアガロース15mlを調製し、次いで、亜鉛
イオンを導入することによって得た。亜鉛イオンの導入
は、ビスカルボキシメチルアミノアガロース15m1を
、lQmM ZnC1zおよびIM NaC1を含
む100mM酢酸緩衝液(pH4,0) 150ml中
で2時間攪拌することによって行い、さらにI MN
a C1を含む100mM酢酸緩衝液(pH4,0)
75mlで洗浄後、0.IM Na(lを含む20
m Mリン酸緩衝液(pH7,4)で平衡化した〔J、
Porath et al、: ネイチ+ −(Nat
ure)韮、 598(1975) 〕。
LT溶液を通塔後、l Q m Mヒスチジンおよび0
.IM NaCfを含む20mMリン酸緩衝液(pH
7,4)20mlを用いて5ml/hrの流速で洗浄し
、不純物の大半を除去した。次いで、100mMヒスチ
ジンおよび0、IM NaCAを含む20’mMリン
酸緩衝液(pH7,4)30ff11を5ml/hrの
流速で流し、溶出液を1mlずつ分画採取した。実験方
法2に従ってLT蛋白質量を測定し、蛋白純度50%以
上の分画を集めてLT溶出液を得た。
.IM NaCfを含む20mMリン酸緩衝液(pH
7,4)20mlを用いて5ml/hrの流速で洗浄し
、不純物の大半を除去した。次いで、100mMヒスチ
ジンおよび0、IM NaCAを含む20’mMリン
酸緩衝液(pH7,4)30ff11を5ml/hrの
流速で流し、溶出液を1mlずつ分画採取した。実験方
法2に従ってLT蛋白質量を測定し、蛋白純度50%以
上の分画を集めてLT溶出液を得た。
得られた溶出液のLT活性と蛋白質量を第1表に示す。
この亜鉛キレート担体力ラム工程の回収率は約90%で
あった。第1表から高純度のLTが高濃度に精製された
ことがわかる。
あった。第1表から高純度のLTが高濃度に精製された
ことがわかる。
亜鉛キレート担体カラムを0.1N NaO830m
lで洗浄後亜鉛イオンを導入し、再生した。
lで洗浄後亜鉛イオンを導入し、再生した。
第 1 表
実施例2
参考例に従って、組換え体プラスミドpLdTD11
。
。
pLdTD12またはpLdTA2を持つ大腸菌εLd
TD11(FERM BP−963)、ELdTD12
(FERII BP−964)、ELdTA2(FER
M BP−962)をそれぞれ培養して得られたヒ)L
Tポリペプチド誘導体抽出液各20m1について実施例
1と同様にして硫安沈殿の溶液各80m1を取(尋した
。このヒ)LTポリペプチド誘導体溶液を実施例1と同
様にして、亜鉛キレート担体カラム(1,5X5.7c
m)に通塔後洗浄および溶出を行った。
TD11(FERM BP−963)、ELdTD12
(FERII BP−964)、ELdTA2(FER
M BP−962)をそれぞれ培養して得られたヒ)L
Tポリペプチド誘導体抽出液各20m1について実施例
1と同様にして硫安沈殿の溶液各80m1を取(尋した
。このヒ)LTポリペプチド誘導体溶液を実施例1と同
様にして、亜鉛キレート担体カラム(1,5X5.7c
m)に通塔後洗浄および溶出を行った。
得られた溶出液のLT活性と蛋白質量を第2,3゜4表
に示す。
に示す。
第2表[EシdTD11(FERM BP−963)の
抽出液からの精製例3本 回収率52% 第3表CELdTD12(FERN BP−964)の
抽出液からの精製例3本 回収率27% 第4表(ELdTA2(FERM BP−962)の抽
出液からの精製例3本 回収率60% 実施例3 実施例1と同様にして得たLTを含む硫安沈澱の溶液3
Qmlを亜鉛キレート担体カラムに通塔した。この亜鉛
キレート担体カラムは、実施例1に使用後再生したもの
である。LT溶液を通塔後、0.IM NaC1を含
む0.1M酢酸緩衝液(pH5,5) 20mlを用い
て5+++l/hrの流速で洗浄し、次いで0.1M
NaCβを含む0.05M酢酸緩衝液(pH4,0)
30mlを用いて5ml/hrの流速で実施例1と同
様にしてLTを溶出した。この際、溶出液を最終pHが
7前後になるよう調整されたリン酸緩衝液中に滴下し、
溶出後すぐ中和した。
抽出液からの精製例3本 回収率52% 第3表CELdTD12(FERN BP−964)の
抽出液からの精製例3本 回収率27% 第4表(ELdTA2(FERM BP−962)の抽
出液からの精製例3本 回収率60% 実施例3 実施例1と同様にして得たLTを含む硫安沈澱の溶液3
Qmlを亜鉛キレート担体カラムに通塔した。この亜鉛
キレート担体カラムは、実施例1に使用後再生したもの
である。LT溶液を通塔後、0.IM NaC1を含
む0.1M酢酸緩衝液(pH5,5) 20mlを用い
て5+++l/hrの流速で洗浄し、次いで0.1M
NaCβを含む0.05M酢酸緩衝液(pH4,0)
30mlを用いて5ml/hrの流速で実施例1と同
様にしてLTを溶出した。この際、溶出液を最終pHが
7前後になるよう調整されたリン酸緩衝液中に滴下し、
溶出後すぐ中和した。
得られた溶出液のLT活性と蛋白質量を第5表に示す。
この亜鉛キレート担体力ラム工程は、回収率が約60%
であった。
であった。
第 5 表
実施例4
LTi導後0リンパ芽球細胞株L u K II [8
,Y、 Rubinet al、 : プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイx
7 ス(Proc、 Natl、 Acad、Sci
、 )82、6637 (1985) ’]をプロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス(Proc、 Natl。
,Y、 Rubinet al、 : プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイx
7 ス(Proc、 Natl、 Acad、Sci
、 )82、6637 (1985) ’]をプロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス(Proc、 Natl。
Acad、 Sci、) 77、5938(1980)
に従って培養して得られた培養上清10100Oを20
m1/hrの流速で銅キレート担体カラム(1,5X
5.7 am)に通塔した。銅キレート担体カラムはl
n Cl 2の代わりにCu5Oaを用いて実施例1
と同様に調製した。また、洗浄および溶出も実施例1と
同様に行った。
に従って培養して得られた培養上清10100Oを20
m1/hrの流速で銅キレート担体カラム(1,5X
5.7 am)に通塔した。銅キレート担体カラムはl
n Cl 2の代わりにCu5Oaを用いて実施例1
と同様に調製した。また、洗浄および溶出も実施例1と
同様に行った。
得られた溶出液のLT活性と蛋白質量を第6表に示す。
この銅キレート担体力ラム工程は、回収率が約70%で
あった。
あった。
第6表
実施例5
参考例に従って組換え体プラスミド匹dTD11を持つ
大腸菌ELdTD11 (FERN BP−963)を
用いて生産されたヒ)LTポリペプチド誘導体抽出液2
Qmlについても実施例1と同様にして硫安沈澱の溶液
3Qmlを取得した。
大腸菌ELdTD11 (FERN BP−963)を
用いて生産されたヒ)LTポリペプチド誘導体抽出液2
Qmlについても実施例1と同様にして硫安沈澱の溶液
3Qmlを取得した。
このヒ)LTポリペプチド誘導体溶液を5ml/hrの
流速で銅キレート担体カラム(1,5x5.7 cm)
に通塔した。
流速で銅キレート担体カラム(1,5x5.7 cm)
に通塔した。
銅キレート担体カラムは、ZnCl2の代わりに(u
S Oaを用いて実施例1と同様に調製した。また洗浄
および溶出も実施例1と同様に行った。
S Oaを用いて実施例1と同様に調製した。また洗浄
および溶出も実施例1と同様に行った。
得られた溶出液のLT活性と蛋白質量を第7表に示す。
この銅キレート担体力ラム工程は、回収率が約28%で
あった。
あった。
第 7 表
実施例6
参考例に従って組換え体プラスミドpLdTD12を持
つ大腸菌ELdTD12 (FERM BP−964)
を用いて生産されたと)LTポリペプチド誘導体抽出液
20m1についても実絶倒1と同様にして硫安沈澱の溶
液80m1を取得した。
つ大腸菌ELdTD12 (FERM BP−964)
を用いて生産されたと)LTポリペプチド誘導体抽出液
20m1についても実絶倒1と同様にして硫安沈澱の溶
液80m1を取得した。
このヒトLTポリペプチド誘導体溶液を5nl/hrの
流速でニッケルキレート担体カラム(1,5X5.7
am) に通塔した。このニッケルキレート担体カラ
ムは、Z n CE ;の代わりにN1Cj!2を用い
て実施例1と同様に調製した。また洗浄および溶出も実
施例1と同様に行った。
流速でニッケルキレート担体カラム(1,5X5.7
am) に通塔した。このニッケルキレート担体カラ
ムは、Z n CE ;の代わりにN1Cj!2を用い
て実施例1と同様に調製した。また洗浄および溶出も実
施例1と同様に行った。
得られた溶出液のLT活性と蛋白質量を第8表に示す。
このニッケルキレ−)ff1体力ラム工程は、回収率が
約3596であった。
約3596であった。
第 8 表
実施例7
参考例に従って組換え体プラスミドpLdTA2を持つ
大腸菌ELdTA2 (FERN BP−962)を用
いて生産されたヒ)LTポリペプチド誘導体抽出液2(
1mlについても実施例1と同様にして硫安沈殿の溶液
3Qmlを取得した。
大腸菌ELdTA2 (FERN BP−962)を用
いて生産されたヒ)LTポリペプチド誘導体抽出液2(
1mlについても実施例1と同様にして硫安沈殿の溶液
3Qmlを取得した。
このヒ)LTポリペプチド誘導体溶液を5ml/hrの
流速でコバルトキレート担体カラム(1,5x5.7
am)に通塔した。このコバルトキレート担体カラムは
、ZnCf2の代わりにCo(12を用いて実施例1こ
同様に調製した。洗浄および溶出も実施例1と同様に行
った。
流速でコバルトキレート担体カラム(1,5x5.7
am)に通塔した。このコバルトキレート担体カラムは
、ZnCf2の代わりにCo(12を用いて実施例1こ
同様に調製した。洗浄および溶出も実施例1と同様に行
った。
、 得られた溶出液のLT活性と蛋白質量を第9表に
示す。このコバルトキレート担体力うムエ稈は、回収率
が約61%であった。
示す。このコバルトキレート担体力うムエ稈は、回収率
が約61%であった。
第 9 表
参考例
LTポリペプチド誘導体をコードする組換え体プラスミ
ドpLdTD11. pLdTD12またはpLclT
A2を持つ大腸菌KM 430+9F、CそれぞれEL
dTtnHFERh+ BP−963)、 巳LdTD
12(FERM BP−964)、 ELdTA2(F
ERM BP−962)として工業技術院応用微生物工
業技術研究所に寄託されている〕をLGs地〔バクトド
リプトン10g、酵母エキス5g1Na(15g、グル
コース1gを水1 p +l:溶かし、NaOHにてp
Hを7.0とする〕でそれぞれ37℃、18時間培養し
、この培養液5.Qmlを25g/w+のトリプトファ
ンと50■/lTlのアンピンリンを含むMCG培地C
N a2HP 040.6%、K N2 P O−0,
3%、NaC420,5%、カザミノ酸 0.5%、M
gS○。
ドpLdTD11. pLdTD12またはpLclT
A2を持つ大腸菌KM 430+9F、CそれぞれEL
dTtnHFERh+ BP−963)、 巳LdTD
12(FERM BP−964)、 ELdTA2(F
ERM BP−962)として工業技術院応用微生物工
業技術研究所に寄託されている〕をLGs地〔バクトド
リプトン10g、酵母エキス5g1Na(15g、グル
コース1gを水1 p +l:溶かし、NaOHにてp
Hを7.0とする〕でそれぞれ37℃、18時間培養し
、この培養液5.Qmlを25g/w+のトリプトファ
ンと50■/lTlのアンピンリンを含むMCG培地C
N a2HP 040.6%、K N2 P O−0,
3%、NaC420,5%、カザミノ酸 0.5%、M
gS○。
1mM、ビタミ7B1 4g/ml pH’、J〕
I Q Omlに接種し、30℃で4〜8時間培養後、
トリプトファンの誘導物質である3β−インドールアク
リル酸(3β−+ndoleacrylic acid
)を10g/ml加え、さらに2〜12時間培養を続け
る。培養液を8.000rpm、10分間遠心して集菌
し、30mM NaC1,30mM Tr i 5
−HCj! (pH7,5)緩衝液で洗浄する。洗浄菌
体を上記緩衝液2Qmlに懸濁し、0℃で超音波破砕(
BRANSON 5ONICPOWERCOX!PAN
Y社5CINIFIERCELL (llIsRtl
PTOR20G、 0UTPtlT C0NTR0L2
. 10分間処理)する。これを15.000rpm
、 30分間遠心して上清を2QmlLTポリペプチド
誘導体抽出液として得ることができる。
I Q Omlに接種し、30℃で4〜8時間培養後、
トリプトファンの誘導物質である3β−インドールアク
リル酸(3β−+ndoleacrylic acid
)を10g/ml加え、さらに2〜12時間培養を続け
る。培養液を8.000rpm、10分間遠心して集菌
し、30mM NaC1,30mM Tr i 5
−HCj! (pH7,5)緩衝液で洗浄する。洗浄菌
体を上記緩衝液2Qmlに懸濁し、0℃で超音波破砕(
BRANSON 5ONICPOWERCOX!PAN
Y社5CINIFIERCELL (llIsRtl
PTOR20G、 0UTPtlT C0NTR0L2
. 10分間処理)する。これを15.000rpm
、 30分間遠心して上清を2QmlLTポリペプチド
誘導体抽出液として得ることができる。
発明の効果
本発明方法によれば、LT類を含む溶液を安価に効率よ
く精製することができる。
く精製することができる。
Claims (3)
- (1)リンホトキシン類を含む溶液を、銅(Cu)、亜
鉛(Zn)、コバルト(Co)およびニッケル(Ni)
からなる群から選ばれる少なくとも一つの遷移金属をキ
レート化させたキレート基結合担体と接触させ、該担体
に該リンホトキシン類を吸着させた後、溶出液を用いて
該リンホトキシン類を溶出させ回収することを特徴とす
るリンホトキシン類の精製法。 - (2)該リンホトキシン類が動物細胞培養液から得られ
ることを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (3)該リンホトキシン類が遺伝子組換え技術を用いて
生産されたリンホトキシンおよびその誘導体であること
を特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61163413A JPS6317898A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | リンホトキシン類の精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61163413A JPS6317898A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | リンホトキシン類の精製法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6317898A true JPS6317898A (ja) | 1988-01-25 |
Family
ID=15773422
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61163413A Pending JPS6317898A (ja) | 1986-07-11 | 1986-07-11 | リンホトキシン類の精製法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6317898A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994003626A1 (en) * | 1992-07-31 | 1994-02-17 | The Green Cross Corporation | Method of highly purifying human serum albumin |
-
1986
- 1986-07-11 JP JP61163413A patent/JPS6317898A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1994003626A1 (en) * | 1992-07-31 | 1994-02-17 | The Green Cross Corporation | Method of highly purifying human serum albumin |
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