JPS6317898A - リンホトキシン類の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はリンホトキシン（以下ＬＴと略記する）および
ＬＴポリペプチド誘導体の精製方法に閲すＬＴは活性化
されたリンパ球により産生されるリンホカインである。

ＬＴはある種のガン細胞に対して強力な細胞障害活性を
示すが、正常細胞には作用しないと報告されており、制
ガン剤としての臨床応用が期待されている。またＬＴを
コードする遺伝子を含む組換え体プラスミドを保有する
微生物を培養して得られるＬＴおよびＬＴポリペプチド
誘導体〔ネイチャー（Ｎａｔｌ、Ｉｒｅ）　３１２．７
２１゜（１９８４）、特願昭６１−２３３１９〕もＬＴ
活性を有しており、ＬＴと同様医薬としての利用が期待
される。

従来の技術 今日、ヒ）ＬＴは動物細胞大予培養技術および組換えＤ
　Ｎ　Ａ技術の進歩により大量に入手することができる
。特に後者では前者に比し非常に多量のＬＴを入手する
ことができる。

動物細胞培養上清には、ウシ血清をはじめとする多種の
異種蛋白質が存在する。また組換えＬＴは微生物由来で
あるので、微生物または培地からの初期抽出物は一連の
微生物不純蛋白を含んでいる。

従っていずれの生産法でも治療用医薬品として使用する
ためにはＬＴを高度に精製する必要がある。従来、ＬＴ
の精製においては、主にクロマトグラフィー法が使用さ
れてきた〔たとえば、ｅ、　ｅ。

Ａｇｇａｒｗａｌ　ｅｔ　ａｌ、　：　ジャーナ／Ｌ、
−オブ　／＜イオロジカルーケミストリイ（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｉ、　）　２５９　。

６８６　（１９８４）：］。なかでも、免疫吸着剤（ｉ
ｍｍｕｎｏ−ａｄｓＯｒｂｅｎｔｓ）　、すなわち抗Ｌ
Ｔ抗体を用いるクロマトグラフィー法は有効である（Ｐ
、Ｗ、Ｇｒａｙｅｔａｌ　：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）　３１２．７２Ｈ１９８４）　　〕。

一方、金属キレートクロマトグラフィーは、β−インタ
ーフェロンの有効な精、製手法として知られている。（
Ｖ、Ｇ、Ｅｄｙ、ｅｔ　ａｌ、　　：　　ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　）■、　５９３４　（１９７７）　Ｅ。

発明が解決しようとする問題点 抗体クロマトグラフィー法は一段階での高度精製は期待
できるが、精製コストが高い点、溶出液中に抗体および
その分解物が混入する可能性がある点などの問題がある
。また種々のクロマトグラフィーなどの組合せは収率の
低下、工程の煩雑さなどから、工業化に不向きである。

従って本発明の目的は、比較的安価なりロマトグラフィ
ー担体を用い、−段階で効率よ＜ＬＴを精製する手法を
提供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明者は各種クロマトグラフィーを検討した。

その結果金属キレートクロマトグラフィーにより、ＬＴ
を高純度に精製できることを見出し、本発明を完成する
に至った。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、リンホトキシン類を含む溶液を銅（Ｃｕ）、
亜鉛（Ｚｎ）、コバルト（Ｇｏ）およびニッケル（Ｎ１
）からなる群から選ばれる少なくとも一つの遷移金属を
キレート化させたキレート基結合担体と接触させ、該担
体に該リンホトキシン類を吸着させた後、溶出液を用い
て該リンホトキシン類を溶出させ回収することを特徴と
するリンホトキシン類の精製法を提供する。

本発明に用いられるＬＴ類はいかなる起源のものでもよ
いが、リンパ芽球細胞系の産生ずるもの〔Ｂ、Ｙ、Ｒｕ
ｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、ニブロン−ディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　　８２　、６６
３７（１９８５）、　８．Ｂ。

Ａｇｇａｒｗａｉ　ｅｔ　ａｌ、　：ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、　）　　２￥Ｌ。

６８６（１９８４＞　）や組換えＤ　Ｎ　Ａ技術を用い
て生産されたヒ）ＬＴポリペプチドおよびその誘導体〔
ネイチａｒ　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１２　、７２１
（１９８４）　、特願昭６１−２３３１９１などがあげ
られる。

本発明に用いられるキレート基結合担体としては、キレ
ート化能を有する交換基、たとえばビスカルボキンメチ
ルイミノ基［ニーＮ　（ＣＨｚＣＯ○Ｈ）２〕が結合し
たキレート基を有する不溶性多糖類系担体または三次元
架橋したポリオレフィン系担体などかあげられる。好ま
しくはビスカルボキシメチルイミノ基を有する不溶性多
糖類系担体が用いられる。たとえば、エポキシ活性化セ
ファローズか：）誘導され、下記の化学構造を持つもの
がこれに該当する（Ｊ、Ｐｏｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、　
：ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）ユ、　５９ｇ　（１９７５
）　〕。

ＯＨＣ）＋２ＣＯＤ− （Ｍｅ＝遷移金属） また本発明で用いられる遷移金属はコバルト（ｃｏ）、
二７ケ／ｌ／（Ｎｌ）、銅（Ｃｕ）および亜鉛（Ｚｎ）
からなる群から選ばれた少な（とも一つの遷移金属かあ
げられる。

遷移金属キレート担体はＪ、　Ｐｏｒａｔｈ　らの方法
に準じて調製することができる（　Ｊ、Ｐｏｒａｔｈ　
ｅｔ　ａｌ、　　ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）２５８
　、５９８　（１９７５））。

本発明で用いられる吸着方法としては、ｐＨ５〜１０、
好ましくはｐＨ７〜８に調整したＬＴ溶液を遷移金属キ
レート担体にカラム方式あるいはバッチ方式にて吸着さ
せる方法が用いられる。

本発明で用いられる溶出方法には、溶出液のｐＨを酸ａ
（ｐＨ３〜６）にして溶出する方法および溶出液にキレ
ート化剤を用いて溶出する方法とがある。溶出液のｐＨ
を酸性にして溶出する方法においては、ＬＴが失活しな
い範囲でいかなる酸を用いてもよいが、通常酢酸緩衝液
を用いて行う。好ましくは、最１ｐＨが７前後になるよ
う調整されたリン酸１ｍ液などに滴下し、溶出後すぐに
中和する。また、溶出液にキレート化剤を用いる方法に
おいては、キレート化剤として、遷移金属に対してキレ
ート能を有する物質、たとえば、エチレンジアミン四酢
酸、ヒスチジン、−３Ｈ化合物、イミノジ酢酸などを５
ｍＭ〜ＩＭの範囲で用いるのがよく、好ましくはヒスチ
ジンが用いられる。

ＬＴ溶液を遷移金属キレート担体に吸着させた後、ＬＴ
を溶出する前に、キレート担体に吸着した不純物を除去
するために洗浄剤で洗浄する必要がある。洗浄剤として
は、溶出方法により異なるが、溶出液に用いることがで
きるものはすべて用いることができる。溶出液のｐＨを
酸性にして溶出する方法では、溶出液よりもｐＨが高い
もの（たとえば、溶出液のｐＨが４の場合洗浄液のｐＨ
は５）を用い、溶出液にキレート化剤を用いる方法では
、溶出液よりも濃度が低いもの（たとえば、溶出液のキ
レート他剤濃度が１００ｍＭの場合、洗浄液のキレート
他剤濃度はｌＱｍＭ）を用いる。洗浄剤と溶出液は同じ
もので、ｐＨまたは濃度をかえただけのものを用いるの
が好ましい。

本発明においてキレート他系水溶液を用いて回収したＬ
Ｔ温溶液はキレート化剤、および遷移金属が混入してく
るが、これらは通常の低分子成分と高分子成分を分離す
る方法、即ち、水、希薄塩または希薄酸溶液中にて透析
、またはセファデックスなどを用いるゲル濾過法によっ
て脱塩または減塩することによって除去される。

精製されたＬＴは失活しやすいので、通常、上記の脱塩
または減塩化に先立ち、ヒトアルブミンなどを安定化剤
として添加することが好ましい。実用上、前もって回収
剤にヒトアルブミンなどを添加しておいてもよい。脱塩
または減塩化されたＬＴ温溶液場合によって中性にｐＨ
調整し、必要に応じ添加物を加えた後、無菌濾過し、さ
らに分注、凍結乾燥して注射用製側などにすることがで
きる。

本発明で使用された金属キレート担体カラムは、通常使
用後、０．ＩＭ　　ＮａＯＨを通液し、不可逆的に吸着
した不純物を除去するとともに滅菌し、ついで遷移金属
キレートを形成させることにより繰り返し使用できる。

ＬＴ温溶液該吸着体と直接接触させてもよいが、好まし
くは硫安分画などの簡便な前処理を行った後に接触させ
るのがよい。

本発明における総蛋白質量、ＬＴ蛋白質量、細胞障害活
性は以下に記載する実験方法１〜３によって測定する。

実験方法１　蛋白質の測定はエム・エム・ブラブドフォ
ードの方法ＣＭ、Ｍ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ　：　　７ナリ
テイカル・バイオケミストリ４　（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）７２．２４８（１９’！６）　〕により行う
。

実験方法２　　ＬＴ蛋白質量はレムリの方法Ｃ１，に、
　Ｌａｅｍｍｌ　ｒ　：ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　
２２７．６８０＜１９７０）　〕により〕５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳を行った後、クロマトスキャ
ナー（Ｃ３−９３０高滓製作所）で測定する。

実験方法３　細胞障害活性の測定は、ミュリン　フィブ
ロプラスト上９２９アフセイ法ＣＢ、Ｂ、Ａｇｇａｒｗ
ａｌ　ｅｔａｌ、　：　ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　
）　２６０　、２３４５（１９８５）　）により行う。

本発明の精製法を以下の実施例でより詳細に説明するが
、これは本発明を限定するものではない。

実施例１ 組換えＤＮＡ技術を用いて生産されたＬＴ抽出液２０ｍ
１を硫安塩析し、４０％飽和硫安沈殿を得た。得られた
硫安沈澱を０．ＩＭ　　ＮａＣ１を含む２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）８０ｍｌに溶解し、５ｍｌ／ｈｒ
の流速で、亜鉛キレート担体カラム（１，５ｘ５．７ｃ
ｍ）に通塔した。

亜鉛キレート担体は、イミノジ酢酸の２ナトリウム塩（
２ｇ）を１０ｍ１の２Ｍ　　Ｎａ２ｃｏ３＋＝溶解、し
、エポキシ活性化セファローズ６Ｂ　　１５ｍ１と６５
℃、２４時間反応させることにより、ビスカルボキシメ
チルアミノアガロース１５ｍｌを調製し、次いで、亜鉛
イオンを導入することによって得た。亜鉛イオンの導入
は、ビスカルボキシメチルアミノアガロース１５ｍ１を
、ｌＱｍＭ　　ＺｎＣ１ｚおよびＩＭ　　ＮａＣ１を含
む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）　１５０ｍｌ中
で２時間攪拌することによって行い、さらにＩ　ＭＮ　
ａ　Ｃ１を含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）　
７５ｍｌで洗浄後、０．ＩＭ　　Ｎａ（ｌを含む２０　
ｍ　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化した〔Ｊ、
Ｐｏｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、：　ネイチ＋　−（Ｎａｔ
ｕｒｅ）韮、　　５９８（１９７５）　〕。

ＬＴ溶液を通塔後、ｌ　Ｑ　ｍ　Ｍヒスチジンおよび０
．ＩＭ　　ＮａＣｆを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，４）２０ｍｌを用いて５ｍｌ／ｈｒの流速で洗浄し
、不純物の大半を除去した。次いで、１００ｍＭヒスチ
ジンおよび０、ＩＭ　　ＮａＣＡを含む２０’ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，４）３０ｆｆ１１を５ｍｌ／ｈｒの
流速で流し、溶出液を１ｍｌずつ分画採取した。実験方
法２に従ってＬＴ蛋白質量を測定し、蛋白純度５０％以
上の分画を集めてＬＴ溶出液を得た。

得られた溶出液のＬＴ活性と蛋白質量を第１表に示す。

この亜鉛キレート担体力ラム工程の回収率は約９０％で
あった。第１表から高純度のＬＴが高濃度に精製された
ことがわかる。

亜鉛キレート担体カラムを０．１Ｎ　　ＮａＯ８３０ｍ
ｌで洗浄後亜鉛イオンを導入し、再生した。

第　　　１　　　表 実施例２ 参考例に従って、組換え体プラスミドｐＬｄＴＤ１１　
。

ｐＬｄＴＤ１２またはｐＬｄＴＡ２を持つ大腸菌εＬｄ
ＴＤ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−９６３）、ＥＬｄＴＤ１２
（ＦＥＲＩＩ　ＢＰ−９６４）、ＥＬｄＴＡ２（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−９６２）をそれぞれ培養して得られたヒ）Ｌ
Ｔポリペプチド誘導体抽出液各２０ｍ１について実施例
１と同様にして硫安沈殿の溶液各８０ｍ１を取（尋した
。このヒ）ＬＴポリペプチド誘導体溶液を実施例１と同
様にして、亜鉛キレート担体カラム（１，５Ｘ５．７ｃ
ｍ）に通塔後洗浄および溶出を行った。

得られた溶出液のＬＴ活性と蛋白質量を第２，３゜４表
に示す。

第２表［ＥシｄＴＤ１１（ＦＥＲＭ　ＢＰ−９６３）の
抽出液からの精製例３本　回収率５２％ 第３表ＣＥＬｄＴＤ１２（ＦＥＲＮ　ＢＰ−９６４）の
抽出液からの精製例３本　回収率２７％ 第４表（ＥＬｄＴＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−９６２）の抽
出液からの精製例３本　回収率６０％ 実施例３ 実施例１と同様にして得たＬＴを含む硫安沈澱の溶液３
Ｑｍｌを亜鉛キレート担体カラムに通塔した。この亜鉛
キレート担体カラムは、実施例１に使用後再生したもの
である。ＬＴ溶液を通塔後、０．ＩＭ　　ＮａＣ１を含
む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５，５）　２０ｍｌを用い
て５＋＋＋ｌ／ｈｒの流速で洗浄し、次いで０．１Ｍ　
　ＮａＣβを含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）
　３０ｍｌを用いて５ｍｌ／ｈｒの流速で実施例１と同
様にしてＬＴを溶出した。この際、溶出液を最終ｐＨが
７前後になるよう調整されたリン酸緩衝液中に滴下し、
溶出後すぐ中和した。

得られた溶出液のＬＴ活性と蛋白質量を第５表に示す。

この亜鉛キレート担体力ラム工程は、回収率が約６０％
であった。

第　　　５　　　表 実施例４ ＬＴｉ導後０リンパ芽球細胞株Ｌ　ｕ　Ｋ　ＩＩ　［８
，Ｙ、　Ｒｕｂｉｎｅｔ　ａｌ、　：　プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイｘ
　７　ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、　）８２、６６３７　（１９８５）　’］をプロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　７７、５９３８（１９８０）
に従って培養して得られた培養上清１０１００Ｏを２０
ｍ１／ｈｒの流速で銅キレート担体カラム（１，５Ｘ　
５．７　ａｍ）に通塔した。銅キレート担体カラムはｌ
　ｎ　Ｃｌ　２の代わりにＣｕ５Ｏａを用いて実施例１
と同様に調製した。また、洗浄および溶出も実施例１と
同様に行った。

得られた溶出液のＬＴ活性と蛋白質量を第６表に示す。

この銅キレート担体力ラム工程は、回収率が約７０％で
あった。

第６表 実施例５ 参考例に従って組換え体プラスミド匹ｄＴＤ１１を持つ
大腸菌ＥＬｄＴＤ１１　（ＦＥＲＮ　ＢＰ−９６３）を
用いて生産されたヒ）ＬＴポリペプチド誘導体抽出液２
Ｑｍｌについても実施例１と同様にして硫安沈澱の溶液
３Ｑｍｌを取得した。

このヒ）ＬＴポリペプチド誘導体溶液を５ｍｌ／ｈｒの
流速で銅キレート担体カラム（１，５ｘ５．７　ｃｍ）
　に通塔した。

銅キレート担体カラムは、ＺｎＣｌ２の代わりに（ｕ　
Ｓ　Ｏａを用いて実施例１と同様に調製した。また洗浄
および溶出も実施例１と同様に行った。

得られた溶出液のＬＴ活性と蛋白質量を第７表に示す。

この銅キレート担体力ラム工程は、回収率が約２８％で
あった。

第　　　７　　　表 実施例６ 参考例に従って組換え体プラスミドｐＬｄＴＤ１２を持
つ大腸菌ＥＬｄＴＤ１２　（ＦＥＲＭ　ＢＰ−９６４）
を用いて生産されたと）ＬＴポリペプチド誘導体抽出液
２０ｍ１についても実絶倒１と同様にして硫安沈澱の溶
液８０ｍ１を取得した。

このヒトＬＴポリペプチド誘導体溶液を５ｎｌ／ｈｒの
流速でニッケルキレート担体カラム（１，５Ｘ５．７　
ａｍ）　　に通塔した。このニッケルキレート担体カラ
ムは、Ｚ　ｎ　ＣＥ　；の代わりにＮ１Ｃｊ！２を用い
て実施例１と同様に調製した。また洗浄および溶出も実
施例１と同様に行った。

得られた溶出液のＬＴ活性と蛋白質量を第８表に示す。

このニッケルキレ−）ｆｆ１体力ラム工程は、回収率が
約３５９６であった。

第　　　８　　　表 実施例７ 参考例に従って組換え体プラスミドｐＬｄＴＡ２を持つ
大腸菌ＥＬｄＴＡ２　（ＦＥＲＮ　ＢＰ−９６２）を用
いて生産されたヒ）ＬＴポリペプチド誘導体抽出液２（
１ｍｌについても実施例１と同様にして硫安沈殿の溶液
３Ｑｍｌを取得した。

このヒ）ＬＴポリペプチド誘導体溶液を５ｍｌ／ｈｒの
流速でコバルトキレート担体カラム（１，５ｘ５．７　
ａｍ）に通塔した。このコバルトキレート担体カラムは
、ＺｎＣｆ２の代わりにＣｏ（１２を用いて実施例１こ
同様に調製した。洗浄および溶出も実施例１と同様に行
った。

、　　得られた溶出液のＬＴ活性と蛋白質量を第９表に
示す。このコバルトキレート担体力うムエ稈は、回収率
が約６１％であった。

第　　　９　　　表 参考例 ＬＴポリペプチド誘導体をコードする組換え体プラスミ
ドｐＬｄＴＤ１１．　ｐＬｄＴＤ１２またはｐＬｃｌＴ
Ａ２を持つ大腸菌ＫＭ　４３０＋９Ｆ、ＣそれぞれＥＬ
ｄＴｔｎＨＦＥＲｈ＋　ＢＰ−９６３）、　巳ＬｄＴＤ
１２（ＦＥＲＭ　ＢＰ−９６４）、　ＥＬｄＴＡ２（Ｆ
ＥＲＭ　ＢＰ−９６２）として工業技術院応用微生物工
業技術研究所に寄託されている〕をＬＧｓ地〔バクトド
リプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ１Ｎａ（１５ｇ、グル
コース１ｇを水１　ｐ　＋ｌ：溶かし、ＮａＯＨにてｐ
Ｈを７．０とする〕でそれぞれ３７℃、１８時間培養し
、この培養液５．Ｑｍｌを２５ｇ／ｗ＋のトリプトファ
ンと５０■／ｌＴｌのアンピンリンを含むＭＣＧ培地Ｃ
Ｎ　ａ２ＨＰ　０４０．６％、Ｋ　Ｎ２　Ｐ　Ｏ−０，
３％、ＮａＣ４２０，５％、カザミノ酸　０．５％、Ｍ
ｇＳ○。

１ｍＭ、ビタミ７Ｂ１　４ｇ／ｍｌ　　ｐＨ’、Ｊ〕　
Ｉ　Ｑ　Ｏｍｌに接種し、３０℃で４〜８時間培養後、
トリプトファンの誘導物質である３β−インドールアク
リル酸（３β−＋ｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄ
）を１０ｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を続け
る。培養液を８．０００ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌
し、３０ｍＭ　　ＮａＣ１，３０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５
−ＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）緩衝液で洗浄する。洗浄菌
体を上記緩衝液２Ｑｍｌに懸濁し、０℃で超音波破砕（
ＢＲＡＮＳＯＮ　５ＯＮＩＣＰＯＷＥＲＣＯＸ！ＰＡＮ
Ｙ社５ＣＩＮＩＦＩＥＲＣＥＬＬ　　（ｌｌＩｓＲｔｌ
ＰＴＯＲ２０Ｇ、　０ＵＴＰｔｌＴ　Ｃ０ＮＴＲ０Ｌ２
．　１０分間処理）する。これを１５．０００ｒｐｍ　
、　３０分間遠心して上清を２ＱｍｌＬＴポリペプチド
誘導体抽出液として得ることができる。

発明の効果 本発明方法によれば、ＬＴ類を含む溶液を安価に効率よ
く精製することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）リンホトキシン類を含む溶液を、銅（Ｃｕ）、亜
   鉛（Ｚｎ）、コバルト（Ｃｏ）およびニッケル（Ｎｉ）
   からなる群から選ばれる少なくとも一つの遷移金属をキ
   レート化させたキレート基結合担体と接触させ、該担体
   に該リンホトキシン類を吸着させた後、溶出液を用いて
   該リンホトキシン類を溶出させ回収することを特徴とす
   るリンホトキシン類の精製法。
2. （２）該リンホトキシン類が動物細胞培養液から得られ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）該リンホトキシン類が遺伝子組換え技術を用いて
   生産されたリンホトキシンおよびその誘導体であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。