JP2003096092A - 陽イオン交換クロマトグラフィーを介する薬理学的に活性なタンパク質の精製方法 - Google Patents
陽イオン交換クロマトグラフィーを介する薬理学的に活性なタンパク質の精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明の範囲は、薬理学的に活性なタンパク
質、主にインターフェロンタンパク質およびアルブミン
タンパク質の精製に有用な新規な方法を見出すことであ
る。 【解決手段】 タンパク質の精製方法は、固体マトリク
スでの陽イオン交換クロマトグラフィーの使用に基づ
き、精製されるタンパク質の等電点（ｐＩ）に相当する
ｐＨについてよりも塩基性であるが、そのタンパク質
は、なお吸着したままであるｐＨで実施する。精製され
る薬理学的に活性なタンパク質の種類に対して、ときど
き調整されるｐＨおよびイオン強度の値を有する緩衝液
は、純粋な形態でのタンパク質の溶出のために使用され
る。
質、主にインターフェロンタンパク質およびアルブミン
タンパク質の精製に有用な新規な方法を見出すことであ
る。 【解決手段】 タンパク質の精製方法は、固体マトリク
スでの陽イオン交換クロマトグラフィーの使用に基づ
き、精製されるタンパク質の等電点（ｐＩ）に相当する
ｐＨについてよりも塩基性であるが、そのタンパク質
は、なお吸着したままであるｐＨで実施する。精製され
る薬理学的に活性なタンパク質の種類に対して、ときど
き調整されるｐＨおよびイオン強度の値を有する緩衝液
は、純粋な形態でのタンパク質の溶出のために使用され
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、特定の条件下にお
ける固体マトリクスでの陽イオン交換クロマトグラフィ
ーの使用に基づく薬理学的に活性なタンパク質の精製方
法に関する。
ける固体マトリクスでの陽イオン交換クロマトグラフィ
ーの使用に基づく薬理学的に活性なタンパク質の精製方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】大部分の生物医学的科学は、それ自体、
抽出技術によって得られる天然起源の、および組換えＤ
ＮＡ技術によって得られる合成起源の、両方の薬理学的
に活性なタンパク質の使用に基づく。目的の産物の純度
レベルは両方の場合において重要である。なぜなら、薬
理学的に活性なタンパク質の活性の理解は、生物学的効
果と固定量のそのタンパク質の存在とが厳密に結びつく
可能性によって決定されるからである。
抽出技術によって得られる天然起源の、および組換えＤ
ＮＡ技術によって得られる合成起源の、両方の薬理学的
に活性なタンパク質の使用に基づく。目的の産物の純度
レベルは両方の場合において重要である。なぜなら、薬
理学的に活性なタンパク質の活性の理解は、生物学的効
果と固定量のそのタンパク質の存在とが厳密に結びつく
可能性によって決定されるからである。
【０００３】この文脈において、製造されたタンパク質
の純度は、医薬品に含まれる活性素因または賦形剤が関
係する場合に顕著な重要性があると仮定されるので、薬
理学的に活性なタンパク質の精製方法は、重要な割合を
占める。治療中に毒性効果が起こる可能性および／また
は副作用が生じる可能性は、登録および認可を担う権限
を実際に推し進める。さらにより厳重な規定を導入する
ために、タンパク質に基づく医薬品市場に対するこの規
定は、市販の医薬品に含まれるタンパク質起源の活性素
因の品質および製造一貫性を決定するためのものであ
る。
の純度は、医薬品に含まれる活性素因または賦形剤が関
係する場合に顕著な重要性があると仮定されるので、薬
理学的に活性なタンパク質の精製方法は、重要な割合を
占める。治療中に毒性効果が起こる可能性および／また
は副作用が生じる可能性は、登録および認可を担う権限
を実際に推し進める。さらにより厳重な規定を導入する
ために、タンパク質に基づく医薬品市場に対するこの規
定は、市販の医薬品に含まれるタンパク質起源の活性素
因の品質および製造一貫性を決定するためのものであ
る。
【０００４】タンパク質の精製方法の前記重要性から、
薬理学的に活性なタンパク質は常に多くの他のタンパク
質と一緒になった複合混合物の状態である、という実際
に存在する主な問題が明らかに現われる。
薬理学的に活性なタンパク質は常に多くの他のタンパク
質と一緒になった複合混合物の状態である、という実際
に存在する主な問題が明らかに現われる。
【０００５】この事実は、天然供給源および組換えＤＮ
Ａ技術の両方にあてはまり、天然供給源（たとえば、血
液、動物または植物の器官からの抽出物など）の場合
は、薬理学的に活性なタンパク質を抽出するために使用
され、そして組換えＤＮＡ技術の場合は、タンパク質が
それらの起源から独立して由来するそのタンパク質間で
類似の化学物理学的特性を示すので使用される。
Ａ技術の両方にあてはまり、天然供給源（たとえば、血
液、動物または植物の器官からの抽出物など）の場合
は、薬理学的に活性なタンパク質を抽出するために使用
され、そして組換えＤＮＡ技術の場合は、タンパク質が
それらの起源から独立して由来するそのタンパク質間で
類似の化学物理学的特性を示すので使用される。
【０００６】したがって、前記から、薬理学的に活性な
タンパク質の精製の場合、類似の特性を有する他のタン
パク質と混合したタンパク質、そして、しばしば非常に
多量の目的のタンパク質が高純度で単離されなければな
らないことになる。
タンパク質の精製の場合、類似の特性を有する他のタン
パク質と混合したタンパク質、そして、しばしば非常に
多量の目的のタンパク質が高純度で単離されなければな
らないことになる。
【０００７】この課題は厳密であり、そしていくつかの
精製工程は、通常、目的の純度を得るために使用され
る。精製方法は、この場合、非常に複雑となり、そして
タンパク質の工業的製造の成功は、本質的にその精製方
法の効率と結びついている。なぜなら、後者は、製造費
用を充分に決定するからである。
精製工程は、通常、目的の純度を得るために使用され
る。精製方法は、この場合、非常に複雑となり、そして
タンパク質の工業的製造の成功は、本質的にその精製方
法の効率と結びついている。なぜなら、後者は、製造費
用を充分に決定するからである。
【０００８】多くの技術（たとえば、水性溶媒または有
機溶媒における、あるいはカオトロピック剤を用いる選
択的な沈殿；濾過および／または透析による分離；適切
な抗体を用いる免疫沈澱方法；クロマトグラフィー法な
ど）が、タンパク質を精製するために使用される。この
技術のうちクロマトグラフィー法は、近年、主に、Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４１８，１１５−１４３，（１
９８７）でＲｅｇｎｉｅｒ Ｆ．Ｅ．により報告された
ように要求された純度を得ることを可能にするので非常
に重要になっている。
機溶媒における、あるいはカオトロピック剤を用いる選
択的な沈殿；濾過および／または透析による分離；適切
な抗体を用いる免疫沈澱方法；クロマトグラフィー法な
ど）が、タンパク質を精製するために使用される。この
技術のうちクロマトグラフィー法は、近年、主に、Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．４１８，１１５−１４３，（１
９８７）でＲｅｇｎｉｅｒ Ｆ．Ｅ．により報告された
ように要求された純度を得ることを可能にするので非常
に重要になっている。
【０００９】多くの技術は、科学文献に列挙され、そし
てタンパク質を分離するのに適用される作用機構に基づ
いて分類され得る。これらの技術としては、たとえば、
分子量に基づく分離、通常、固定相ともいわれる極性マ
トリクスへの吸着、逆固定相といわれる非極性マトリク
スへの吸着、銅、亜鉛、鉄および白金のような重金属、
ブリリアントブルーなどの化学色素、プロテインＡおよ
びプロテインＧなどのタンパク質、多糖およびグルコサ
ミノグリカンなどの糖質などの不活性マトリクスに結合
するリガンドとの選択的親和性による吸着、不活性マト
リクスに結合する特定抗体との免疫親和性による吸着、
不活性マトリクスに結合する静電気的に荷電したリガン
ドとのイオン相互作用による吸着などがあげられる。
てタンパク質を分離するのに適用される作用機構に基づ
いて分類され得る。これらの技術としては、たとえば、
分子量に基づく分離、通常、固定相ともいわれる極性マ
トリクスへの吸着、逆固定相といわれる非極性マトリク
スへの吸着、銅、亜鉛、鉄および白金のような重金属、
ブリリアントブルーなどの化学色素、プロテインＡおよ
びプロテインＧなどのタンパク質、多糖およびグルコサ
ミノグリカンなどの糖質などの不活性マトリクスに結合
するリガンドとの選択的親和性による吸着、不活性マト
リクスに結合する特定抗体との免疫親和性による吸着、
不活性マトリクスに結合する静電気的に荷電したリガン
ドとのイオン相互作用による吸着などがあげられる。
【００１０】選択性、すなわち、目的タンパク質を選択
的に認識する能力、費用および工業的レベルで使用され
る可能性が、種々のクロマトグラフィー技術の性能を評
価するためのパラメータとして使用される。
的に認識する能力、費用および工業的レベルで使用され
る可能性が、種々のクロマトグラフィー技術の性能を評
価するためのパラメータとして使用される。
【００１１】これらのパラメータに基づくと、免疫アフ
ィニティクロマトグラフィーが、高度な選択性を保証す
ると考えられる。しかし、抗体は動物起源であるので、
使用費用が高い、抗体が変性する危険性および精製産物
の最終安全性に結びつく危険性などの欠点を示す。
ィニティクロマトグラフィーが、高度な選択性を保証す
ると考えられる。しかし、抗体は動物起源であるので、
使用費用が高い、抗体が変性する危険性および精製産物
の最終安全性に結びつく危険性などの欠点を示す。
【００１２】イオン交換クロマトグラフィーともいわれ
るイオン相互作用を使用するクロマトグラフィーは、タ
ンパク質の薬理学的な活性を保持するための、危険性の
より少ない技術であると考えられ、そして低い管理費用
により容易に工業的な様式で実施されるが、選択性が乏
しいという欠点を示す。
るイオン相互作用を使用するクロマトグラフィーは、タ
ンパク質の薬理学的な活性を保持するための、危険性の
より少ない技術であると考えられ、そして低い管理費用
により容易に工業的な様式で実施されるが、選択性が乏
しいという欠点を示す。
【００１３】したがって、イオン交換クロマトグラフィ
の選択性を上昇させる、その実施の条件を見出し、その
結果、得られた産物の純度の観点からイオン交換クロマ
トグラフィーを他の技術より優位にすることは、非常に
好都合である。
の選択性を上昇させる、その実施の条件を見出し、その
結果、得られた産物の純度の観点からイオン交換クロマ
トグラフィーを他の技術より優位にすることは、非常に
好都合である。
【００１４】イオン交換クロマトグラフィーは、通常、
不変の条件または特定の条件下で静電的に荷電する化学
基を含む固体マトリクスで充填された種々のサイズのカ
ラムを用いることによって実施される。
不変の条件または特定の条件下で静電的に荷電する化学
基を含む固体マトリクスで充填された種々のサイズのカ
ラムを用いることによって実施される。
【００１５】イオン交換カラムに充填される化合物は、
そのマトリクスに結合する電荷で、クーロン引力／反発
により相互作用する。混合物に含まれる種々の化合物
は、その化合物が有する荷電量の作用によって固定相に
それら自体を結合することができ、そして結果として、
その化合物は多かれ少なかれ保持され、荷電量の作用
が、カラムの出口での化合物の分離を規定する。
そのマトリクスに結合する電荷で、クーロン引力／反発
により相互作用する。混合物に含まれる種々の化合物
は、その化合物が有する荷電量の作用によって固定相に
それら自体を結合することができ、そして結果として、
その化合物は多かれ少なかれ保持され、荷電量の作用
が、カラムの出口での化合物の分離を規定する。
【００１６】クロマトグラフィーは、マトリクスの電荷
が陰性である場合、陽イオンが保持されるので陽イオン
交換クロマトグラフィーといわれる。一方、マトリクス
の電荷が陽性である場合、陰イオン交換クロマトグラフ
ィーといわれる。
が陰性である場合、陽イオンが保持されるので陽イオン
交換クロマトグラフィーといわれる。一方、マトリクス
の電荷が陽性である場合、陰イオン交換クロマトグラフ
ィーといわれる。
【００１７】タンパク質は、アミノ酸の異種ポリマーに
よって構成される１０，０００ダルトンより大きな高分
子量を有する化合物である。いくつかのアミノ酸は、そ
れらの側鎖に、陰性様式（酸性アミノ酸）において、ま
たは陽性様式（塩基性アミノ酸）において溶液のｐＨの
作用によってイオン化され得る官能基を有し、したがっ
て、すべてのタンパク質は、多数の負電荷および正電荷
を有する。タンパク質の等電点ｐＩは、負電荷の寄与が
正電荷の寄与と等しいので、そのタンパク質が中性であ
るｐＨである。ｐＩの電場あるタンパク質は、その電場
のいずれの極性からも引き付けられない。
よって構成される１０，０００ダルトンより大きな高分
子量を有する化合物である。いくつかのアミノ酸は、そ
れらの側鎖に、陰性様式（酸性アミノ酸）において、ま
たは陽性様式（塩基性アミノ酸）において溶液のｐＨの
作用によってイオン化され得る官能基を有し、したがっ
て、すべてのタンパク質は、多数の負電荷および正電荷
を有する。タンパク質の等電点ｐＩは、負電荷の寄与が
正電荷の寄与と等しいので、そのタンパク質が中性であ
るｐＨである。ｐＩの電場あるタンパク質は、その電場
のいずれの極性からも引き付けられない。
【００１８】負電荷の数は、ｐＩよりも高いｐＨで上昇
し、そしてそのタンパク質は、正味の負電荷を増す。一
方、その反対のことが、ｐＩよりも低いｐＨで起こり、
そしてそのタンパク質は、正味の正電荷を増す。すべて
のタンパク質は、そのタンパク質自体に特徴的なｐＩを
有する。その特徴的なｐＩは、等電点で不溶化される傾
向にある他のタンパク質およびいくつかのタンパク質か
らそのタンパク質を区別する。
し、そしてそのタンパク質は、正味の負電荷を増す。一
方、その反対のことが、ｐＩよりも低いｐＨで起こり、
そしてそのタンパク質は、正味の正電荷を増す。すべて
のタンパク質は、そのタンパク質自体に特徴的なｐＩを
有する。その特徴的なｐＩは、等電点で不溶化される傾
向にある他のタンパク質およびいくつかのタンパク質か
らそのタンパク質を区別する。
【００１９】Ｒｅｇｎｉｅｒ Ｆ．Ｅ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３８，３１９−３２３，（１９８７）によって、
およびＹａｍａｍｏｔｏ Ｓ．ら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ，４３，
（１９８８），ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって報告され
たように、タンパク質がｐＩよりも低いｐＨの溶液にあ
る場合、そのタンパク質は、正味の正電荷を有し、した
がって、負に荷電したマトリクスと相互作用し得、そし
て陽イオン交換クロマトグラフィーに供され得るが、一
方、そのタンパク質が、そのタンパク質のｐＩよりも高
いｐＨでは、陰イオン交換クロマトグラフィーに供され
得る。
ｅ，２３８，３１９−３２３，（１９８７）によって、
およびＹａｍａｍｏｔｏ Ｓ．ら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ，４３，
（１９８８），ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋによって報告され
たように、タンパク質がｐＩよりも低いｐＨの溶液にあ
る場合、そのタンパク質は、正味の正電荷を有し、した
がって、負に荷電したマトリクスと相互作用し得、そし
て陽イオン交換クロマトグラフィーに供され得るが、一
方、そのタンパク質が、そのタンパク質のｐＩよりも高
いｐＨでは、陰イオン交換クロマトグラフィーに供され
得る。
【００２０】これに反して、本発明者らは予測せずに、
タンパク質の相当するｐＩよりも高いｐＨであって、そ
のタンパク質が、陽イオン交換クロマトグラフィーのマ
トリクスに吸着したままであるｐＨ値の範囲を見出すこ
とが可能であることを見出し、その結果、陽イオン交換
クロマトグラフィーを実施することがなお可能であるこ
とを見出した。そして本発明の目的は、この事実に基づ
く。このような状況は、これらの条件下で得られるタン
パク質間の高選択性のために、および、そのような精製
の高効率性を生じる有意な分離を得るために充分となる
タンパク質間のｐＩの非常に小さな差のためにも、とく
に重要である。
タンパク質の相当するｐＩよりも高いｐＨであって、そ
のタンパク質が、陽イオン交換クロマトグラフィーのマ
トリクスに吸着したままであるｐＨ値の範囲を見出すこ
とが可能であることを見出し、その結果、陽イオン交換
クロマトグラフィーを実施することがなお可能であるこ
とを見出した。そして本発明の目的は、この事実に基づ
く。このような状況は、これらの条件下で得られるタン
パク質間の高選択性のために、および、そのような精製
の高効率性を生じる有意な分離を得るために充分となる
タンパク質間のｐＩの非常に小さな差のためにも、とく
に重要である。
【００２１】後者の理由は、組換えタンパク質の精製方
法においてとくに重要である。ここで、目的の産物は、
しばしば、相関した不純物（すなわち、その産物の非常
に小さな構造変化、たとえば、異なる酸化状態、アセチ
ル化、アミド基の欠失などから作られる不純物）をとも
なう。この種類の不純物は、多くの場合、抗体がこれら
の不純物を区別することができないので、免疫アフィニ
ティクロマトグラフィーによっても除かれることが非常
に困難である。
法においてとくに重要である。ここで、目的の産物は、
しばしば、相関した不純物（すなわち、その産物の非常
に小さな構造変化、たとえば、異なる酸化状態、アセチ
ル化、アミド基の欠失などから作られる不純物）をとも
なう。この種類の不純物は、多くの場合、抗体がこれら
の不純物を区別することができないので、免疫アフィニ
ティクロマトグラフィーによっても除かれることが非常
に困難である。
【００２２】この見出された現象を説明し得る機構は、
そのタンパク質の外表面の電荷の分布が単一ではなく、
その結果、ｐＨがｐＩよりも少し高く、そしてそのタン
パク質が全体として正味の負電荷を有する場合、負固定
相と相互作用し得るその分子に位置するいくつかの正電
荷がなお存在しているという事実に基づく。
そのタンパク質の外表面の電荷の分布が単一ではなく、
その結果、ｐＨがｐＩよりも少し高く、そしてそのタン
パク質が全体として正味の負電荷を有する場合、負固定
相と相互作用し得るその分子に位置するいくつかの正電
荷がなお存在しているという事実に基づく。
【００２３】この機構を効果的にするために、過剰な負
電荷が過度に強調されないことが重要であり、そうでな
いと、負電荷で創られた電場は高く、タンパク質全体と
負に電荷したクロマトグラフィーマトリクスとの相互作
用を防止する。
電荷が過度に強調されないことが重要であり、そうでな
いと、負電荷で創られた電場は高く、タンパク質全体と
負に電荷したクロマトグラフィーマトリクスとの相互作
用を防止する。
【００２４】さらに、高イオン強度は、タンパク質を保
護する効果を有し、そのタンパク質と固定相との相互作
用を防止するので、溶離液として使用されるこの溶液の
イオン強度は、適切に制御されることが必要である。
護する効果を有し、そのタンパク質と固定相との相互作
用を防止するので、溶離液として使用されるこの溶液の
イオン強度は、適切に制御されることが必要である。
【００２５】Ｌａｍｐｓｏｎ Ｇ．Ｐ．ら、Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１，３７４−３７７，（１９６
５）において、小さなｐＨ変動があるが、０．１Ｍリン
酸溶液によって与えられる過度に高いイオン強度を保持
する、ヒトガンマグロブリン、リボヌクレアーゼ、ヘモ
グロビン、デルタキモトリプシン、グロビンおよびリゾ
チームなどのタンパク質の場合は、陽イオン交換クロマ
トグラフィーにおける溶出が、ｐＩよりも常に０．４単
位低いｐＨで起こったことが報告された。
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１，３７４−３７７，（１９６
５）において、小さなｐＨ変動があるが、０．１Ｍリン
酸溶液によって与えられる過度に高いイオン強度を保持
する、ヒトガンマグロブリン、リボヌクレアーゼ、ヘモ
グロビン、デルタキモトリプシン、グロビンおよびリゾ
チームなどのタンパク質の場合は、陽イオン交換クロマ
トグラフィーにおける溶出が、ｐＩよりも常に０．４単
位低いｐＨで起こったことが報告された。
【００２６】本発明が基づく前記のような原理は、以前
は、タンパク質の効果的な精製方法を実施するための発
明者の知識の範囲にはなかった。
は、タンパク質の効果的な精製方法を実施するための発
明者の知識の範囲にはなかった。
【００２７】Ｋｏｎｔｔｕｒｉ Ａ．Ｋ．ら、Ａｃｔａ
Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，５０（２），１０２−１０
６，（１９９６）によって記載される精製方法を最適化
するために、タンパク質の等電点の差異を使用する可能
性は、実際には、イオン交換クロマトグラフィーの慣用
的な使用をいう。ここで、陽イオン交換クロマトグラフ
ィーは、常にそのタンパク質の等電点よりも低いｐＨで
実施されるが、一方、陰イオン交換クロマトグラフィー
は、その等電点よりも高いｐＨで実施される。本特許出
願に記載の方法は、反対に、陽イオン交換クロマトグラ
フィーがそのタンパク質の等電点よりも高いｐＨで実施
される方法である。
Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，５０（２），１０２−１０
６，（１９９６）によって記載される精製方法を最適化
するために、タンパク質の等電点の差異を使用する可能
性は、実際には、イオン交換クロマトグラフィーの慣用
的な使用をいう。ここで、陽イオン交換クロマトグラフ
ィーは、常にそのタンパク質の等電点よりも低いｐＨで
実施されるが、一方、陰イオン交換クロマトグラフィー
は、その等電点よりも高いｐＨで実施される。本特許出
願に記載の方法は、反対に、陽イオン交換クロマトグラ
フィーがそのタンパク質の等電点よりも高いｐＨで実施
される方法である。
【００２８】本特許出願に記載される方法は、報告され
た例において示される一般的な性質が考慮され得る。こ
の例において、天然起源のタンパク質および組換えＤＮ
Ａ由来のタンパク質の両方に対して、本出願に記載され
る方法が、首尾よく適用可能であることを実証した。タ
ンパク質間の差異は、目的のタンパク質の精製に有用で
ある、ｐＩよりも高いｐＨの範囲にある。実際には、た
とえば、以下の例において示されるように、このような
範囲は、インターフェロンタンパク質の場合は、約０．
２ｐＨ単位であるが、一方、アルブミンの場合は、約１
ｐＨ単位である。
た例において示される一般的な性質が考慮され得る。こ
の例において、天然起源のタンパク質および組換えＤＮ
Ａ由来のタンパク質の両方に対して、本出願に記載され
る方法が、首尾よく適用可能であることを実証した。タ
ンパク質間の差異は、目的のタンパク質の精製に有用で
ある、ｐＩよりも高いｐＨの範囲にある。実際には、た
とえば、以下の例において示されるように、このような
範囲は、インターフェロンタンパク質の場合は、約０．
２ｐＨ単位であるが、一方、アルブミンの場合は、約１
ｐＨ単位である。
【００２９】Ｔｈａｔｃｈｅｒ Ｄ．およびＰａｎａｙ
ｏｔａｔｏｓ Ｎ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１１９，１６６−１７７，（１９８６）によって報
告された、組換えα型インターフェロン（ｒＩＦＮα）
（等電点は、５．９である）の精製への本発明の適用
は、その例の中で報告され、そしてｐＨ６．１での陽イ
オン交換において、本発明の適用がｒＩＦＮαを精製す
るのを可能にし、そして精製するのに好都合であること
を示す。さらに、その例は、Ｒｙｌａｔｔ Ｄ．Ｂ．
ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，８６５，１４５−１
５３（１９９９）によって報告された、ヒト血清アルブ
ミン（ｐＩが４．９である）を示し、そしてｐＨ６．０
での陽イオン交換クロマトグラフィーにおいてヒト血清
アルブミンを精製するのを可能にし、そして精製するの
に好都合であることを示す。
ｏｔａｔｏｓ Ｎ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１１９，１６６−１７７，（１９８６）によって報
告された、組換えα型インターフェロン（ｒＩＦＮα）
（等電点は、５．９である）の精製への本発明の適用
は、その例の中で報告され、そしてｐＨ６．１での陽イ
オン交換において、本発明の適用がｒＩＦＮαを精製す
るのを可能にし、そして精製するのに好都合であること
を示す。さらに、その例は、Ｒｙｌａｔｔ Ｄ．Ｂ．
ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，８６５，１４５−１
５３（１９９９）によって報告された、ヒト血清アルブ
ミン（ｐＩが４．９である）を示し、そしてｐＨ６．０
での陽イオン交換クロマトグラフィーにおいてヒト血清
アルブミンを精製するのを可能にし、そして精製するの
に好都合であることを示す。
【００３０】本発明の方法目的の利点は、科学文献およ
び／またはα型インターフェロンの精製に関する特許お
よびヒト血清アルブミンの精製に関する特許に記載され
る方法、３つ以上の連続処理を通常必要とする方法の結
果、高い工業的費用および収率の減少が生じる事実と比
較した場合、非常に顕著であった。Ｔｈａｔｃｈｅｒ
Ｄ．およびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１９，１６６−１７７，（１
９８６）は、以下の５つの連続的な処理を通じるヒト組
換えα型インターフェロンｒＩＦＮ−α２の精製を記載
する：ａ）陽イオン交換クロマトグラフィー；ｂ）陰イ
オン交換クロマトグラフィー；ｃ）重金属用アフィニテ
ィークロマトグラフィー；ｄ）硫酸アンモニウムの飽和
溶液による処理；ｅ）分子排除クロマトグラフィー。
び／またはα型インターフェロンの精製に関する特許お
よびヒト血清アルブミンの精製に関する特許に記載され
る方法、３つ以上の連続処理を通常必要とする方法の結
果、高い工業的費用および収率の減少が生じる事実と比
較した場合、非常に顕著であった。Ｔｈａｔｃｈｅｒ
Ｄ．およびＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１９，１６６−１７７，（１
９８６）は、以下の５つの連続的な処理を通じるヒト組
換えα型インターフェロンｒＩＦＮ−α２の精製を記載
する：ａ）陽イオン交換クロマトグラフィー；ｂ）陰イ
オン交換クロマトグラフィー；ｃ）重金属用アフィニテ
ィークロマトグラフィー；ｄ）硫酸アンモニウムの飽和
溶液による処理；ｅ）分子排除クロマトグラフィー。
【００３１】欧州特許第０１０８５８５号は、インター
フェロンの精製を記載している。この精製は、以下の３
つの型のクロマトグラフィーの連続使用を含む：ａ）免
疫−アフィニティ；ｂ）陽イオン交換；ｃ）分子排除。
インターフェロン精製についての米国特許第４７６５９
０３号は、４つの型のクロマトグラフィーの連続使用を
記載している：ａ）モノクロナール抗体を用いる免疫−
アフィニティ；ｂ）逆相；ｃ）陽イオン交換；ｄ）分子
排除。
フェロンの精製を記載している。この精製は、以下の３
つの型のクロマトグラフィーの連続使用を含む：ａ）免
疫−アフィニティ；ｂ）陽イオン交換；ｃ）分子排除。
インターフェロン精製についての米国特許第４７６５９
０３号は、４つの型のクロマトグラフィーの連続使用を
記載している：ａ）モノクロナール抗体を用いる免疫−
アフィニティ；ｂ）逆相；ｃ）陽イオン交換；ｄ）分子
排除。
【００３２】欧州特許第０６７９７１８号は、以下の４
つのクロマトグラフィー工程を認識するα型インターフ
ェロン産生用方法を記載している：ａ）金属キレート；
ｂ）陽イオン交換；ｃ）陰イオン交換；ｄ）ゲル濾過。
つのクロマトグラフィー工程を認識するα型インターフ
ェロン産生用方法を記載している：ａ）金属キレート；
ｂ）陽イオン交換；ｃ）陰イオン交換；ｄ）ゲル濾過。
【００３３】他の刊行物および特許（たとえば、米国特
許第４７３２６８３号、国際特許出願ＷＯ８６０４０６
７およびＫｈａｎ Ｆ．Ｒ．およびＲａｉ Ｖ．Ｒ．，
Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，７，１６１
−１６９，（１９９０）による刊行物）は、インターフ
ェロンタンパク質の精製のために必要な３つ以上の処理
を記載している。
許第４７３２６８３号、国際特許出願ＷＯ８６０４０６
７およびＫｈａｎ Ｆ．Ｒ．およびＲａｉ Ｖ．Ｒ．，
Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．，７，１６１
−１６９，（１９９０）による刊行物）は、インターフ
ェロンタンパク質の精製のために必要な３つ以上の処理
を記載している。
【００３４】この引用した例は、一般的に、インターフ
ェロンの精製およびとくにα型インターフェロンの精製
について報告されたほとんどの関連事項を網羅する。こ
れらの例は、後者の精製がとくに困難であることを示
し、そして多くの精製工程が必要であることを示す。さ
らに、高精製レベルは、とくに、マウス起源のモノクロ
ナール抗体を用いることによる免疫アフィニティクロマ
トグラフィーによって得られることは、強調するべきで
ある。しかし、ヒトにおける医薬用途のための有効成分
の製造を目的とする工業的産生方法内のこのようなクロ
マトグラフ技術の存在は、マウス起源のウイルスに由来
する潜在的なウイルス汚染の危険性および工業的観点か
らクロマトグラフィーマトリクスを有効にすることの困
難さを生じる。ウイルス汚染の危険性は、最終産物にお
けるマウスイムノグロブリンから生じる潜在的な免疫原
性フラグメントの存在のために生じる。
ェロンの精製およびとくにα型インターフェロンの精製
について報告されたほとんどの関連事項を網羅する。こ
れらの例は、後者の精製がとくに困難であることを示
し、そして多くの精製工程が必要であることを示す。さ
らに、高精製レベルは、とくに、マウス起源のモノクロ
ナール抗体を用いることによる免疫アフィニティクロマ
トグラフィーによって得られることは、強調するべきで
ある。しかし、ヒトにおける医薬用途のための有効成分
の製造を目的とする工業的産生方法内のこのようなクロ
マトグラフ技術の存在は、マウス起源のウイルスに由来
する潜在的なウイルス汚染の危険性および工業的観点か
らクロマトグラフィーマトリクスを有効にすることの困
難さを生じる。ウイルス汚染の危険性は、最終産物にお
けるマウスイムノグロブリンから生じる潜在的な免疫原
性フラグメントの存在のために生じる。
【００３５】さらに、簡単に例示した例から、陽イオン
交換クロマトグラフィーは、広範に使用されるが、独特
な分離技術として使用されかった。なぜなら陽イオン交
換クロマトグラフィーの性能は、精製レベルの上昇に関
して限定されるからである。
交換クロマトグラフィーは、広範に使用されるが、独特
な分離技術として使用されかった。なぜなら陽イオン交
換クロマトグラフィーの性能は、精製レベルの上昇に関
して限定されるからである。
【００３６】Ｂａｂｕ Ｋ．Ｒ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３（６），
６６５−６６０，（２０００）およびＢｏｕｙｏｎ
Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ Ａｐｌｉｃａｄ
ａ，１４，１８９−１９２，（１９９７）の刊行物は、
塩化ナトリウム勾配におけるイオン交換クロマトグラフ
ィーによる一工程でのα型インターフェロンの精製方法
を記載する。しかし、これらの両方の場合において、充
分に純粋な産物を得るためにその著者は、α型インター
フェロンが含まれているクロマトグラフィー画分のいく
つかのみを単離しなければならなく、その結果、非常に
低い収率（最小で７．５％まで）となる。さらに、この
記載された塩化ナトリウム勾配におけるクロマトグラフ
ィーの精製方法は、工業的レベルで使用される傾向にな
い。
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３（６），
６６５−６６０，（２０００）およびＢｏｕｙｏｎ
Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ Ａｐｌｉｃａｄ
ａ，１４，１８９−１９２，（１９９７）の刊行物は、
塩化ナトリウム勾配におけるイオン交換クロマトグラフ
ィーによる一工程でのα型インターフェロンの精製方法
を記載する。しかし、これらの両方の場合において、充
分に純粋な産物を得るためにその著者は、α型インター
フェロンが含まれているクロマトグラフィー画分のいく
つかのみを単離しなければならなく、その結果、非常に
低い収率（最小で７．５％まで）となる。さらに、この
記載された塩化ナトリウム勾配におけるクロマトグラフ
ィーの精製方法は、工業的レベルで使用される傾向にな
い。
【００３７】クロマトグラフィー精製の多くの技術は、
ヒト血清を画分化することから始まって、または組換え
ＤＮＡ技術によって得られたアルブミンの調製、複雑で
かつ工業レベルにはほとんどできない調製、ヒトアルブ
ミンの場合においても記載されており、このことは、天
然起源、および組換え起源の両方のヒトアルブミンの有
効な精製に関する問題がまだ存在しているということを
確かにする。
ヒト血清を画分化することから始まって、または組換え
ＤＮＡ技術によって得られたアルブミンの調製、複雑で
かつ工業レベルにはほとんどできない調製、ヒトアルブ
ミンの場合においても記載されており、このことは、天
然起源、および組換え起源の両方のヒトアルブミンの有
効な精製に関する問題がまだ存在しているということを
確かにする。
【００３８】米国特許第６１５０５０４号および同第５
５２１２８７号は、イオン交換クロマトグラフィーおよ
び疎水性相互作用によるアルブミンの精製を記載する。
米国特許第６０３４２２１号に記載されるこの精製スキ
ームは、２つのクロマトグラフィー工程、１度の限外濾
過そして２つのさらなるクロマトグラフィー精製による
アルブミン精製を認識する。
５２１２８７号は、イオン交換クロマトグラフィーおよ
び疎水性相互作用によるアルブミンの精製を記載する。
米国特許第６０３４２２１号に記載されるこの精製スキ
ームは、２つのクロマトグラフィー工程、１度の限外濾
過そして２つのさらなるクロマトグラフィー精製による
アルブミン精製を認識する。
【００３９】流動層における陰イオン交換クロマトグラ
フィーまたはＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ（登録商標）のマト
リクスなどの市販のマトリクス、あるいは、改質化ジル
コニウムの粒子またはペルフルオロハイドロカーボンの
エマルジョンなどを適切に調製したマトリクスと相互作
用するアフィニティクロマトグラフィーが使用されるア
ルブミン精製のあまり慣用的ではない方法は、米国特許
第５９６２６４９号において、およびＳｕｍｉ Ａ．
ら、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，８（１−５），１９
５−２００，（１９９９），Ｍｕｌｌｉｃｋ Ａ．およ
びＦｌｉｃｋｉｎｇｅｒ Ｍ．Ｃ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６５（３），２８２−２９０，
（１９９９）およびＭｃ Ｃｒｅａｔｈ Ｇ．Ｅ．ら、
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５９７（１−２），１８９
−１９６，（１９９２）による刊行物において記載され
ている。
フィーまたはＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ（登録商標）のマト
リクスなどの市販のマトリクス、あるいは、改質化ジル
コニウムの粒子またはペルフルオロハイドロカーボンの
エマルジョンなどを適切に調製したマトリクスと相互作
用するアフィニティクロマトグラフィーが使用されるア
ルブミン精製のあまり慣用的ではない方法は、米国特許
第５９６２６４９号において、およびＳｕｍｉ Ａ．
ら、Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，８（１−５），１９
５−２００，（１９９９），Ｍｕｌｌｉｃｋ Ａ．およ
びＦｌｉｃｋｉｎｇｅｒ Ｍ．Ｃ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６５（３），２８２−２９０，
（１９９９）およびＭｃ Ｃｒｅａｔｈ Ｇ．Ｅ．ら、
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５９７（１−２），１８９
−１９６，（１９９２）による刊行物において記載され
ている。
【００４０】重金属についてのアルブミンの精製の最近
の技術はまた、Ｙａｎｇ Ｌ．ら、Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ
Ｋｕｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｈｓｕｅｈ Ｐａｏ，１６
（１），７４−７７，（２０００）によっても記載され
ている。そしてＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ Ｆ３Ｇなど
の色素の分子が結合するマトリクスについてのアフィニ
ティー技術は、Ｃｏｍｐａｇｎｉｎｉ Ａ．ら、Ｊ．Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，７３６（１−２），１１５，
（１９９６）によって記載されている。
の技術はまた、Ｙａｎｇ Ｌ．ら、Ｓｈｅｎｇ Ｗｕ
Ｋｕｎｇ Ｃｈｅｎｇ Ｈｓｕｅｈ Ｐａｏ，１６
（１），７４−７７，（２０００）によっても記載され
ている。そしてＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ Ｆ３Ｇなど
の色素の分子が結合するマトリクスについてのアフィニ
ティー技術は、Ｃｏｍｐａｇｎｉｎｉ Ａ．ら、Ｊ．Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，７３６（１−２），１１５，
（１９９６）によって記載されている。
【００４１】すべてのこれらの技術は、具現化の複雑さ
および高費用の種々の様式の問題において示され、容易
かつ効果的な工業的実現の可能性ならびに経済的利点の
両方で、薬理学的に活性なタンパク質の新規な精製方法
を個別化する問題は、解決されていない。
および高費用の種々の様式の問題において示され、容易
かつ効果的な工業的実現の可能性ならびに経済的利点の
両方で、薬理学的に活性なタンパク質の新規な精製方法
を個別化する問題は、解決されていない。
【００４２】以下に記載した本発明は、容易な工業的活
用の、および顕著な経済的利点により低費用の、薬理学
的に活性なタンパク質の精製方法を提供することによっ
てこれらの重要な必要性に対する答えを提供する。
用の、および顕著な経済的利点により低費用の、薬理学
的に活性なタンパク質の精製方法を提供することによっ
てこれらの重要な必要性に対する答えを提供する。
【００４３】
【発明が解決しようとする課題】薬理学的に活性なタン
パク質の精製の場合、類似の特性を有する他のタンパク
質と混合したタンパク質、そして、しばしば非常に多量
の目的のタンパク質が高純度で単離されなければならな
いことになる。
パク質の精製の場合、類似の特性を有する他のタンパク
質と混合したタンパク質、そして、しばしば非常に多量
の目的のタンパク質が高純度で単離されなければならな
いことになる。
【００４４】この課題は厳密であり、そしていくつかの
精製工程は、通常、目的の純度を得るために使用され
る。精製方法は、この場合、非常に複雑となり、そして
タンパク質の工業的製造の成功は、本質的にその精製方
法の効率と結びついている。なぜなら、後者は、製造費
用を充分に決定するからである。
精製工程は、通常、目的の純度を得るために使用され
る。精製方法は、この場合、非常に複雑となり、そして
タンパク質の工業的製造の成功は、本質的にその精製方
法の効率と結びついている。なぜなら、後者は、製造費
用を充分に決定するからである。
【００４５】したがって、本発明は、薬理学的に活性な
タンパク質、主にインターフェロンタンパク質およびア
ルブミンタンパク質の精製に有用な新規な方法を提供す
ることを目的とする。
タンパク質、主にインターフェロンタンパク質およびア
ルブミンタンパク質の精製に有用な新規な方法を提供す
ることを目的とする。
【００４６】
【課題を解決するための手段】本発明は、薬理学的に活
性なタンパク質の精製方法であって、精製される該タン
パク質の等電点ｐＩに相当するｐＨよりも塩基性のｐＨ
であって、該タンパク質がなお吸着しているｐＨにおい
て、固体マトリクスで陽イオン交換クロマトグラフィー
を実施する工程、ならびに溶離液のイオン強度および／
またはｐＨを上昇させることによって該タンパク質を溶
出させる工程からなる精製方法に関する。
性なタンパク質の精製方法であって、精製される該タン
パク質の等電点ｐＩに相当するｐＨよりも塩基性のｐＨ
であって、該タンパク質がなお吸着しているｐＨにおい
て、固体マトリクスで陽イオン交換クロマトグラフィー
を実施する工程、ならびに溶離液のイオン強度および／
またはｐＨを上昇させることによって該タンパク質を溶
出させる工程からなる精製方法に関する。
【００４７】前記陽イオン交換クロマトグラフィーに用
いる溶離液が、ｐＨが２と１１とのあいだである緩衝水
溶液から作製されることが好ましい。
いる溶離液が、ｐＨが２と１１とのあいだである緩衝水
溶液から作製されることが好ましい。
【００４８】さらに、前記緩衝水溶液のｐＨが、４と
８．５とのあいだであることが好ましい。
８．５とのあいだであることが好ましい。
【００４９】前記緩衝水溶液が、５〜１００ｍＭの以下
の緩衝混合液：リン酸二水素カリウムおよび第二リン酸
ナトリウム、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化ナト
リウム、第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウ
ム、クエン酸および第二リン酸ナトリウム、イミダゾー
ルおよび塩酸を含むことが好ましい。
の緩衝混合液：リン酸二水素カリウムおよび第二リン酸
ナトリウム、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化ナト
リウム、第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウ
ム、クエン酸および第二リン酸ナトリウム、イミダゾー
ルおよび塩酸を含むことが好ましい。
【００５０】前記緩衝液が、該緩衝液のイオン強度を変
更しやすい、１〜１００ｍＭの有機塩または無機塩を含
み得ることが好ましい。
更しやすい、１〜１００ｍＭの有機塩または無機塩を含
み得ることが好ましい。
【００５１】前記薬理学的に活性なタンパク質が、イン
ターフェロンタンパク質およびアルブミンタンパク質で
あることが好ましい。
ターフェロンタンパク質およびアルブミンタンパク質で
あることが好ましい。
【００５２】前記インターフェロンタンパク質が、α
型、β型、γ型、δ型、ω型、τ型、白血球由来の天然
のα型、組換えα−２ｂインターフェロンおよびコンセ
ンサスインターフェロンであり、そしてアルブミンタン
パク質は、天然のヒトアルブミンおよび組換えヒトアル
ブミンであることが好ましい。
型、β型、γ型、δ型、ω型、τ型、白血球由来の天然
のα型、組換えα−２ｂインターフェロンおよびコンセ
ンサスインターフェロンであり、そしてアルブミンタン
パク質は、天然のヒトアルブミンおよび組換えヒトアル
ブミンであることが好ましい。
【００５３】また、本発明は、組換えα−２ｂインター
フェロン（ｒＩＦＮα−２ｂ）の精製方法であって、１
Ｍの酢酸ナトリウム溶液を加え、そして酢酸でｐＨ５．
５にしたｒＩＦＮα−２ｂの培養による製造から生じる
タンパク質混合物を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液に
よってｐＨ５．５に調整した強陽イオン交換樹脂を充填
したカラムに充填し、その結果、１ｍｌの固定相あたり
に、６ｍｇと８ｍｇとのあいだのタンパク質が存在する
工程、該カラムを２回の洗浄サイクルに供する工程であ
って、まず、５ｍＭと１５ｍＭとのあいだの濃度のｐＨ
６．１の緩衝溶液を用い、ついで、２ｍＭの塩化カリウ
ムを添加した該同一の緩衝液を用いる工程、ならびに、
最後に、１５ｍＭと２５ｍＭとのあいだの濃度で塩化カ
リウムを含む、５ｍＭと１５ｍＭとのあいだの濃度のｐ
Ｈ６．１の緩衝液を用いることによって該カラムから純
粋なｒＩＦＮα−２ｂを溶出する工程、からなる方法に
関する。
フェロン（ｒＩＦＮα−２ｂ）の精製方法であって、１
Ｍの酢酸ナトリウム溶液を加え、そして酢酸でｐＨ５．
５にしたｒＩＦＮα−２ｂの培養による製造から生じる
タンパク質混合物を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液に
よってｐＨ５．５に調整した強陽イオン交換樹脂を充填
したカラムに充填し、その結果、１ｍｌの固定相あたり
に、６ｍｇと８ｍｇとのあいだのタンパク質が存在する
工程、該カラムを２回の洗浄サイクルに供する工程であ
って、まず、５ｍＭと１５ｍＭとのあいだの濃度のｐＨ
６．１の緩衝溶液を用い、ついで、２ｍＭの塩化カリウ
ムを添加した該同一の緩衝液を用いる工程、ならびに、
最後に、１５ｍＭと２５ｍＭとのあいだの濃度で塩化カ
リウムを含む、５ｍＭと１５ｍＭとのあいだの濃度のｐ
Ｈ６．１の緩衝液を用いることによって該カラムから純
粋なｒＩＦＮα−２ｂを溶出する工程、からなる方法に
関する。
【００５４】使用した前記樹脂が、ムスタング（Ｍｕｓ
ｔａｎｇ）（登録商標）Ｓであり、そして緩衝液混合物
が、リン酸二水素カリウムおよび第二リン酸ナトリウ
ム、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化ナトリウム、
第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウム、クエ
ン酸および第二リン酸ナトリウム、イミダゾールおよび
塩酸から作製される緩衝液混合物から選択されることが
好ましい。
ｔａｎｇ）（登録商標）Ｓであり、そして緩衝液混合物
が、リン酸二水素カリウムおよび第二リン酸ナトリウ
ム、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化ナトリウム、
第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウム、クエ
ン酸および第二リン酸ナトリウム、イミダゾールおよび
塩酸から作製される緩衝液混合物から選択されることが
好ましい。
【００５５】また、本発明は、ヒト血清アルブミンの精
製方法であって、クエン酸によってｐＨ３にしたヒト血
清アルブミンを含む溶液を、２０ｍＭのクエン酸溶液を
用いてｐＨ３に調整した強陽イオン交換樹脂を充填した
カラムに充填し、その結果、１ｍｌの固定相あたりに、
６ｍｇと８ｍｇとのあいだのタンパク質が存在する工
程、２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液を用いて該カラムを
２回の洗浄サイクルに供し、その結果、ｐＨ値を５．５
および５．８にする工程、ついで、５ｍＭと１００ｍＭ
とのあいだの濃度のリン酸二水素カリウムおよび第二リ
ン酸ナトリウムの混合液から作製されるｐＨ６．０の緩
衝液によって該カラムから純粋なヒト血清アルブミンを
溶出する工程、からなる方法に関する。
製方法であって、クエン酸によってｐＨ３にしたヒト血
清アルブミンを含む溶液を、２０ｍＭのクエン酸溶液を
用いてｐＨ３に調整した強陽イオン交換樹脂を充填した
カラムに充填し、その結果、１ｍｌの固定相あたりに、
６ｍｇと８ｍｇとのあいだのタンパク質が存在する工
程、２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液を用いて該カラムを
２回の洗浄サイクルに供し、その結果、ｐＨ値を５．５
および５．８にする工程、ついで、５ｍＭと１００ｍＭ
とのあいだの濃度のリン酸二水素カリウムおよび第二リ
ン酸ナトリウムの混合液から作製されるｐＨ６．０の緩
衝液によって該カラムから純粋なヒト血清アルブミンを
溶出する工程、からなる方法に関する。
【００５６】また、本発明は、薬理学的に活性なタンパ
ク質に基づく医薬品に含まれる活性素因を製造する前記
方法の使用に関する。
ク質に基づく医薬品に含まれる活性素因を製造する前記
方法の使用に関する。
【００５７】前記活性素因が、インターフェロンタンパ
ク質であることが好ましい。
ク質であることが好ましい。
【００５８】前記インターフェロンタンパク質が、組換
えα−２ｂインターフェロンであることが好ましい。
えα−２ｂインターフェロンであることが好ましい。
【００５９】前記活性素因が、アルブミンタンパク質で
あることが好ましい。
あることが好ましい。
【００６０】前記アルブミンタンパク質が天然ヒト血清
アルブミンまたは組換えヒト血清アルブミンであること
が好ましい。
アルブミンまたは組換えヒト血清アルブミンであること
が好ましい。
【００６１】
【発明の実施の形態】本発明は、特定の条件下における
固体マトリクスでの陽イオン交換クロマトグラフィーの
使用に基づく薬理学的に活性なタンパク質の精製方法に
関する。その条件は、試料の充填後、適切なｐＨおよび
イオン強度の溶離液でカラムを調整するような条件を含
み、その結果、このタンパク質は、そのカラムに、薬理
学的に活性なタンパク質の相当する等電点ｐＩより塩基
性、すなわち、より高いｐＨで均一に存在する。しか
し、そのようなｐＨでは、このタンパク質は、なお陽イ
オン交換クロマトグラフィーに使用される固体マトリク
スに吸着したままである。この調整段階の後、薬理学的
に活性なタンパク質を、溶離液のイオン強度および／ま
たはｐＨを上昇させることによってカラムから溶出させ
る。
固体マトリクスでの陽イオン交換クロマトグラフィーの
使用に基づく薬理学的に活性なタンパク質の精製方法に
関する。その条件は、試料の充填後、適切なｐＨおよび
イオン強度の溶離液でカラムを調整するような条件を含
み、その結果、このタンパク質は、そのカラムに、薬理
学的に活性なタンパク質の相当する等電点ｐＩより塩基
性、すなわち、より高いｐＨで均一に存在する。しか
し、そのようなｐＨでは、このタンパク質は、なお陽イ
オン交換クロマトグラフィーに使用される固体マトリク
スに吸着したままである。この調整段階の後、薬理学的
に活性なタンパク質を、溶離液のイオン強度および／ま
たはｐＨを上昇させることによってカラムから溶出させ
る。
【００６２】本発明の効果的な性能は、使用するクロマ
トグラフィーマトリクス、ｐＩよりも高いｐＨ値、およ
びクロマトグラフィー溶離液において使用されるイオン
強度の中の正しい組み合わせの個別化を要する。なぜな
ら、一旦、クロマトグラフィーマトリクスが規定される
と、効果的な精製は、ｐＨおよび／またはイオン強度の
限定変動、すなわち一般的には、小数点のｐＨ単位およ
び／または数百のμＳのイオン強度の小数点の変動によ
って得られ得るからである。
トグラフィーマトリクス、ｐＩよりも高いｐＨ値、およ
びクロマトグラフィー溶離液において使用されるイオン
強度の中の正しい組み合わせの個別化を要する。なぜな
ら、一旦、クロマトグラフィーマトリクスが規定される
と、効果的な精製は、ｐＨおよび／またはイオン強度の
限定変動、すなわち一般的には、小数点のｐＨ単位およ
び／または数百のμＳのイオン強度の小数点の変動によ
って得られ得るからである。
【００６３】陽イオン交換クロマトグラフィーの固定相
として、一般的に使用されるすべての機能化した固体マ
トリクスが使用され得る。しかし、精製されるタンパク
質のｐＩが６よりも低いが、一方、強いおよび弱いの両
方の陽イオン交換を有する固定相が、６よりも高いｐＩ
を有するタンパク質を除外しないで使用され得る場合、
とくに強陽イオン交換といわれる固定相が好ましい。こ
の固定相は、プロトンまたはアルカリ塩の両方の形態下
で、スルホニル基またはカルボキシル基によって機能化
されるシリカ質マトリクスまたはポリマーマトリクスを
有し得る。たとえば、Ｓｏｕｒｃｅ（登録商標）Ｓ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ（登録商標）ＳＰ−Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ（登録商標）ＳＰ−Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒ
ｍａｎｃｅ、Ｓｐ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｘ
Ｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｆｒａｃ
ｔｏｇｅｌ（登録商標）Ｓ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔ
ａｄｔ）、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ（Ｐａｌｌ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登
録商標）ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録
商標）ＡＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｐｏｒｏｓ（登録商
標）Ｓ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）、Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）−Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ（登録商標）ＳＰ（Ｔｏｓｏｈａｓｓ）などの市販
の固定相が、首尾よく使用され得る。
として、一般的に使用されるすべての機能化した固体マ
トリクスが使用され得る。しかし、精製されるタンパク
質のｐＩが６よりも低いが、一方、強いおよび弱いの両
方の陽イオン交換を有する固定相が、６よりも高いｐＩ
を有するタンパク質を除外しないで使用され得る場合、
とくに強陽イオン交換といわれる固定相が好ましい。こ
の固定相は、プロトンまたはアルカリ塩の両方の形態下
で、スルホニル基またはカルボキシル基によって機能化
されるシリカ質マトリクスまたはポリマーマトリクスを
有し得る。たとえば、Ｓｏｕｒｃｅ（登録商標）Ｓ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ（登録商標）ＳＰ−Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ（登録商標）ＳＰ−Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒ
ｍａｎｃｅ、Ｓｐ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｘ
Ｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｆｒａｃ
ｔｏｇｅｌ（登録商標）Ｓ（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔ
ａｄｔ）、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｓ（Ｐａｌｌ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登
録商標）ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録
商標）ＡＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｐｏｒｏｓ（登録商
標）Ｓ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）、Ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）−Ｓ、Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌ（登録商標）ＳＰ（Ｔｏｓｏｈａｓｓ）などの市販
の固定相が、首尾よく使用され得る。
【００６４】本発明が効果的に実施され得るｐＨ値の範
囲は、精製される薬理学的に活性なタンパク質の等電点
に依存して非常に広く、そして２と１１とのあいだのｐ
Ｈ、好ましくは４と８．５とのあいだのｐＨである。
囲は、精製される薬理学的に活性なタンパク質の等電点
に依存して非常に広く、そして２と１１とのあいだのｐ
Ｈ、好ましくは４と８．５とのあいだのｐＨである。
【００６５】本発明において記載された方法が適用可能
であるｐＩよりも、高いｐＨ値の範囲に拡大すること
は、薬理学的に活性なタンパク質のｐＩに相当するｐＨ
値からそのｐＩを１ｐＨ単位まで超えて変化し得、タン
パク質間の顕著な差異を示す。
であるｐＩよりも、高いｐＨ値の範囲に拡大すること
は、薬理学的に活性なタンパク質のｐＩに相当するｐＨ
値からそのｐＩを１ｐＨ単位まで超えて変化し得、タン
パク質間の顕著な差異を示す。
【００６６】たとえば、組換えα２ｂインターフェロン
（ｒＩＦＮα−２ｂ）の場合、タンパク質のｐＩである
５．９を０．２ｐＨ単位まで超えた陽イオン交換マトリ
クスへのタンパク質の吸着を得ることが可能であり、そ
の結果、陽イオン交換クロマトグラフィーによるそのタ
ンパク質の精製を実施することが可能であることを見出
した。一方、ヒト血清アルブミンの場合は、タンパク質
は、そのタンパク質のｐＩを１ｐＨ単位まで超えて吸着
したままであることを見出した。
（ｒＩＦＮα−２ｂ）の場合、タンパク質のｐＩである
５．９を０．２ｐＨ単位まで超えた陽イオン交換マトリ
クスへのタンパク質の吸着を得ることが可能であり、そ
の結果、陽イオン交換クロマトグラフィーによるそのタ
ンパク質の精製を実施することが可能であることを見出
した。一方、ヒト血清アルブミンの場合は、タンパク質
は、そのタンパク質のｐＩを１ｐＨ単位まで超えて吸着
したままであることを見出した。
【００６７】効果的に使用可能な溶離液として使用され
る水溶液の塩化ナトリウム濃度の範囲は、精製される薬
理学的に活性なタンパク質の種類に依存し、そしてその
範囲が、１ｍＭと１００ｍＭの値のあいだ、好ましくは
１ｍＭと３０ｍＭとのあいだであることを見出した。
る水溶液の塩化ナトリウム濃度の範囲は、精製される薬
理学的に活性なタンパク質の種類に依存し、そしてその
範囲が、１ｍＭと１００ｍＭの値のあいだ、好ましくは
１ｍＭと３０ｍＭとのあいだであることを見出した。
【００６８】たとえば、組換えα２ｂインターフェロン
（ｒＩＦＮα−２ｂ）の精製の場合、塩化ナトリウム水
溶液の濃度は、１ｍＭと３０ｍＭとのあいだ、好ましく
は５ｍＭと１５ｍＭとのあいだである。
（ｒＩＦＮα−２ｂ）の精製の場合、塩化ナトリウム水
溶液の濃度は、１ｍＭと３０ｍＭとのあいだ、好ましく
は５ｍＭと１５ｍＭとのあいだである。
【００６９】本発明のクロマトグラフィー目的に使用さ
れる溶離液の固定された、かつ安定なｐＨの必要性は、
絶対に必要ではないとしても非常に有用であり、５〜１
００ｍＭ、好ましくは１０〜２０ｍＭの緩衝化混合液を
含む適切に緩衝された水溶液を使用する。２と１１との
あいだのｐＨの範囲において緩衝力を有するすべての化
学物質または化学物質の混合液は、使用され得るその溶
離液のｐＨ値が２と１１とのあいだであるので、有利に
使用され得る。
れる溶離液の固定された、かつ安定なｐＨの必要性は、
絶対に必要ではないとしても非常に有用であり、５〜１
００ｍＭ、好ましくは１０〜２０ｍＭの緩衝化混合液を
含む適切に緩衝された水溶液を使用する。２と１１との
あいだのｐＨの範囲において緩衝力を有するすべての化
学物質または化学物質の混合液は、使用され得るその溶
離液のｐＨ値が２と１１とのあいだであるので、有利に
使用され得る。
【００７０】以下を含む多くの緩衝水溶液が、本発明の
実施において有利に使用され得る：グリシンおよび塩化
ナトリウム、マレイン酸および水酸化ナトリウム、マロ
ン酸および水酸化ナトリウム、乳酸および水酸化ナトリ
ウム、蟻酸および水酸化ナトリウムもしくは水酸化リチ
ウム、コハク酸および水酸化ナトリウム、Ｎ−メチルピ
ペラジンおよび塩酸、ピペラジンおよび塩酸もしくは酢
酸、Ｌ−ヒスチジンおよび塩酸、４−（２−ヒドロキシ
エチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸および水酸
化ナトリウムもしくは水酸化リチウム、Ｎ−メチルジエ
タノールアミンおよび硫酸、Ｎ−メチルジエタノールア
ミンおよび硫酸、Ｎ−メチルジエタノールアミンおよび
塩酸もしくは酢酸、ピリジンおよび蟻酸、第二クエン酸
ナトリウムおよび水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリ
ウムおよび塩酸、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化
ナトリウム、リン酸二水素カリウムおよび第二リン酸ナ
トリウム、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）および水酸化ナトリ
ウム、バルビタールナトリウムおよび塩酸、ホウ酸ナト
リウムおよび塩酸、ホウ酸ナトリウムおよび水酸化ナト
リウム、１，３−ジアミノプロパンおよび塩酸、クエン
酸および第二リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび
酢酸、イミダゾールおよび塩酸、トリエタノールアミン
および塩酸もしくは酢酸、トリス（ヒドロキシメチルア
ミノメタン）および塩酸、炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕ
ｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）および炭酸ナトリウム（ｓｏ
ｄｉｕｍ ａｃｉｄ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、エタノー
ルアミンおよび塩酸、ピペリジンおよび塩酸、トリメチ
ルアミンおよび蟻酸、ピリジンおよび酢酸、トリメチル
アミンおよび酢酸、トリメチルアミンおよび塩酸、水酸
化アンモニウムおよび蟻酸、水酸化アンモニウムおよび
酢酸、トリメチルアミンおよび炭酸ナトリウム、炭酸ア
ンモニウムおよび水酸化アンモニウム。
実施において有利に使用され得る：グリシンおよび塩化
ナトリウム、マレイン酸および水酸化ナトリウム、マロ
ン酸および水酸化ナトリウム、乳酸および水酸化ナトリ
ウム、蟻酸および水酸化ナトリウムもしくは水酸化リチ
ウム、コハク酸および水酸化ナトリウム、Ｎ−メチルピ
ペラジンおよび塩酸、ピペラジンおよび塩酸もしくは酢
酸、Ｌ−ヒスチジンおよび塩酸、４−（２−ヒドロキシ
エチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸および水酸
化ナトリウムもしくは水酸化リチウム、Ｎ−メチルジエ
タノールアミンおよび硫酸、Ｎ−メチルジエタノールア
ミンおよび硫酸、Ｎ−メチルジエタノールアミンおよび
塩酸もしくは酢酸、ピリジンおよび蟻酸、第二クエン酸
ナトリウムおよび水酸化ナトリウム、リン酸二水素カリ
ウムおよび塩酸、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化
ナトリウム、リン酸二水素カリウムおよび第二リン酸ナ
トリウム、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）および水酸化ナトリ
ウム、バルビタールナトリウムおよび塩酸、ホウ酸ナト
リウムおよび塩酸、ホウ酸ナトリウムおよび水酸化ナト
リウム、１，３−ジアミノプロパンおよび塩酸、クエン
酸および第二リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび
酢酸、イミダゾールおよび塩酸、トリエタノールアミン
および塩酸もしくは酢酸、トリス（ヒドロキシメチルア
ミノメタン）および塩酸、炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕ
ｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）および炭酸ナトリウム（ｓｏ
ｄｉｕｍ ａｃｉｄ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、エタノー
ルアミンおよび塩酸、ピペリジンおよび塩酸、トリメチ
ルアミンおよび蟻酸、ピリジンおよび酢酸、トリメチル
アミンおよび酢酸、トリメチルアミンおよび塩酸、水酸
化アンモニウムおよび蟻酸、水酸化アンモニウムおよび
酢酸、トリメチルアミンおよび炭酸ナトリウム、炭酸ア
ンモニウムおよび水酸化アンモニウム。
【００７１】とくに、組換えα２ｂインターフェロン
（ｒＩＦＮα−２ｂ）の精製の場合、５．９と６．１と
のあいだのｐＨで緩衝力を示すすべての緩衝液が使用さ
れ得、好ましくは、リン酸二水素カリウムおよび第二リ
ン酸ナトリウム、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化
ナトリウム、第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化ナト
リウム、クエン酸および第二リン酸ナトリウム、イミダ
ゾールおよび塩酸を含む５．９と６．１とのあいだのｐ
Ｈの緩衝液が使用され得、一方、ヒト血清アルブミンの
精製の場合、４．９と６．０とのあいだのｐＨで緩衝力
を示す化合物の同一の混合物を含む緩衝液が、使用され
得る。
（ｒＩＦＮα−２ｂ）の精製の場合、５．９と６．１と
のあいだのｐＨで緩衝力を示すすべての緩衝液が使用さ
れ得、好ましくは、リン酸二水素カリウムおよび第二リ
ン酸ナトリウム、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化
ナトリウム、第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化ナト
リウム、クエン酸および第二リン酸ナトリウム、イミダ
ゾールおよび塩酸を含む５．９と６．１とのあいだのｐ
Ｈの緩衝液が使用され得、一方、ヒト血清アルブミンの
精製の場合、４．９と６．０とのあいだのｐＨで緩衝力
を示す化合物の同一の混合物を含む緩衝液が、使用され
得る。
【００７２】溶離液として使用される水溶液は、そのｐ
Ｈを緩衝するために使用されるその化学物質に加えて、
溶液のイオン強度を改変する化学物質をも含み得る。こ
の目的を達成するために、ナトリウム、カリウム、アン
モニウム、一級アミン、二級アミン、三級アミンまたは
芳香族アミンと塩化され得る、たとえば、カルボキシレ
ート、アルキルスルホネート、フタラートなどの有機塩
またはサルフェート、クロリド、ホスフェートなどの無
機塩の両方が、有利に使用され得る。
Ｈを緩衝するために使用されるその化学物質に加えて、
溶液のイオン強度を改変する化学物質をも含み得る。こ
の目的を達成するために、ナトリウム、カリウム、アン
モニウム、一級アミン、二級アミン、三級アミンまたは
芳香族アミンと塩化され得る、たとえば、カルボキシレ
ート、アルキルスルホネート、フタラートなどの有機塩
またはサルフェート、クロリド、ホスフェートなどの無
機塩の両方が、有利に使用され得る。
【００７３】これらの化合物は、１ｍＭ〜１００ｍＭま
でのあいだ、好ましくは、１ｍＭと３０ｍＭとのあいだ
の値である濃度で有利に使用され得る。
でのあいだ、好ましくは、１ｍＭと３０ｍＭとのあいだ
の値である濃度で有利に使用され得る。
【００７４】たとえば、組換えα２ｂインターフェロン
（ｒＩＦＮα−２ｂ）の精製の場合、これらの化合物の
濃度は、１ｍＭと３０ｍＭとのあいだ、好ましくは、２
ｍＭと２０ｍＭとのあいだで変化し得る。
（ｒＩＦＮα−２ｂ）の精製の場合、これらの化合物の
濃度は、１ｍＭと３０ｍＭとのあいだ、好ましくは、２
ｍＭと２０ｍＭとのあいだで変化し得る。
【００７５】精製効率は、薬理学的に活性なタンパク質
の溶出の前に、適切なｐＨおよびイオン強度を有する溶
離液を用いて１回以上洗浄し、そのカラムを常にｐＩよ
りも高いｐＨにすることによって上昇され得る。
の溶出の前に、適切なｐＨおよびイオン強度を有する溶
離液を用いて１回以上洗浄し、そのカラムを常にｐＩよ
りも高いｐＨにすることによって上昇され得る。
【００７６】たとえば、ｐＩが４．９であるヒト血清ア
ルブミンの場合、洗浄は、５．５と５．８とのあいだで
あるｐＨの緩衝液を用いて実施され得る。一方、ｐＩが
５．９である組換えα２ｂインターフェロン（ｒＩＦＮ
α−２ｂ）の場合は、洗浄は、６．０と６．１とのあい
だであるｐＨの緩衝液を用いて実施され得る。
ルブミンの場合、洗浄は、５．５と５．８とのあいだで
あるｐＨの緩衝液を用いて実施され得る。一方、ｐＩが
５．９である組換えα２ｂインターフェロン（ｒＩＦＮ
α−２ｂ）の場合は、洗浄は、６．０と６．１とのあい
だであるｐＨの緩衝液を用いて実施され得る。
【００７７】これらの洗浄中に通過する溶離液の量は、
変化可能であるが、通常は、５と１００カラム容量（Ｃ
Ｖ）とのあいだの量である。
変化可能であるが、通常は、５と１００カラム容量（Ｃ
Ｖ）とのあいだの量である。
【００７８】たとえば、ヒト血清アルブミンの場合、達
成された洗浄は、２０ＣＶと４０ＣＶとのあいだであ
る。一方、組換えα２ｂインターフェロン（ｒＩＦＮα
−２ｂ）の場合、１０ＣＶと８０ＣＶとのあいだであ
る。
成された洗浄は、２０ＣＶと４０ＣＶとのあいだであ
る。一方、組換えα２ｂインターフェロン（ｒＩＦＮα
−２ｂ）の場合、１０ＣＶと８０ＣＶとのあいだであ
る。
【００７９】カラムに供給され得る精製される産物の量
は、使用されるクロマトグラフィーマトリクスに依存
し、そして１ｍｌの固定相につき、全タンパク質で最大
で１００ｍｇまで達し得るが、通常は、より低量で使用
されるとしても、５ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとのあ
いだである。
は、使用されるクロマトグラフィーマトリクスに依存
し、そして１ｍｌの固定相につき、全タンパク質で最大
で１００ｍｇまで達し得るが、通常は、より低量で使用
されるとしても、５ｍｇ／ｍｌと２０ｍｇ／ｍｌとのあ
いだである。
【００８０】溶離液は、最大値が１０ｃｍ／分と等しい
速度までの固定相と適合する直線速度で、カラムを通過
し得る。
速度までの固定相と適合する直線速度で、カラムを通過
し得る。
【００８１】前記例示した精製方法は、すべての薬理学
的に活性なタンパク質に適用され得る；とくに、インタ
ーフェロンα型、β型、γ型、δ型、ω型、τ型、白血
球由来の天然のα型インターフェロン、組換えα２ｂイ
ンターフェロンおよびコンセンサスインターフェロンに
関するインターフェロンタンパク質の精製、ならびにと
くに、天然起源および組換え起源の両方のヒトアルブミ
ンに関するアルブミンの精製が、本発明の実施において
好ましい。
的に活性なタンパク質に適用され得る；とくに、インタ
ーフェロンα型、β型、γ型、δ型、ω型、τ型、白血
球由来の天然のα型インターフェロン、組換えα２ｂイ
ンターフェロンおよびコンセンサスインターフェロンに
関するインターフェロンタンパク質の精製、ならびにと
くに、天然起源および組換え起源の両方のヒトアルブミ
ンに関するアルブミンの精製が、本発明の実施において
好ましい。
【００８２】前記精製方法の範囲は、工業的および経済
的な様式で、薬理学的に活性なタンパク質を含む医薬品
の製造のために直接使用されるような純度で、薬理学的
に活性なタンパク質を得ることである。
的な様式で、薬理学的に活性なタンパク質を含む医薬品
の製造のために直接使用されるような純度で、薬理学的
に活性なタンパク質を得ることである。
【００８３】とくに、本発明の範囲内で好ましい医薬品
は、インターフェロン、なおより好ましくは組換えα２
ｂインターフェロン（ｒＩＦＮα−２ｂ）、ならびにア
ルブミン、なおより好ましくは、天然起源および組換え
起源の両方のヒトアルブミンを含む医薬品である。
は、インターフェロン、なおより好ましくは組換えα２
ｂインターフェロン（ｒＩＦＮα−２ｂ）、ならびにア
ルブミン、なおより好ましくは、天然起源および組換え
起源の両方のヒトアルブミンを含む医薬品である。
【００８４】本発明の範囲は、薬理学的に活性なタンパ
ク質、主にインターフェロンタンパク質およびアルブミ
ンタンパク質の精製に有用な新規な方法を見出すことで
ある。
ク質、主にインターフェロンタンパク質およびアルブミ
ンタンパク質の精製に有用な新規な方法を見出すことで
ある。
【００８５】タンパク質の精製方法は、固体マトリクス
での陽イオン交換クロマトグラフィーの使用に基づき、
精製されるタンパク質の等電点（ｐＩ）に相当するｐＨ
についてよりも塩基性であるが、そのタンパク質は、な
お吸着したままであるｐＨで実施する。
での陽イオン交換クロマトグラフィーの使用に基づき、
精製されるタンパク質の等電点（ｐＩ）に相当するｐＨ
についてよりも塩基性であるが、そのタンパク質は、な
お吸着したままであるｐＨで実施する。
【００８６】精製される薬理学的に活性なタンパク質の
種類に対して、ときどき（ｆｒｏｍｔｉｍｅ ｔｏ ｔ
ｉｍｅ）調整されるｐＨおよびイオン強度の値を有する
緩衝液は、純粋な形態でのタンパク質の溶出のために使
用される。
種類に対して、ときどき（ｆｒｏｍｔｉｍｅ ｔｏ ｔ
ｉｍｅ）調整されるｐＨおよびイオン強度の値を有する
緩衝液は、純粋な形態でのタンパク質の溶出のために使
用される。
【００８７】本発明の方法目的のいくつかの例示的な実
施例を、本発明を明らかにする１つの範囲とともに本明
細書中以下に報告するが、それらは、本発明自体の何ら
かの制限であると考慮されるきものではない。
施例を、本発明を明らかにする１つの範囲とともに本明
細書中以下に報告するが、それらは、本発明自体の何ら
かの制限であると考慮されるきものではない。
【００８８】
【実施例】実施例１
（組換えα２ｂインターフェロン（ｒＩＦＮα−２ｂ）
の産生）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１
ＤＥ３株の細胞の一部を、５ｎｇのｐＥＴ９ａ−ＩＦ
Ｎα−２ｂプラスミドを用いて形質転換した。このプラ
スミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて
より頻繁なコドンに配列を、ｐＥＴ９ａプラスミド（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ）にあてがうために適切に改変された、Ｉ
ＮＦα−２ｂのヒト遺伝子配列を複製する合成遺伝子を
クローニングすることによって得られた。
の産生）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１
ＤＥ３株の細胞の一部を、５ｎｇのｐＥＴ９ａ−ＩＦ
Ｎα−２ｂプラスミドを用いて形質転換した。このプラ
スミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて
より頻繁なコドンに配列を、ｐＥＴ９ａプラスミド（Ｎ
ｏｖａｇｅｎ）にあてがうために適切に改変された、Ｉ
ＮＦα−２ｂのヒト遺伝子配列を複製する合成遺伝子を
クローニングすることによって得られた。
【００８９】上記の改変されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ細胞から発現されたタンパク質配列は、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．から発行されたＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，Ｃ部、
Ｐｅｓｔｋａ Ｓ．編、１１９，３−１４，（１９８
６）の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ）において報告された配列
と等しい。
ｃｏｌｉ細胞から発現されたタンパク質配列は、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．から発行されたＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，Ｃ部、
Ｐｅｓｔｋａ Ｓ．編、１１９，３−１４，（１９８
６）の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ）において報告された配列
と等しい。
【００９０】ｐＥＴ９ａ−ＩＦＮα−２ｂプラスミドに
よって形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＢＬ２１ ＤＥ３株を、適切な培地（たとえば、１
２ｇ／ｌのフィトペプトン（ｐｈｙｔｏｐｅｐｔｏｎ
ｅ）（Ｐｈｙｔｏ ｐｅｐｔｏｔｏｎ，ＢＢＬ）、２４
ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，Ｄ
ＩＦＣＯ）、４ｇ／ｌのグリセロール（ＢＤＨ）および
ネオマイシンを含む溶液）におけるフラスコ内での培養
において、３７℃で、６００ｎｍでの光学密度の値が
０．６〜０．８と等しくなるまで充分な時間（通常は、
７〜９時間）置いた。そうして得られた培地を、つい
で、５１培養器に接種するために１〜１００倍希釈で使
用する。培養器内には、前述したフラスコの培地と等し
い培地が含まれている。この培養を、培養容量について
１分間に１空気容量と等しいエアレーションで３７℃で
１４時間保持する。
よって形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ ＢＬ２１ ＤＥ３株を、適切な培地（たとえば、１
２ｇ／ｌのフィトペプトン（ｐｈｙｔｏｐｅｐｔｏｎ
ｅ）（Ｐｈｙｔｏ ｐｅｐｔｏｔｏｎ，ＢＢＬ）、２４
ｇ／ｌの酵母抽出物（Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ，Ｄ
ＩＦＣＯ）、４ｇ／ｌのグリセロール（ＢＤＨ）および
ネオマイシンを含む溶液）におけるフラスコ内での培養
において、３７℃で、６００ｎｍでの光学密度の値が
０．６〜０．８と等しくなるまで充分な時間（通常は、
７〜９時間）置いた。そうして得られた培地を、つい
で、５１培養器に接種するために１〜１００倍希釈で使
用する。培養器内には、前述したフラスコの培地と等し
い培地が含まれている。この培養を、培養容量について
１分間に１空気容量と等しいエアレーションで３７℃で
１４時間保持する。
【００９１】その培養が終結すると、細菌細胞を、１分
あたり６０００回転（ｒｐｍ）で遠心することによって
収集した。その細菌細胞を、遠心した細菌の湿重量のグ
ラムあたり６ｍｌ以下の量の、１ｍＭのジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）を含む適切な水溶液中に懸濁する。細菌
懸濁液を、確立かつ記載された技術（たとえば、超音波
破砕または水圧破砕など）によって細胞溶解に供する。
あたり６０００回転（ｒｐｍ）で遠心することによって
収集した。その細菌細胞を、遠心した細菌の湿重量のグ
ラムあたり６ｍｌ以下の量の、１ｍＭのジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）を含む適切な水溶液中に懸濁する。細菌
懸濁液を、確立かつ記載された技術（たとえば、超音波
破砕または水圧破砕など）によって細胞溶解に供する。
【００９２】得られた懸濁液を、遠心分離によって回収
し、そして固体部分を、１ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍｌ
の塩化ナトリウム水溶液中に懸濁し、再度、遠心分離す
る。
し、そして固体部分を、１ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍｌ
の塩化ナトリウム水溶液中に懸濁し、再度、遠心分離す
る。
【００９３】封入体からなる固体成分を収集し、そし
て、室温で、６Ｍのグアニジン塩酸塩、５０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ
を含む４５０ｍｌの溶液中に激しく撹拌しながら懸濁す
る。その懸濁液を遠心分離し、そしてその上清をタンパ
ク質の再生に適する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８）および０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む塩化
ナトリウム溶液中に１〜１００から１〜２００の比で希
釈する。再生用の溶液は、たとえばグリシンまたはアル
ギニンなどのアミノ酸；たとえばグルタチオン、エタノ
ールアミン、システインなどの形成されたジスルフィド
結合を有する酸化形態および還元形態で硫化物を含む化
合物の混合物を含み得る。再生を、４℃でほとんど７２
時間、この溶液を激しく撹拌しながら実施し、ついで、
この溶液を濾過し、ついで、最終濃度係数が５〜１０倍
になるまで、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に
よって作製された緩衝液に対して透析濾過（ｄｉａ−ｆ
ｉｌｔｒａｔｉｏｎ）方法によって濃縮する。この溶液
の最終濃度は、通常、０．４ｍｇ／ｍｌと１．０ｍｇ／
ｍｌとのあいだである。
て、室温で、６Ｍのグアニジン塩酸塩、５０ｍＭのＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ
を含む４５０ｍｌの溶液中に激しく撹拌しながら懸濁す
る。その懸濁液を遠心分離し、そしてその上清をタンパ
ク質の再生に適する５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８）および０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を含む塩化
ナトリウム溶液中に１〜１００から１〜２００の比で希
釈する。再生用の溶液は、たとえばグリシンまたはアル
ギニンなどのアミノ酸；たとえばグルタチオン、エタノ
ールアミン、システインなどの形成されたジスルフィド
結合を有する酸化形態および還元形態で硫化物を含む化
合物の混合物を含み得る。再生を、４℃でほとんど７２
時間、この溶液を激しく撹拌しながら実施し、ついで、
この溶液を濾過し、ついで、最終濃度係数が５〜１０倍
になるまで、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に
よって作製された緩衝液に対して透析濾過（ｄｉａ−ｆ
ｉｌｔｒａｔｉｏｎ）方法によって濃縮する。この溶液
の最終濃度は、通常、０．４ｍｇ／ｍｌと１．０ｍｇ／
ｍｌとのあいだである。
【００９４】実施例２
（組換えα２ｂ−インターフェロン（ｒＩＦＮα−２
ｂ）の精製）１Ｍの酢酸ナトリウム溶液を、実施例１で
生じたｒＩＦＮα−２ｂを含むタンパク質混合物に、最
終濃度が２０ｍＭになるまで添加し、そしてその混合物
を、酢酸でｐＨ５．５にする。そうして得られた溶液
を、市販のクロマトグラフィーマトリクス Ｍｕｓｔａ
ｎｇ（登録商標）Ｓ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）
を含む強力な陽イオン交換カラムに充填する。この陽イ
オン交換カラムを、２０カラム容量（ＣＶ）と同量の２
０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）によって調整
し、そののち、タンパク質溶液を充填した。
ｂ）の精製）１Ｍの酢酸ナトリウム溶液を、実施例１で
生じたｒＩＦＮα−２ｂを含むタンパク質混合物に、最
終濃度が２０ｍＭになるまで添加し、そしてその混合物
を、酢酸でｐＨ５．５にする。そうして得られた溶液
を、市販のクロマトグラフィーマトリクス Ｍｕｓｔａ
ｎｇ（登録商標）Ｓ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）
を含む強力な陽イオン交換カラムに充填する。この陽イ
オン交換カラムを、２０カラム容量（ＣＶ）と同量の２
０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．５）によって調整
し、そののち、タンパク質溶液を充填した。
【００９５】ついで、１ｍｌの固定相に充填されるタン
パク質が１０ｍｇ値の量を上回らないような量で、好ま
しくは６ｍｇ／ｍｌと８ｍｇ／ｍｌとのあいだの量で、
このタンパク質溶液を充填する。
パク質が１０ｍｇ値の量を上回らないような量で、好ま
しくは６ｍｇ／ｍｌと８ｍｇ／ｍｌとのあいだの量で、
このタンパク質溶液を充填する。
【００９６】充填後、固定相に結合する産物を、全体と
しての濃度が５ｍＭと１５ｍＭとのあいだであるリン酸
二水素カリウムおよび第二リン酸ナトリウムの混合液か
らなる塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．１）による洗浄
の、第一サイクルに供する。この溶液の最適濃度を、伝
導率が約１８００μＳを上回らないという事実に基づい
て固定する。５ＣＶと６０ＣＶとのあいだ、好ましく
は、２５ＣＶと３５ＣＶとのあいだである溶液の全量を
使用する。
しての濃度が５ｍＭと１５ｍＭとのあいだであるリン酸
二水素カリウムおよび第二リン酸ナトリウムの混合液か
らなる塩化ナトリウム溶液（ｐＨ６．１）による洗浄
の、第一サイクルに供する。この溶液の最適濃度を、伝
導率が約１８００μＳを上回らないという事実に基づい
て固定する。５ＣＶと６０ＣＶとのあいだ、好ましく
は、２５ＣＶと３５ＣＶとのあいだである溶液の全量を
使用する。
【００９７】ついで、ある量の塩化カリウムを最終濃度
が３ｍＭ、好ましくは２ｍＭを上回らない濃度と同一の
濃度になるように塩化カリウムが添加された第一サイク
ルの洗浄液と同様の溶液を用いることによって、洗浄の
第二サイクルを実施する；１０ＣＶと１００ＣＶとのあ
いだ、好ましくは、３０ＣＶと６０ＣＶとのあいだであ
る溶液の全量を使用する。
が３ｍＭ、好ましくは２ｍＭを上回らない濃度と同一の
濃度になるように塩化カリウムが添加された第一サイク
ルの洗浄液と同様の溶液を用いることによって、洗浄の
第二サイクルを実施する；１０ＣＶと１００ＣＶとのあ
いだ、好ましくは、３０ＣＶと６０ＣＶとのあいだであ
る溶液の全量を使用する。
【００９８】この洗浄サイクルの後、溶出期を、最終濃
度が１０ｍＭ以上の濃度、好ましくは、１５ｍＭと２５
ｍＭとのあいだである濃度の塩化カリウムを含む洗浄の
第一サイクルの溶液などの溶液を用いることによって実
施する。全体としての量が１５ＣＶと４０ＣＶとのあい
だ、好ましくは、２０ＣＶと３０ＣＶとのあいだの溶液
を、溶出のために用いる。
度が１０ｍＭ以上の濃度、好ましくは、１５ｍＭと２５
ｍＭとのあいだである濃度の塩化カリウムを含む洗浄の
第一サイクルの溶液などの溶液を用いることによって実
施する。全体としての量が１５ＣＶと４０ＣＶとのあい
だ、好ましくは、２０ＣＶと３０ＣＶとのあいだの溶液
を、溶出のために用いる。
【００９９】すべての溶液および充填した試料は、０．
１ｃｍ／分と１ｃｍ／分とのあいだ、好ましくは、０．
４ｃｍ／分と０．７ｃｍ／分とのあいだである直線速度
でカラムを通過させる。
１ｃｍ／分と１ｃｍ／分とのあいだ、好ましくは、０．
４ｃｍ／分と０．７ｃｍ／分とのあいだである直線速度
でカラムを通過させる。
【０１００】これらの条件下で、ｒＩＦＮα−２ｂを、
８０％よりも高い目的産物の回収率で、９８％よりも高
い純度でカラムから溶出する。一方、開始溶液は、純度
が約４０％であった。
８０％よりも高い目的産物の回収率で、９８％よりも高
い純度でカラムから溶出する。一方、開始溶液は、純度
が約４０％であった。
【０１０１】カラムクロマトグラフィー精製の前後のカ
ラムクロマトグラフィープロフィールを、図１および２
に示す。
ラムクロマトグラフィープロフィールを、図１および２
に示す。
【０１０２】図１は、精製前のインターフェロン溶液の
クロマトグラフィープロフィールを示し、そして図２
は、精製後のクロマトグラフィープロフィールを示す。
クロマトグラフィープロフィールを示し、そして図２
は、精製後のクロマトグラフィープロフィールを示す。
【０１０３】クロマトグラフィープロフィールは、Ｖｙ
ｄａｃ Ｃ１８カラムおよび２１４ｎｍに設定したＵＶ
検出器を用いる液体クロマトグラフＨＰ １０９０によ
るＨＰＬＣにおいて実施される。溶出は、以下の２つの
溶離液からなる混合液を用いることによって１ｍｌ／分
の流量で実施される；溶離液Ａは、７００ｍｌの水、２
９８ｍｌのアセトニトリルおよび２ｍｌのトリフルオロ
酢酸からなり、そして溶離液Ｂは、１９８ｍｌの水、８
００ｍｌのアセトニトリルおよび２ｍｌのトリフルオロ
酢酸からなる。この２つの溶離液は、以下の表にしたが
って溶出中に混合される：
ｄａｃ Ｃ１８カラムおよび２１４ｎｍに設定したＵＶ
検出器を用いる液体クロマトグラフＨＰ １０９０によ
るＨＰＬＣにおいて実施される。溶出は、以下の２つの
溶離液からなる混合液を用いることによって１ｍｌ／分
の流量で実施される；溶離液Ａは、７００ｍｌの水、２
９８ｍｌのアセトニトリルおよび２ｍｌのトリフルオロ
酢酸からなり、そして溶離液Ｂは、１９８ｍｌの水、８
００ｍｌのアセトニトリルおよび２ｍｌのトリフルオロ
酢酸からなる。この２つの溶離液は、以下の表にしたが
って溶出中に混合される：
【０１０４】
【表１】
【０１０５】実施例３
この方法を、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化ナト
リウムからなる緩衝液を用いることによって実施例２の
説明にしたがって実施する。
リウムからなる緩衝液を用いることによって実施例２の
説明にしたがって実施する。
【０１０６】実施例４
この方法を、第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化ナト
リウムからなる緩衝液を用いることによって実施例２の
説明にしたがって実施する。
リウムからなる緩衝液を用いることによって実施例２の
説明にしたがって実施する。
【０１０７】実施例５
この方法を、クエン酸および第二リン酸ナトリウムから
なる緩衝液を用いることによって実施例２の説明にした
がって実施する。
なる緩衝液を用いることによって実施例２の説明にした
がって実施する。
【０１０８】実施例６
この方法を、イミダゾールおよび塩酸からなる緩衝液を
用いることによって実施例２の説明にしたがって実施す
る。
用いることによって実施例２の説明にしたがって実施す
る。
【０１０９】実施例７
（ヒト血清アルブミンの精製）ヒト血清アルブミン（Ｈ
ＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ（２０００年のカタログ番号Ａ１
６５３）より購入した。このアルブミン調製物の名目上
のラベルには、９９．６％と記されているが、ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ分析では、実際には、アルブミン様産物を不純物
とみなす場合、８８％に等しいことを示す。ＨＳＡ溶液
を、１ｍｇ／ｍｌに等しい最終濃度で、ｐＨ３の２０ｍ
Ｍのクエン酸溶液において調製し、そして市販のクロマ
トグラフィーマトリクス Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）
Ｓ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）を含む強陽イオン
交換カラムに充填した。この陽イオン交換カラムを、２
０カラム容量（ＣＶ）と同一の量で調整して、そのの
ち、ｐＨ３．０の２０ｍＭのクエン酸溶液を充填した。
ＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ（２０００年のカタログ番号Ａ１
６５３）より購入した。このアルブミン調製物の名目上
のラベルには、９９．６％と記されているが、ＲＰ−Ｈ
ＰＬＣ分析では、実際には、アルブミン様産物を不純物
とみなす場合、８８％に等しいことを示す。ＨＳＡ溶液
を、１ｍｇ／ｍｌに等しい最終濃度で、ｐＨ３の２０ｍ
Ｍのクエン酸溶液において調製し、そして市販のクロマ
トグラフィーマトリクス Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）
Ｓ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ）を含む強陽イオン
交換カラムに充填した。この陽イオン交換カラムを、２
０カラム容量（ＣＶ）と同一の量で調整して、そのの
ち、ｐＨ３．０の２０ｍＭのクエン酸溶液を充填した。
【０１１０】充填した溶液の量は、１ｍｌの固定相あた
り、１０ｍｇの充填タンパク質の値、好ましくは、６ｍ
ｇ／ｍｌと８ｍｇ／ｍｌとのあいだである量を上回らな
いような量である。
り、１０ｍｇの充填タンパク質の値、好ましくは、６ｍ
ｇ／ｍｌと８ｍｇ／ｍｌとのあいだである量を上回らな
いような量である。
【０１１１】充填後、固定相に結合した産物を、以下の
洗浄サイクルに供する： １．洗浄サイクル−ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリ
ウムを用いて４０ＣＶ ２．洗浄サイクル−ｐＨ５．８の２０ｍＭの酢酸ナトリ
ウムを用いて３０ＣＶ 混合液の組成に依存して５ｍＭと１００ｍＭとのあいだ
である濃度のリン酸二水素カリウムおよび第二リン酸ナ
トリウムの混合液からなるｐＨ６．０の塩化ナトリウム
溶液によって、このカラムからの目的産物の溶出を実施
する。しかし、この溶液の伝導率は、１４０μＳを上回
らない。２５ＣＶと３５ＣＶとのあいだである溶液の全
量を使用する。
洗浄サイクルに供する： １．洗浄サイクル−ｐＨ５．５の２０ｍＭの酢酸ナトリ
ウムを用いて４０ＣＶ ２．洗浄サイクル−ｐＨ５．８の２０ｍＭの酢酸ナトリ
ウムを用いて３０ＣＶ 混合液の組成に依存して５ｍＭと１００ｍＭとのあいだ
である濃度のリン酸二水素カリウムおよび第二リン酸ナ
トリウムの混合液からなるｐＨ６．０の塩化ナトリウム
溶液によって、このカラムからの目的産物の溶出を実施
する。しかし、この溶液の伝導率は、１４０μＳを上回
らない。２５ＣＶと３５ＣＶとのあいだである溶液の全
量を使用する。
【０１１２】すべての溶液および充填した試料は、０．
１ｃｍ／分と１ｃｍ／分とのあいだ、好ましくは、０．
４ｃｍ／分と０．７ｃｍ／分とのあいだである直線速度
でカラムを通過させる。
１ｃｍ／分と１ｃｍ／分とのあいだ、好ましくは、０．
４ｃｍ／分と０．７ｃｍ／分とのあいだである直線速度
でカラムを通過させる。
【０１１３】これらの条件下で、ＨＳＡを、５６％より
も高い目的産物の回収率とともに、９９％よりも高い純
度でカラムから溶出する。
も高い目的産物の回収率とともに、９９％よりも高い純
度でカラムから溶出する。
【０１１４】図３および４は、精製前後のＨＳＡのＨＰ
ＬＣクロマトグラフィープロフィールを示す。この分析
は、以下の２つの溶離液の混合物を用いることによっ
て、図１および２のために使用されたのと同一の手段で
実施した；溶離液Ａは、９５０ｍｌの０．１％トリフル
オロ酢酸および５０ｍｌのアセトニトリルからなり、そ
して溶離液Ｂは、９５０ｍｌのアセトニトリルおよび５
０ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸からなる。この溶出
を、２０％のＢで開始し、２０分間で、Ｂが６０％に達
する溶離液ＡおよびＢの混合物の直線勾配を用いること
によって１ｍｌ／分の流量で実施した。
ＬＣクロマトグラフィープロフィールを示す。この分析
は、以下の２つの溶離液の混合物を用いることによっ
て、図１および２のために使用されたのと同一の手段で
実施した；溶離液Ａは、９５０ｍｌの０．１％トリフル
オロ酢酸および５０ｍｌのアセトニトリルからなり、そ
して溶離液Ｂは、９５０ｍｌのアセトニトリルおよび５
０ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸からなる。この溶出
を、２０％のＢで開始し、２０分間で、Ｂが６０％に達
する溶離液ＡおよびＢの混合物の直線勾配を用いること
によって１ｍｌ／分の流量で実施した。
【０１１５】
【発明の効果】本発明によると、非常に多量の目的のタ
ンパク質を高純度で単離することができる。
ンパク質を高純度で単離することができる。
【０１１６】また、本発明によると、精製は非常に簡潔
となり、そして、タンパク質の精製費用を抑えることが
でき、容易かつ効果的な工業的実現を可能とする。
となり、そして、タンパク質の精製費用を抑えることが
でき、容易かつ効果的な工業的実現を可能とする。
【０１１７】本発明は、薬理学的に活性なタンパク質、
主にインターフェロンタンパク質およびアルブミンタン
パク質の精製に有用である。
主にインターフェロンタンパク質およびアルブミンタン
パク質の精製に有用である。
【図１】精製前のインターフェロン溶液のクロマトグラ
フィープロフィールを示す。
フィープロフィールを示す。
【図２】精製後のクロマトグラフィープロフィールを示
す。
す。
【図３】精製前後のＨＳＡのＨＰＬＣクロマトグラフィ
ープロフィールを示す。
ープロフィールを示す。
【図４】精製前後のＨＳＡのＨＰＬＣクロマトグラフィ
ープロフィールを示す。
ープロフィールを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 14/555 Ｃ０７Ｋ 14/565
14/56 14/76
14/565 14/765
14/76 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｄ
14/765 37/02
// Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(72)発明者 ルチーア スカポル
イタリア共和国、40037 サッソ マルコ
ーニ（ボローニャ）、ビア ベンティチン
クェジモ アプリレ、17
(72)発明者 ジュゼッペ クラウディオ ビスコーミ
イタリア共和国、40037 サッソ マルコ
ーニ（ボローニャ）、ビア ベンティチン
クェジモ アプリレ、17
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA22 BA23 BA24 BA40
CA06 DA06 EA04 FA10 GA19
4C084 AA06 BA44 CA18 CA53 DA21
DA22 DA23 DA24 DA36 NA06
NA07 ZB092 ZB332
4H045 AA20 BA09 BA50 BA53 CA40
DA15 DA16 DA17 DA18 DA70
EA20 FA73 FA74 GA01 GA15
GA23 HA14 HA15
Claims (15)
- 【請求項１】 薬理学的に活性なタンパク質の精製方法
であって、精製される該タンパク質の等電点ｐＩに相当
するｐＨよりも塩基性のｐＨであって、該タンパク質が
なお吸着しているｐＨにおいて、固体マトリクスで陽イ
オン交換クロマトグラフィーを実施する工程、ならびに
溶離液のイオン強度および／またはｐＨを上昇させるこ
とによって該タンパク質を溶出させる工程からなる精製
方法。 - 【請求項２】 前記陽イオン交換クロマトグラフィーに
用いる溶離液が、ｐＨが２と１１とのあいだである緩衝
水溶液から作製されることを特徴とする請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】 前記緩衝水溶液のｐＨが、４と８．５と
のあいだであることを特徴とする請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 前記緩衝水溶液が、５〜１００ｍＭの以
下の緩衝混合液：リン酸二水素カリウムおよび第二リン
酸ナトリウム、フタル酸二水素カリウムおよび水酸化ナ
トリウム、第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリ
ウム、クエン酸および第二リン酸ナトリウム、イミダゾ
ールおよび塩酸を含むことを特徴とする請求項２または
３記載の方法。 - 【請求項５】 前記緩衝液が、該緩衝液のイオン強度を
変更しやすい、１〜１００ｍＭの有機塩または無機塩を
含み得ることを特徴とする請求項２、３または４記載の
方法。 - 【請求項６】 前記薬理学的に活性なタンパク質がイン
ターフェロンタンパク質およびアルブミンタンパク質で
あることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 前記インターフェロンタンパク質が、α
型、β型、γ型、δ型、ω型、τ型、白血球由来の天然
のα型、組換えα−２ｂインターフェロンおよびコンセ
ンサスインターフェロンであり、そしてアルブミンタン
パク質は、天然のヒトアルブミンおよび組換えヒトアル
ブミンであることを特徴とする請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 組換えα−２ｂインターフェロン、ｒＩ
ＦＮα−２ｂの精製方法であって、１Ｍの酢酸ナトリウ
ム溶液を加え、そして酢酸でｐＨ５．５にしたｒＩＦＮ
α−２ｂの培養による製造から生じるタンパク質混合物
を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液によってｐＨ５．５
に調整した強陽イオン交換樹脂を充填したカラムに充填
し、その結果、１ｍｌの固定相あたりに、６ｍｇと８ｍ
ｇとのあいだのタンパク質が存在する工程、該カラムを
２回の洗浄サイクルに供する工程であって、まず、５ｍ
Ｍと１５ｍＭとのあいだの濃度のｐＨ６．１の緩衝溶液
を用い、ついで、２ｍＭの塩化カリウムを添加した該同
一の緩衝液を用いる工程、ならびに最後に、１５ｍＭと
２５ｍＭとのあいだの濃度で塩化カリウムを含む、５ｍ
Ｍと１５ｍＭとのあいだの濃度のｐＨ６．１の緩衝液を
用いることによって該カラムから純粋なｒＩＦＮα−２
ｂを溶出する工程、からなる方法。 - 【請求項９】 使用した樹脂が、ムスタングＳであり、
そして緩衝液混合物が、リン酸二水素カリウムおよび第
二リン酸ナトリウム、フタル酸二水素カリウムおよび水
酸化ナトリウム、第二クエン酸ナトリウムおよび水酸化
ナトリウム、クエン酸および第二リン酸ナトリウム、イ
ミダゾールおよび塩酸から作製される緩衝液混合物から
選択されることを特徴とする請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 ヒト血清アルブミンの精製方法であっ
て、クエン酸によってｐＨ３にしたヒト血清アルブミン
を含む溶液を、２０ｍＭのクエン酸溶液を用いてｐＨ３
に調整した強陽イオン交換樹脂を充填したカラムに充填
し、その結果、１ｍｌの固定相あたりに、６ｍｇと８ｍ
ｇとのあいだのタンパク質が存在する工程、２０ｍＭの
酢酸ナトリウム溶液を用いて該カラムを２回の洗浄サイ
クルに供し、その結果、ｐＨ値を５．５および５．８に
する工程、ついで、５ｍＭと１００ｍＭとのあいだの濃
度のリン酸二水素カリウムおよび第二リン酸ナトリウム
の混合液から作製されるｐＨ６．０の緩衝液によって該
カラムから純粋なヒト血清アルブミンを溶出する工程、
からなる方法。 - 【請求項１１】 薬理学的に活性なタンパク質に基づく
医薬品に含まれる活性素因を製造する、請求項１、２、
３、４、５、６、７、８、９または１０記載の方法の使
用。 - 【請求項１２】 前記活性素因が、インターフェロンタ
ンパク質であることを特徴とする請求項１１記載の使
用。 - 【請求項１３】 前記インターフェロンタンパク質が、
組換えα−２ｂインターフェロンであることを特徴とす
る請求項１２記載の使用。 - 【請求項１４】 前記活性素因が、アルブミンタンパク
質であることを特徴とする請求項１１記載の使用。 - 【請求項１５】 前記アルブミンタンパク質が天然ヒト
血清アルブミンまたは組換えヒト血清アルブミンである
ことを特徴とする請求項１４記載の使用。
Applications Claiming Priority (2)
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