JPS6159292B2 - - Google Patents
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- JPS6159292B2 JPS6159292B2 JP53137036A JP13703678A JPS6159292B2 JP S6159292 B2 JPS6159292 B2 JP S6159292B2 JP 53137036 A JP53137036 A JP 53137036A JP 13703678 A JP13703678 A JP 13703678A JP S6159292 B2 JPS6159292 B2 JP S6159292B2
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- protein
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- interferon
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Links
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はエンドトキシンの分離法に関し、特に
注射に適したタンパク質製剤を製造するためのエ
ンドトキシンの分離法に関する。
注射に適したタンパク質製剤を製造するためのエ
ンドトキシンの分離法に関する。
現在あるいは近い将来医療用の目的で注射薬と
して利用されるタンパク質にはインシユリン、脳
下垂体などの各種ホルモン製剤、ウロキナーゼ、
キモトリプシンなどの各種酵素製剤、γ−グロブ
リンなど血清各種タンパク質製剤、インターフエ
ロンなどの抗ウイルス製剤などがあげられる。こ
れらのタンパク質はすべて生体由来のものである
ため、これら原料の集収過程、あるいは分離精製
を行なう過程で発熱性物質の混入を受けることが
屡々経験され、これの除去方法が色々と報告され
ている。
して利用されるタンパク質にはインシユリン、脳
下垂体などの各種ホルモン製剤、ウロキナーゼ、
キモトリプシンなどの各種酵素製剤、γ−グロブ
リンなど血清各種タンパク質製剤、インターフエ
ロンなどの抗ウイルス製剤などがあげられる。こ
れらのタンパク質はすべて生体由来のものである
ため、これら原料の集収過程、あるいは分離精製
を行なう過程で発熱性物質の混入を受けることが
屡々経験され、これの除去方法が色々と報告され
ている。
発熱性物質の代表的なものに、エンドトキシン
がある。エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁
由来のリポ多糖で、これの超微量（ｎｇ／Kg
body）が注射で体内に入ると著明な発熱をひき
起すことが知られている。一方、有用タンパク質
の製剤化の場合には、高度の濃縮を必要とする場
合が多い。従つて原液中のエンドトキシン量が極
微量であつても、最終濃縮製剤中にはこれが同様
に濃縮されており、注射時に発熱の副作用を示す
結果となる。
がある。エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁
由来のリポ多糖で、これの超微量（ｎｇ／Kg
body）が注射で体内に入ると著明な発熱をひき
起すことが知られている。一方、有用タンパク質
の製剤化の場合には、高度の濃縮を必要とする場
合が多い。従つて原液中のエンドトキシン量が極
微量であつても、最終濃縮製剤中にはこれが同様
に濃縮されており、注射時に発熱の副作用を示す
結果となる。
我々はこの間題について鋭意研究を重ねた結
果、例えばイミノ二酢酸−金属イオン錯体（銅ま
たは亜鉛イオン）を不溶性担体に結合したクロマ
トグラフイー系が、エンドトキシンを除去する有
力な手段であることを発見して、本発明を完成し
たものである。
果、例えばイミノ二酢酸−金属イオン錯体（銅ま
たは亜鉛イオン）を不溶性担体に結合したクロマ
トグラフイー系が、エンドトキシンを除去する有
力な手段であることを発見して、本発明を完成し
たものである。
本発明に用いられるクロマトグラフイー担体と
しては、イミノ二酢酸−金属イオンを結合した不
溶性担体があり、一例としてJ.Porathら
（Nature、258 5381−5385（1975））の報告した
エポキシ活性化セフアローズを用いたものがあ
り、構造は下記の通りである。
しては、イミノ二酢酸−金属イオンを結合した不
溶性担体があり、一例としてJ.Porathら
（Nature、258 5381−5385（1975））の報告した
エポキシ活性化セフアローズを用いたものがあ
り、構造は下記の通りである。
本担体にタンパク質水溶液を流下すると、タン
パク質の側鎖のイミダゾール基、チオール基など
が金属イオンの所に配位結合をしてカラムに吸着
し、この結合力の強弱に応じてタンパク質相互が
分離される。また、そのほか市販のキレート樹
脂、例えばダイヤイオンCR−10なども同様な活
性を持つ担体として使用することができる。エン
ドトキシンは、タンパク質が最もよく吸着する条
件、すなわちＣ＋＋ ｕ−キレートカラム、PH７〜8.5
の展開溶媒でも全く吸着されずに素通りし、続い
て少量のPH７〜8.5溶液でカラムを洗浄すれば完
全に除去できる。続いてカラムを低いPHの溶液、
あるいは錯塩形成能力の大きい試薬溶液で展開す
れば、タンパク質の配位結合が切れて、発熱性物
質を含まないタンパク質が好収量で回収できる。
パク質の側鎖のイミダゾール基、チオール基など
が金属イオンの所に配位結合をしてカラムに吸着
し、この結合力の強弱に応じてタンパク質相互が
分離される。また、そのほか市販のキレート樹
脂、例えばダイヤイオンCR−10なども同様な活
性を持つ担体として使用することができる。エン
ドトキシンは、タンパク質が最もよく吸着する条
件、すなわちＣ＋＋ ｕ−キレートカラム、PH７〜8.5
の展開溶媒でも全く吸着されずに素通りし、続い
て少量のPH７〜8.5溶液でカラムを洗浄すれば完
全に除去できる。続いてカラムを低いPHの溶液、
あるいは錯塩形成能力の大きい試薬溶液で展開す
れば、タンパク質の配位結合が切れて、発熱性物
質を含まないタンパク質が好収量で回収できる。
以下、実施例について説明する。
実施例 １
ヒト二倍体線維芽細胞をポリイノシン酸−ポリ
シチジル酸処理でインターフエロンを誘導し、さ
らにシクロヘキシミドとアクチノマイシンＤでイ
ンターフエロンを超誘導して得られた粗インター
フエロン水溶液を適当な方法で部分精製したイン
ターフエロン水溶液を出発物質とした。本溶液の
PHは７〜８、活性は２×105U／ml、タンパク質
含量は20μｇ／ml前後であつた。また、この溶液
のエンドトキシン含量はリムラス試験法で約
30ng／ml（E.coli O111B4相当）であつた。この
溶液100mlをJ.Porathらの方法に従つて作製した
イミノ二酢酸結合−Ｚ＋＋ ｏキレートカラム（樹脂量
２ml）に通液した。続いて0.1Mりん酸緩衝液PH
8.3 10ml、さらに蒸溜水10mlでカラムを洗浄し
た。素通り液中のインターフエロン活性は添加総
量の約５％であるのに対し、エンドトキシン量は
30ng／mlとほぼ定量的で、水溶液ではリムラス
反応が陰性であつた。続いて0.135M食塩を含有
する0.01Mりん酸緩衝液PH4.5 20mlでインターフ
エロンを溶出すると、ほぼ定量的にインターフエ
ロン活性を回収でき、かつエンドトキシン含量は
リムラス試験法で0.1ng／ml以下であり、ほぼ完
全にエンドトキシンフリーの製剤が得られた。
シチジル酸処理でインターフエロンを誘導し、さ
らにシクロヘキシミドとアクチノマイシンＤでイ
ンターフエロンを超誘導して得られた粗インター
フエロン水溶液を適当な方法で部分精製したイン
ターフエロン水溶液を出発物質とした。本溶液の
PHは７〜８、活性は２×105U／ml、タンパク質
含量は20μｇ／ml前後であつた。また、この溶液
のエンドトキシン含量はリムラス試験法で約
30ng／ml（E.coli O111B4相当）であつた。この
溶液100mlをJ.Porathらの方法に従つて作製した
イミノ二酢酸結合−Ｚ＋＋ ｏキレートカラム（樹脂量
２ml）に通液した。続いて0.1Mりん酸緩衝液PH
8.3 10ml、さらに蒸溜水10mlでカラムを洗浄し
た。素通り液中のインターフエロン活性は添加総
量の約５％であるのに対し、エンドトキシン量は
30ng／mlとほぼ定量的で、水溶液ではリムラス
反応が陰性であつた。続いて0.135M食塩を含有
する0.01Mりん酸緩衝液PH4.5 20mlでインターフ
エロンを溶出すると、ほぼ定量的にインターフエ
ロン活性を回収でき、かつエンドトキシン含量は
リムラス試験法で0.1ng／ml以下であり、ほぼ完
全にエンドトキシンフリーの製剤が得られた。
実施例 ２
牛−γ−グロブリン（Miles Laboratories
INC.製、牛−γ−グロブリンFraction ）８
mgと１μｇのエンドトキシン（E.coli O111B4由
来）とを４mlの0.5M食塩含有0.1Mりん酸緩衝液
PH8.5に溶かし、この溶液をイミノ二酢酸結合−
Ｃ＋＋ ｕキレートカラム（樹脂量２ml）に通液した。
このカラムを上記の緩衝液で14mlづつ２回洗浄し
た後、0.5M食塩含有0.1M酢酸緩衝液PH4.5を14ml
通液後、最後に0.5M食塩含有0.1M酢酸溶液14ml
で溶出した。各溶出液についてエンドトキシンと
タンパク質の分析を行なつた所、素通りおよび第
１のPH8.5洗浄区分に殆んどのエンドトキシンが
溶出したが、タンパク質は13％が溶出されたにす
ぎなかつた。第２のPH8.5洗浄区分には残りの数
％のエンドトキシンが溶出されただけで、タンパ
ク質は全く認められなかつた。
INC.製、牛−γ−グロブリンFraction ）８
mgと１μｇのエンドトキシン（E.coli O111B4由
来）とを４mlの0.5M食塩含有0.1Mりん酸緩衝液
PH8.5に溶かし、この溶液をイミノ二酢酸結合−
Ｃ＋＋ ｕキレートカラム（樹脂量２ml）に通液した。
このカラムを上記の緩衝液で14mlづつ２回洗浄し
た後、0.5M食塩含有0.1M酢酸緩衝液PH4.5を14ml
通液後、最後に0.5M食塩含有0.1M酢酸溶液14ml
で溶出した。各溶出液についてエンドトキシンと
タンパク質の分析を行なつた所、素通りおよび第
１のPH8.5洗浄区分に殆んどのエンドトキシンが
溶出したが、タンパク質は13％が溶出されたにす
ぎなかつた。第２のPH8.5洗浄区分には残りの数
％のエンドトキシンが溶出されただけで、タンパ
ク質は全く認められなかつた。
PH4.5の溶出液中には、エンドトキシン不存で
γ−グロブリン26％が回収され、0.1M酢酸溶出
液中にもエンドトキシンは認められず、γ−グロ
ブリン53％が回収された。
γ−グロブリン26％が回収され、0.1M酢酸溶出
液中にもエンドトキシンは認められず、γ−グロ
ブリン53％が回収された。
タンパク質の全回収率は92％であつた。（280n
ｍの紫外部吸光度で測定した）。
ｍの紫外部吸光度で測定した）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ エンドトキシンを含有する有用タンパク質
を、金属イオンと錯体形成能を有する基を結合さ
せた金属キレートクロマトグラフイー担体を使用
して、クロマトグラフイーに付することを特徴と
する有用タンパク質からのエンドトキシンの分離
方法。 ２ クロマトグラフイー担体が、アガロースまた
はセフアデツクスにイミノ二酢酸を結合させたも
のからなり、かつ金属イオンとして、亜鉛または
銅イオンを配位させたものである特許請求の範囲
第１項の記載による分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13703678A JPS5562902A (en) | 1978-11-07 | 1978-11-07 | Separation of endotoxin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13703678A JPS5562902A (en) | 1978-11-07 | 1978-11-07 | Separation of endotoxin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5562902A JPS5562902A (en) | 1980-05-12 |
| JPS6159292B2 true JPS6159292B2 (ja) | 1986-12-16 |
Family
ID=15189342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13703678A Granted JPS5562902A (en) | 1978-11-07 | 1978-11-07 | Separation of endotoxin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5562902A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4569794A (en) * | 1984-12-05 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Process for purifying proteins and compounds useful in such process |
| JP3360315B2 (ja) * | 1992-07-31 | 2002-12-24 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | ヒト血清アルブミンの高度精製方法 |
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-
1978
- 1978-11-07 JP JP13703678A patent/JPS5562902A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5562902A (en) | 1980-05-12 |
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