JP2854872B2 - カブトガニ血球膜由来抗菌性ペプタイドをリガンドとする不溶性担体 - Google Patents
カブトガニ血球膜由来抗菌性ペプタイドをリガンドとする不溶性担体Info
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- JP2854872B2 JP2854872B2 JP1022642A JP2264289A JP2854872B2 JP 2854872 B2 JP2854872 B2 JP 2854872B2 JP 1022642 A JP1022642 A JP 1022642A JP 2264289 A JP2264289 A JP 2264289A JP 2854872 B2 JP2854872 B2 JP 2854872B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細菌性物質、真菌性物質等からなる発熱物
質（パイロジェン、Pyrogen）の除去に関する。
質（パイロジェン、Pyrogen）の除去に関する。
注射剤には発熱物質が含まれていないことが必要で、
日本薬局方では発熱性物質試験の項目を設け製剤中の発
熱物質量を規制している。
日本薬局方では発熱性物質試験の項目を設け製剤中の発
熱物質量を規制している。
これは、発熱物質は極微量で恒温動物の体質を異常に
上昇させる物質であり、直接人体の血液に静脈注射等を
介して混入すると薬剤の主作用とは別個に強い発熱を引
き起こし、過度にこの作用が起こると悪寒戦りつを伴う
発熱や時にはショック死に至ると言われていることによ
る。
上昇させる物質であり、直接人体の血液に静脈注射等を
介して混入すると薬剤の主作用とは別個に強い発熱を引
き起こし、過度にこの作用が起こると悪寒戦りつを伴う
発熱や時にはショック死に至ると言われていることによ
る。
この発熱物質には細菌性物質、炎症性物質、植物糖類
又は血液型物質等が知られているが、これらの中で最も
発熱に関与する物質は細菌性のものであり、細菌毒素と
称されており、一般に外毒素（Exotoxin）及び内毒素
（Endotoxin）に大別されている。これらの毒素のう
ち、グラム陰性菌の細胞壁隣脂質多糖類（Lipopolysacc
haride:LPS）を主とするいわゆるＯ抗原として内毒素が
最も発熱性が強力であり、一度混入すると除去するのが
非常に困難である。
又は血液型物質等が知られているが、これらの中で最も
発熱に関与する物質は細菌性のものであり、細菌毒素と
称されており、一般に外毒素（Exotoxin）及び内毒素
（Endotoxin）に大別されている。これらの毒素のう
ち、グラム陰性菌の細胞壁隣脂質多糖類（Lipopolysacc
haride:LPS）を主とするいわゆるＯ抗原として内毒素が
最も発熱性が強力であり、一度混入すると除去するのが
非常に困難である。
そこで、注射用蒸留水及び注射剤の製造にあたっては
発熱物質の混入を防ぐ種々な努力が払われている。従来
発熱物質の除去法としては物理的に吸着させる方法や化
学的に分解させる方法が用いられていた。このうち物理
的吸着においては、主たる薬剤が分解されるおそれが少
なく、操作法としても簡便である。この物理的吸着法に
は発熱物質吸着体として限界濾過による分離、炭末、イ
オン交換樹脂等が用いられている。しかし、これらの方
法では発熱物質除去には効果的ではなく、使用できたと
しても目的物質の回収率が低かった。
発熱物質の混入を防ぐ種々な努力が払われている。従来
発熱物質の除去法としては物理的に吸着させる方法や化
学的に分解させる方法が用いられていた。このうち物理
的吸着においては、主たる薬剤が分解されるおそれが少
なく、操作法としても簡便である。この物理的吸着法に
は発熱物質吸着体として限界濾過による分離、炭末、イ
オン交換樹脂等が用いられている。しかし、これらの方
法では発熱物質除去には効果的ではなく、使用できたと
しても目的物質の回収率が低かった。
従来の吸着法による発熱物質の分離で使用する吸着体
はその吸着性能に問題があり一操作だけでは完全に発熱
物質を除去することは困難であり、発熱物質を特異的に
吸着するわけのものではなく、主たる薬剤も吸着される
ことが少なくないという欠点があった。特に、血液製
剤、ワクチン、酵素、抗体などのような比較的不安定な
高分子物質からの発熱物質の除去にはあまり効果的では
なく、使用できたとしても目的物質の回収率が著しく低
くなることが多い。とりわけ、遺伝子工学、酵素工学、
細胞工学などのバイオテクノロジーの進展とともに、イ
ンターフェロン、TNF、各種ホルモンなどの遺伝子組替
え技術にとって製造される高分子タンパク質などを薬剤
として開発することが多くなってきたため、パイロジェ
ンの特異的除去の必要性がさらに高まった。
はその吸着性能に問題があり一操作だけでは完全に発熱
物質を除去することは困難であり、発熱物質を特異的に
吸着するわけのものではなく、主たる薬剤も吸着される
ことが少なくないという欠点があった。特に、血液製
剤、ワクチン、酵素、抗体などのような比較的不安定な
高分子物質からの発熱物質の除去にはあまり効果的では
なく、使用できたとしても目的物質の回収率が著しく低
くなることが多い。とりわけ、遺伝子工学、酵素工学、
細胞工学などのバイオテクノロジーの進展とともに、イ
ンターフェロン、TNF、各種ホルモンなどの遺伝子組替
え技術にとって製造される高分子タンパク質などを薬剤
として開発することが多くなってきたため、パイロジェ
ンの特異的除去の必要性がさらに高まった。
本発明はこれらの従来技術の有する課題を解決するも
のである。
のである。
本発明は上記の事情に鑑み検討の結果得られたもので
ある。
ある。
すなわち、本発明はカブトガニの血球膜由来抗菌性ペ
プタイドを直接又はスペーサーを介して担体に結合した
不溶性担体に関し、特に発熱物質の除去に有効である。
プタイドを直接又はスペーサーを介して担体に結合した
不溶性担体に関し、特に発熱物質の除去に有効である。
以下本発明について詳細に説明する。
本発明は、カブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイド
を担体と直接又はスペーサーを介して結合したものであ
る。このペプタイドはカブトガニ、たとえば北米産カブ
トガニ学名Limulus polyphemus,その他学名をTachypleu
s tridentatus,T.gigas,Carcinosorpius roundicauda,
と称する各種のカブトガニの血球膜中に見い出されるも
のである。
を担体と直接又はスペーサーを介して結合したものであ
る。このペプタイドはカブトガニ、たとえば北米産カブ
トガニ学名Limulus polyphemus,その他学名をTachypleu
s tridentatus,T.gigas,Carcinosorpius roundicauda,
と称する各種のカブトガニの血球膜中に見い出されるも
のである。
このカブトガニの血球膜由来の抗菌性ペプタイドに
は、例えばタキプレシンＩ（Tachyplesin I），タキプ
レシンII（Tachyplesin II），ポリヘムシンＩ（Polyph
emusin I），ポリヘムシンII（Polyphemusin II）等の
ペプタイドが含まれる。
は、例えばタキプレシンＩ（Tachyplesin I），タキプ
レシンII（Tachyplesin II），ポリヘムシンＩ（Polyph
emusin I），ポリヘムシンII（Polyphemusin II）等の
ペプタイドが含まれる。
これらのペプタイドに関しては次の文献に記載されて
いる。
いる。
第61回日本生化学大会講演要旨集第874頁（タキプレシ
ンI,II） 特願昭63−244522号、特願昭63−203724号（ポリヘムシ
ンI,II） 次にこれらのペプタイドの構造式を示す。
ンI,II） 特願昭63−244522号、特願昭63−203724号（ポリヘムシ
ンI,II） 次にこれらのペプタイドの構造式を示す。
（式中、と、とは、それぞれ直接に接合してい
る。Arg−NH2は、アルギニンのカルボキシル基がアミド
化されていることを示す。） （式中、と、とは、それぞれ直接に接合してい
る。Arg−NH2は、アルギニンのカルボキシル基がアミド
化されていることを示す。） 式中、と、とは、それぞれ直接に接合してい
る。
る。Arg−NH2は、アルギニンのカルボキシル基がアミド
化されていることを示す。） （式中、と、とは、それぞれ直接に接合してい
る。Arg−NH2は、アルギニンのカルボキシル基がアミド
化されていることを示す。） 式中、と、とは、それぞれ直接に接合してい
る。
式中、と、とは、それぞれ直接に接合してい
る。
る。
（上記４種の構造式のうちArg−NH2は、アルギニンのカ
ルボキシル基がアミド化されていることを示す。） 次に、カブトガニの血球膜由来の抗菌性ペプタイドの
代表例としての上記４種のペプタイドの製法の一例を簡
単に示す。詳細については上記文献に記載されている。
ルボキシル基がアミド化されていることを示す。） 次に、カブトガニの血球膜由来の抗菌性ペプタイドの
代表例としての上記４種のペプタイドの製法の一例を簡
単に示す。詳細については上記文献に記載されている。
ポリフェムシンの製造 北米産カブトガニ（Limulus Polyphemus）の血球に、
塩化ナトリウム及びベンズアミジン塩酸塩を含むトリス
塩酸緩衝液を加え粉砕し、これを遠心して沈澱物を得
る。これに塩酸溶液を加え粉砕し、遠心して上澄を得
る。これをSephadex Ｇ−50カラムに添加して、塩酸溶
液で溶出する。280nmにおける吸光度を測定して集めた
溶出区分を、コスモシール 5C18カラムに添加しアセト
ニトリルの濃度を変化させたトリフルオロ酢酸溶液で溶
出することにより、目的のポリヘムシン画分を得る。ポ
リヘムシンＩとポリヘムシンIIとは溶出時間が相違する
のでこれを利用して分離することができる。
塩化ナトリウム及びベンズアミジン塩酸塩を含むトリス
塩酸緩衝液を加え粉砕し、これを遠心して沈澱物を得
る。これに塩酸溶液を加え粉砕し、遠心して上澄を得
る。これをSephadex Ｇ−50カラムに添加して、塩酸溶
液で溶出する。280nmにおける吸光度を測定して集めた
溶出区分を、コスモシール 5C18カラムに添加しアセト
ニトリルの濃度を変化させたトリフルオロ酢酸溶液で溶
出することにより、目的のポリヘムシン画分を得る。ポ
リヘムシンＩとポリヘムシンIIとは溶出時間が相違する
のでこれを利用して分離することができる。
タキプレシンはポリヘムシンと同様の方法によって製
造することができ、血球抽出物の不溶性画分の塩酸抽出
物からSephadex Ｇ−50、逆相系HPLCによりペプタイド
を精製することによって得られる。
造することができ、血球抽出物の不溶性画分の塩酸抽出
物からSephadex Ｇ−50、逆相系HPLCによりペプタイド
を精製することによって得られる。
これらのペプタイドはこのようにカブトガニの血球膜
から得ることができるが、化学的合成法によっても製造
できることは言うまでもない。
から得ることができるが、化学的合成法によっても製造
できることは言うまでもない。
本発明において使用される担体は、直接又はスペーサ
ーを介してカブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドと
結合することができ、しかもこのペプタイドの活性を害
しない担体であればどのような材質のものでも使用でき
ることは言うまでもない。この担体の選択は、いわゆる
周知技術に基づいて行なうことができる。本発明の担体
として使用できる材料の代表例としては、デキストラ
ン、ポリアクリルアミド、アガロースゲル、架橋アガロ
ースゲル、デキストラン誘導体ゲル、多孔質ガラス、ポ
リスチレンゲル、ポリビニル、ポリスチレン、ポリアク
リルアミドなどを挙げることができる。
ーを介してカブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドと
結合することができ、しかもこのペプタイドの活性を害
しない担体であればどのような材質のものでも使用でき
ることは言うまでもない。この担体の選択は、いわゆる
周知技術に基づいて行なうことができる。本発明の担体
として使用できる材料の代表例としては、デキストラ
ン、ポリアクリルアミド、アガロースゲル、架橋アガロ
ースゲル、デキストラン誘導体ゲル、多孔質ガラス、ポ
リスチレンゲル、ポリビニル、ポリスチレン、ポリアク
リルアミドなどを挙げることができる。
本発明において、担体とカブトガニの血球由来抗菌性
ペプタイドとを結合するにあたっては、両者を直接結合
しても良いし、またスペーサーを介して結合しても良
い。そして、スペーサーを介して結合した場合は、内毒
素（Endotoxin）の水不溶性担体への吸着性が更に高め
られた。スペーサーを介して両者を結合するにあたって
は、スペーサーが担体とカブトガニの血球膜由来抗菌性
ペプタイドとの両方に結合力を有すること、しかもスペ
ーサーがペプタイドの活性を害することがないことの性
質を有していればよいことは言いまでもない。このスペ
ーサーとしては、いわゆる周知技術に基づいて選択でき
るが、好ましい例としては、次の構造式で示されるもの
が挙げられる。
ペプタイドとを結合するにあたっては、両者を直接結合
しても良いし、またスペーサーを介して結合しても良
い。そして、スペーサーを介して結合した場合は、内毒
素（Endotoxin）の水不溶性担体への吸着性が更に高め
られた。スペーサーを介して両者を結合するにあたって
は、スペーサーが担体とカブトガニの血球膜由来抗菌性
ペプタイドとの両方に結合力を有すること、しかもスペ
ーサーがペプタイドの活性を害することがないことの性
質を有していればよいことは言いまでもない。このスペ
ーサーとしては、いわゆる周知技術に基づいて選択でき
るが、好ましい例としては、次の構造式で示されるもの
が挙げられる。
（２） −CH2−NH− （３） −CH2CH2−NH− 〔実施例１〕 （１） セファロースCL−6B（ファルマシア社製の商
品） 30g（湿重量）を1M食塩水、次いで水で充分洗浄
後、水45mlに懸濁し、懸濁液に2N水酸化ナトリウム水溶
液19.5ml及びエピクロロヒドリン4.5mlを加え40℃で２
時間撹拌する。反応終了後、混合物をろ過し、残査を水
で洗浄することによりエポキシ−セファロースCL−6Bを
得る。得られたエポキシセファロースCL−6Bを0.625％
ヘキサメチレンジアミンの水溶液120mlに懸濁し、60℃
で２時間撹拌する。反応終了後、混合物をろ過し、残査
を水で洗浄することによりアミノヘキシル−セァロース
CL−6B32.8g（湿重量）を得る。セファロースのアミノ
ヘキシル基の含量を滴定により求めたところ約65μmole
/g（湿重量）であった。
品） 30g（湿重量）を1M食塩水、次いで水で充分洗浄
後、水45mlに懸濁し、懸濁液に2N水酸化ナトリウム水溶
液19.5ml及びエピクロロヒドリン4.5mlを加え40℃で２
時間撹拌する。反応終了後、混合物をろ過し、残査を水
で洗浄することによりエポキシ−セファロースCL−6Bを
得る。得られたエポキシセファロースCL−6Bを0.625％
ヘキサメチレンジアミンの水溶液120mlに懸濁し、60℃
で２時間撹拌する。反応終了後、混合物をろ過し、残査
を水で洗浄することによりアミノヘキシル−セァロース
CL−6B32.8g（湿重量）を得る。セファロースのアミノ
ヘキシル基の含量を滴定により求めたところ約65μmole
/g（湿重量）であった。
（２） アミノヘキシル−セファロースCL−6B6g（湿重
量）を0.05Mリン酸緩衝液（pH7.0）15.2mlに懸濁し、懸
濁液に25％グルタルアルデヒド水溶液6.4mlを加えて室
温で２時間撹拌後、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で充分
洗浄する。残査を15mMポリヘムシン−0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.0）20.0mlに懸濁し、懸濁液にソジウムボロヒド
リド100mlを加え室温で１時間撹拌する。反応終了後、
混合物をろ過し、残査を1M食塩水及び水で充分洗浄す
る。
量）を0.05Mリン酸緩衝液（pH7.0）15.2mlに懸濁し、懸
濁液に25％グルタルアルデヒド水溶液6.4mlを加えて室
温で２時間撹拌後、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で充分
洗浄する。残査を15mMポリヘムシン−0.1Mリン酸緩衝液
（pH7.0）20.0mlに懸濁し、懸濁液にソジウムボロヒド
リド100mlを加え室温で１時間撹拌する。反応終了後、
混合物をろ過し、残査を1M食塩水及び水で充分洗浄す
る。
かくして式 で示されるリガンド結合多糖類6.0g（湿重量）が得られ
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り11.2μ
moleであった。
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り11.2μ
moleであった。
〔実施例２〕 （１） セルロース90g（湿重量）を1N水酸化ナトリウ
ム水溶液900mlに懸濁し、懸濁液にエピクロロヒドリン1
00mlを加え60℃で30分間撹拌する。反応終了後、反応混
合物に氷水を加えてろ過し、残査を水で洗浄することに
より、エポキシ活性化セルロース82g（湿重量）を得
る。エポキシ活性化セルロース82g（湿重量）に0.625％
ヘキサメチレンジアミン水溶液400mlを加え60℃で２時
間撹拌する。反応終了後、混合物をろ過し、残査を水で
洗浄することによりアミノヘキシル−セルロース78g
（湿重量）を得る。セルロースのアミノヘキシル基の含
量を滴定により求めたところ約69.4mole/g（湿重量）で
あった。
ム水溶液900mlに懸濁し、懸濁液にエピクロロヒドリン1
00mlを加え60℃で30分間撹拌する。反応終了後、反応混
合物に氷水を加えてろ過し、残査を水で洗浄することに
より、エポキシ活性化セルロース82g（湿重量）を得
る。エポキシ活性化セルロース82g（湿重量）に0.625％
ヘキサメチレンジアミン水溶液400mlを加え60℃で２時
間撹拌する。反応終了後、混合物をろ過し、残査を水で
洗浄することによりアミノヘキシル−セルロース78g
（湿重量）を得る。セルロースのアミノヘキシル基の含
量を滴定により求めたところ約69.4mole/g（湿重量）で
あった。
（２） アミノヘキシル−セルロース6g（湿重量）を0.
05Mリン酸緩衝液（pH7.0）15.2mlに懸濁し、懸濁液に25
％グルタルアルデヒド水溶液6.4mlを加えて室温で２時
間撹拌後、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で充分洗浄す
る。残査を15mMポリヘムシン−0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）20.0mlに懸濁し、室温で24時間撹拌する。反応終了
後、混合物をろ過し、残査を1M食塩水及び水で充分洗浄
する。残査を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）10mlに懸濁
し、この懸濁液にソジウムボロヒドリド100mlを加え、
室温にて１時間撹拌する。反応終了後、混合物をろ過
し、残査を1M食塩水及び水で充分洗浄する。
05Mリン酸緩衝液（pH7.0）15.2mlに懸濁し、懸濁液に25
％グルタルアルデヒド水溶液6.4mlを加えて室温で２時
間撹拌後、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）で充分洗浄す
る。残査を15mMポリヘムシン−0.1Mリン酸緩衝液（pH7.
0）20.0mlに懸濁し、室温で24時間撹拌する。反応終了
後、混合物をろ過し、残査を1M食塩水及び水で充分洗浄
する。残査を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）10mlに懸濁
し、この懸濁液にソジウムボロヒドリド100mlを加え、
室温にて１時間撹拌する。反応終了後、混合物をろ過
し、残査を1M食塩水及び水で充分洗浄する。
かくして式 で示されるリガンド結合多糖類2.0g（湿重量）が得られ
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り11.2μ
moleであった。
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り11.2μ
moleであった。
〔実施例３〕 ４％アガロースゲル100mlをブフナー漏斗で10倍容の
水で洗浄後、ビーカーに移し等容の水を加える。温度計
とガラス電極を浸しスターラーで撹拌する。ゲル1mg当
り300mgの臭化シアンを添加する。pHが低下し始めた
ら、2N NaOHを添加して11に保つ。10から20分後にpH低
下が遅くなる。漏斗に移し、吸引しつつ急速に10倍容の
0.1Mホウ酸緩衝液（pH9.0）で洗浄後、ビーカーに0.1M
ホウ酸緩衝液（pH9.0）でポリヘムシン100μmole/mlに
調製した溶液を100mlとり、ゲルを加え、20分間振とう
する。ゲルを10倍容の水で洗浄し、1Mになるようにエタ
ノールアミン溶液（pH8）を加え１時間撹拌する。反応
終了後、混合物をろ過し、残査を1M食塩水及び水で充分
洗浄する。かくして式 で示されるリガンド結合多糖類80g（湿重量）が得られ
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り13.2μ
moleであった。
水で洗浄後、ビーカーに移し等容の水を加える。温度計
とガラス電極を浸しスターラーで撹拌する。ゲル1mg当
り300mgの臭化シアンを添加する。pHが低下し始めた
ら、2N NaOHを添加して11に保つ。10から20分後にpH低
下が遅くなる。漏斗に移し、吸引しつつ急速に10倍容の
0.1Mホウ酸緩衝液（pH9.0）で洗浄後、ビーカーに0.1M
ホウ酸緩衝液（pH9.0）でポリヘムシン100μmole/mlに
調製した溶液を100mlとり、ゲルを加え、20分間振とう
する。ゲルを10倍容の水で洗浄し、1Mになるようにエタ
ノールアミン溶液（pH8）を加え１時間撹拌する。反応
終了後、混合物をろ過し、残査を1M食塩水及び水で充分
洗浄する。かくして式 で示されるリガンド結合多糖類80g（湿重量）が得られ
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り13.2μ
moleであった。
〔実施例４〕 凍結乾燥品AF−トレシルトヨパール650を蒸留水で膨
潤し水洗する。蒸留水で洗浄したゲルを湿重量5g計りと
る。ポリヘムシン0.15gを0.5M NaCl,0.1Mリン酸バッフ
ァー（pH7.0）30mlに溶解する。この溶液にゲルを加
え、４℃で一夜撹拌する。反応終了後、1.0M NaCl溶液
で洗浄し、さらに、過剰の活性基をブロッキングするた
め、0.5M NaCl0.1M Tris−HCl（pH8.0）50mlで25℃、一
時間反応させる。
潤し水洗する。蒸留水で洗浄したゲルを湿重量5g計りと
る。ポリヘムシン0.15gを0.5M NaCl,0.1Mリン酸バッフ
ァー（pH7.0）30mlに溶解する。この溶液にゲルを加
え、４℃で一夜撹拌する。反応終了後、1.0M NaCl溶液
で洗浄し、さらに、過剰の活性基をブロッキングするた
め、0.5M NaCl0.1M Tris−HCl（pH8.0）50mlで25℃、一
時間反応させる。
かくして式 で示されるリガンド結合多糖類80g（湿重量）が得られ
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り12.0μ
moleであった。
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り12.0μ
moleであった。
〔実施例５〕 エポキシ活性化セファロース6B乾燥粉末1gを蒸留水で
膨潤して湿重量3.0mlを測りとる。ポリヘムシン0.15gを
0.5M NaCl,0.1Mリン酸バッファー（pH7.0）30mlに溶解
する。この溶液にゲルを加え、25℃で16時間ウォーター
バスの中のシェーカー内で反応させる。反応終了後、0.
5M NaCl,0.1Mリン酸バッファー（pH7.0）で過剰のリガ
ンドを洗浄し、0.1M炭酸バッファー（pH8.0）,0.1M酢酸
バッファー（pH4.0）で交互に洗浄し、1Mエタノールア
ミンに一晩放置し活性基をブロッキングする。
膨潤して湿重量3.0mlを測りとる。ポリヘムシン0.15gを
0.5M NaCl,0.1Mリン酸バッファー（pH7.0）30mlに溶解
する。この溶液にゲルを加え、25℃で16時間ウォーター
バスの中のシェーカー内で反応させる。反応終了後、0.
5M NaCl,0.1Mリン酸バッファー（pH7.0）で過剰のリガ
ンドを洗浄し、0.1M炭酸バッファー（pH8.0）,0.1M酢酸
バッファー（pH4.0）で交互に洗浄し、1Mエタノールア
ミンに一晩放置し活性基をブロッキングする。
かくして式 で示されるリガンド結合多糖類80g（湿重量）が得られ
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り14.0μ
moleであった。
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り14.0μ
moleであった。
〔実施例６〕 Activated CH−Sepharose4B乾燥粉末1gを1mM HClで膨
潤して湿重量3.0mlを測りとる。ポリヘムシン0.15gを0.
1M NaHCO3（pH8.0）30mlに溶解する。
潤して湿重量3.0mlを測りとる。ポリヘムシン0.15gを0.
1M NaHCO3（pH8.0）30mlに溶解する。
この溶液にゲルを加え、25℃で１時間ウォーターバス
中のシェーカー内で反応させる。反応終了後、0.5M NaC
l,0.05M Tris−HCl（pH8.0）,0.5M NaCl0.05Mギ酢酸バ
ッファー（pH4.0）で交互に洗浄し、1Mエタノールアミ
ンに一晩放置し活性基をブロッキングする。
中のシェーカー内で反応させる。反応終了後、0.5M NaC
l,0.05M Tris−HCl（pH8.0）,0.5M NaCl0.05Mギ酢酸バ
ッファー（pH4.0）で交互に洗浄し、1Mエタノールアミ
ンに一晩放置し活性基をブロッキングする。
かくして式 で示されるリガンド結合多糖類80g（湿重量）が得られ
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り14.0μ
moleであった。
る。本品のポリヘムシン含量は1g（湿重量）当り14.0μ
moleであった。
実施例１で調製したリガンド結合多糖類8mlを1.5M食
塩水で洗浄した後、内径13mm、長さ100mmの滅菌したカ
ラムに充填し、パイロジェンを含まない1.5M食塩水250m
l、注射用蒸留水100ml、0.05M食塩水100mlで順次洗浄し
たこのカラムに各種細菌由来のパイロジェン100μｇを
それぞれ0.05M食塩水100mlに溶解した溶液をsv＝12の流
速で流下した。流出液について、パイロジェン濃度の測
定をトキシカラー（生化学工業）及びリムラスHSテスト
（和光純薬）を行った。また真菌に対しても同様の測定
を行った。その結果は下記の第一表の通りである。
塩水で洗浄した後、内径13mm、長さ100mmの滅菌したカ
ラムに充填し、パイロジェンを含まない1.5M食塩水250m
l、注射用蒸留水100ml、0.05M食塩水100mlで順次洗浄し
たこのカラムに各種細菌由来のパイロジェン100μｇを
それぞれ0.05M食塩水100mlに溶解した溶液をsv＝12の流
速で流下した。流出液について、パイロジェン濃度の測
定をトキシカラー（生化学工業）及びリムラスHSテスト
（和光純薬）を行った。また真菌に対しても同様の測定
を行った。その結果は下記の第一表の通りである。
リムラスHSシングルテスト：試料溶液を0.2ml加え、3
7℃で60分保温後、静かに180゜転倒し、内容物が凝固し
て変形しない場合を陽性（＋）、それ以外の場合を陰性
（−）とする。
7℃で60分保温後、静かに180゜転倒し、内容物が凝固し
て変形しない場合を陽性（＋）、それ以外の場合を陰性
（−）とする。
また、真菌に関してCandida albicans100μｇを0.05M
食塩水100mlに溶解した溶液を上記と同様の操作を行
い、β−グルカンに対する特異性の高いライセート（特
願昭63−292494参照）を調製し、定量した結果検出限界
以下であった。
食塩水100mlに溶解した溶液を上記と同様の操作を行
い、β−グルカンに対する特異性の高いライセート（特
願昭63−292494参照）を調製し、定量した結果検出限界
以下であった。
本発明の発熱物質を特異的に吸着するペプタイドをリ
ガンドとした不溶性担体は発熱物質除去用吸着体として
有用であり、この吸着担体は広範囲のグラム陰性細菌及
びグラム陽性細菌に対して結合性が有し、細菌性物質を
完全に除去できる。また真菌類（例えばCandida albica
ns等）に対しても結合性を有しているので人体に対して
有毒を産生する真菌類をも除去できる。
ガンドとした不溶性担体は発熱物質除去用吸着体として
有用であり、この吸着担体は広範囲のグラム陰性細菌及
びグラム陽性細菌に対して結合性が有し、細菌性物質を
完全に除去できる。また真菌類（例えばCandida albica
ns等）に対しても結合性を有しているので人体に対して
有毒を産生する真菌類をも除去できる。
すなわち、発熱物質を含むアミノ酸（例えばヒスチジ
ン、アラニン）、核酸（例えばシトシン）抗生物質（例
えばペニシリン）、ホルモン（例えばインスリン）、ビ
タミン（例えばフラビン）血清タンパク質（例えばアル
ブミン）、抗体（例えばイムムグロブリン）、酵素（例
えばウロキナーゼ）等の生理活性物質から発熱物質を除
去するために使用することができる。特に発熱物質を含
まない水を調製するために好適である。
ン、アラニン）、核酸（例えばシトシン）抗生物質（例
えばペニシリン）、ホルモン（例えばインスリン）、ビ
タミン（例えばフラビン）血清タンパク質（例えばアル
ブミン）、抗体（例えばイムムグロブリン）、酵素（例
えばウロキナーゼ）等の生理活性物質から発熱物質を除
去するために使用することができる。特に発熱物質を含
まない水を調製するために好適である。
フロントページの続き (72)発明者 木村 省二 東京都中央区月島３―２―９ 大洋漁業 株式会社大洋研究所内 (56)参考文献 特開 昭60−126227（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−53799（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−152987（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂ．Ｃ．，ｖｏｌ．263，Ｎｏ. 32，ｐ．16709−16713（1988) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 17/00 - 17/14 C07K 7/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】次式で表される、ポリヘムシンＩ（Polyph
emusin I）を担体に結合したことを特徴とする水不溶性
担体。 （式中、と、とは、それぞれ直接に接合してい
る。Arg−NH2は、アルギニンのカルボキシル基がアミド
化されていることを示す。） - 【請求項２】次式で表される、ポリヘムシンII（Polyph
emusin II）を担体に結合したことを特徴とする水不溶
性担体。 （式中、と、とは、それぞれ直接に接合してい
る。Arg−NH2は、アルギニンのカルボキシル基がアミド
化されていることを示す。） - 【請求項３】ペプタイドをスペーサーを介して担体に結
合した請求項（１）または（２）に記載の水不溶性担
体。 - 【請求項４】担体がアガロースであることを特徴とする
請求項（１）ないし（３）のいずれかに記載の水不溶性
担体。 - 【請求項５】担体がセルロースであることを特徴とする
請求項（１）ないし（３）のいずれかに記載の水不溶性
担体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1022642A JP2854872B2 (ja) | 1989-02-02 | 1989-02-02 | カブトガニ血球膜由来抗菌性ペプタイドをリガンドとする不溶性担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1022642A JP2854872B2 (ja) | 1989-02-02 | 1989-02-02 | カブトガニ血球膜由来抗菌性ペプタイドをリガンドとする不溶性担体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02204500A JPH02204500A (ja) | 1990-08-14 |
| JP2854872B2 true JP2854872B2 (ja) | 1999-02-10 |
Family
ID=12088501
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1022642A Expired - Fee Related JP2854872B2 (ja) | 1989-02-02 | 1989-02-02 | カブトガニ血球膜由来抗菌性ペプタイドをリガンドとする不溶性担体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2854872B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0598903B1 (en) * | 1991-03-14 | 1997-08-27 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | (1-3)-beta-d-glucan assaying agent |
| US5488035A (en) * | 1991-12-06 | 1996-01-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Peptide with inhibitory activity towards plant pathogenic fungi |
| DE69211973T2 (de) * | 1991-12-25 | 1996-12-19 | Maruha Corp | Reagenzien und Verfahren zur Bestimmung von Beta-Glucanen |
| WO2003089455A2 (en) | 2002-04-22 | 2003-10-30 | Dow Global Technologies Inc. | Low-cost production of peptides |
-
1989
- 1989-02-02 JP JP1022642A patent/JP2854872B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂ．Ｃ．，ｖｏｌ．２６３，Ｎｏ．３２，ｐ．１６７０９−１６７１３（１９８８） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02204500A (ja) | 1990-08-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |