JPH02204500A

JPH02204500A - カブトガニ血球膜由来抗菌性ペプタイドをリガンドとする不溶性担体

Info

Publication number: JPH02204500A
Application number: JP2264289A
Authority: JP
Inventors: Isayoshi Tsuboi; 五三美坪井; Takashi Kitagawa; 剛史北川; Hiroshi Nakajima; 浩中島; Seiji Kimura; 木村　省二
Original assignee: Taiyo Fishery Co Ltd
Current assignee: Maruha Nichiro Corp
Priority date: 1989-02-02
Filing date: 1989-02-02
Publication date: 1990-08-14
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: JP2854872B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、細菌性物質、真菌性物質等からなる発熱物質
（パイロジエン、Ｐｙｒｏｇｅｎ）の除去に関する。

〔従来の技術〕

注射剤には発熱物質が含まれていないことが必要で、日
本薬局方では発熱性物質試験の項目を設は製剤中の発熱
物質量を規制している。

これは、発熱物質は極微量で恒温動物の体質を異常に上
昇させる物質であり、直接人体の血液に静脈注射等を介
して混入すると薬剤の主作用とは別個に強い発熱を引き
起こし、過度にこの作用が起こると悪寒戦りつを伴う発
熱や時にはショック死に至ると言われていることによる
。

この発熱物質には細菌性物質、炎症性物質、植物糖類又
は血液型物質等が知られているが、これらの中で最も発
熱に関与する物質は細菌性のものであり、細菌毒素と称
されており、一般に外毒素（Ｅｘｏｔｏｘｉｎ）及び内
毒素（Ｅｎｄｏ　ｔｏｘ　ｉｎ）に大別されている。こ
れらの毒素のうち、ダラム陰性菌の細胞壁隔脂質多糖類
（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｔｄｅ：ＬＰＳ）を
主とするいわゆる０抗原として内毒素が最も発熱性が強
力であり、−度混入すると除去するのが非常に困難であ
る。

そこで、注射用蒸留水及び注射剤の製造にあたっては発
熱物質の混入を防ぐ種々な努力が払われている。従来発
熱物質の除去法とし２ては物理的に吸着させる方法や化
学的に分解させる方法が用いられていた。この・うち物
理的吸着においては、主たる薬剤が分解されるおそれが
少なく、操作法としても簡便である。この物理的吸着法
には発熱物質吸着体として限界濾過による分離、炭末、
イオン交換樹脂等が用いられている。し７かし、こ４１
らの方法では発熱物質除去には効果的ではなく、使用で
きたと（−７でも目的物質の回収率が低かった。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来の吸着法による発熱物質の分離で使用する吸着体は
その吸着性能に問題があり一操作だけでは完全に発熱物
質を除去することは困難であり、発熱物質を特異的に吸
着するわけのものではなく、主たる薬剤も吸着されるこ
とが少なくないという欠点があった。特に、血液製剤、
ワクチン、酵素、抗体などのような比較的不安定な高分
子Ｔｈ１ｆからの発熱物質の除去にはあまり効果的では
なく、使用できたとしても目的物質の回収率が著しく低
くなることが多い。とりわけ、遺伝子工学、酵素工学、
細胞工学などのバイオテクノロジーの進展とともに、イ
ンターフェロン、Ｔ　Ｎ　Ｆ、各種ホルモンなどの遺伝
子組替え技術にとって製造される高分子タンパク質など
を薬剤と１．て開発することが多くなってきたため、４
パイロジ覧ンの特異的除去の必要性がざらに高まった。

本発明はこれらの従来技術の有する課題を解決するもの
である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は上記の事情（５こ鑑み検討の結果得られたもの
である。

すなわち、本発明はカブトガニの血球膜由来抗菌性ペプ
タイドを直接又はスペーサーを介して担体に結合した不
溶性担体に関し７、特に発熱物質の除去に有効である。

以下本発明について詳細に説明する。

本発明は、カブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドを
担体と直接又はスペーサーを介して結合したものである
。このペプタイドはカブトガニ、たとえば北米産カブト
ガニ学名Ｌｉｍｕｌｕｓｐｏｌｙｐｈｅ＋＋ｕｓ、その
他学名をＴａｅｈｐｌｅｕｓ　ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ
、Ｔ。

ｇｉｇａｓ、Ｃａｒｃｉｎｏｓｏｒｐｉｕｓ　ｒｏｕｎ
ｄｉｅａｕｄａ＋　と称する各種のカブトガニの血球膜
中に見い出されるものである。

このカブトガニの血球膜由来の抗菌性ペプタイドには、
例えばタキプレシンＩ　（Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ　１
　）　＋タキプレシンＩＩ　（Ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ
　ＩＩ　）＋ポリヘムシンＩ（Ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉ
ｎ　Ｉ　）＋ポリヘムシンＩ［（Ｐｏｌｙｐｈｅｓｉｕ
ｓｉｎ■）等のペプタイドが含まれる。

これらのペプタイドに関しては次の文献に記載されてい
る。

第６１回日本生化学大会講演要旨隼第８７４頁（タキプ
レシン１．　　ＩＩ）特願昭６３−２４４５２２号、特願昭６３−２０３７２
４号（ポリヘムシン１．　　ＩＩ）次にこれらのペプタイドの構造式を示す。

〔タキプレシン■〕

（式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に接合してい
る。　Ａｒｇ−ＮＨ，は、アルギニンのカルボキシル基
がアミドであることを示す。）〔タキプレシン■〕（式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に接合してい
る。＾ｒｇ−ＮＨ，は、アルギニンのカルボキシル基が
アミドであることを示す、、）〔ポリヘムシンＩ〕式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に接合している
。

〔ポリヘムシン■〕

式中、■と■、■と■は、それぞれ直接に接合している
。

（上記４種の構造式のうちＡｒｇ−ＮＨ，は、アルギニ
ンのカルボキシル基がアミドであることを示す。）次に
、カブトガニの血球膜由来の抗菌性ペブタイドの代表例
としての上記４種のペプタイドの製法の一例を簡単に示
す、詳細については上記文献に記載されている。

ポリフェムシンの製造北米産カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ　　ｏｌ　　ｈｅｍ
ｕｓ）の血球に、塩化ナトリウム及びベンズアミジン塩
酸塩を含むトリス塩酸緩衝液を加え粉砕し、これを遠心
して沈澱物を得る。これに塩酸溶液を加え粉砕し、遠心
して上澄を得る。これを５ｅｐｈａｄｅｘ　＠　Ｇ−５
０カラムに添加して、塩酸溶液で溶出する。　２８０ｎ
ｍにおける吸光度を測定して集めた溶出区分を、コスモ
シール８５Ｃ１８カラムに添加しアセトニトリルの濃度
を変化させたトリフルオロ酢酸溶液で溶出することによ
り、目的のポリヘムシン画分を得る。ポリフェムシンＩ
とポリヘムシン■とは溶出時間が相違するのでこれを利
用して分離することができる。

タキプレシンはボリフェムシンと同様の方法によって製
造することができ、血球抽出物の不溶性画分の塩酸抽出
物から５ｅｐｈａｄｅｘ　＠　Ｇ−５０、逆相系ＨＰＬ
Ｃによりペプタイドを精製することによって得られる。

これらのペプタイドはこのようにカブトガニの血球膜か
ら得ることができるが、化学的合成法によっても製造で
きることば言うまでもない。

本発明において使用される担体は、直接又はスペーサー
を介してカブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドと結
合することができ、しかもこのペプタイドの活性を害し
ない担体であればどのような材質のものでも使用できる
ことは言うまでもない。この担体の選択は、いわゆる周
知技術に基づいて行なうことができる。本発明の担体と
して使用できる材料の代表例としては、デキストラン、
ポリアクリルアミド、アガロースゲル、架橋アガロース
ゲル、デキストラン誘導体ゲル、多孔質ガラス、ポリス
チレンゲル、ポリビニル、ポリスチレン、ポリアクリル
アミドなどを挙げることができる。

本発明において、担体とカブトガニの血球由来抗菌性ペ
プタイドとを結合するにあたっては、両者を直接結合し
ても良いし、またスペーサーを介して結合し、でも良い
。そして、スペーサーを介して結合した場合は、内毒素
（Ｅｎｄｏ　ｔｏｘ　ｉｔ＋）の水不溶性担体への吸着
性が更に高められた。スベ・−サーを介して両者を結合
するにあたっては、スペーサーが担体とカブトガニの血
球膜由来抗菌性ペプタイドとの両方に結合力を有するこ
と、しかもスペーサーがペプタイドの活性を害すること
がないことの性質を有し２ていればよいことは言うまで
もない。このスペーサーとしては、いわゆる周知技術に
基づいて選択できるが、好ましい例としては、次の構造
式で示されるものが挙げられる。

（１）　　−０ＣＲよ−Ｃ）Ｉ−ＣＨＪＨ（ＣＩ（ｚ）
ＪＨ（Ｃｔｌｚ）ｓＮＨＨ（２）　　−ＣＨｇ−ＮＨ− （３）　　−ＣＨｚ（［ｔ−ＮＨ− （４）　　−（ＣＨｚ）　５−Ｃ−Ｎ）Ｉ−〔実施例１
〕（１）　　セファロースＣＬ−６８（ファルマシア社製
の商品）３０ｇ　（湿重量）を１Ｍ食塩水、次いで水で
充分洗浄後、水４５ｍ１に懸濁し、懸濁液に２Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液１９゜５！１２及びエビクロロヒドリ
ン４，５−を加え４０℃で２時間攪拌する。反応終了後
、混合物をろ過し、残香を水で洗浄することによりエポ
キシ−セファロースＣＬ−６Ｂを得る。得られたエポキ
シセファロースＣＬ−６Ｂを０．６２５％へキサメチレ
ンジアミンの水溶液１２０ｄに懸濁し、６０’Ｃで２時
間攪拌する。反応終了後、混合物をろ過し、残香を水で
洗浄することによりアミノヘキシルーセアロースＣＬ−
６Ｂ　３２．８ｇ（湿重量）を得る。セファロースのア
ミノへキシル基の含量を滴定により求めたところ約６５
μｍｏｌｅ／ｇ　（湿重量）であった。

（２）　　アミノヘキシル−セファロースＣＬ−６８６
ｇ　（湿重量）を０．０５Ｍリン酸緩衝液ｃｐ　Ｈ７，
０）　１５．２滅に懸濁し、懸濁液に２５％グルタルア
ルデヒド水溶液６、４７を加えて室温で２時間攪拌後、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で充分洗浄する。

残香を１５ｍＭポリヘムシン−０，１Ｍリン酸緩衝液（
ｐｉ−Ｔ７．０）２０．０Ｉｌｌｅに懸濁し、懸濁液に
ソジウムボロヒドリド１００ｄを加え室温で１時間攪拌
する。反応終了後、混合物をろ過し、残香を１Ｍ食塩水
及び水で充分洗浄する。

ＨＲ：フルギニン　１トリヅト７７ン　Ｃニジスティン　
Ｆ：フェ：ルアラニ〉　ｖ：バリンＹ：チＵシン　Ｇニ
ゲリシン　Ｋ：リシンで示されるリガンド結合子ｔｉ類
６．０ｇ（湿重量）が得られる。本島のポリヘムシン含
量はＩｇ（湿重量）当り１１．２μｍｏｌｅであった。

〔実施例２〕（１）セルロース９０ｇ（湿重量）をＩＮ水酸化すＦ・
リウム水溶液９００ｍ１に懸濁し、懸濁液にエビクロロ
ヒドリンｉｏｏｍｌを加え６０”Ｃで３０分間攪拌する
。反応終了後、反応混合物に氷水を加えてろ過し２、残
香を水で洗浄することにより、エポキシ活性化セルロー
ス８２ｇ（湿重量）を得る。エポキシ活性化セルロース
８２ｇ　（湿Ｍ　ｉ　）に０．６２５％へキザメチレン
ジアミン水溶液４００ｄを加え６０″Ｃで２時間攪拌す
る。反応終了後、混合物をろ過し、残金を水で洗浄する
ことによりアミノヘキシル−セファロースＣＬ−６Ｂ　
７８ｇ（湿重量）を得る。セファロースのアミノへキシ
ル基の含量を滴定により求めたところ約６９．４　ｐ　
ｍｏｌｅ／ｇ　（湿重量）であった。

（２）アミノヘキシル−セファロースＣＬ−６８６ｇ　
（湿重量）を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）１
５．２１１に懸濁し、懸濁液に２５％グルタルアルデヒ
ド水溶液６．４−を加えて室温で２時間攪拌後、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞で充分洗浄する。残金を
１５ｍＭポリヘムシン−０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ
７，０）　２０．０ｄに懸濁し７、室温で２４時間攪拌
する。反応終了後、混合物をろ過し、残金を１Ｍ食塩水
及び水で充分洗浄する。残金を０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，０）１０ｍｌに懸濁し、この懸濁液にソジウム
ボロヒドリド１００−を加え、室温にて１時間攪拌する
。反応終了後、混合物をろ過し、残金を１Ｍ食塩水及び
水で充分洗浄する。

ＨＲ：アルギニン　Ｗニトリブトファン　Ｃニジスティン
　Ｆ：７エニルアラニン　Ｖ：バリンＹ：チ■シン　Ｇ
ニゲリシン　Ｋ：リシンで示されるリガンド結合多糖類
２．０ｇ（湿重量）が得られる。本島のポリヘムシン含
量はＩｇ（湿重量）当り１１．２μ＋＊ｏｌｅであった
。

〔実施例３〕４％アガロースゲル１００ｄをブフナー漏斗で１０倍賽
の水で洗浄後、ビーカーに移し等容の水を加える。温度
計とガラス電極を浸しスターラーで攪拌する。ゲルｌｌ
ｌＩｇ当り３００１１１ｇの臭化シアンを添加する。ｐ
Ｈが低下し始めたら、２ＮＮａＯＨを添加して１１に保
つ。１０から２０分後にｐＨ低下が遅くなる。

漏斗に移し、吸引しつつ急速に１０倍賽の０．１Ｍホウ
酸緩衝液（ｐＨ９，０）テ洗浄後、ビーカーニ０．１　
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ９，０）でポリヘムシン１００　
ｐ　ｍｏｌｅ／ｄに調製した溶液を１００ｏｊ！とり、
ゲルを加え、２０分間振とうする。ゲルを１０倍賽の水
で洗浄し、ＩＭになるようにエタノールアミン溶液（ｐ
Ｈ８）を加え１時間攪拌する。反応終了後、混合物をろ
過し、残金を１Ｍ食塩水及び水で充分洗浄する。

かくして式湿重量５ｇ計りとる。ポリヘムシン０．１５ｇを０．５
？ｌＮａＣ１，０，１Ｍリン酸バッファー　（ｐＨ７，
０）　３０−に溶解する。この溶液にゲルを加え、４°
Ｃで一夜攪拌する。反応終了後、１．ＯＭ　ＮａＣ１溶
液で洗浄し、さらに、過剰の活性基をブロッキングする
ため、０．５Ｍ　ＮａＣｌ　０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩ
ＣＩ（ｐＨ８，０）　５０ｄで２５°Ｃ１−時間反応さ
せる。

かくして式Ｒ：アルギニン　−二トリブトファン　Ｃニジスティン
　Ｆ：フェニルアラニン　Ｖ：バリシＹ：チ■シン　Ｇ
ニゲリシン　Ｋ：リシンで示されるリガンド結合子１１
！類８０ｇ（湿重量）が得られる。本島のポリヘムシン
含量はＩｇ（湿重量）当り１３．２７／　ｍｏｌｅであ
った・〔実施例４〕凍結乾燥品ＡＰ−１−レシルトヨバール６５０を蒸留水
で膨潤し水洗する。蒸留水で洗浄したゲルをで示される
リガンド結合多糖類８０ｇ（湿重量）が得られる。本島
のポリヘムシン含量はＩｇ（湿重量）当り１２．０μｍ
ｏｌｅであった。

〔実施例５〕Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ
　６Ｂ乾燥粉末１ｇを蒸留水で膨潤して湿重量３．ＯＩ
ｄを測りとる。ポリヘムシン０．１５ｇを０．５Ｍ　Ｎ
ａＣ１，０，１Ｍリン酸バッツァ一（ｐＨ７，０）３０
ｄに溶解するゆこの溶液にゲルを加え、２５°Ｃで１６
時間ウォーターバスの中のシェーカー内で反応させる。

反応終了後、０．５Ｍ　ＮａＣ１゜０．１ＭＩＪン酸バ
ッファー（ｐＨ７，０）で過剰のりガントを洗浄し、０
．１Ｍ炭酸バッファー（ｐ　Ｈ８，０）　、　０８１Ｍ
酢酸バッファー（ｐＨ４，０）で交互に洗浄し、１Ｍエ
タノールアミンに一晩放置し活性基をブロッキングする
。

かくして式％式％この溶液にゲルを加え、２５°Ｃで１時間ウォーターバ
ス中のシェーカー内で反応させる。反応終了後、０．５
Ｍ　ＮａＣ１，０，０５Ｍ　ＴｒｉｓＪＣｌ　（ｐＨ８
，０）、　０．５ＭＮａＣ１０，０５Ｍギ酢酸バッフｙ
−（ｐＨ４，０）で交互に洗浄し、１Ｍエタノ−・ルア
ミンに一晩放置し活性基をブロッキングする。

で示されるリガンド結合多Ｉ！類８０ｇ（湿重量）が得
られる。本島のポリヘムシン含量はＩｇ（湿重量）当り
１４．０　ｐ　ｍｏｌｅであった。

〔実施例６〕Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ
乾燥粉末１ｇを１ｍＭ　ＨＣＩで膨潤して湿重量３．０
ｄを測りとる。ポリで示されるリガンド結合多糖類８０
ｇ（湿重量）が得られる０本品のポリヘムシン含量はＩ
ｇ（湿重量）当り１４．０　ｐ　ｍｏｌｅであった。

〔参考例〕

実施例１で調製したりガント結合多糖類８ｄを１．５Ｍ
食塩水で洗浄した後、内径１３闘、長さ１００閣の滅菌
したカラムに充填し、パイロジエンを含まない１．５Ｍ
食塩水２５０ｄ、注射用蒸留水１００ｄ、０．０５Ｍ　
食塩水１００！ｄで順次洗浄したこのカラムに各種細菌
由来のパイロジエン１００μｇをそれぞれ０．０５Ｍ食
塩水１００ｄに溶解した溶液を５ｖ＝１２の流速で流下
した。流出液について、パイロジエン濃度の測定をトキ
シカラー（生化学工業）及びリムラスＨＳテスト　（和
光純薬）を行った。また真菌に対しても同様の測定を行
った。その結果は下記の第−表の通りである。

（本頁以下余白）第−表Ｎ、Ｄ　：　ｎｏｔ　　ｄｅｔｅｃｔリムラスＨＳシングルテスト：試料溶液を００２Ｉｄ。

加え、３７℃で６０分保温後、静かに１８０°転倒し、
内容物が凝固して変形しない場合を陽性（＋）、それ以
外の場合を陰性（−）とする。

また、真菌に関してＣａｎｄｔｄａ　ａｌｂｉｅａｒｉ
ｓ　１１００ｕを０．０５？１食塩水１０Ｍｔに溶解し
た溶液を上記と同様の操作を行い、β−グルカンに対す
る特異性の高いライセード　（特願昭６３−２９２４９
４参照）を調製し、定量した結果検出限界以下であった
。

〔発明の効果〕

本発明の発熱物質を特異的に吸着するペプタイドをリガ
ンドとした不溶性担体は発熱物質除去用吸着体として有
用であり、この吸着担体は広範囲のダラム陰性細菌及び
グラム陽性細菌に対して結合性が有し、細菌性物質を完
全に除去できる。また真菌類（例えば（：Ｈｄｉｄａａ
ｌｂｉｅａｎｓ等）に対しても結合性を有しているので
人体に対して有毒を産生ずる真菌類をも除去できる。

すなわち、発熱物質を含むアミノ酸（例えばヒスチジン
、アラニン）、核酸（例えばシトシン）抗生物質（例え
ばペニシリン）、ホルモン（例えばインスリン）、ビタ
ミン（例えばフラビン）血清タンパク質（例えばアルブ
ミン）、抗体（例えばイムムグロプリン）、酵素（例え
ばウロキナーゼ）等の生理活性物質から発熱物質を除去
するために使用することができる。特に発熱物質を含ま
ない水を調製するために好適である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）カブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドを担体
に結合した水不溶性担体。
（２）カブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドをスペ
ーサーを介して担体に結合した水不溶性担体。
（３）カブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドが次式
を有するタキプレシン I （Ｔａｃｈｙｐｌｅ−ｓｉｎ
I ）であることを特徴とする請求項（１）記載の水不
溶性担体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
直接に接合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
のカルボキシル、基がアミドであることを示す。）
（４）カブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドが次式
を有するタキプレシンII（ＴａｃｈｙｐｌｅｓｉｎII）
であることを特徴とする請求項（１）記載の水不溶性担
体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
直接に接合している。Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
のカルボキシル基がアミドであることを示す。）
（５）カブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドが次式
を有するポリヘムシンＩ（Ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉｎ
I ）であることを特徴とする請求項（１）記載の水不溶
性担体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、［１］と［２」、［３］と［４］は、それぞれ
直接に接合している、Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
のカルボキシル基がアミドであることを示す。）
（６）カブトガニの血球膜由来抗菌性ペプタイドが次式
を有するポリヘムシンII（ＰｏｌｙｐｈｅｍｕｓｉｎI
I）であることを特徴とする請求項（１）記載の水不溶
性担体。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、［１］と［２］、［３］と［４］は、それぞれ
直接に接合している、Ａｒｇ−ＮＨ＿２は、アルギニン
のカルボキシル基がアミドであることを示す。）
（７）担体がアガロースであることを特徴とする請求項
（１）ないし（６）のいずれかに記載の水不溶性担体。
（８）担体がセルロースであることを特徴とする請求項
（１）ないし（６）のいずれかに記載のカブトガニの血
球膜由来抗菌性ペプタイドを直接又はスペーサーを介し
て結合した水不溶性担体。