JPH03169893A - 精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は、一般に百日咳に対するワクチンの戊分に関す
る。より詳細には、本発明は、百日咳菌（ＢｏｒｄｅＬ
ｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）から抗原因子を高収量
で、純粋かつ安定した形で分離・精製する方法、精製さ
れた因子およびそれらの混合物に関する。

【従来の技術１ 百日咳は主に子供を冒す非常に伝染しやすい病気である
。呼吸器合併症を起こすほかに、百日咳は、特に社会経
済的に下層の子供や母親の抗百日咳Ｌ１体をもたない新
生児において、神経障害と高い死亡率をもたらす。百日
咳の原因菌はダラム陰性球杆菌のＢｏｒｄｅＬｅｌｌａ
　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓである。この細菌は気道に侵入し
て、細菌が死滅したあとでさえも残存する中毒症状を誘
発すると考えられている。 目下、肚界保健機構は百日咳の発生および蔓延を防ぐた
めに乳幼児の免疫化を勧めているが、種々のワクチン製
剤のネガティブ効果に対して多大の懸念が生じている。 通常のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓワクチン製剤の毒性は、
単純な紅潮から永久的な神経障害および／または死亡に
まで及ぶ副作用を引き起こす。その結果、通常のＢ．ｐ
ｅｒＬｕｓｓｉｓワクチンの使用が減り、百日咳の症例
数が増加した。 最も広く使用されたワクチンはＢ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ
の全菌体を含み、これは５６℃、３０分の処理で不活化
される。この細菌は他の減毒処理にさらされないので、
加温に耐えられる毒性物質がワクチン中に混入し、これ
が副作用の発生の一因となっている。このタイプのワク
チンのもう１つの結果は、投与に対する応答として広範
囲の抗体が形成されることである。この穐のワクヂンに
より誘導された血清は、予防または治療物質として使用
するための高い特異性および高い防ｌｌｉｆ＠を備えて
おらず、また診断物質としての価値も有していない。 他の百日咳ワクチンはＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの培養上
清からつくられる。しかしながら、培養の可変性は微生
物の最終組戊を変化させ、また不活化剤のグルタルアル
デヒドやホルムアルデヒドは時々貯蔵の際に活性有毒物
質に転化されやすい凝集物質の形戊へ導くことがある。 別のワクチンは無毒性株または毒素欠損株からつくられ
る。しかしながら、これらのワクチンは毒性株からつく
ったものよりも防御能がかなり劣ることが証明された。 Ｗａｒｄｌａｖ　ｅｔ　ａｌ．．　Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃ
ｒｏ．Ｂｉｏｌ．．　９：８９−１００　（１９７６）
を参照されたい。 全菌体ワクチンにより起こる副作用をなくすために、研
究は無細胞ワクチン中で使用するためのＢ．ｐｅｒＬｕ
ｓｓｉｓの毒性或分の研究へ向けられた．１つの重要な
戒分は、百日咳の発生において主要な役割を演ずる蛋白
外毒素、すなわち百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｔ
ｏｘｉｎ：　Ｐ　Ｔ）であり、これは百日咳菌の主な防
御抗原であると考えられる［Ａ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ　ｅｔ
　ａｌ．，　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．．
　４０：６６１　（１９８６）　］　． 無細胞Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓワクチンの別の興味ある
戊分は線状赤血球凝集素抗原（　Ｆ　Ｈ　Ａ　）である
。 この抗原は、単独でまたはＰＴとの組合わせで、いくら
かの防御能をもつことが分かっている。例えば、米国特
許第４５６３３０３号および欧州特許公開第２３１０８
３号を参照されたい。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ全菌体からＰＴおよびＦＨＡ抗
原を分離・′ｖ４％する方法はすでに発表されており、
これらの方法は様々な収量と戒分純度をもたらす。 例えば、米国特許第４５６３３０３号は、セルヮース硫
酸、テキストラン硫酸と結合した多糖ゲル、または架橋
多糖ゲルに吸着させ、その後ＦＨＡを溶離することによ
り、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａからＦＨＡを精製することを
開示している。 Ｊ．ＪｊＪｕｎｏｚ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｆ．Ｉｍｍ
ｕｎ．．　３２：２４３−２５０　（１９８３）および
日本公開特許公報５９．１７５４３９Ａは、２つの因子
ＰＴとＦ　Ｈ　Ａのそれぞれの異なる発酵法およびＦＨ
Ａの生産培地に関する。これらの文献に記載された分離
・精製法は、労力と時間のかかる抽出、沈澱、遠心、透
析、その後のクロマトグラ７精製を必要とする。このよ
うなプロセスは単一因子の分離に少なくとも１週間を要
し、しかも商業規模での抗原またはワクチンの製造にと
って明らかに満足のゆくものではない。 Ｍ．Ｃｈａｚｏｎｏ　ａｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓ
ｔａｎｄ．．１６：８３−８９（１９８８）および欧州
特許公開第１２１２４９号はＴ５．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ
から分泌された全赤血球凝集素画分の主要物質としての
ＰＴとＦＨＡに関し、これらの物質は発酵培地中に存在
する比と同じ比でワクチン製剤において使用される。赤
血球凝集素の抽出・精製のために、発酵培地は遠心して
細胞塊を除き、次に上清から硫酸アンモニウムを用いて
沈澱させた。沈澱物はシヨ糖密度遠心により再沈澱させ
、次に分離および透析を行って精製した。この方法で使
用する技術は大容量の操作を含み、複雑で精巧な装置、
例えば外気への長時間露出を避けるための連続遠心分離
、および骨の折れる繁雑な操作を必要とする。これはバ
ッチごとに変化する生戒物の抗原組或をもたらす。最後
に、得られた抗原の純度は、残留する菌体内毒素および
外気への長時間露出によりもたらされた発熱性物質のた
めにまだ不十分である。 Ｙ．Ｓａｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．．　４１：３１３−３２０　（１９８３）は主に
ア７イニティーク口マトグラ７イーを用いるｇ４製法を
開示している。この方法では、発酵培地が回転楕円形の
ヒドロキシアパタイトに約ｐＨ８で送られ、これにより
大部分のＦＩＩＡが吸着され、一方ＰＴは溶出される。 吸着剤による濾過に先立って遠心を行うと、細胞や破片
による吸着剤のプロッキング（少ない流れ挙動、低い回
収率、遅い操作、および後続の工程にとって望ましくな
い汚染を引き起こす）が避けられる。その後、ＰＴ画分
を含む溶出液は約ｐＨ６に調整し、別のヒドロキシアパ
タイトカラムを通過させ、これによりＰＴを保持させる
。その後、両因子は完全に別々の系でさらに処理される
。この方法では、両因子は、適当な緩衝液／塩溶液でヒ
ドロキシアパタイトキャリヤーから溶離された後、ハブ
トグロビンーセ７アロースまたは７エチュインーセ７ア
ロースのようなア７イニティーリガンドで［１された担
体に送られ、これにＰＴが選択的に結合され、一方ＦＨ
Ａはそのまま溶出される。その後、精製は沈澱、および
／または別の簡単なクロマトグラ７イー分画化、および
／または透析により完結される。 Ｒ．Ｄ．Ｓｅｋｕｒａ　ｅＬ　ａ＋．，　Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．，　２５８：１４６４７−１４６５１　（
＋９８３）はＰＴのみに限定された類似方法を開示して
いる。この方法では、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ発酵培地
の遠心により得られた上清からの抽出は、ｐ　１１　６
の上清にア７イゲルブルー（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌｂｌｕｅ
）　ｍ脂を加え、約２日間の接触時間後液相からそれを
取り出し、（そのＮＡＤ様構造ゆえに）シバクロン色素
に特異的に結合したＰＴを適当な緩衝液／塩溶液で溶離
し、活性画分をプールすることにより達威されるａ最初
の精製では、ＰＴを選択的に結合させるために、アフィ
ニティー担体としてフェチュインーアガロースが使用さ
れる；溶離後、精製は簡単な分画クロマトグラ７イーお
よび塩析により完結される。 Ｓａｇｏ　ｅＬ　ａｌおよびＳｅｋｕｒａ　ｅＬ　ａｌ
のクロマトグラ７イー法は非常に労働集約的で時間のか
かるゾーン遠心分離を回避するものであるが、それらは
まだ発酵培地からの細胞および破片の分離を必要とする
。Ｓｅｋｕｒａ　ａｔ　ａｔに記載されるような、クロ
マトグラ７カラムに全液体を通すことのない、上清から
の吸着は実際的な簡素化にあたる。しかしながら、この
方法では、Ｉｌｌｌ類のターゲット成分が分離されるに
すぎない。 ＦＴ単独の別のクロマトグラフィー精製はＭ．Ｓｖｏｂ
ｏｄａ　ｅｔ　ａｔ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
．　１５９：４０２−４１１　（１９８６）により報告
された。ＰＴはブルーセ７アロース（他のシバクロン改
質担体と同等物）とｐｒＩ６．０で約１２時間接触させ
、吸着剤を濾過し、それをクロマトグラ７イーカラムに
充填することにより培養上清から吸着された。溶離およ
びプール後、ＰＴＷＭ分を直ちにフェニルセ７アロース
担体に加えた。ＰＴは、その疎水性ゆえに、および媒体
の高いイオン強度ゆえに、フェニルセファロース担体に
結合された。溶離は比較的低い塩濃度でｐＨ１０緩衝液
／グリセロール混合物を用いて行われた。プールした画
分は希釈され、ｐＨ５．０に酸性化され、ヒドロキシア
パタイトＨＴＰに加えられ、モして溶離およびプール後
に残留するＰＴ断片から分離されＩ；。 Ｍ．ＣｈｒｊｓＬｏｄｏｕ口ｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ．，　
Ｖａｃｃｉｎｅ．　５：１９９−２０７　（１９８７）
は、Ｓｅｋｕｒａ　ｅＬ　ａｌの方法に基づいた色素−
リガンドクａマトグラ７イーを使用することによるＢ．
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培養物からのＰＴおよびＦＨＡの抽
出を開示している。培養液のｐ　Ｈは６．０にｍＷされ
、ブルーセファロースゲルが加えられた。このゲルはト
リスーＨＣＩ、ｐＩ｛８．０緩衝液で洗浄され、結合物
質はＩ．ＯＭＮａＣＩ含有緩衝液、ｐＴＴ８−０で溶離
された。 Ｙ．ＳａＬｏ　ｅＬ　ａｌ．，　Ｌａｎｃｅｔ．　ｐ．
１２２−１２６　（Ｊａｎ．２１．１９８４）は、分別
沈澱、リン酸塩緩衝液での抽出によるＢ．ｐｅｒＬｕｓ
ｓｉｓ培養物中のＦ　１１　Ａ抗原とＬＰＦ　−　Ｈ　
Ａ抗原の塩析；超遠心分離による分画化；１｛Ａ画分の
ブール；ホルマリンによる不活化；およびアジュバント
の添加によってつくられた百日咳成分ワクチンを開示し
ている。 さらに他の精製法は、Ｂ．ｐ６ｒｔｕｓｓｉｓ培養上清
からＦＴを選択的に吸着させるための担体を使用してい
る。欧州特許公開第１４０３８６Ａ号は、ＣＮ　Ｂ　ｒ
　活性化セ７アロース、アガロース、セルロ一スまたは
テキストランに結合しうるアフィニテーリガンドとして
変性ヒトまたは動物セルロプラスミンの使用を開示して
いる。 しかしながら、これらのアフィニティー担体のより大量
でしかも一定の保証された品質での利用可能性は、目下
使用しうる精製法の大規模商業使用に対して１つの重大
な欠点を残している。このタイプの担体は無菌であるは
ずがなく、従って常にヒトの医薬品の製造において許容
し得ない汚染（特に、ウイルスによる汚染）の危険性を
伴う。 当分野では、百日咳に対する有効で安全なワクチン、並
びにＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ感染症の早期発見のための
簡便な診断手段の必要性が依然として残っている。 ［発明が解決しようとする課題Ｊ 本発明は、ｉつの面において、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
発酵培地から高度に精製されたＢ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ
抗原因子を迅速、簡便、安全に抽出するための改良方法
を提供する。望ましくは、抽出される因子は百日咳毒素
（ＰＴ）および／または線状赤血球凝集イ 素（ＦｉＴＡ）である。 この方法は、これらのＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原の一
方または両方を含む全発酵培地もしくは無細胞培養上清
を、両抗原を吸着できるヒドロキシアパタイト含有吸着
剤と接触させることを伴う。この吸着剤は、培地との適
当な接触時間後、培地から分離される。その後、部分的
ｌこ精製されたＰＴおよび／または１７ＨＡを含む溶液
はｐＨ１イオン強度および温度の適当な条件下で吸着剤
から溶離される。 本方法によれば、微孔質膜を通す濾過により簡単に滅菌
できる濃ｔｒ１／部分精製された形で、かつ良好な収量
でこれらの因子が得られる。本方法が全発酵培地に適用
される場合には、菌体を除去して無細胞培養上清を得る
ための遠心分離の必要性が回避できる。 本発明の別の面は、ＰＴおよび／またはＦＨＡ含有溶液
の更なる精製を可能にする上記方法の改良を提供する。 上記方法のほかに、本発明の抽出手順後の追加工程はＩ
４！！またはそれ以上の抗原因子の更なる精製を町能に
する。これらの追加工程は上記の溶液を２つの連続カラ
ムクロマトグラフィーにかけることを含む。クロマトグ
ラフィーの１つは無極性リガンドクロマトグラフィーカ
ラムを使用する。好ましくは、無極性リガンドクロマト
グラフィーは２つのクロマトグラ７イーのうちの最初の
ものである。これらの２つのカラムからのＰ　Ｔ　１５
　ｃｌ：　（ｆ　Ｆ　Ｈ　Ａの部分精製混合物の溶離は
、菌体内毒素や他の蛋白様物質を本質的に含まない形の
、精製された抗原混合物をもたらす。 本発明のさらに別の面において、上記の精製工程から得
られた混合物中のＰ　Ｔ　ｊ−ｉよびＦ　Ｈ　Ａ因子は
、通常のサイズ排除クロマトグラフィー工程の適用によ
って、相互汚染なしに互いから容易に分離することがで
きる。 本発明のこの改良法によれば、ＦＴまたはＦ　ＨＡ因子
が良好な収量で、しかも免疫原因子または前駆物質とし
てヒトへ投与するのに許容しうる品質レベルで得られる
。さらに、この方法は工業生産規模に合わせることが容
易である。 さらに別の面において、本発明は、本発明方法により大
量に生産される、高度精製Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ抗原
因子、とりわけＰＴおよびＦ　Ｈ　Ａを提供する。 これらの因子は、個々に使用されようと他の生物、ウイ
ルスまたは病気に対するワクチンと一緒に混合物として
使用されようと、Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓに対する安全
でしかも効力がある安定した戊分ワクチンの開発を可能
にする。これらの精製因子は、Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ
感染症の予防、診断または治療処置に有用な抗Ｂ．ｐｅ
ｒＬｕｓｓｉｓ血清を生産するための基本物質を提供す
る。 本発明の他の而および利点は、以下で詳述する本発明の
好適な実施態様においてさらに説明することにする。 ［課題を解決するための千段］ 本発明は、Ｂ，ρｅｒｔｕｓｓ＋ｓの発酵培地または培
養物から１ｌ１またはそれ以上の抗原因子を抽出・精製
するための改良法を提供する。特に、本発明によって、
因子ＰＴおよび／またはＦＨＡの精製法が提供される。 また、精製されたＰＴおよびＦ　ＨＡ抗原の混合物、並
びに個々の゛精製抗原も本発明によって提供される。 本発明の１つの方法は、Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓの発酵
培地または培養物からのＰＴおよび／またはＦＨＡの抽
出を提供する。本発明方法で用いるＢ．ｐｅｒＬｕｓｓ
ｉｓの種々の菌株は知られており、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションのような商業コレクション
から容易に入手できる。これらの利用可能な菌株は、そ
れらが目的の抗原因子ＰＴおよびＦ　Ｈ　Ａの少なくと
も一方、好ましくは両方、を液休培地中で十分量生産で
きる限り、本発明方法において使用可能である。 本発明方法で使用しうる菌株の例は、制限するものでは
ないが、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｐｈａｓｅ　Ｔ　１
Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ　ｐｈａｓｅ　Ｈ、Ｂ．ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ　ｐｈａｓｅ　ｒ　ＣＳ，＋３．ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉｓ　ＴｏｈａｍａｌｌＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
　ｌ　８　５　−　３　０株、Ｂ．ｐｅｒｉｕｓｓｉｓ
　ｌ　８　−　３　２　３株、Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ
１３４株、Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ　５　０　９株、Ｂ
．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓＷｅｌｌｃｏｍｅ　２　８株、お
よびＯｆｆｉｃｅ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢ．ｐｅ
ｒＬｕｓｓｉｓ　１　６　５株などである。本発明で使
用１るのに適した菌株は、大阪の発酵研究所から寄託番
号ＩＦＯ−１／１０７３として入手できるＩ３．ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓ　ｐｌｅａｓｅ　Ｉ　％Ｔｏｈａｍａであ
る。 本発明で使用するために、所定のＢ．ｐｅｒＬｕｓｓｉ
ｓ菌株は当分野で知られたいろいろな方法で増殖させる
ことができる。種培養物の量および起源または保存方法
に応じて、異なる培養工程および液体または固体培地を
用いる種々の培養法が知られている。しかしながら、大
規模生産のために通常許容しうる大きさの接種物をもた
らす既知方法はどれも本発明において使用するのに適し
ているだろう。 Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ接種物の適当な増殖培地は当分
野で習熟した者によって選択され、例えばＧａ　ｎ　ｇ
　Ｏ　’培地ＩＥＰＡ８２／３０５４６５．５］　　；
Ｎ．Ａｎｄｏｒｎ　ｅＬ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．．２８：３５６
−３６０　（１９８８）およびそこに引用された文献に
記載の培地；　Ｖｅｒｗａｙ培地［米国特許第４７８４
５８９号］　；合戊培地Ｂ　２　ＩＰ．Ｖａｎ■ｅｍｅ
ｒｔ．Ｐｒｏｇ．ＩｎｄｕｓｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，
　（Ｂｕｌｌ，ｌＪ．Ｊ．，ｅｄ），　ｖｏｌ．１３＋
　　ｐ．ｌ５１，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉ．，　　八
ｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９７７）］または記載されたそ
の修飾培地を含むが、これらに制限されない。 本発明の出発物質であるＢ．ｐｅｒＬｕｓｓｊｓ培養物
の増殖のために、接種物は適当な液体培地に加えられ、
その後当分野で知られた通常の発酵方法および発酵槽設
計を用いて発酵が行われる。当分野で習熟した者は、通
常の発酵槽設計、発酵培地、発酵方法および発酵バラメ
ーターの特定の組合わせの選択に応じて、異なる結果が
得られることを理解するであろう。本発明で使用するの
に適した組合わせは大規模生産で使用するのに適したも
のである。方法、設計および培地のこのような組合わせ
の例はＥＰＡＯ７７６４６　；ＥＰＡ１２１２４　９　
；　Ｅ　Ｐ　Ａ　２　３　９　５　０　４　；　Ａｎｄ
ｏｒｎ　ｅｔ　ａｌ，　ＳａｇｏｅＬａｌ　（１９８３
）．　Ｓｅｋｕｒａ　ｅｔ　ａｌ　８よびＳｖｏｂｏｄ
ａ　ｅｔａｔ（すべて先に引用されており、参照により
ここに挿入される）に例示されている。ＥＰＡＩ２１２
４９：先に引用した＾ｎｄｏｒｎ　ｅＬ　ａｌ　；およ
びＥＰＡ２３９５０４に記載の方法が最適である。 本発明の実施において、発酵完了後、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓ
ｓｉｓ発酵培地は目的のＰＴまたはＦ　Ｈ　Ａ因子の変
性および／または分解を避けるために、無菌状態で維持
される。２種の抗原は１〜２５℃の温度範囲で抽出され
る。本発明の好適な実施態様では、培地を１〜ＩＯ℃に
冷却し、この温度に保持する。 ｐ■■は７．０以下に調整する。好ましくは、ｐ　Ｈは
リン酸または酢酸を用いてｐｉｆ６．０〜６．４の範囲
に調整する。場合により、防腐剤を培地に加えてもよい
。例えば、チメロサールナトリウムが０．２ｇ／Ｉまで
の最終濃度で培地に加えられるか、または２−７エノキ
シーエタノールが０．３〜ｌ％の最終濃度で培地に加え
られる。所望により、慣用防腐剤は本発明方法で用いる
緩衝溶液に加えることもできる。 本発明方法における任意の第一工程として、発酵培地は
大きい粒子やベレットを除くためにフィルターを通すこ
とができる；ただし、その際環境からの汚染の危険性の
ある接触を避けるようにする。 本方法によれば、ヒドロキシアパタイト（　ＩＴ　Ｏ−
ａｐａ）が培地中の細胞や小さい細胞粒子よりも一層容
易に沈降するのに適した形で発酵培地に加えられる。好
適な実施態様において、本発明方法は、全培養液からの
１■０−ａｐａの分離を促進し、かつ培養液と吸着剤の
接触時間を最小限にするために、物理的手段または追加
のプロセス工程を採用する。例えば、吸着剤は多孔性ま
たは半透性担体もしくはキャリヤーとして培地に導入さ
れる。この種の好適な実施態様では、ＩＩＯ−ａｐａは
結晶形であるか、またはもとの培地中の大部分の粒子の
比重と十分に異なる比重をＩＯ−ａｐａ粒子に与える担
体材料に結合または吸着されるか、あるいはその中に封
じ込められる。好適な形の１１０−ａｐａ吸着剤は、慣
用手段によるＩ｛　０　−ａｐａ／吸着ＰＴおよびＦＨ
Ａの液体からの分離を促進するために、１．１５に等し
いか又はそれより大きい見掛け密度を有する。 本発明の別の好適な実施態様において、１１０−ａｐａ
吸着剤は吸着剤の粒度測定、多孔性および機械的性質を
促進する担体に担持される。好適な担体は６０μｍまた
はそれ以上の粒径、および両抗原の拡散を可能にする孔
径（３００ＫＤａまたはそれ以上の排出限界に対応ずる
）を有する。このような吸着剤は培地と適合する多孔性
硬質構造体中にＨＯ−ａｐａを封じ込めるか、またはそ
れに結合もしくは吸着させることにより得られる。 このような担体には、制限するものではないが、シリカ
、アルミナおよび他の一般的な無機多孔質担体、または
アクリル樹脂、ビニル樹脂、アガロース、セルロースま
たはこれらの混合物のような有機樹脂もしくはバイオー
有機ゲル担体が含まれる。これらの担体は最後に架橋に
より構造化または硬化することができる。多数の望まし
い担体が市販されている：例えば、ＩＩＡ−Ｕｔｒｏｇ
ｅｌ　［ＩＩＩＦ，　７ランス】またはＩＩＡ−ＴＳＫ
−Ｇｅｌ、■Ａ型［ＴＯＹ０　５００Ｍｆｇ．　Ｇｏ．
、日本Ｊ．これらの担体は、目的の生物学的因子に対す
る最大の吸着能と共に、良好な流動性および十分な分離
力を可能にする。これらの担体に担持された｝１０−ａ
ｐａの使用は、クロマトグラ７イーカラムへの担体の充
填およびその中での担体の洗浄、その後の目的因子の溶
離を容易にする。また、本発明で使用する場合、吸着剤
は無菌であることが好適である。 本発明の実施によれば、ＩＯ−ａｐａ吸着剤は培養液Ｉ
リットルあたりＨＯ−ａｐａ少なくとも０．５グラムの
最少量でＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ培地に加えられる。Ｉ
Ｏ−ａｐａの適量は培養液１リットルあたりＨＯ−ａｐ
ａＯ．５〜２．０グラムの範聞である。 その後、吸着剤は吸着剤に目的成分をほぼ完全に吸着さ
せるに足る時間のあいだ培養液と接触させておく。一般
に、完全吸着に要する時間は５分から３０時間までの範
囲でありうる。より好ましくは、吸着時間は６〜２４時
間、通常一晩である。 吸着時間のあいだ、培地は穏やかに撹拌することが望ま
しい。また、撹拌やポンプ運動のような機械的手段を吸
着時間のあいだ使用してもよく、これは培養液と吸着剤
とのより緊密な接触を可能にする。 吸着の完了後、吸着剤は、一般に培地が入っている容器
の底へ沈降させることにより、培養液から分離される。 場合により、培養液は発酵槽から改良された吸着剤分離
能を有する別のタンクまたは容器へ移してもよい。例え
ば、円錐形の底をもつ容器は吸着剤の沈降後の分離を容
易にする。また、大部分の目的因子がＨＯ−ａｐａに吸
着された後で、吸着剤からの培養液のデカントを可能に
する容器が使用されてもよい。吸着剤の選択的保持は濾
過、流動化または遠心分離のような技術により促進され
る。 培養液からの分離後、吸着剤は５〜２００ｍＭの低イオ
ン強度の緩衝溶液により十分に洗浄される。緩衝液は５
〜８のｌ）Ｈをもつことが望ましい。 この洗浄工程は約１〜１５℃の温度で実施され、大部分
の残留細胞ともとの発酵培地の不要の残留戊分を除去す
る。好ましくは、洗浄工程はｐ　Ｈが約５．５〜７の範
囲で、イオン強度が１５０より小さい緩衝液を用いる。 特に望ましい洗浄温度は約４〜８℃である。 本発明で用いる緩衝系は生物学的因子の処理に常用され
、当分野でよく知られた、いずれの緩衝系であってもよ
い。この方法に有用な慣用緩衝系に対する制限は、単に
、所定の緩衝液が望ましいｐ｝｛およびイオン強度で作
用し、かつ目的の抗原因子、ＨＯ−ａｐａまたはその担
体材料とネガティブに相互作用しないということである
。本発明で使用される緩衝液の例には、制限するもので
はないが、リン酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリ
ス、およびアンモニウム緩衝液が含まれる。 その後、吸着剤はカラムに充填され、それに吸着された
抗原因子が２００ｍＭより大きいイオン強度の緩衝塩溶
液によりほぼ中性ｐＨで担体から溶離される。望ましく
は、溶離はＩ−１５゜Ｃの温度範囲および約６．０〜９
．０のｐ　Ｉ−１で緩衝塩溶液を用いて行われる。約４
〜８℃の温度が特に好適である。塩溶液は当分野で通常
使用されて当業者によく知られたいずれの塩を含んでい
てもよい。 塩の例には、制限するものではないが、塩化物または硫
酸塩の可溶性形態のＮａ，Ｃａ％Ｋ，Ｍｇ，アンモニウ
ム塩が含まれる。 本発明の最適な実施態様では、ただ２つのｐＨレベルお
よびｐＴｌにつきただ２つの希釈率をもつリン酸塩緩衝
液が洗浄および溶離工程で、並びに本発明の精製・分離
方法における追加工程で適用しうる標準セットとして使
用される。この単純な緩衝液を使用することにより調製
および操作が簡単になり、抗原因子の不安定化および汚
染の危険性が相当に低減される。さらに、リン酸塩緩衝
液はやはりリン酸基を含むＩＯ−ａｐａと非常によく適
合する。 従って、本発明の好適な実施態様では、目的の抗原因子
が吸着されたＨＯ−ａｐａ担体は初めに緩衝液Ａ，（リ
ン酸塩１０〜１５ｍＭ，ｐＨ５．５〜７．０）で、次に
より高いイオン強度の緩衝液ＡＸ（リン酸塩５０−３０
０ｍＭ，ｐＨ５．５〜７．０）で十分に洗浄される。そ
の後、抗原因子はＮ　ａ　Ｃ　Ｉ　（０〜７　０　０　
ｍＭ）を補給した緩衝液ｂ２（リン酸塩１００−５００
ｍＭ，ｐＨ７．２〜８．０）により一緒に溶離され、活
性蛋白因子がプールされる。 本発明の１つの実施態様では、内毒素による重大汚染を
避けるために、最初の蛋白ピークだけがプールされる。 溶離後のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの残留菌休による汚染
を避けるためには、プールした両分を通常の滅菌濾過に
かける。 こうして、本発明方法は１つの溶液中の２種の目的抗原
因子の混合物をもたらす。溶液中のこれらの因子は少な
くとも３０％の純度である点に特徴がある。一般に、純
度は５０％を越える。この溶液中で、これらの因子はイ
ムノアッセイ（精製抗原因子で免疫したヤギおよびウサ
ギにより生産された抗体を使用）で調べた′ときＰＴに
ついては５０ｍｇ／１以上かつ／またＦ　Ｈ　Ａについ
ては２００ｍｇ／Ｉ以上の特定濃度を有する。これらの
イムノアッセイに関する技術については、先に引用した
Ｙ．ＳａＬｏ　ｅｔ　ａ１．，　Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ
ｕｎ．を参照されたい。本発明方法により単離された因
子を含む溶液中の残留内毒素のレベルは、通常のリムル
ス血球溶解物テストで測定したとき、５Ｘ１０’内毒素
単位／　ｍ　ｇ蛋白より少ない。これらのテストは当分
野で知られており、製品化されている。 これらの部分精製因子の純度および収量は、当分野で知
られた他の精製法から得られた抗原混合物をしのいで、
主要な利点を提供する。とりわけ、この混合物は蛋白加
水分解現象により生じたより小さい断片が混入していな
い部分精製ＰＴおよび／またはＦＩＩＡを含んでいる。 また、本発明の実施によれば、上記溶液中の抗原因子は
残留蛋白、脂質および他の汚染物からさらに精製するこ
とができる。本発明の追加のｍｓ工程は２つのクロマト
グラフィー工程を含む。これらの工程は溶液から２種類
の因子を分離することなく行うことができる。 クロマトグラフィー工程はここに示した条件に従って順
に行われるが、本発明の好適な実施態様は以下で説明す
る。この好適な実施態様は脱塩、透析または濃縮のよう
な時間のかかる工程を省き、最初のクロマトグラフィー
の溶媒系からの残留汚染の危険性をなくすものである。 本発明によれば、クロマトグラ７イー工程の１つ（好ま
しくは、最初のもの）は上記溶液中の部分精製抗原を、
約６．０〜９．０の範囲の中性または弱アルカリ性ｐ　
ＩＩおよび高イオン強度（好ましくは、０．２〜ｌ二５
Ｍ）で、通常の担体に添加することを含む。 本発明のこの工程で使用する担体の例には、制限するも
のではないが、セルロース、アガロース、テキストラン
、アクリル樹脂および他のポリ炭水化物、並びにそれら
の架橋された又は他の方法で改質された誘導体もしくは
多孔性樹脂、または無機担体が含まれ、これらの担体に
無極性リガンドが担体に疎水性を与えるに足る量で結合
される。 無極性リガンドは担体との結合に関与するような極性ま
たは反応性基を含まない、芳香族または直鎖状、分校鎖
状もしくは環状脂肪族化合物でありうる。選ばれた無極
性基の種類、並びに担体の置換体積および置換度は、目
的抗原を吸着するそれぞれの最終担体の能力を決定する
パラメーターであることが、当分野で習熟した者には明
らかであるだろう。 本発明の好適な実施態様において、最初のｇ４製工程で
用いる担体は、置換または無置換フェニル、アルキルフ
ェニル、もしくは炭素原子数２〜２６の直鎖状脂肪族基
として無極性リガンドが結合された通常の高分子マトリ
ックスである。この目的にかなう担体が数種類市販され
ている；例えば、ブグ−ルーＴＳＫまたはオクチルーＴ
　Ｓ　Ｋ　（Ｍｅｒｃｋ社）、フェニルセ７アロースま
たはプチルセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎ
ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）。 本発明の最適な実施態様において、最初の精製工程で用
いる担体はより大きい剛性または架橋結合によって特徴
づけられるもの、例えば良好な流動性により迅速な精製
を可能にずるＴＳＫ，から選ばれる。最適な実施態様で
は、担体上にブチルまたはオクチルのような脂肪族リガ
ンドの存在するものが最も効率のよい抗原因子の結合お
よび精製を可能にする。 この担体はさらに、高イオン強度にさらした際に２種の
抗原を同時にそして完全に結合する能力によって特徴づ
けられる。高イオン強度（例。０．２Ｍ以上）の条件下
で、抗原はより無緬性の形態で存在すると思われる。 以下で詳述するクロマトグラ７イー工程において使用さ
れる緩衝系は、それらが希望のｐＨ範囲とイオン強度を
有しかつ目的抗原因子とも吸着剤ともネガティブに相互
作用しない限り、生物学的因子の処理に常用されるいず
れの緩衝系であってもよい。このような用途に適する緩
衝液の例には、制限するものではないが、リン酸塩、酢
酸塩、炭酸塩、トリスエタノーノレアミノメタンおよび
アンモニウム緩衝系が含まれる。低イオン強度の場合に
は、緩衝塩の濃度が低く保たれる；高イオン強度の場合
には、緩衝塩の濃度が高いか、または、好ましくは追加
の非緩衝塩がその系に添加される。 これらの塩は当分野で通常使用されて当業者によく知ら
れたいずれの塩であってもよく、例えば塩化物または硫
酸塩の可溶性形態のＮａ，Ｃａ，Ｋ，Ｍ　ｇ　ｓアンモ
ニウム塩が含まれる。本発明の最適な実施態様では、先
に述べたように、また実施例２に記載するように、ただ
２つのｐ｝ｆレベルとｐＩ１につきただ２つの希釈率を
もつリン酸塩緩衝液が標中セットとして使用される。 このキャリヤーに吸着された抗原はその後、大部分の内
毒素と残留する少量の不純物を除くために、中性ないし
弱アルカリ性（ｐＨ７．０〜９．０）の緩衝塩溶液で洗
浄される。好ましくは、緩衝塩溶液Ｂ２を使って担体を
洗浄する。 ２種の抗原は界面活性剤を補給した低イオン強度ないし
中イオン強度（例．１０ｍＭ〜３００ｍＭ）の酸性緩衝
液（　ｐＨ範囲５．０〜７．０）を使用することにより
一緒に溶離される。好ましくは、界面活性剤を補給した
緩衝液Ａ２を使って２種の抗原を溶離する。界面活性剤
は水溶性の非イオン界面活性剤でありうる。好適な実施
態様において、非イオン界面活性剤はエトキシル化脂肪
酸アルコール、例えばツィーン系（１０１社、英国）、
トリトンＸ系（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ社、米国）
、ベロール（Ｂａｒｏｌ）系（Ｂｅｒｏｌ社、デンマー
ク）、またはマーリバル（Ｍａｒｌｉｐａｌ）系（ｎｕ
ｌｓ社、ドイツ）であり、緩衝液に約０．５〜２５％の
量で加えられる。最適な界面活性剤はベロール１８５（
Ｂｅｒｏｌ社）とマーリバル２　４　／　８　０　（Ｉ
ｒｕｌｓ社）であり、これらは０．５〜５．０％程度に
少ない量の界面活性剤による迅速溶離を可能にする。こ
の溶離工程後、抗原を含む画分がプールされる。 本方法で有用な他のクロマトグラフィーエ程は、抽出工
程からのプールした抗原溶液、または好ましくは、第一
のクロマトグラフィー工程からのプールした抗原画分を
、弱酸性ｐｒｌ（ｐＨ５．０〜７．０）および低イオン
強度（Ｉ　Ｏ〜２００ｍＭ）で両抗原を保持しうる第二
のキャリヤーに装填することを含む。この工程は前工程
からの界面活性剤の除去を可能にする。 両抗原因子を保持しうる第二のキャリヤーは好ましくは
ヒドロキシアパタイトキャリヤーである。 この用途に適するキャリヤーの例には、純粋なヒドロキ
シアパタイト、または他のキャリヤー材料（例えば、生
物学・生化学分野で通常使用されるシバクロンーブルー
改質ゲル担体）に担持された又は封じ込められたヒドロ
キシアパタイトが含まれる。弱酸性ないし中性のｐｌｌ
（ｐＨ５．０〜７．０）ｊ；よび低イオン強度（１０〜
２００ｍＭ）で両方の目的抗原因子を吸着できる上記の
ような他のキャリヤーもこの方法において有用である。 好適な担体はｐｔｉｓ．ｏ〜７．０および低イオン強度
で接触させたとき両抗原を保持する、良好な流動姓と機
械抵抗をもつ市販の吸着剤である。この種のキャリヤー
の例は、制限するものではないが、Ｈ　Ａ　　ウルトロ
ゲル（ＩＢＦ社、フランス）、トリスアクリルーブル−
（ＩＢＦ社，７ランス）、ブルーセ７アロースゲル（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデン）、ア７イゲルブル
ー（ＢｊｏＲａｄ社、米国）などである。この精製工程
には、トリスアクリルブルーが最も適した吸着剤である
。 その後、公着された抗原は低イオン強度の緩衝＃液で洗
浄され、２００ｍＭより大きい高イオン強度の中性ない
し弱アルカリ性緩衝溶液（　ｐ　Ｈ　６　．０〜９．０
）で一緒に溶離される。好ましくは、洗浄のために緩衝
溶液Ａ２が用いられ、抗原の溶離のために緩衝塩溶液Ｂ
２が用いられる。別法として、２１ｍの抗原はリン酸塩
緩衝液中のＮａＣ　１の線勾配を使って溶離される。活
性画分は特異的イムノアッセイ　【先に引用したＳａｔ
ｏ　ｅｔ　ａｌを参照１により同定され、プールされる
。 この段階で、目的の抗原画分は単一溶液中に含まれる２
種類の高度精製抗原の混合物として得られる。一般には
、百日咳毒素を構戊する５つの蛋白サブユニットと２２
０ＫＤａのＦ　Ｈ　ＡがＳＤＳ一ゲル電気泳動により検
出される。Ｆ　Ｈ　Ａは他の精製法ではしばしば２２０
ｋｄ物質の分解産物に相当するより小さい蛋白種の混合
物として得られる。例えば、Ｔ．Ｌ．Ｃｏｗｅｌｌ　ａ
ｔ　ａｌ．，“ＢａｃｔｅｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅｓ　
，　Ｖｏｌ　ＩＶ：３７１−３７９，　Ｒｏｈｂｉｎｓ
，　Ｉｌｉｌｌ，Ｓａｄｏｆｆ　ｅｄｓ．，　Ｔｈｉｅ
ｎｎｅ−Ｓｔｒａｔｔｏｎ，　Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ　（１
９８２）を参照されたい。従って、本発明の更なる利点
は他の分解産物からの完全Ｆ　Ｈ　Ａ種の精製である。 リムルス血球溶解物テストで測定した精製抗原の内毒素
含量はＩＯ内毒素単位／　ｍ　ｇ蛋白より少ない。 この形態において、抗原はホルマリン、グルタルアルデ
ヒド、過酸化水素、テトラニト口メタン、または他の不
活化剤を使う無毒化反応に供される。 また、この混合物はワクチン分野で通常使用される技術
を使ってワクチン製造用の精製抗原原液として用いられ
る。例えば、混合物は滅菌濾過、無毒化、濃度の調整、
およびワクチンを投与する際に常用されるアジュバント
（例．水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは
カルシウム）の添加からなる常法に付される。また、こ
の原液は同一または異なる病気に対する他の抗原もしく
はトキソイドと組み合わせたワクチンのために使用され
る。 しかしながら、得られた溶液混合物中に存在する２種類
のＢ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ抗原の比と異なる比が望まれ
る場合、またはワクチンや診断剤として１種類のみの抗
原を使用することが望まれる場合、２種類の因子はそれ
らの分子量に基づいて交差汚染なしに互いから簡単に分
離できる。混合物中のＰＴとＦＩＴＡを分離するための
慣用技術には、当分野で習熟した者によく知られた、ゲ
ル担体上での排除クロマトグラ７イーが含まれる。この
種の排除クロマトグラフイーゲルは一般に製品化されて
いる（例．セ７アクリルゲル；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
）。 例えば、２つの純粋因子の分離が望まれる場合は、＃終
抗原プールを蛋白濃度の調整後七７アクリル５２００−
Ｔｌｌ？ゲルに加え、続いて溶媒系Ｂｌ（３００〜７０
０ｍＭ　ＮａＣ　＋を含むリン酸塩緩衝液１　０−１　
０　０ｍＭ，ｐｌＩ５−　　５−８−　　５）を使って
このゲルから抗原を溶離する。 こうして、ここに記截した木発明方法は当分野の方法と
対照的に多くの利点により特徴づけられる。例えば、こ
れらの２１１の抗原のいずれか一方を精製する従来方法
と相違して、本発明方法は意外にも、遠心により細胞や
破片を前以て除去することなく、１回の吸着工程で８．
ｐｅｒｔｕｓｓｊｓ　＃￥養物からのＰＴとＦＩＩＡの
両抗原の選択的抽出を可能にする。これにより、本発明
方法では従来方法においてしばしば用いられた入手困難
な特異的ヒトまたは動物ア７イニティーリガンド修飾担
体の使用が避けられる。 また、本発明方法は大量の発酵培地を取り扱う必要がな
いので簡便かつ迅速に実施される。さらに、本発明方法
は、所望により完全無菌条件下で、迅速に行われるとい
う点で最終抗原因子の品質および純度に貢献ずる。大気
との接触または外来生物学的物質（例．アフィニティー
リガンド）からの外部汚染、および熱変性または分解か
らの内部汚染はこの方法によって最大限に回避で・きる
。 当分野で習熟した者の予想に反して、また先に引用した
Ｓｖｏｂｏｄａ　ｅＬ　ａｔおよびＳａｇｏ　ｅｔ　ａ
ｌの親察に反して、この方法が付着細胞による流動障害
、乏しい機械抵抗、または吸着核酸によるＵＶ監視の妨
害の諸難点を排除するということは驚くべきことである
。前以て培養液の遠心を行うことなく全精製工程の第一
工程としてヒドロキシアパタイトを使用することは本方
法の主な利点であると考えられる。 本発明方法の別の利点は市販の合或クロマトグラ７イー
担体を用いることである。このような合戊担体は、本方
法と得られた精製抗原因子に、滅菌の改良とヒトに対す
る使用安全性の利点を与える。意外にも、ＰＴまたはＦ
　Ｈ　Ａ　１７）精製に関して、あるいは２種の抗原の
うち一方の選択的吸着に関して先に記載した数種のクロ
マトグラ７イー担体は、本方法によって与えられた特定
のｐＨ範囲およびイオン強度で作用させたとき、２つの
目的因子を一緒に吸着および溶離する木発明方法におい
て満足のゆくことが見いだされた。 また、本発明方法はプールした後の活性画分の操作を軽
減し、これにより汚染の危険性を少なくする。数多くの
利点ゆえに、本発明方法は因子ＰＴまたはＦＩｒＡを別
々に、あるいは一緒に分離・精製するのに有用である。 以下の実施例は本発明を単に例示するものであって、本
発明の範囲を制限するものではない。 ［実施例］ 実施例ｌ：抽出方法 Ｂ．ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ　ｐｈａｓｅ　Ｉ　，　Ｔｏｈ
ａｍａの培養物は、ＥＰＡ２３９５０４　（参照により
ここに引用される）に記載の方法および条件に従って、
修飾ＳＬａｉｎｅｒ−Ｓｃｈｏｌｔｅ培地で発酵させた
。 発酵完了後、培地をｉ−ｔｏ℃に冷却し、その，　ＩＩ
をリン酸で約６．２に調整した。防腐剤チメロサールナ
トリウムを０．１ｇ／ｌの最終濃度で培地に加えた。 ３５ｇ（３ｖ／ｖ％）の滅菌ＨＡ−ＵＩ　Ｌｒｏｇｅｌ
担体を培地に加え、穏やかに撹拌しながら一晩培地と接
触させておいた。担体に吸着された抗原を沈降させた後
、それを培地から分離し、リン酸塩緩衝液（ｐＴ−１６
．２、１０ｍＭ）で繰り返し洗ッタ。 最初の洗浄後、吸着剤はアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）カラ
ム（Ｇ９０型）に充填した。その後、リン酸塩緩衝液（
ｌｏｏｍＭ，ｐＨ６．２）を用いて２回目の洗浄を行い
、ＮａＣ　ｌ　（５００ｍＭ）ｔｔ補給したリン酸塩緩
衝液（ｐＨ７．６、２００ｍＭ）を使って、抗原因子を
一緒に溶離した。 活性蛋白ピークをプールした。一般的な溶離グロ７イー
ルは第１図に示してある（２８０ｎｍでＵＶ監視）。 こうして、この方法は部分精製された形でＰＴとＦ　Ｉ
Ｉ　Ａの混合物を含む１つの溶液をもたらした。 この溶液はその後滅菌濾過に付した。 実施例２：精製方法 実施例１の溶液からの部分精製抗原因子は、Ｎａｃｔ（
５００ｍＭ）を補給したリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．６、
２００ｍＭ）に溶解し、その他の処理を行うことなく同
一緩衝液で予め平衡化したブプールーＴＳＫキャリヤー
に加えた。 吸着抗原は上と同じ緩衝液で洗い、これにより内毒素の
レベルを約５０〜１０００｛Δまでさらに減少させた。 抗原は２．２％ベロール（Ｂｅｒｏｌ）＋８５界面活性
剤（Ｂｅｒｏｌ社、デンマーク）を加えたリン酸塩緩衝
液（２００ｍＭ，ｐＨ６．２）で同時溶離し、活性画分
をプールした。一般的な溶離プロフィールは第２図に示
してある（２８０ｎｍでＵＶ監視）。 その後、最初のクロマトグラ７イー精製工程からのプー
ルは発熱物質を含まない水で１００ｍＭ以下の濃度に希
釈し、リン酸塩緩衝液（５０ｍＭ，ｐ｝１６．２）で平
衡化したトリスアクリルブルー（Ｔｒｉｓａｃｒｙ！旧
ｕｅ）に加えた。この吸着剤は痕跡量の界面活性剤をす
べて除くために同一緩衝液で洗った。その後、リン酸塩
緩衝液（ｌｏｏｍＭ，ｐＨ７．６）中のＮａＣｌの線勾
配（０〜５００ｍ　Ｍ　）を用いて目的抗原を一緒に溶
離し、活性画分をプールした。一般的な溶離プロフィー
ルは第３図に示してある（２　８　０　ｎｍでＵＶ監視
）。 得られた溶液は目的とする２種類の生物学的因子Ｐ丁お
よびＦＩｒＡをきわめて純粋な形で含んでい　Ｉこ　。 実施例３：抗原の分離 実施例２の溶液中の２種類の抗原の分離が望まれう場合
、セ７アクリルＳ　２　０　０　−　Ｈ　Ｒによるサイ
ズ排除クロマトグラ７イーがＮａＣＩ　　（５００ｍ　
Ｍ　）を補給したリン酸塩緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ７．
６）を使って実施される。七フアクリルＳ２００−ＨＲ
ゲルでの抗原の分離を容易にするために、トリスアクリ
ルブルーカラムのプール画分中の蛋白濃度は１．５〜３
．０ｍｇ／ｍｌにするのが好適である。 このゲルから、ＰＴは０．１ｋｄ以下で溶離し、ＦＨＡ
は０．３ｋｄ以上で溶離した。一般的な溶離プロ７イー
ルはｍ４図に示してある（２　８　０　ｎｍ″ｃＵＶ監
視）。 今や、得られた高度精製抗原は、トキソイドの調製のた
めにおよび／または免疫原調製物の更なる開発のために
、完全に別個に処理することができ、互いとあるいは他
の抗原、トキソイドまたはこのような処理以前の免疫原
因子とあらゆる比で混合することができる。 実施例４：ワクチン製造 精製抗原はその後ＰＴの毒性を除くために、化学薬品、
すなわちホルマリン、グルタルアルデヒド、過酸化水素
、テトラニトロメタン、または他の不活化剤による不活
化処理を受けた。場合により、それ自体で毒性をもたず
、かつＰＴにより実質的に汚染されていないＦＨＡは不
活化処理なしで使用することができる。こうして、不活
化ＰＴおよびＦＨＡまたは処理ＦＨＡはその後不活化剤
を除くために処理され、希望する割合で組み合わされ、
そしてアジュバント、すなわち水酸化アルミニウム、リ
ン酸アルミニウムまたはリン酸カルシウムと混合される
。 従って、本発明の生産物および方法は、プロセス工程と
関連技術の簡便性、使用する物質および装置の入手容易
性、迅速な処理（例えば、発酵終了から純粋な最終抗原
まで２日未満）、および工業生産へのスケールアップの
容易性の諸利点により特徴づけられ、一方で発酵培地か
らの不要物質よりもむしろ抗原に対する特異的選択性に
より良好な収量、外部汚染に対する防御、および良好な
純度を提供する。 本発明の多くの修飾および変更が上記の詳細な説明中に
含まれ、これらは当分野で習熟した者に明白であると思
われる。本発明の組戊物および方法に対するこのような
修飾・変更は添付の特許請求の範囲に包含されると考え
られる。

【図面の簡単な説明】

Ｗｃｌ図は、実施例ｌに記載の本発明方法を行った後で
得られた蛋白ピークの２　８　０　ｎ　ｍで記録した溶
離グロフィールでアル。 第２図は、実施例２に記載の本発明方法の２つのクロマ
トグラ７イー工程の最初のものから得られた蛋白ピーク
の２８０ｎｍで記録した溶離ブロ７イールである。 第３図はミ実施例２に記載の本発明方法の２番目のクロ
マトグラ７イー工程から得られた蛋白ピークの２８０ｎ
ｍで記録した溶離プロフィールである。 第４図は、実施例３に記載のサイズ排除クロマトグラフ
ィーにより分離された抗原因子ＰＴとＦＨ　Ａの２８０
ｎｍで記録した溶離プロフィールである。 代謹人弁理士秋沢政．光 他　１　名 第 １ 図 ＨＡ−ウルトロゲルによるヒドロキソアバタイトクロマ
トグラフィーアミコンカラム　６　９０Ｉ７ 流速　６°ｅｒｎＬ１″ 溶離

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）百日咳毒素（ＰＴ）および線状赤血球凝集素抗原
   （ＦＨＡ）の少なくとも一方を含む百日咳菌（Ｂｏｒｄ
   ｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）発酵培地または無
   細胞培養上清から百日咳毒素および／または線状赤血球
   凝集素抗原を精製する方法であって： 前記培地または上清とヒドロキシアパタイト含有吸着剤
   とを、前記毒素および／または抗原を吸着させるに足る
   時間接触させ；そして 前記吸着剤から、前記吸着毒素および／または抗原を含
   む第一混合物を溶離する； ことから成る上記方法。 （２）前記吸着剤は少なくとも１．１５の比重を有する
   、請求項１記載の方法。 （３）前記吸着剤は多孔質または半透性キャリヤー上の
   ヒドロキシアパタイトから成る、請求項１または２記載
   の方法。 （４）前記キャリヤーはシリカ；アルミナ；他の無機多
   孔質担体；有機樹脂およびバイオゲル担体、例えばアク
   リル樹脂、ビニル樹脂、アガロース、セルロース；およ
   びこれらの混合物より成る群から選ばれ、場合により架
   橋して構造化または硬質化される、請求項３記載の方法
   。 （５）前記吸着剤は培地１リットル当たりヒドロキシア
   パタイト少なくとも０．５グラムの量で前記培地に加え
   られる、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。 （６）前記吸着時間は５分〜３０時間である、請求項１
   〜５のいずれか１項記載の方法。（７）前記抗原（１種
   またはそれ以上）が付着した前記吸着剤を、イオン強度
   が２００ｍＭより小である緩衝溶液で洗浄することをさ
   らに含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。 （８）前記溶離工程はｐＨが６．０〜９．０の範囲で、
   イオン強度が２００ｍＭより大である緩衝液を用いて行
   う、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。 （９）前記第一混合物は溶離すべき第一蛋白ピークに相
   当するプール画分から成る、請求項１〜８のいずれか１
   項記載の方法。 （１０）前記第一混合物は前記毒素および／または抗原
   を少なくとも３０％の量で含む、請求項１〜９のいずれ
   か１項記載の方法。 （１１）前記第一混合物を２つの連続クロマトグラフィ
   ーカラム（前記カラムの１つは無極性リガンドクロマト
   グラフィーカラムである）にかける工程、第二クロマト
   グラフィーカラムから内毒素および他の蛋白様物質を実
   質的に含まないＰＴおよび／またはＦＨＡを含む第二混
   合物を溶離する工程をさらに含む、請求項１〜１０のい
   ずれか１項記載の方法。 （１２）前記無極性リガンドクロマトグラフィーカラム
   は、無極性リガンドが担体に疎水性を与えるに足る量で
   結合された担体から成る、請求項１１記載の方法。 （１３）前記無極性リガンドは、リガンドと担体間の結
   合と反応しうる基を含まない、芳香族または直鎖状、分
   枝鎖状もしくは環状脂肪族化合物から成る、請求項１２
   記載の方法。 （１４）前記無極性リガンド担体は置換または非置換フ
   ェニル、アルキルフェニル、もしくは炭素原子数２〜２
   ６の直鎖状脂肪族基が結合された高分子マトリックスか
   ら成る、請求項１３記載の方法。 （１５）前記担体はセルロース、アガロース、テキスト
   ラン、アクリル樹脂、ポリ炭水化物、それらの架橋およ
   び改質誘導体、多孔質樹脂、および無機担体から選ばれ
   る、請求項１２、１３または１４記載の方法。 （１６）無極性リガンドクロマトグラフィー工程は、（
   ａ）６．０より大のｐＨおよび０．２Ｍより大のイオン
   強度でカラムに装填すること；および／または（ｂ）装
   填したカラムを７．０より大のｐＨ条件下で洗浄するこ
   と；および／または（ｃ）水溶性非イオン界面活性剤の
   存在下にｐＨが７．０より小でイオン強度が３００ｍＭ
   より小の酸性緩衝液で一緒に前記カラムから抗原（１種
   またはそれ以上）を溶離することを含む、請求項１１〜
   １５のいずれか１項記載の方法。 （１７）前記無極性リガンドクロマトグラフィーカラム
   は２つのカラムのうちの第一カラムである、請求項１１
   〜１６のいずれか１項記載の方法。 （１８）前記第二クロマトグラフィー工程は、第一カラ
   ムからの溶離混合物を７．０より小のｐＨおよび２００
   ｍＭより小のイオン強度でＰＴとＦＨＡの両方を結合し
   うる担体に装填し、前記担体から６．０より大のｐＨお
   よび２００ｍＭより大のイオン強度の条件下で内毒素お
   よび他の蛋白様物質を実質的に含まない前記ＰＴおよび
   ／またはＦＨＡの混合物を溶離することを含む、請求項
   １１〜１７のいずれか１項記載の方法。 （１９）サイズ排除クロマトグラフィーによりＰＴをＦ
   ＨＡから分離することをさらに含む、請求項１〜１８の
   いずれか１項記載の方法。