JPS641447B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、ボルデテラ属菌が産生する線維状赤
血球凝集素（Filamentous Hemagglutinin；以
下Ｆ―HAと略称する）の精製方法、さらに詳し
くは、ボルデテラ属菌培養物を、セルロース硫酸
エステルのゲルに接触せしめ、Ｆ―HAを吸着さ
せた後、ゲルから溶出することにより高純度Ｆ―
HAを採取する方法に関する。 産業上の利用分野 ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、こ
れらは種々の生物学的活性物質を産生する。Ｆ―
HAはこれらの生物学的活性物質の中の１つであ
り、ボルデテラ属に属する菌は、いずれもＦ―
HAを産生する。 最近になつて百日咳菌Ｆ―HAが、百日咳菌の
感染および発病の防御において、きわめて重要な
役割を演じていることが明らかにされ、百日咳菌
感染防御抗原として注目されるようになつた
〔Sato Ｙら；Infect.Immun.，31，1223〜1231
（1981）、およびSeminars in Infectious
Diseases IV，Bacterial Vaccine，380〜385
（1982）〕。またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ―
HAが免疫学的に同一であることが確認され
〔Arai，Ｈら；Infect.Immun.，32，(1)，243〜
250（1981）〕、各Ｆ―HAがボルデテラ属菌に共通
のワクチンコンポーネントとなり得る可能性も示
されている。このようなことから、医療上有効な
生物学的活性物質であるＦ―HAを簡単にかつ大
量に単離精製する方法の開発が望まれている。 従来技術 従来知られているＦ―HAの採取精製法として
は、百日咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾
配遠心にかけ、さらにゲルろ過を２回くり返し百
日咳菌Ｆ―HAを得る方法がある〔Sato，Ｙら；
Infect，Immun.，９，801（1974）〕。しかしなが
らこの方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ
―HAの収率が低い等の欠点があり、工業的な精
製法としては採用し難い。 また同様に百日咳菌Ｆ―HAを精製した例とし
て、イオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過に
よる方法〔Arai，Ｈら；Infect.Immun.，25，
460（1979）〕があるが、この方法によれば、Ｆ―
HAの収率が低いうえに、百日咳菌内毒素の除去
が困難であり、実用には供し難い。 さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフイー、ハプトグロビアン・ア
フイニテイクロマトグラフイー、硫安分画、ゲル
ろ過を組合わせる方法〔Cowell，J.L.ら；
Seminars in Infectious Diseases IV，
Bacterial Vaccine.，37，１（1982）〕、およびハ
イドロキシアパタイト吸着クロマトグラフイー、
特異抗体・アフイニテイクロマトグラフイー、蔗
糖密度勾配超遠心分離を組合わせる方法〔渡辺
ら；日本細菌学雑誌，38，423（1983）〕があるが、
これらの方法は工程が非常に長く複雑であるうえ
に、Ｆ―HAの収率が低く、さらにハイドロキシ
アパタイトは高価であり、また上記において用い
られているアフイニテイクロマトグラフイゲルは
市販されておらず、これらの調製は非常に手間が
かかるうえに、原材料が非常に高価である。この
ような種々な欠点のため、上記方法もＦ―HAの
工業的で安価な採取方法とはなり得ない。 発明の目的 本発明者らは、Ｆ―HAの工業的な単離精製法
を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデ
テラ属菌培養物を、セルロース硫酸エステルのゲ
ルに接触せしめ、Ｆ―HAを吸着させ、夾雑物質
と分離し、ゲルから溶出することにより、高純度
のＦ―HAがきわめて簡単にしかも非常に高い収
率で得られることを発見し、本発明を完成するに
至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるＦ―HAを、工業的に簡
単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製する
方法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、セルロー
ス硫酸エステルのゲルに接触せしめ、Ｆ―HAを
吸着させた後、ゲルから溶出することを特徴とす
るＦ―HAの精製方法である。本発明において、
出発材料であるボルデテラ属菌培養物とは、百日
咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌の培養物を
含む。本発明において好ましい培養物は、百日咳
菌培養物であり、百日咳菌を通常の培地、たとえ
ばコーエン・ウイラー培地や、ステナー・シヨル
テ培地などの液状培地にて、常法により静置培養
または振盪培養もしくは通気攪拌培養して得られ
る培養物である。この培養物は、猿心分離により
菌体を除去した培養上清、あるいは菌体破壊物遠
心上清、あるいはこれらの部分精製標品の形で本
発明方法に供される。本発明方法によれば、塩
析、抽出、超遠心分離等の前段部分精製処理をあ
えて行なう必要性はなく、培養上清等をそのまま
セルロース硫酸エステルゲル吸着クロマトグラフ
イーに付すことができ、工程がきわめて簡単であ
る。 本発明で用いられるセルロース硫酸エステルと
は、セルロースを硫酸エステル化して得られるの
であるが、好ましくは結晶セルロースあるいは、
結晶領域および非結晶領域からなるセルロースを
硫酸エステル化したものが良い。この場合、得ら
れたセルロース硫酸エステルは原料の形状を保持
し、水性媒質に不溶性であり、物理的安定性にす
ぐれ、クロマトグラフイー用ゲルとして好適であ
る。これらの原料セルロース類はすでに市販され
ており例えば、アビセル（旭化成工業社製）、セ
ルロフアインGC―15、同GH―25、同GC―100、
同GC―200（チツソ社製）などがある。これらの
ゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下ク
ロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させること
により所望のセルロース硫酸エステルのゲルが得
られる。 本発明において、セルロース硫酸エステルゲル
を用いて、ボルデテラ属菌培養物中のＦ―HAを
精製採取するにあたつては、次のような方法で行
なわれる。 セルロース硫酸エステルゲルは、あらかじめ例
えば0.2M塩化ナトリウム添加0.01Mリン酸緩衝
液等の、中性付近のPH値（PH６〜９）であり、比
電導度５〜25ms／cm程度の適当な緩衝液を用い
て平衡化を行なつた後に、Ｆ―HAの吸着操作に
供する。 セルロース硫酸エステルゲルへのＦ―HAの吸
着、ゲルの洗浄、Ｆ―HAの溶出等一連の精製操
作は、バツチ法およびカラム法等の工業的に通常
よく用いられる操作方法で行なう。バツチ法で行
なう場合は、ボルデテラ属菌培養物中にセルロー
ス硫酸エステルゲルを投入し、PH6.0〜9.0程度の
範囲において０〜30℃程度の温度にて10〜60分程
度緩く攪拌してＦ―HAを吸着させる。この際、
ボルデテラ属菌培養物の比電導度が5.0〜
25.0ms／cm程度となるように、適宜濃縮または
希釈して吸着操作に付す。 吸着終了後、培養物―ゲル混合液をろ過器上に
充填し、吸引ろ過してゲルとロ液を分離する。分
離したゲルを、比電導度５〜25ms／cm程度で、
PHが5.0〜10.0程度である適当な緩衝液例えば、
0.2M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベン
（McIlvaine′s）緩衝液、0.3M塩化ナトリウム添
加0.0Mリン酸緩衝液あるいは0.3M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mトリス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引して
洗浄する。 この後、PHが5.0〜10.0程度で、比電導度が25
〜130ms／cm程度である（上記洗浄用緩衝液の比
電導度より大）適当な緩衝液、例えば1.5M塩化
ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩化
ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着して
いるＦ―HAを溶出する。 カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材
料液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバツ
チ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、
10ml／cm2／Hr〜500ml／cm2／Hr程度に調整して
行なうとよい。 本発明の精製法によれば、百日咳菌培養物中の
Ｆ―HAの特異的吸着能にすぐれ、Ｆ―HAの精
製度は数十倍に達し、しかもＦ―HAの回収率は
90％以上100％近くに達する。得られた精製Ｆ―
HAの比活性か４〜８×104HAユニツト／mg蛋白
質ときわめて高く、ポリアクリルアミドデイスク
電気泳動（PH4.5）分析において単一のバンドを
形成し、百日咳菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日咳菌培養物から所望のＦ―HAを高収率、
高純度に採取することができ、その操作もきわめ
て簡単で、またその精製用クロマトグラフイー吸
着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使用し
ても劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐれて
いる。 したがつて、本発明方法は高純度Ｆ―HAの工
業的精製法としてきわめてすぐれた方法である。
また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾
配超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフイー法等と組合わせることも可能であり、そ
の際は従来方法で得られる結果に比して非常にす
ぐれた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるＦ―HAは高純度で他
の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素も
ほぼ完全に除去されているため、その生物学的活
性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに百
日咳菌ワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGC―15（チツソ社製）80gを加え、
撹拌下65〜70℃にて３時間反応させる。反応終了
後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加え
て中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩
衝液食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エス
テルゲルを得る。 調製例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中に結
晶セルロースであるクロマトグラフイー用アビセ
ル（旭化成工業社製）80gを加え、攪拌下65〜70
℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、10
％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲ
ルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分
に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。 調製例 ３ ０〜５℃の温度にてピリジン500mlにクロルス
ルホン酸82gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGH―25（チツソ社製）80gを加え、
攪拌下65〜70℃にて４時間反応させる。反応終了
後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を徐々
に加えて中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリ
ン酸緩衝食塩液（PH7.2）で充分に洗浄してセル
ロース硫酸エステルゲルを得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調製したセルロフア
インGC―15の硫酸エステル化物をカラム（16mm
φ×100mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0、比電導度約
17.5ms／cm）を通液して平衡化する。このカラ
ムに百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメンター培養上清
800mlを希釈して、比電導度約17.5ms／cm、PH8.0
に合わせた液を通液する。通液後、上記緩衝液に
て洗浄し、夾雑物質を洗い出す。ついで、1.5M
塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH7.6）で溶
出し、Ｆ―HAを含む画分30mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ―HA
画分の分析結果を第１表に記す。 Ｆ―HAの回収率は93.8％で、精製度（精製Ｆ
―HA画分の比活性／培養上清の比活性）は34倍
に達した。精製Ｆ―HA画分のLPF―HA活性は、
ハプトELISA法〔佐藤ら、第28回毒素シンポジ
ウム予稿集141（1981）〕による分析で10ELISAユ
ニツト／ml以下であつた。
血球凝集素（Filamentous Hemagglutinin；以
下Ｆ―HAと略称する）の精製方法、さらに詳し
くは、ボルデテラ属菌培養物を、セルロース硫酸
エステルのゲルに接触せしめ、Ｆ―HAを吸着さ
せた後、ゲルから溶出することにより高純度Ｆ―
HAを採取する方法に関する。 産業上の利用分野 ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳
菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌等があり、こ
れらは種々の生物学的活性物質を産生する。Ｆ―
HAはこれらの生物学的活性物質の中の１つであ
り、ボルデテラ属に属する菌は、いずれもＦ―
HAを産生する。 最近になつて百日咳菌Ｆ―HAが、百日咳菌の
感染および発病の防御において、きわめて重要な
役割を演じていることが明らかにされ、百日咳菌
感染防御抗原として注目されるようになつた
〔Sato Ｙら；Infect.Immun.，31，1223〜1231
（1981）、およびSeminars in Infectious
Diseases IV，Bacterial Vaccine，380〜385
（1982）〕。またさらに、各ボルデテラ属菌のＦ―
HAが免疫学的に同一であることが確認され
〔Arai，Ｈら；Infect.Immun.，32，(1)，243〜
250（1981）〕、各Ｆ―HAがボルデテラ属菌に共通
のワクチンコンポーネントとなり得る可能性も示
されている。このようなことから、医療上有効な
生物学的活性物質であるＦ―HAを簡単にかつ大
量に単離精製する方法の開発が望まれている。 従来技術 従来知られているＦ―HAの採取精製法として
は、百日咳菌培養上清を硫安分画し、蔗糖密度勾
配遠心にかけ、さらにゲルろ過を２回くり返し百
日咳菌Ｆ―HAを得る方法がある〔Sato，Ｙら；
Infect，Immun.，９，801（1974）〕。しかしなが
らこの方法は、工程が多く複雑であり、しかもＦ
―HAの収率が低い等の欠点があり、工業的な精
製法としては採用し難い。 また同様に百日咳菌Ｆ―HAを精製した例とし
て、イオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過に
よる方法〔Arai，Ｈら；Infect.Immun.，25，
460（1979）〕があるが、この方法によれば、Ｆ―
HAの収率が低いうえに、百日咳菌内毒素の除去
が困難であり、実用には供し難い。 さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト
吸着クロマトグラフイー、ハプトグロビアン・ア
フイニテイクロマトグラフイー、硫安分画、ゲル
ろ過を組合わせる方法〔Cowell，J.L.ら；
Seminars in Infectious Diseases IV，
Bacterial Vaccine.，37，１（1982）〕、およびハ
イドロキシアパタイト吸着クロマトグラフイー、
特異抗体・アフイニテイクロマトグラフイー、蔗
糖密度勾配超遠心分離を組合わせる方法〔渡辺
ら；日本細菌学雑誌，38，423（1983）〕があるが、
これらの方法は工程が非常に長く複雑であるうえ
に、Ｆ―HAの収率が低く、さらにハイドロキシ
アパタイトは高価であり、また上記において用い
られているアフイニテイクロマトグラフイゲルは
市販されておらず、これらの調製は非常に手間が
かかるうえに、原材料が非常に高価である。この
ような種々な欠点のため、上記方法もＦ―HAの
工業的で安価な採取方法とはなり得ない。 発明の目的 本発明者らは、Ｆ―HAの工業的な単離精製法
を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデ
テラ属菌培養物を、セルロース硫酸エステルのゲ
ルに接触せしめ、Ｆ―HAを吸着させ、夾雑物質
と分離し、ゲルから溶出することにより、高純度
のＦ―HAがきわめて簡単にしかも非常に高い収
率で得られることを発見し、本発明を完成するに
至つた。 すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な
生物学的活性物質であるＦ―HAを、工業的に簡
単でかつ大量に、きわめて高純度にまで精製する
方法を提供することにある。 発明の構成および効果 本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、セルロー
ス硫酸エステルのゲルに接触せしめ、Ｆ―HAを
吸着させた後、ゲルから溶出することを特徴とす
るＦ―HAの精製方法である。本発明において、
出発材料であるボルデテラ属菌培養物とは、百日
咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌の培養物を
含む。本発明において好ましい培養物は、百日咳
菌培養物であり、百日咳菌を通常の培地、たとえ
ばコーエン・ウイラー培地や、ステナー・シヨル
テ培地などの液状培地にて、常法により静置培養
または振盪培養もしくは通気攪拌培養して得られ
る培養物である。この培養物は、猿心分離により
菌体を除去した培養上清、あるいは菌体破壊物遠
心上清、あるいはこれらの部分精製標品の形で本
発明方法に供される。本発明方法によれば、塩
析、抽出、超遠心分離等の前段部分精製処理をあ
えて行なう必要性はなく、培養上清等をそのまま
セルロース硫酸エステルゲル吸着クロマトグラフ
イーに付すことができ、工程がきわめて簡単であ
る。 本発明で用いられるセルロース硫酸エステルと
は、セルロースを硫酸エステル化して得られるの
であるが、好ましくは結晶セルロースあるいは、
結晶領域および非結晶領域からなるセルロースを
硫酸エステル化したものが良い。この場合、得ら
れたセルロース硫酸エステルは原料の形状を保持
し、水性媒質に不溶性であり、物理的安定性にす
ぐれ、クロマトグラフイー用ゲルとして好適であ
る。これらの原料セルロース類はすでに市販され
ており例えば、アビセル（旭化成工業社製）、セ
ルロフアインGC―15、同GH―25、同GC―100、
同GC―200（チツソ社製）などがある。これらの
ゲルを例えばピリジンなどの有機溶媒の存在下ク
ロルスルホン酸、無水硫酸などを作用させること
により所望のセルロース硫酸エステルのゲルが得
られる。 本発明において、セルロース硫酸エステルゲル
を用いて、ボルデテラ属菌培養物中のＦ―HAを
精製採取するにあたつては、次のような方法で行
なわれる。 セルロース硫酸エステルゲルは、あらかじめ例
えば0.2M塩化ナトリウム添加0.01Mリン酸緩衝
液等の、中性付近のPH値（PH６〜９）であり、比
電導度５〜25ms／cm程度の適当な緩衝液を用い
て平衡化を行なつた後に、Ｆ―HAの吸着操作に
供する。 セルロース硫酸エステルゲルへのＦ―HAの吸
着、ゲルの洗浄、Ｆ―HAの溶出等一連の精製操
作は、バツチ法およびカラム法等の工業的に通常
よく用いられる操作方法で行なう。バツチ法で行
なう場合は、ボルデテラ属菌培養物中にセルロー
ス硫酸エステルゲルを投入し、PH6.0〜9.0程度の
範囲において０〜30℃程度の温度にて10〜60分程
度緩く攪拌してＦ―HAを吸着させる。この際、
ボルデテラ属菌培養物の比電導度が5.0〜
25.0ms／cm程度となるように、適宜濃縮または
希釈して吸着操作に付す。 吸着終了後、培養物―ゲル混合液をろ過器上に
充填し、吸引ろ過してゲルとロ液を分離する。分
離したゲルを、比電導度５〜25ms／cm程度で、
PHが5.0〜10.0程度である適当な緩衝液例えば、
0.2M塩化ナトリウム添加0.02Mマツキルベン
（McIlvaine′s）緩衝液、0.3M塩化ナトリウム添
加0.0Mリン酸緩衝液あるいは0.3M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mトリス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引して
洗浄する。 この後、PHが5.0〜10.0程度で、比電導度が25
〜130ms／cm程度である（上記洗浄用緩衝液の比
電導度より大）適当な緩衝液、例えば1.5M塩化
ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、1.5M塩化
ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着して
いるＦ―HAを溶出する。 カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材
料液、洗浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバツ
チ法の場合と同様でよく、これらの通液速度は、
10ml／cm2／Hr〜500ml／cm2／Hr程度に調整して
行なうとよい。 本発明の精製法によれば、百日咳菌培養物中の
Ｆ―HAの特異的吸着能にすぐれ、Ｆ―HAの精
製度は数十倍に達し、しかもＦ―HAの回収率は
90％以上100％近くに達する。得られた精製Ｆ―
HAの比活性か４〜８×104HAユニツト／mg蛋白
質ときわめて高く、ポリアクリルアミドデイスク
電気泳動（PH4.5）分析において単一のバンドを
形成し、百日咳菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。 上述のとおり本発明の方法によれば、出発材料
の百日咳菌培養物から所望のＦ―HAを高収率、
高純度に採取することができ、その操作もきわめ
て簡単で、またその精製用クロマトグラフイー吸
着体は、安価に調製でき、しかもくり返し使用し
ても劣化が全く無く、きわめて経済的にすぐれて
いる。 したがつて、本発明方法は高純度Ｆ―HAの工
業的精製法としてきわめてすぐれた方法である。
また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾
配超遠心分離法、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフイー法等と組合わせることも可能であり、そ
の際は従来方法で得られる結果に比して非常にす
ぐれた結果を得ることができる。 本発明の方法で得られるＦ―HAは高純度で他
の蛋白質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素も
ほぼ完全に除去されているため、その生物学的活
性を利用した各種試薬、医薬品の調製、さらに百
日咳菌ワクチンの調製に有用である。 実施例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに
具体的に説明する。 調製例 １ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGC―15（チツソ社製）80gを加え、
撹拌下65〜70℃にて３時間反応させる。反応終了
後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を加え
て中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリン酸緩
衝液食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エス
テルゲルを得る。 調製例 ２ ０℃以下の温度にてピリジン600mlにクロルス
ルホン酸117gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中に結
晶セルロースであるクロマトグラフイー用アビセ
ル（旭化成工業社製）80gを加え、攪拌下65〜70
℃にて４時間保持する。反応終了後、冷却し、10
％水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。ゲ
ルを過分離し、0.01Mリン酸緩衝食塩液で充分
に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを得る。 調製例 ３ ０〜５℃の温度にてピリジン500mlにクロルス
ルホン酸82gを滴下し、混合する。滴下終了後、
混液を加熱し、65〜70℃に昇温する。この中にセ
ルロフアインGH―25（チツソ社製）80gを加え、
攪拌下65〜70℃にて４時間反応させる。反応終了
後、冷却し、10％水酸化ナトリウム水溶液を徐々
に加えて中和する。ゲルを過分離し、0.01Mリ
ン酸緩衝食塩液（PH7.2）で充分に洗浄してセル
ロース硫酸エステルゲルを得る。 実施例 １ 前記調製例１と同様にして調製したセルロフア
インGC―15の硫酸エステル化物をカラム（16mm
φ×100mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウ
ム添加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0、比電導度約
17.5ms／cm）を通液して平衡化する。このカラ
ムに百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメンター培養上清
800mlを希釈して、比電導度約17.5ms／cm、PH8.0
に合わせた液を通液する。通液後、上記緩衝液に
て洗浄し、夾雑物質を洗い出す。ついで、1.5M
塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（PH7.6）で溶
出し、Ｆ―HAを含む画分30mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ―HA
画分の分析結果を第１表に記す。 Ｆ―HAの回収率は93.8％で、精製度（精製Ｆ
―HA画分の比活性／培養上清の比活性）は34倍
に達した。精製Ｆ―HA画分のLPF―HA活性は、
ハプトELISA法〔佐藤ら、第28回毒素シンポジ
ウム予稿集141（1981）〕による分析で10ELISAユ
ニツト／ml以下であつた。
【表】
実施例 ２
調製例２と同様にして得られたアビセルの硫酸
エステル化物をカラム（12mmφ×10mm）に充填
し、これに0.14M塩化ナトリウム添加0.01Mリン
酸緩衝液（PH8.0）を通液して平衡化する。この
カラムに、百日咳Ｉ相菌東浜株静置培養上清400
mlを、比電導度約10ms／cmに希釈し、PH8.0に合
わせた液を通液する。通液終了後、上記緩衝液で
洗浄し、ついで、1.5M塩化ナトリウム添加リン
酸緩衝液（PH7.6）で溶出して精製Ｆ―HA含有画
分15mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ―HA
画分の分析結果を第２表に記す。 Ｆ―HAの回収率は75％で、精製度は18倍に達
した。
エステル化物をカラム（12mmφ×10mm）に充填
し、これに0.14M塩化ナトリウム添加0.01Mリン
酸緩衝液（PH8.0）を通液して平衡化する。この
カラムに、百日咳Ｉ相菌東浜株静置培養上清400
mlを、比電導度約10ms／cmに希釈し、PH8.0に合
わせた液を通液する。通液終了後、上記緩衝液で
洗浄し、ついで、1.5M塩化ナトリウム添加リン
酸緩衝液（PH7.6）で溶出して精製Ｆ―HA含有画
分15mlを得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ―HA
画分の分析結果を第２表に記す。 Ｆ―HAの回収率は75％で、精製度は18倍に達
した。
【表】
実施例 ３
調製例３と同様にして得られたセルロフアイン
GH―25の硫酸エステル化物をカラム（16mmφ×
100mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウム添
加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）を通液し平衡化
する。このカラムに実施例１で用いたものと同一
ロツトの百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメンター培養
上清800mlを希釈して比電導度約17.5ms／cm、お
よびPHを8.0に調整した液を通液する。通液終了
後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。ついで1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH7.6）で溶出し、Ｆ―HAを含む画分30mlを
得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ―HA
画分の分析結果を第３表に記す。 Ｆ―HAの回収率は93.8％で、精製度は30倍に
達した。 本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜき
ワクチン」（薬発第287号、1981を参照）に準じ、
マウス体重減少試験、マウス白血球増加試験、易
熱性毒素否定試験およびマウスヒスタミン増感試
験を実施したが、いずれも、生理食塩水を接種し
た対照群と同等であり、副作用は認められなかつ
た。
GH―25の硫酸エステル化物をカラム（16mmφ×
100mm）に充填し、これに0.2M塩化ナトリウム添
加0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）を通液し平衡化
する。このカラムに実施例１で用いたものと同一
ロツトの百日咳Ｉ相菌東浜株フアーメンター培養
上清800mlを希釈して比電導度約17.5ms／cm、お
よびPHを8.0に調整した液を通液する。通液終了
後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出
す。ついで1.5M塩化ナトリウム添加リン酸緩衝
液（PH7.6）で溶出し、Ｆ―HAを含む画分30mlを
得る。 培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ―HA
画分の分析結果を第３表に記す。 Ｆ―HAの回収率は93.8％で、精製度は30倍に
達した。 本精製品を用いて生物学的製剤基準「百日ぜき
ワクチン」（薬発第287号、1981を参照）に準じ、
マウス体重減少試験、マウス白血球増加試験、易
熱性毒素否定試験およびマウスヒスタミン増感試
験を実施したが、いずれも、生理食塩水を接種し
た対照群と同等であり、副作用は認められなかつ
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ボルデテラ属菌が産生する線維状赤血球凝集
素を精製取得するに際し、該線維状赤血球凝集素
含有液を、セルロース硫酸エステルのゲルに接触
せしめ、線維状赤血球凝集素を吸着させた後、吸
着した線維状赤血球凝集素をゲルから溶出するこ
とを特徴とする線維状赤血球凝集素の精製方法。 ２ セルロース硫酸エステルが結晶セルロースま
たは結晶領域および非結晶領域からなるセルロー
ス硫酸エステルである前記第１項記載の方法。 ３ 該セルロース硫酸エステルのゲルを、PH6.9
〜9.0、比電導度5.0〜25.0ms／cmの緩衝液であら
かじめ処理して平衡化したのち吸着処理に付す、
前記第１また２項の方法 ４ 該吸着処理を、PH6.0〜8.0、温度０〜30℃、
比電導度5.0〜25.0ms／cmの条件下に行なう前記
第１〜３項のいずれか１つの方法。 ５ 線維状赤血球凝集素のゲルからの溶出を、PH
5.0〜10.0、比電導度25.0〜130ms／cmの緩衝液を
用いて行なう前記第１〜４項のいずれか１つの方
法。 ６ 該溶出処理に先だつて、吸着ゲルを、PH5.0
〜10.0、比電導度5.0〜25.0ms／cmの緩衝液で洗
浄する前記第５項の方法。 ７ 該線維状赤血球凝集素含有液が百日咳菌培養
物である前記第１〜６項のいずれか１つの方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59091631A JPS60237027A (ja) | 1984-05-07 | 1984-05-07 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
| US06/722,381 US4563303A (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| AU41223/85A AU571078B2 (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Purification of filamentous hemagglutinin |
| CA000479022A CA1237998A (en) | 1984-04-14 | 1985-04-12 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| KR1019850002492A KR890001927B1 (ko) | 1984-04-14 | 1985-04-13 | 섬유질 헤마글루티닌의 정제방법 |
| EP85104545A EP0159003B1 (en) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Method for purification of filamentous hemagglutinin |
| DE8585104545T DE3576173D1 (de) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Verfahren zur reinigung von faserartigem haemoglobin. |
| AT85104545T ATE50600T1 (de) | 1984-04-14 | 1985-04-15 | Verfahren zur reinigung von faserartigem haemoglobin. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59091631A JPS60237027A (ja) | 1984-05-07 | 1984-05-07 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60237027A JPS60237027A (ja) | 1985-11-25 |
| JPS641447B2 true JPS641447B2 (ja) | 1989-01-11 |
Family
ID=14031889
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59091631A Granted JPS60237027A (ja) | 1984-04-14 | 1984-05-07 | 線維状赤血球凝集素の精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60237027A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2597344B1 (fr) * | 1986-04-16 | 1989-06-23 | Merieux Inst | Perfectionnement au procede de purification d'antigenes proteiques de bacteries appartenant au genre bordetella, en vue de l'obtention d'un vaccin acellulaire. |
| CA1337859C (en) * | 1987-04-24 | 1996-01-02 | Masashi Chazono | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
-
1984
- 1984-05-07 JP JP59091631A patent/JPS60237027A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60237027A (ja) | 1985-11-25 |
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