JPS60237027A - 線維状赤血球凝集素の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ボルデテラ属菌が産生する線維状赤血球凝集
素（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　Ｈｅｍａｇｇｌｕｌ、１
ｎｉｎ；　）Ｊ、下Ｆ　−１−Ｉ　Ａと略称する）の精
製方法、さらに詳しくは、ボルデテラ属菌培養物を、セ
ルロース硫酸エステルのゲルに接触せしめ、Ｆ　−１−
Ｉ　Ａを吸着させた後、ゲルから溶出することにより高
純度Ｆ−ＨＡを採取する方法に関する。

産業上の１９−用功１ｆ ボルデテラ属に属する微生物としては、百日咳菌、パラ
百１］咳菌、気管支敗血症菌等があり、これらは種々の
生物学的活性物質を産生する。Ｆ−ＩＩＡはこれらの生
物学的活性物質の中の１つであり、ボルデテラ属に属す
る菌は、いずれもド−ＨＡを産生する。

最近になって百日咳菌Ｆ　−１−Ｉ　Ａが、百日咳菌の
感染および発病の防御において、きわめて重要なる役割
を演じていることが明らかにされ、百日咳菌感染防御抗
原として注目されるようになった［Ｓａｌ、ｏ、　’ｌ
’ら；　Ｔｎｆｅｃｌ、、ＴＩＩＩＩＩＴＩＩＩＩ、　
、３１　＋　１２２：’ｌ−１２３１（１！Ｈ日）、お
よびＳｅ＋ｎ１ｎａｒｓ　１ｎＩｎｒｅｃ１．１ｏｕｓ
　ｌ’）ｉｓｅａｓｅｓ　ＩＶ、　Ｂａｃｌ、ｅｒｉａ
ｌＶａｃｃｉｎｅ、　、３８ｆｌ＝３８５（１９８２）
ｌ。またさらに、各ボルデテラ属菌のｌ’　−ＨＡが免
疫学的に同一であることが確認され（Ａｒａｉ、　Ｈら
；Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍ＋ｎｕｎ、　、３２．　（１）、
　２４３−２５ｆ’）（１り　８　］）］　、＠Ｆ’−
ＨＡがボルデテラ属菌に共通のワクチンコンポーネント
となり得る可能性も示されている。　このようなことが
ら、医療−に有効な生物学的活性物質であるＦ　−ＨＡ
を簡単にかつ大量に単離精製する方法の開発か望まれて
いる。

Ｗ木技術 従来知られているＦ　−１−Ｉ　Ａの採取精製法として
は、石１］咳菌培養−上清を硫安分画し、蔗糖密度勾配
遠心にかけ、さらにゲルろ過を２回くり返し百日咳菌Ｆ
　−１−Ｉ　Ａを得る方法かある１ｓａ１．ｏ、Ｙら；
Ｔ＋汀ｅＣｔ、Ｌｕ＋ｕ＋ｎ、、’Ｊ、８　ｉ’ｌ　ｌ
（１９７４，）］。　しかしながらこの方法は、工程が
多く複雑であり、しかもＦ　−ＨＡの収率が低い等の欠
点があ１）、工業的な精製法としては採用し難い。

また同様に百日咳菌Ｆ　−ＨＡを精製した例として、イ
オン交換クロマ）・グラフィー、ゲルろ過による方法［
Ａｒａｉ、ＩＩら；　Ｔｎｆｅｃｔ、Ｔｍｍｕｎ、　、
　２５、４．６０（１９７９）］があるが、この方法に
よれば、Ｆ　−１−Ｉ　Ａの収率が低いうえに、百日咳
菌内毒素の除去か゛困難であり、実用には供し難い。

さらに別の例として、ハイドロキシアパタイト吸着クロ
マトグラフィー、ハブトグロビアン・ア３− フィニティクロマ）・グラフィー、硫安分画、ゲルろ過
を組合わせる方法（Ｃｏｕ＋ｅｌＬ　、Ｊ、　Ｌ、ら；
Ｓｐｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｉ　ｎｆｅｃｌ、１ｏｕｓ　
Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ＩＶ＋ｒ３ａｃ１．ｅｒｉａｌ　Ｖ
ａｃｃｉｎｅ、、　２７．１　（川３８２）ｌおよびハ
イドロキシアパタイト１汲着クロマトグラフィー、特異
抗体・アフィニティクロマｉ・グラフィー。

蔗糖密度勾配超遠心分離を糾合わせる方法［流用ら；［
１本細菌学雑誌、３８，４２３（１９８３）１かあるが
、これらの方法は工程が非常に長く複雑であるうえに、
Ｆ−１１Ａの収率が低く、さらにハイドロキシアパタイ
トは高価であり、また−に記において用いられているア
フィニティクロマトグラフィデルは市販されでおらず、
これらの調製は非常に手間がかかるうえに、原料材が非
常に高価である。このような種々の欠点のため、Ｌ配力
法もＦ　ＩＩＡの工業的で安価な採取方法とはなり得な
い。

発明−の−目的 本発明考らは、Ｆ　−ＩＩ　Ａの工業的な単離精製法を
見い出すべく、種々検討を重ねた結果、ボルデ４− テラ属菌培養物を、セルロース硫酸エステルのゲルに接
触せしめ、Ｆ−ＨＡを吸着させ、夾雑物質と分離し、ゲ
ルから溶出することにより、高純度のＦ−ＨＡ７！Ｉｆ
％わめて簡酢にしがも非常に高い収率で得られることを
発見し、本発明を完成するに至った。

すなわも本発明の目的は、医療−１−非常に有用な生物
学的活性物質であるＦ　ＩＩＡを、工業的に簡単でかつ
大計に、きわめて高純度にまで精製する方法を提供する
ことにある。

発−吸＠構露扛側■釆 本発明は、ボルデテラ属菌培養物を、セルロース硫酸エ
ステルのゲルに接触せしめ、Ｆ　−ＨＡを吸着させた後
、ゲルから溶出することを特徴とするＦ−Ｉ−ＩＡの精
製方法である。　本発明において、出発材料であるボル
デテラ属菌培養物とは、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管
支敗血症菌の培養物を含む。本発明において好ましい培
養物は、百日咳菌培養物であり、百日咳菌を通常の培地
、たとえばコーエン・ウィラー培地や、ステナー・ショ
ルテ培地などの液状培地にて、常法により静置培養また
は振盪培養らしくは通気撹拌培養して得られる培養物で
ある。この培養物は、遠心分離により菌体を除去した培
養−に清、あるいは菌体破壊物遠心−Ｌ清、あるいはこ
れらの部分精製標品の形で本発明方法に供される。本発
明方法によれば、塩析。

抽出、超遠心分離等の前段部分精製処理をあえて行なう
必要はなく、培養上清等をそのままセルロース硫酸工人
チルゲル１汲着クロマトグラフィーに付すことがでト、
工程が鰺わめで筒！ｉｉである。

本発明で用いられるセルロース硫酸エステルとは、セル
ロースを硫酸エステル化して得られるのであるが、好ま
しくは結晶セルロースあるいは、結晶領域お］：び非結
晶領域からなるセルロースを硫酸エステル化したものが
良い。この場合、得られたセルロース硫酸エステルは原
料の形状を保持し、水性媒質に不溶性であｉ）、物理的
安定性にすぐれ、クロマトグラフィー用ゲルとして好適
である。これらの原料セルロース類はすでに市販されて
おり例えば、アビセル（旭化成工業拐製）、セルロファ
インＣ責Ｃ−１５、同ＧＨ−２５、同ＧＣ−１（１（１
、同ＧＣ−２を目）（チッソ社製）などかある。これら
のデルを例えばピリジ゛ンなどの有機溶媒の存在下クロ
ルスルホン酸、無水硫酸などを作用させることによｉ）
所望のセルロース硫酸エステのゲルが得られる。

本発明において、セルロース硫酸エステルゲルを用いて
、ボルデテラ属菌培養物中のＦ　−ＨＡを精製採取する
１こあたっては、次のよらな方法で行なわれる。

セルロース硫酸エステルゲルは、あらかしめ例えば０．
２　Ｍ塩化すトリウム添力旧）、ｆ’）１Ｍリン酸緩衝
液等の、中性付近の１泪値（１］Ｈ６−９）でお１）、
比電導度５−２５　ｔｏｓ／ｃＩＩｌ程度の適当な緩衝
液を用いて平衡化を行なった後に、Ｆ　ＨＡの＠着操作
に供する。

セルロース硫酸エステルデルへのＦ−ＩＩｉ”、、の吸
着、ゲルの洗浄、Ｆ　−ＨＡの溶出等一連の精製操　（
作は、バッチ法およびカラム法等の工業的に通常よく用
いられる操作方法で行な）。バッチ法で行７− なう場合は、ボルデテラ属菌培養物中にセルロース硫酸
エステルゲルを投入し、ｐ　Ｈ６、（’１−・９．（）
程度の範囲において（）・〜３ｏ’Ｃ程度の温度にて１
（）〜６０分程度緩く撹拌してＦ　−ＨＡを吸着させる
。この際、ボルデテラ属菌培養物の比電導度が５．０〜
２５．０　＋ｎｓ／　ｃｍ程度となるように、適宜濃縮
または希釈して吸着操作に付す。

吸着終了後、培養物−ゲル混合液をろ過器−１−に充填
し、吸引ろ過してゲルと口数を分離する。分離したゲル
を、比電導度５〜２５ｍ５／ｃｍ程度で、１））］が５
．０〜１０．０程度である適当な緩衝液例えば、（’１
．２　Ｍ塩化ナトリ・クム添加１１　、　ｆ’１２　Ｍ
マッキｎｔヘン（Ｍｃ　Ｉ　１ｖａｉｎｅ’ｓ）緩衝液
、（’ｌ、　３Ｍ塩化ナトリウム添力旧１　、ｆ’ｌ　
Ｉ　Ｍリン酸緩衝液ある（・は０゜３Ｍ塩化ナトリウム
添加０，０］Ｍ）リス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引して洗浄
する。

この後１．Ｈが５．０〜］　（１、ｌ）程度で、比電導
度が２５−　］　３　（’ｌ　＋ｎｓ／　ｃｍ程度であ
る（ｌ記洗浄用緩衝液の比電導度より太）適当な緩衝液
、例えば１．５Ｍ塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝
液、８− １．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸
着しているＰ　−ＨＡを溶出する。

カラム法にて本発明方法を実施する場合は原材料液、洗
浄用緩衝液、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同
様でよく、これらの通液速度は、］　ｆ）＋ｎｌ／ｃ＋
ｎ２／　Ｉ−（ｒ−５１）　（’ｈｌ／ｃｍ２／Ｉ−（
ｒ程度に調整して行なうとよい。

本発明の精製法によれば、百日咳菌培養物中のＦ　ＨＡ
の特異的吸着能にすぐれ、Ｐ　ＨＡの精製度は数十倍に
達し、しかもＦ　ＨＡの回収率は９（）％以上１００％
近くに達する。得られる精製Ｆ　ＩＩＡの比活性は４〜
８Ｘ１（１４１−（Ａユニット／１１１ｇ蛋白質とトわ
めて高く、ポリアクリルアミドディスク電気泳動（ｐＨ
４、５）分析において草−のバンドを形成し、百日咳菌
内毒素がほぼ完全に除去される。

」二連のとおり本発明の方法によれば、出発材料の百日
咳菌培養物から所望のＦ　−１（Ａを高収率、高純度に
採取することができ、その操作もきわめて簡ｉｔで、ま
たその精製用クロマトグラフィー吸着体は、安価に調製
でト、しかもくり返し使用しても劣化が全く無く、きわ
めて経済的にすぐれている。

したがって、本発明方法は高純度Ｆ　−ＨＡの工業的精
製法としてきわめてすぐれた方法である。

また本発明の方法は従来の技術である蔗糖密度勾配超遠
心分離法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー法等
と組合わせることも可能であり、その際は従来方法で得
られる結果に比して非常にすぐれた結果を得ることがで
外る。

本発明の方法で得られるＰ　−ＨＡは高純度で他の蛋白
質、脂質、糖類等を含まず、また内毒素もほぼ完全に除
去されているため、その生物学的活性を利用した各種試
薬、医薬品の調製、さらに百日咳菌ワクチンの調製に有
用である。

へ例 以下、調製例、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。

調製例１ ０℃以下の温度にてピリジン６００ｍ、（７にクロルス
ルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混
液を加熱し、６５〜７０℃に昇温する。

この中にセルロファインＧＣ−１５（チッソ社製）８０
ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて３時間反応させる。

反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を
加えて中和する。ゲルを濾過分離し、＋１．（１１Ｍリ
ン酸緩衝食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステ
ルゲルを得る。

調製例２ ０°Ｃ以下の温度にてピリジン６　ｆ’ｌ　（１＋ｎθ
　にクロルスルホン酸１１７ｇを滴下し、混合する。滴
下終了後、混液を加熱し、６５〜７（）℃に昇温する。

この中に結晶セルロースであるクロマトグラフィー用ア
ビセル（無化成工業社製）８（’１ｇを加え、撹拌下６
５〜７　（’）　’Ｃにて４時間保持する。反応終了後
、冷却し、１０％水酸化す）　ＩＪウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを濾過分離し、Ｏｏ（１１Ｍリン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄してセルロース硫酸エステルゲルを
得る。

調製例３ １１− ０〜５℃の温度にてピリジン５００Ｊ　にクロルスルホ
ン酸８２ｇを滴下し、混合する。滴下終了後、混液を加
熱し、６５〜７０℃に昇温する。

この中にセルロファインＧＨ−２５（チッソ社製）８０
ｇを加え、撹拌下６５〜７０℃にて４時間反応させる。

反応終了後、冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液を
徐々に加えて中和する。デルを濾過分離し、Ｑ　、（’
、１１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝食塩液（ｐＨ７゜２）で充分
に洗浄してセルロース硫酸エステルデルを得る。

実施例１ 前記調製例１と同様にして調製したセルロファインＧＣ
−１５の硫酸エステル化物をカラム（１６ｍｍφＸ　１
００　ｎ＋ｍ）に充填し、これに０．２　Ｍ塩化す）　
ＩＪウム添加０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液（ρ１−１８．
Ｏ１比電導度約１７　、５　ｍｓ／ｃｍ）を通液して平
衡化する。このカラムに百日咳■相菌東浜株ファーメン
ター培養」二清８００ｍ１を希釈して、比電導度的１　
？、　５　ｍｓ／Ｃｍ　、ｐＨ８，０に合わせた液を通
液する。通液後、上記緩衝液にて洗浄し、夾−】２− 雑物質を洗い出す。ついで、１．５Ｍ塩化ナトリウム添
加リン酸緩衝液（ｐＨ７，６）で溶出し、Ｆ−ＨＡを含
む両分３０ｍ１を得る。

培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ画分の分
析結果を第１表に記す。

Ｆ　−ＨＡの回収率は９３．８％で、精製度（精製Ｆ−
ＨＡ画分の比活性／培養上清の比活性）は３４倍に達し
た。精製Ｆ　−ＨＡ画分のＬ　Ｐ　Ｆ　−ＨＡ活性は、
ハブ）　ＥＬＩＳＡ法［佐藤ら、第２８回毒素シンポジ
ウム予稿集１４１（１，９８１）］による分析で１．Ｏ
ＥＬＩＳ八ユニへ）／ｍｌ以下であった。

第　１　表 １）Ｆ−ＨＡ血球凝集試験［５ａｔｏ、　Ｙ、ｅＬ　ａ
ｌ、Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、、　７，９２９−９９９（１９７３）１２
）キルゾール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋白質
含量として表示 ３）ＨＡ価／蛋白質含量 ４）５）６．２５μｇ蛋白質／１ｎ１の含量に希釈後、
生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じて
実施した。

実施例２ 調製例２と同様にして得られたアビセルの硫酸エステル
化物をカラム（１２＋ｏｍφ×１０ＩＩＩＩ１１）に充
填し、これに０．１４Ｍ塩化ナトリウム添加Ｏ０（）１
Ｍ　リン酸緩衝液（１）Ｈ８、Ｏ）を通液して平衡化す
る。このカラムに、百日咳Ｉ相菌東浜株静置培養上清４
０（’１ｍｌを、比電導度的１　（ｌｎ＋ｓ／ｃｍに希
釈し、ｐＨ８，０に合わせた液を通液する。通液終了後
、」二記緩衝液で洗浄し、ついで、１．５Ｍ塩化ナトリ
ウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ７，６）で溶出して精製Ｐ
−ＨＡ含有画分１５艶１を得る。

培養上清液お上び、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ画分の分
析結果を第２表に記す。

Ｆ−ＨＡの回収率は７５％で、精製度は１８倍に達した
。

で １５− １７− １６− 実施例３ 調製例３と同様にして得られたセルロファインＧＨ−２
５の硫酸エステル化物をカラム（１６ｎ＋ｍφＸ］ＯＯ
ｍ＋ｎ）に充填し、これに０．２Ｍ塩化ナトリウム添加
０．ＯＩＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）を通液し平衡
化する。このカラムに実施例１で用いたものと同一ロッ
トの百日咳■相菌東浜株ファーメンター培養」二清８０
０＋ｏｌを希釈して比電導度的１７　、５　ｍｓ／ｃｍ
、およびｒ＋Ｈを８．０に調整した液を通液する。通液
終了後、上記緩衝液にて洗浄し、夾雑物質を洗い出す。

ついで１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐＨ
７，６）で溶出し、Ｆ−ＨＡを含む画分３０ＩＩｌｌを
得る。

培養上清液および、素通り画分、精製Ｆ−ＨＡ画分の分
析結果を第３表に記す。

Ｆ−ＨＡの回収率は９３．８％で、精製度は３０倍に達
した。

本精製品を用いて生物学的製剤基準［百日ぜきワクチン
］（薬発第２８７号、１９８１を参照）に準じ、マウス
体重減少試験、マウス白血球増加試験、易熱性毒素否定
試験およびマウスヒスタミン増感試験を実施したか、い
ずれも、生理食塩水を接種した対照群と同等であり、副
作用は認められなかった。

第　３　表 Ｊ）、、？）、　３）、４）、５）第１表に同じ特許出
願人　財団法人化学友血清療法研究所代理　人　弁理士
前出　葆はか１名 １９− ２０−

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ボルデテラ属菌が産生する線維状赤面味？疑集素
   を精製取得するに際し、該線維状赤血球凝集素含有液を
   、セルロース硫酸エステルのゲルに接触せしめ、線維状
   赤血球凝集素を吸着させた後、吸着した線維状赤血球凝
   集素をゲルから溶出することを特徴とする線維状赤血球
   凝集素の精製方法。
2. （２）　セルロース硫酸エステルが結晶セルロース主た
   は結晶領域および非結晶領域からなるセルロースの硫酸
   エステルである前記第（１）項記載の方法。
3. （３）　該セルロー又硫酸エステルのゲルな、ｐＨ６，
   ９−９，（１、比電導度５．０−２５．Ｏｍｓ／ｃ箱の
   緩衝液であらかじめ処理して平衡化したのち吸着処理に
   付す、前記第（１）または（２）項の方法。
4. （４）該吸着処理を、ｐＨ６，０〜８．１’）、温度（
   １−３（１’Ｃ１比電導度５．０−２５．（１＋ｎｓ／
   ｃｍの条件下に行なう前記第（１）〜（３）項の０ずれ
   か１つの方法。
5. （５）線維状赤血球凝集素のゲルからの溶出を、ｐＨ５
   ，０〜１０．０、比電導度２５．０〜１３０ｍ５／ｃ＋
   １１の緩衝液を用いて行なう前記第（１）〜（４）項の
   いずれか１つの方法。
6. （６）該溶出処理に先だって、＠着ゲルを、ｐＨ５、（
   １−１（１，（１、比電導度５．（’１−２５，０１ｌ
   ｌｓ／ｅｔａの緩衝液で洗浄する前記第（５）項の方法
   。
7. （７）該線維状赤血球凝集素含有液が百日咳菌培養物で
   ある前記第（１）〜（６）項のいずれか１つの方法。