DE3726879A1

DE3726879A1 - Verfahren zur herstellung von rekombinanten vakzinen gegen hepatitis b

Info

Publication number: DE3726879A1
Application number: DE19873726879
Authority: DE
Inventors: Igor Viktorovic Krasilnikov; Nikolaj Nikolaevic Granovskij; Viktor Michajlovic Zdanov; Rem Viktorovic Petrov; Boris Michajlovic Girdo; Irina Jurievna Kotkova
Original assignee: INST IMMUNOLOGII; INST VIRUSOLOGI IVANOV AN MED
Current assignee: INST IMMUNOLOGII; INST VIRUSOLOGI IVANOV AN MED
Priority date: 1986-08-13
Filing date: 1987-08-12
Publication date: 1988-03-03
Also published as: JPS6399021A; CN87106697A; RU1389060C; FR2602681A1; IT1228928B; IT8721644A0; FR2602681B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Biotechnologie und betrifft insbesondere ein Verfah ren zur Herstellung eines rekombinanten Vakzins gegen Hepatitis B, die in der Medizin zwecks Vakzinenprophylaxe für Menschen Verwendung findet.

Zur Zeit sind das einzige effektive Mittel zur Bekämpfung einer Masseninfektion an Hepatitis B die Vakzine.

Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von Vak zinen gegen Hepatitis B bekannt, die die Züchtung des Produzentenhefestammes des Antigens HBsAg auf einem Nähr medium mit darauffolgender Zerstörung der Hefezellen, Isolierung und Reinigung des Antigens vorsieht. So ist beispielsweise ein Verfahren zur Herstellung von Vakzi nen gegen Hepatitis B bekannt (EP, B 01 35 435), das in der Expression des Antigens HBsAg der Kultur Saccharomyces cerevisiae durch die Zellen ATCC 20665 strain H 52 innerhalb von 4 Tagen besteht. Die Zellen werden innerhalb von 8 Stunden in einem Schüttelkolben bei 28°C inkubiert. Weiter wird die Zellenkultur in ei nem Fermenter untergebracht, in dem das Nährmedium YEHD enthalten ist. Die Fermentation wird bei einer Tempera tur von 28°C unter Rühren innerhalb von 14 bis 40 Stun den bei einem pH-Wert von 5,0 durchgeführt. Nach 40 Stun den wird die Kultur zu 100 l Nährmedium YEHD hinzugesetzt und der Prozeß wird im Fermenter 48 Stunden lang unter Rühren bei einem pH-Wert von 5,0 und einer Konzentration des aufgelösten Sauerstoffes von 20% der Sättigung durch geführt.

Nach dem Durchwaschen der Zellenmasse mit dem Phosphat puffer und der Aufbewahrung bei einer Temperatur von 2 bis 8°C innerhalb von 3 Tagen wird dazu 1% PMSF bis zur Erzielung einer Endkonzentration von PMSF von 2 mMol hinzugegeben. Weiter werden die Zellen am Homogenisator zerstört. Es wird das Antigen HBsAg mit einer Konzentra tion von 0,9 mg/l erhalten, der Gehalt am Gesamtprotein beträgt 1,523 g/l. Danach wird das Antigen HBsAg durch Siliciumoxid geführt, mit Phosphatpuffer gewaschen und 20 Minuten lang bei einer Temperatur von 56°C in 5 mMol Boratpuffer bei einem pH-Wert von 9,1 inkubiert, der 0,25 Masse-% Desoxycholat enthält. Dann wird es nach der Metho de der affinen Chromatographie in der Kolonne gereinigt, die Antikörper zu HBsAg enthält, und mit 3 Mol Ammonium thiocyanat bei einem pH-Wert von 7,2 eluiert. Anschließend wird die Dialyse gegen Phosphatpuffer durchgeführt. Man gibt der wäßrigen Masse Aluminiumhydroxid hinzu, bringt den pH-Wert auf 6,7, rührt bei Zimmertemperatur, zentri fugiert und verdünnt mit physiologischer Lösung (0,85%iger NaCl-Lösung). Eine andere Variante zur Herstellung von Vakzinen besteht darin, daß der wie oben beschrieben er haltene Zellenextrakt mit Siliciumoxid gemischt und 2,5 Stunden lang bei einer Temperatur von 37 bis 39°C inku biert wird. Danach wird das Gemisch mit Phosphatpuffer gewaschen und das Antigen HBsAg wird mit 0,05 Mol Borat puffer bei einem pH-Wert von 8,9 bis 9,2 eluiert, der 0,25 Masse-% Desoxycholat enthält. Das erhaltene Antigen wird zentrifugiert. Die Supernatante wird auf eine Zellu losekolonne aufgetragen, die vorher mit 5 mMol NaCl, 6,25 mMol Tris, 0,5 mMol MgCl₂ behandelt wird. Der Pro zeß wird bei einer Temperatur von 4°C und einem pH-Wert von 7,5 durchgeführt. Danach wäscht man die Kolonne mit demselben Puffer und eluiert mit 0,2 Mol NaCl im Puffer. Die nicht adsorbierte Fraktion enthält 7,95 mg des ge reinigten Antigens HBsAg in 13 mg Gesamtprotein. Weiter wird das Material auf eine Kolonne Sepharose 6 B aufgetra gen und mit Phosphatpuffer mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/h eluiert. Die gereinigte Fraktion wird nach der Dialyse des an Sepharose 6 B gereinigten Antigens gegen 3 Mol Ammoniumthiocyanat im Phosphatpuffer bei einem pH- Wert von 7,2 innerhalb von 16 Stunden erhalten. Ammonium thiocyanat wird durch intensive Dialyse gegen Phosphat puffer entfernt. Das gereinigte Produkt wird mit Phosphat puffer verdünnt, an Aluminiumhydroxid adsorbiert, und weiter wird der Prozeß ähnlich mit der vorhergehenden Variante durchgeführt.

Das bekannte Verfahren sieht die Anwendung der affinen Chromatographie vor, bei welcher die Herabsetzung der antigenen Eigenschaften von HBsAg vor sich geht. Außer dem ist beim Eluieren des Antigens eine teilweise Desorp tion der Antikörper vom affinen Sorptionsmittel möglich, was im Falle der Herstellung eines Vakzinpräparats für Menschen nicht wünschenswert ist (das Vorliegen von frem den Antikörpern erhöht die Reaktogenität des Präparats). Außerdem ist die Verwendung von toxischen Stoffen PMSF und Ammoniumthiocyanat im angegebenen Verfahren bei der Herstellung von Vakzinen für Menschen unzulässig.

Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung des Hepatitis-B-Antigens bekannt, das zur Herstellung von Hepatitis-B-Vakzinen im großen Maßstab geeignet ist (EP, B 01 55 007). Das Verfahren besteht darin, daß die Züchtung des Stammes Saccharomyces cerevisiae - des Produzenten des Antigens HBsAg mit darauffolgender Adsorp tion von HBsAg durch Zellenzerstörung und Vermischung mit Siliciumoxid bei einer Temperatur von 10°C unter Zugabe von Phosphatpuffer durchgeführt wird. Weiter wird die Elution von HBsAg mit einem Gemisch aus 0,05 Mol Na₂CO₃ oder NaHCO₃ (bei einem pH-Wert von 10,5) und Harn stoff bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt. Zur Flüssigkeit über dem Niederschlag gibt man 10%ige Essig säure bis zum Erzielen eines pH-Wertes von 7,2 hinzu und konzentriert auf dem Ultrafilter. Man führt die Gelfil tration durch Sepharose GL-6 B im Phosphatpuffer durch und eluiert mit demselben Puffer. Dann wird die Reinigung von Antigen am Hydroxyapatit durchgeführt. Die Elution wird mit 0,05 Mol KCl unter Zugabe von 0,5 Mol K-Phos phatpuffer durchgeführt. Man erhält ein Endprodukt mit einer Ausbeute von 46 Masse-%. Ungeachtet dessen, daß nach dem angegebenen Verfahren ein reines Antigen HBsAg erhalten wird, ist jedoch dessen Ausbeute nicht hoch ge nug. In der Endstufe wird K-Phosphatpuffer verwendet, was bei der Herstellung von Vakzinen für Menschen wegen seiner Toxizität unerwünscht ist.

Es ist auch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinan ten Vakzinen gegen Hepatitis B aus dem Produzentenhefe stamm des Antigens HBsAg bekannt (Waurpber D. et al., PNAS, Bd. 82, 1985, S. 6830-6834), das im Züchten des Produzentenstammes des Antigens in einem am Phosphor reichen Medium, in der Übertragung der Zellen in ein Nähr medium mit einem niedrigen Phosphorgehalt zur Reproduk tion von HBsAg und im darauffolgenden Waschen der Zellen in der Zentrifuge besteht. Danach wurde die vom Nährmedium befreite Zellenmasse mit dem Phosphatpuffer bis zum Aus gangsvolumen verdünnt. Die Zellen werden mit Hilfe eines Homogenisators unter einem hohen Druck zerstört, und der erhaltene Extrakt, der 30 bis 70 mg/ml Proteine enthält, wird mit dem Phosphatpuffer, der 0,1% Detergent Triton X-100 enthält, auf das Vierfache verdünnt. Dann wird das Gemisch zentrifugiert, das Supernatant wird um das 5fa che konzentriert und es wird die Diafiltration mit zwei Phoshatpuffervolumina durchgeführt. Das Detergent Triton X-100 wird mit Hilfe des Sorptionsmittels XAD-2 entfernt und zentrifugiert. Weiter erfolgt die teilweise Reinigung, indem die Adsorptionselution vom Siliciumoxid ausgenutzt wird. Das erhaltene Präparat wird bei einer Temperatur von 70°C eingefroren. Nach dem Auftauen wird das Präpa rat durch Zentrifugieren geklärt. Das erhaltene Produkt wird durch Chromatographie auf Butylagarose oder durch affine Chromatographie gereinigt. Es wird ein Endprodukt mit einer Ausbeute von 29 Masse-% und einem Gehalt am Begleitprotein von 20 Masse-% erhalten. Das genannte Ver fahren ist durch Vielstufigkeit und die Verwendung von Trägern gekennzeichnet, die toxisches, für Menschen ge fährliches Bromcyan enthalten. Das Endprodukt wird mit einer niedrigen Ausbeute (29 Masse-%) und einem Gehalt am Begleitprotein von 20 Masse-% erhalten, was dessen Anwendung als Vakzine unmöglich macht. Außerdem werden bei der Elution von HBsAg Lösungen verwendet, die Rhodansalze enthalten, was für die Herstellung von Vakzinen für Menschen auch unzulässig ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Verände rung technologischer Vorgänge ein Verfahren zu entwickeln, das es gestattet, die Ausbeute an Endprodukt zu steigern und den Reinheitsgrad des Endproduktes zu erhöhen.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß im Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Vakzinen gegen Hepatitis B, das die Züchtung des Produzentenhefestammes des Anti gens HBsAg hintereinander zuerst auf einem mit einer Phos phorquelle angereicherten Nährmedium und dann auf einem Nährmedium, das die Antigenreproduktion bewirkt und da rauffolgende Zerstörung der Hefezellen, Isolierung und Reinigung des Antigens vorsieht, erfindungsgemäß als Nähr medium, das die Antigenreproduktion sichert, ein Nährme dium verwendet wird, das keine Phosphorquellen enthält, und die Isolierung und Reinigung des Antigens gleichzeitig durch Adsorptionschromatographie auf porösen Kieselerden mit darauffolgendem Ultrazentrifugieren bei einem Dichten gradienten von 1,1 bis 1,3 kg/dm³ durchgeführt wird.

Es ist zweckmäßig, poröse Kieselerden mit einer Poren größe von 1500 bis 2000 Å zu verwenden. Die Desorption bei der Chromatographie wird vorzugsweise mit dem Hydro gencarbonatpuffer bei einem pH-Wert von 9,1 bis 9,5 durch geführt. Das gestattet es, die Ausbeute an Antigen HBsAg bis 90% zu erhöhen.

Um den Reinigungsgrad des Antigens zu erhöhen, ist es zweckmäßig, das Zentrifugieren in einem Dichtengradienten einer 50%igen Kalium- oder Natriumtartratlösung und 25%iger Glycerinlösung bei einem Verhältnis der genannten Komponenten von 1 : 1 durchzuführen. Dabei wird der Reini gungsgrad um mehr als das Zweifache und die Ausbeute der antigenen Aktivität um 10 bis 20% erhöht (im Vergleich zum bekannten Verfahren).

Um die Ausbeute an Endprodukt in der Stufe der Zerstörung der Hefezellen zu erhöhen, ist es zweckmäßig, ein Deter gent einzuführen. Als Detergent wird vorzugsweise Tween- 80 verwendet. Das gestattet es, die Ausbeute an Antigen HBsAg um mehr als das Doppelte im Vergleich zum bekann ten Verfahren zu erhöhen.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet es, das Endpro dukt in einer hohen Ausbeute von 60 bis 67 Masse-% und mit einem hohen Reinheitsgrad (der Gehalt an Begleitpro teinen beträgt 10%) zu erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird folgenderweise durch geführt. Es wird der Hefestamm gezüchtet, der rekombinante Plasmide mit dem Gen HBsAg enthält und fähig ist, das immunogene HBsAg zu produzieren. Als solcher Ausgangs stamm kann ein beliebiger bekannter Produzentenhefestamm des Antigens HBsAg eingesetzt werden, beispielsweise der Stamm Saccharomyces cerevisiae DBY 746/pNMVG 46, der durch die Einschließung der transformierten Plasmide pNMVG 46 in den Rezipientenstamm DBY 746 erhalten wurde. Das Plasmid pNMVG 46 wurde nach der Methode der gentechnischen Modi fikation aus dem bekannten Plasmid pADG 47 erhalten /Molekulare Genetik, Mikrobiologie und Virusologie (Mo lekuljarnaja genetika, mikrobiologÿa i virusologÿa), 1986, Nr. 8, S. 12-19/.

Die Züchtung wird wie folgt durchgeführt:

3 bis 5 große Kolonien des Ausgangsproduzentenhefestammes des Antigens HBsAg werden auf ein mit der Phosphorquelle angereichertes Nährmedium inokuliert. Die Züchtung wird bei einer Temperatur von 30 bis 32°C und unter Rühren innerhalb von 24 Stunden bis zum Erreichen einer Konzen tration von 2-6 · 10⁷ Zellen/ml durchgeführt. Danach wird das ganze Kulturvolumen auf ein Nährmedium übertragen, das die Reproduktion des Antigens bewirkt.

Die Züchtung wird in diesem Medium bei einer Temperatur von 30°C unter Belüftung 24 bis 30 Stunden lang bis zum Erzielen einer Konzentration von 1,8-2,1 · 10⁷ Zellen/ml durchgeführt.

Die Reinheit der Kultur wird mikroskopisch geprüft. Da nach werden die Zellen durch Zentrifugieren bei einer Tem peratur von 4°C gesammelt. Weiterhin werden die Zellen bei einer Temperatur von minus 40°C desintegriert oder eingefroren.

Vor der Zerstörung läßt man die Zellenmasse auftauen, wenn diese eingefroren war, und verdünnt sie mit der Puf ferlösung. Die Zerstörung kann beispielsweise mit Hilfe von Glaskügelchen mit 0,5 mm Durchmesser durch Zerreiben der Hefezellen oder in einem Hochdruckdesintegrator durch geführt werden, wo die Zellen beim Erreichen eines Drucks von 500 bis 1000 atm zerstört werden. Die Desintegration wird beendet, wenn 90% der Zellen zerstört sind. Es ist zweckmäßig, zur Erhöhung der Ausbeute an Endprodukt in der Stufe der Zellenzerstörung ein Detergent einzuführen. Als Detergent wird vorzugsweise Tween-80 verwendet. Da bei wird die Ausbeute an Antigen HBsAg um mehr als das Doppelte höher.

Die zerstörten Zellen werden eingefroren, aufgetaut und dann durch Zentrifugieren bei einer Temperatur von 4°C geklärt. Die Supernatante (der geklärte Extrakt), die das rekombinante Antigen HBsAg enthält, wird einer Adsorp tionschromatographie auf porösen Kieselerden unterzogen.

Für die Adsorptionschromatographie werden vorzugsweise Kieselerden (makroporöse Gläser) mit einem Porendurch messer von 1500 bis 2000 Å verwendet. Solche Sorptions mittel besitzen die höchste Kapazität in bezug auf das rekombinante HBsAg, das sich in Teilchen von 18 bis 22 nm Größe sammelt und weniger als 1% im geklärten Hefe zellenextrakt beträgt.

Nach der Adsorption von HBsAg auf dem Sorptionsmittel, die einige Stunden bis 24 Stunden lang unter ständigem Rühren vor sich geht, wird das Sorptionsmittel ausge fällt, mit einigen Phosphatpuffervolumina gewaschen, in demselben Puffer in die Kolonne übertragen und wiederum mit dem Phosphatpuffer gewaschen, bis der ständige Ex tinktionsindex bei 280 nm erreicht wird. Nach dem Waschen wird das Antigen HBsAg mit einem Puffer von 9 bis 10 pH- Wert desorbiert.

Die Desorption des Antigens erfolgt vorzugsweise mit der Hydrogencarbonatpufferlösung bei einem pH-Wert von 9,1 bis 9,5. In diesem Fall wird die maximale Ausbeute an Antigen HBsAg (etwa 90%) nachgewiesen, was bei der Ver wendung anderer Pufferlösungen für die Adsorption nicht erreicht wird.

Die Eluatfraktionen, die das Antigen HBsAg enthalten, werden vereinigt, falls notwendig durch Ultrafiltration konzentriert und in einem Dichtengradienten von 1,1 bis 1,3 kg/dm³zentrifugiert. Es ist zweckmäßig, das Ultra zentrifugieren in einem Dichtengradienten einer 50%igen Kalium- oder Natriumtartratlösung und einer 25%igen Glyce rinlösung bei einem Verhältnis der angegebenen Lösungen von 1 : 1 durchzuführen. Die Verwendung des Gradienten Tartrat-Glycerin gestattet es, im Vergleich zu anderen Gradienten ein maximal gereinigtes Präparat unter Auf rechterhaltung seiner Antigenaktivität zu erhalten. Die Verwendung solch eines Gradienten erhöht die Reinheits grad des Präparats um mehr als das Doppelte und die Aus beute der Antigenaktivität um 10 bis 20%. Dementsprechend ist die Endausbeute an Endprodukt höher.

Nach dem Ultrazentrifugieren wird der Gradient fraktio niert, in den Fraktionen wird der Titer von HBsAg ermit telt, die Fraktionen, die HBsAg enthalten, werden verei nigt und gegen die 0,8-0,9%ige NaCl-Lösung in 0,02 Mol Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,4 bis 7,6 dialy siert.

Das dialysierte Präparat wird bis zum Erzielen einer Kon zentration von 40 ± 6 µg/ml HBsAg verdünnt, durch Mikrofil tration sterilisiert, auf Aluminiumhydroxid sorbiert und in Ampullen abgefüllt. Eine Vakzindosis enthält ca. 15 µg/ml HBsAg und höchstens 10% des auf 1 mg Aluminiumhy droxid sorbierten Begleitproteins. Das erhaltene Vakzin ist steril, untoxisch und enthält keine fremden Virusan tigene. Die hohe Immunogenität des erhaltenen Vakzins wurde in Versuchen an Tieren und Menschen bestätigt.

Im Versuch an Tieren (Meerschweinchen), die mit einer der epxerimentellen Vakzinserien immunisiert wurden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wur den, wurden Antikörper gegen das Antigen HBsAg bei al len Tieren in hohen Titern (320 bis 650 IE) festgestellt.

40 Volontäre, die keine Antikörper gegen das Antigen HBsAg hatten, wurden mit dem erfindungsgemäß erhaltenen Vakzin geimpft. Die Impfung wurde dreimal mit einem Abstand zwi schen der 1. und 2. Impfung von einem Monat, zwischen der 2. und 3. Impfung von sechs Monaten durchgeführt. Jeden Monat wurde bei den Volontären der Blutgehalt an Antigen HBsAg geprüft. Es wurde eine niedrige Reaktogeni tät der Vakzine im Vergleich zu bekannten Vakzinen fest gestellt.

Einen Monat nach der zweiten Impfung wurden bei 30% der immunisierten Antikörper nachgewiesen, und einen Monat nach der 3. Impfung (8 Monate nach Beginn der Impfung) wurden Antikörper bei 92% der immunisierten Volontäre beobachtet; dabei entsprach der Antikörpertiter 300 bis 700 IE (während der Antikörper-Schutztiter 10 IE beträgt).

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wer den folgende konkrete Beispiele der Durchführung des Ver fahrens angeführt.

Die in den Beispielen beschriebenen Hefestämme sind in der Zeitschrift "Molekulare Genetik, Mikrobiologie und Virusologie 2", 1968, Nr. 8, beschrieben.

Beispiel 1

3 Kolonien der Hefezellen Saacharomyces cerevisiae (von 4 bis 5 mm Durchmesser) des Stammes DBY 746/pNMVG 20, der aus dem Stamm DBY 746 durch Einschließung der trans formierten Plasmide pNMVG 20 erhalten wurde (N. N. Granovskÿ et al., Molekulare Genetik, Mikrobiologie und Virusologie (Molekuljarnaja genetika, mikrobiologÿa i virusologÿa), 1986, Nr. 8, S. 12-19), werden im 2%igen Agar in 200 ml Nährlösung folgender Zusammensetzung (pro 1 l) inokuliert:

KH₂PO₄0,9-1,1 g NaCl0,095-0,10 g Glucose19-21 g MgSO₄0,45-0,55 g CaCl₂0,095-0,105 g Asparagin2,1-2,2 g

Vitamine:

Thiamin190-210 µg Riboflavin190-210 µg Pyridoxin190-210 µg Nikotinsäure190-210 µg para-Aminobenzoesäure190-210 µg Calciumpantothenat190-210 µg Inositol9-11 mg Biotin1,9-2,1 µg

Mikroelemente:

KJ99-101 µg HBO ₃9,9-10,1 µg MnSO₄9,9-10,1 µg (NH₄)₂MoO₄9,9-10,1 µg FeSO₄49-51 µg

Die Kultur wird im Schüttelkolben bei 300 bis 350 U/min bei einer Temperatur von 30°C 24 Stunden lang inkubiert. Die Zellenkonzentration beträgt zu Ende der Züchtung 2,6 · 10⁷ Zellen/ml. Die erhaltene Kultur wird steril in einen Fermenter mit 9 l Nährmedium folgender Zusammen setzung (pro 1 l) übertragen:

KCl0,9-1,1 g NaCl0,095-0,10 g Glucose19-21 g MgSO₄0,45-0,55 g CaCl₂0,095-0,105 g Asparagin2,1-2,2 g

Vitamine:

Mikroelemente:

KJ99-101 µg HBO₃9,9-10,1 µg MnSO₄9,9-10,1 µg (NH₄)₂MoO₄9,9-10,1 µg FeSO₄49-51 µg

Man führt die Inkubation 26 Stunden lang durch. Im Laufe der Inkubation beträgt die Belüftungsintensität (das Ver hältnis Luft : Medium) 1 : 2,5. Die Zellenkonzentration im Medium zu Ende der Inkubation beträgt 2,1 · 10⁷ Zellen/ml.

Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 10 000 × g 20 Minuten lang bei einer Temperatur von +4°C ausgefällt. Die niedergeschlagenen Zellen werden in 100 ml Puffer aus 0,02 Mol Natriumphosphat, 0,5 Mol NaCl bei einem pH- Wert von 7,5 resuspendiert und mit Hilfe von Glaskügel chen innerhalb von 2 Stunden zerstört. Die zerstörten Zellen werden durch Zentrifugieren bei 10 000 × g, einer Temperatur von 4°C innerhalb von 30 Minuten ausgefällt. Die Supernatante wird ausgegossen, zum Niederschlag wer den wieder 100 ml Puffer hinzugegossen und die Prozedur wird noch zweimal wiederholt. Dann wird die vereinigte Supernatante bei einer Temperatur von minus 40°C für 14 Stunden eingefroren. Die aufgetaute Supernatante wird noch einmal durch Zentrifugieren auf gleiche Weise ge klärt. Man erhält 280 ml geklärten Zellenextrakt mit einem Gehalt an Antigen HBsAg von 5 µg/ml (nach der Antigenak tivität).

Dem erhaltenen Präparat gibt man makroporöses Glas mit einem Porendurchmesser von 1050 Å hinzu. Vorher wird das Glas regeneriert und in destilliertem Wasser eingeweicht. Das Volumen des verwendeten makroporösen Glases beträgt 140 cm³. Der Kolben mit der Suspension wird 10 Stunden lang bei einer Temperatur von +4°C stehengelassen. Nach der Adsorption entspricht der Gehalt an Antigen HBsAg in der Flüssigkeit über dem Niederschlag 0,04 µg/ml. Die Flüssigkeit über dem Niederschlag wird abgegossen und das Sorptionsmittel zweimal mit Phosphatpuffer (das Verhältnis 1 : 1) gewaschen, indem dieser nach der vollen Ausfällung des Glases hinzugegeben wird. Danach wird das Sorptionsmittel in die Kolonne übertragen, die Kolonne wird mit Phosphatpuffer gewaschen, um die meisten Be gleitstoffe zu entfernen, danach wird durch die Kolonne die HBsAg desorbierende Pufferlösung 0,05 Mol tris-HCl bei einem pH-Wert von 9 durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen zu 4 ml Volumen gesammelt, in welchen das An tigen HBsAg bestimmt wird. Die Fraktionen werden verei nigt. Man erhält 64 ml Eluat, das 19 µg/ml HBsAg enthält (der HBsAg-Gehalt in den Fraktionen wird nach der immunen Fermentmethode bestimmt). Die Ausbeute an HBsAg beträgt 80%, bezogen auf die Antigenaktivität im geklärten Su pernatant.

Das erhaltene Eluat wird auf den Saccharosegradienten (25- bis 55%ig, Dichte 1,1 bis 1,26 kg/dm³) zu 10 ml Eluat pro 24 ml des auf Grundlage des Tris-HCl-Puffer bereitgestellten Gradienten aufgetragen. Das Ultrazentri fugieren wird bei 95 000 × g und einer Temperatur von 4°C 24 Stunden lang durchgeführt. Danach werden die Gradienten fraktioniert und darin wird HBsAg ermittelt. Die Fraktio nen, welche das Antigen enthalten, werden vereinigt, ge gen Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,6 dialysiert. Im Ergebnis erhält man 16 ml Präparat, das 42 µg/ml HBsAg enthält. Die Ausbeute an HBsAg beträgt 58% bezogen auf die auf den Gradienten aufgetragene Menge.

Das Präparat wird sterilisiert, indem es durch Filter gegeben wird, mit Aluminiumhydroxid mit einer Endkonzen tration von 2 mg/ml um das Zweifache verdünnt und nach einer Stunde in Ampullen zu je 1 ml abgefüllt. Zuvor wer den vor dem Vermischen mit Aluminiumhydroxid die Beimi schungen durch Elektrophorese bestimmt. Deren Gehalt übersteigt 15% vom Gesamtproteingehalt nicht.

Im Ergebnis wird ein Präparat erhalten, das 20 µg/ml HBsAg, 1 mg/ml Aluminiumhydroxid im Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,6 enthält.

Die Ausbeute an Endprodukt (bezogen auf den geklärten Zellenextrakt) beträgt 47%.

Beispiel 2

Es wird der geklärte Zellenextrakt des Hefestammes DBY 746/pNMVG 20 - des Poduzenten des Antigens HBsAg ana log zum Beispiel 1 mit der Ausnahme erhalten, daß die Zellen durch den Druck im spezialisierten Desintegrator zerstört werden. Die Endkonzentration des Antigens HBsAg im geklärten Extrakt (Supernatant) beträgt 5 µg/ml. Für die Adsorptionschromatographie wird makroporöses Glas mit einem Porendurchmesser von 1900 Å verwendet. Zu 280 ml des geklärten Zellenextrakts werden 70 cm³ zuvor im Wasser eingeweichten makroporösen Glases zugegeben. Nach 10 Stunden langem Rühren wird das Sorptionsmittel zwei mal mit Phosphatpuffer analog zum Beispiel 1 gewaschen und in die Kolonne übertragen. Die Kolonne wird mit Phos phatpuffer solange gewaschen, bis der Extinktionskoeffi zient bei 280 nm ständig bleibt, dann wird HBsAg wie in Beispiel 1 desorbiert. Man erhält 30 ml Eluat, das 40 µg/ml Antigen enthält. Das entspricht 86% von der Aus gangsaktivität im geklärten Zellenextrakt.

Das Ultrazentrifugieren, die Dialyse, Sterilisation und das Abfüllen des Präparats werden wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Endausbeute des Antigens an Vakzin beträgt 56%, bezogen auf den Gehalt im geklärten Extrakt, die Menge der Beimischung beträgt 10% vom Gesamtpro teingehalt.

Beispiel 3

Der geklärte Hefezellenextrakt des Produzentenstammes von HBsAg wird analog dem Beispiel 1 erhalten. Die An tigenadsorption auf makroporösem Glas wird analog dem Beispiel 2 durchgeführt. Zur Desorption des Antigens HBsAg wird 0,05 Mol Hydrogencarbonatpufferlösung mit ei nem pH-Wert von 9,1 verwendet. Das Eluat wird in Fraktio nen zu 4 ml Volumen gesammelt und darin die Antigenaktivi tät von HBsAg ermittelt. Man erhält 28 ml Eluat mit einer Antigenaktivität von 45 µg/ml, was 90% der Ausgangsak tivität von HBsAg entspricht. Nach dem Ultrazentrifugie ren, der Sterilisation und dem Abfüllen beträgt die An tigenausbeute an dem Vakzin 63%, bezogen auf den Gehalt im geklärten Zellenextrakt, und der Gehalt an Begleit proteinen höchstens 10% des Gesamtproteingehaltes.

Beispiel 4

Die Herstellung des geklärten Hefezellenextrakts des Pro duzentenstammes von HBsAg und die Adsorptionschromato graphie werden analog dem Beispiel 3 durchgeführt.

Das Ultrazentrifugieren des erhaltenen Eluats, das Antigen HBsAg enthält, wird im Dichtengradienten durchgeführt, indem man als schweren Gradienten eine 50%ige Kalium- oder Natriumtartratlösung und als leichten Gradienten eine 25%ige Glycerinlösung im Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,8 verwendet. Das Ultrazentrifugieren wird 18 Stunden lang bei 90 000 × g und bei einer Temperatur von 4°C durchgeführt. Das Fraktionieren der Gradienten, die Bestimmung des Antigens HBsAg und die Dialyse werden analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Es werden 12 ml Anti genpräparat mit einer Aktivität von 82 µg/ml erhalten, was 76% von der auf den Gradienten aufgetragenen Antigen aktivität beträgt. Die Endausbeute am Antigen HBsAg im Vakzin entspricht 68%, bezogen auf den geklärten Extrakt, und der Gehalt an Begleitproteinen beträgt 5% des Gesamt proteingehaltes.

Beispiel 5

Der geklärte Hefezellenextrakt des Produzentenstammes wird analog dem Beispiel 1 mit der Ausnahme erhalten, daß dem Phosphatpuffer, mit welchem die Zellen vor der Zerstörung verdünnt werden, Triton X-100 bis zum Errei chen einer Endkonzentration von 0,2 Masse-% hinzugefügt wird. Nach der Klärung erhält man 250 ml Extrakt, der 8 µg/ml Antigen HBsAg enthält. Der erhaltene geklärte Extrakt wird wie in Beispiel 4 gereinigt. Es werden 16 ml Präparat mit einer Antigenaktivität von 82 µg/ml er halten. Die Verdünnung, Sterilisation und das Abfüllen des Vakzins werden wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 6

Der geklärte Hefezellenextrakt wird analog dem Beispiel 1 mit der Ausnahme erhalten, daß dem Phosphatpuffer De tergent Tween-80 bis zum Erreichen einer Konzentration von 1 Masse-% hinzugefügt wird. Nach der Klärung werden 280 ml Zellenextrakt mit einer Antigenkonzentration von 10 µg/ml erhalten. Der erhaltene Extrakt wird durch die Adsorptionschromatographie und Ultrazentrifugieren wie in Beispiel 4 gereinigt. Man erhält 18 ml Präparat mit einer Antigenkonzentration von 104 µg/ml. Die Verdünnung, Sterilisation und das Abfüllen des Präparats werden wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Beispiel 7

Zur Herstellung des rekombinanten Vakzins wird der rekom binante Hefestamm DBY 746/pNMVG 46 - der Produzent des Antigens HBsAg verwendet (N. N. Granovskÿ et al., Moleku lare Genetik, Mikrobiologie und Virusologie /Molekuljar naja genetika, mikrobiologÿa i virusologÿa/, 1986, Nr. 8, S. 12-19). Der Herstellungsprozeß des geklärten Ex trakts wird analog dem Beispiel 1 durchgeführt. Man er hält 250 ml geklärten Extrakt mit dem Gehalt am Antigen HBsAg von 30 µg/ml. Weiter verfährt man analog dem Bei spiel 4. Es werden 6 ml Präparat mit der Aktivität des Antigens HBsAg von 760 µg/ml erhalten. Die Endausbeute am Antigen in dem Vakzin beträgt 61%, bezogen auf den Gehalt im geklärten Zellenextrakt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Vakzinen gegen Hepatitis B, das die Züchtung des Produzenten hefestammes des Antigens HBsAg aufeinanderfolgend auf einem mit einer Phosphorquelle angereicherten Nähr medium, dann auf einem Nährmedium, das die Antigenre produktion sichert, und darauffolgende Zerstörung der Hefezellen, Isolierung und Reinigung des Antigens vor sieht, dadurch gekennzeichnet, daß als Nährmedium, das die Antigenreproduktion bewirkt, ein Nährmedium verwendet wird, das kleine Phosporquel len enthält, und die gleichzeitige Isolierung und Rei nigung des Antigens durch Absorptionschromatographie auf porösen Kieselerden mit darauffolgendem Ultrazen trifugieren in einem Dichtengradienten von 1,1 bis 1,3 kg/dm³ durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß als poröse Kieselerden Kiesel erden mit einer Porengröße von 1500 bis 2000 Å ver wendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Desorption bei der Chro matographie mit Hydrogencarbonatpuffer bei einem pH- Wert von 9,1 bis 9,5 erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß das Ultrazentrifugieren in einem Dichtengradienten von 50%iger Kalium- oder Natrium tartratlösung und 25%iger Glycerinlösung bei einem Verhältnis der genannten Komponenten von 1 : 1 erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß zur Erhöhung der Ausbeute an Endprodukt in der Stufe der Zerstörung der Hefezellen ein Detergent zugesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß als Detergent Tween-80 ver wendet wird.