DE1170582B

DE1170582B - Traeger fuer parenterale Vaccine- und Antigen-Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE1170582B
Application number: DEC28202A
Authority: DE
Inventors: George H Scherr; Abraham S Markowitz
Original assignee: CONS LAB Inc
Current assignee: CONS LAB Inc
Priority date: 1961-10-19
Filing date: 1962-10-17
Publication date: 1964-05-21
Also published as: SE328369B; CH470184A; FR1505310A; BE623825A; GB950498A; FR3561M; DK103795C

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Internat. Kl.: A 61 k

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1170 582

Aktenzeichen: C 28202 IV a / 30 h

Anmeldetag: 17. Oktober 1962

Auslegetag: 21. Mai 1964

Die Erfindung betrifft neuartige Träger für Vaccine- und Antigen-Zusammensetzungen. Diese neuartigen Träger enthalten ein lösliches, nicht toxisches Salz der Alginsäure mit bestimmten Eigenschaften, das bei Anwendung der mit diesem Träger hergestellten Vaccine- und Antigen-Zusammensetzungen in ein gelförmiges Alginat umgewandelt wird und hierdurch einen Depoteffekt hervorruft.

Die mit den erfindungsgemäßen Trägern hergestellten Zusammensetzungen können intramuskulär, subkutan und intradermal (intrakutan), jedoch nicht intravenös oder intraperitoneal verabreicht werden. Die Ausdrücke »Vaccine« und »Antigen« schließen sich gegenseitig nach üblichem Sprachgebrauch weder notwendig aus, noch sind sie notwendig synonym; in vielen Fällen haben sie jedoch dieselbe Bedeutung. Beide Mittel geben zur Bildung von Antikörpern Anlaß, und die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf beide. Die Erfindung ist darüber hinaus sowohl auf lösliche oder teilchenfreie wie auf unlösliche oder teilchenförmige Vaccinen und Antigene anwendbar, wenn auch auf Grund der physikalischen Tatbestände der Modus operandi bei beiden Gruppen etwas verschieden ist.

Die Erfindung führt zu Ergebnissen, die bisher während der bereits langen Entwicklung von Vaccine- und Antigenzusammensetzungen nicht für möglich gehalten wurden, obschon während dieser Zeit die Bedeutung und Notwendigkeit einer Verbesserung der Wirksamkeit, Erhöhung des Antikörper-Titers bei einmaliger Gabe und Herabsetzung der notwendigen Zahl von Gaben, die zur Erzielung eines wirksamen Antikörper-Titers vom Standpunkt des Mediziners aus als notwendig oder erwünscht betrachtet werden, voll erkannt worden war.

Es ist bereits seit langem bekannt, daß die Injektion bestimmter Substanzen oder Antigene in einen tierischen, einschließlich den menschlichen Körper, die Bildung gewisser, Antikörper genannter Stoffe auslöst, die mit der Substanz oder dem Antigen auf reproduzierbare Weise (im Reagenzglas, auf einem Nährboden oder in vivo) reagieren. Dieses Phänomen der Reaktion zwischen Antigen und Antikörper ist hinreichend bekannt und wurde z.B. von Landsteiner und Carpenter (Landsteiner, The Specificity of Serological Reactions, Harward University Press, Cambridge, Mass., 1947; Carpenter, Immunology and Serology, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1956) beschrieben.

Partikelförmige Antigene, wie sie z.B. in Vaccinen von Bakterien und Viren vorliegen, lösen im allgemeinen bei intravenöser Injektion einen höheren Träger für parenterale Vaccine- und Antigen-Zusammensetzungen

Anmelder:

Consolidated Laboratories, Inc.,

Chicago Heights, JIl. (V· St. A.)

Vertreter:

Dr. W. Beil, A. Hoeppener und Dr. H. J. Wolff,

Rechtsanwälte,

Frankfurt/M.- Höchst, Antoniterstr. 36

Als Erfinder benannt:

George H. Scherr,

Abraham S. Markowitz, Park Forest, JIl.

(V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 19. Oktober 1961 (37 504),
V. St. v. Amerika vom 8. November 1961
(150 892)

Antikörper-Titer aus als bei anderen Verabreichungsarten. Unter der Voraussetzung gleicher Antigenmengen ergeben lösliche Antigene gewöhnlich bei intramuskulärer Injektion (in das Gewebe) eine höhere Antikörperproduktion als bei intravenöser Injektion. Bei der Immunisierung wird im allgemeinen die Injektion in das Gewebe vorgezogen, da man hierbei weniger als bei wiederholter intravenöser Injektion die Erzeugung einer Anaphylaxie riskiert Auch ist bei der intravenösen Injektion die Gefahr der Embolie und des Eindringens von Mikroben größer.

Die verschiedenen Arten der Beimpfung mit dem Antigen sind auch von Einfluß auf den Grad der Antikörperbildung. Bei intravenöser Injektion muß das Antigen bekanntlich mehrmals im Verlauf eines längeren Zeitraums eingeführt werden, im allgemeinen mehrere Wochen lang mehrmals pro Woche. Dies gilt für teilchenförmige und lösliche Antigene. Wegen der obengenannten Nachteile und der Gefahr der Verödung der zugänglichen Venen wurden andere Zufuhrmöglichkeiten verwendet, z. B. die intraperi-

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toneale Injektion bei der Pasteurschen Behandlung gegen Tollwut. Diese Methode ist jedoch äußerst gefährlich und wurde daher nicht allgemein angewendet. Auch bei Einführung löslicher und teilchenförmiger Antigene und Vaccinen in das Gewebe, d. h. intramuskulär, ist gewöhnlich eine Serie von Injektionen erforderlich. Aus diesen Gründen wurden bereits zahlreiche Versuche unternommen, um die Bildung von Antikörpern bei der Einführung der

pies of Bacteriology and Immunity, 3. Auflage, Bd. 2, S. 1114 ff,).

Nachdem zahlreiche Salze der Alginsäure in den letzten Jahren auf den Markt kamen, wurde auch 5 deren Verwendbarkeit als Hilfsmittel im obigen Sinne diskutiert. Eine hervorstechende Eigenschaft einer Natriumalginatlösung besteht darin, daß in Gegenwart einer entsprechenden Konzentration an Calciumionen ein Niederschlag aus gelförmigem Calcium-Antigene in das Gewebe, d. h. bei intramuskulärer, io alginat entsteht, das von Körperfiüssigkeiten und Geintrakutaner oder subkutaner Injektion zu erhöhen weben allmählich absorbiert werden kann (Blaine, und damit die Anzahl der notwendigen Injektionen Experimental Observations on Absorbable Alginate herabsetzen zu können. Products in Surgery, Annals of Surgery, 125, Nr. 1,

Es hat sich nun gezeigt, daß bestimmte Substanzen S. 102 bis 114 [1946]). Amies (Amies, The Use bei Verwendung als Suspensionsträger von Antigenen 15 of Topically Formed Calcium Alginate as a Depot eine allgemeine Erhöhung des Antikörper-Titers Substance in Active Immunization, Journ. of Pathogegenüber dem ohne dieses Hilfsmittel erzielten Wert logy and Bacteriology, 77, Nr. 2, S. 435 bis 442 bewirken. Solche Hilfsmittel wurden zur Auslösung [1959]) verwendete daher eine Natriumalginatlösung einer vermehrten Bildung von Antikörpern bei der als Träger für Antigene, Vaccinen oder ähnliche Herstellung von Vaccinen gegen Infektionskrank- 20 Substanzen. Dieses Hilfsmittel fällt im Körper nach

heiten, von Antikörpern gegen verschiedene Toxine und von Antikörpern mit Schutzwirkung gegen schädliche Antigene bei allergischen oder hypersensitiven Zuständen verwendet.

Unter diesen Hilfsmitteln ist der Alaun der meistverwendete, z. B. bei der Herstellung von Vaccinen mit Diphtherie-Toxoiden oder Bakterien wie H. pertussis. Weitere bereits gebrauchte derartige Hilfsmittel sind z. B. Aluminiumhydroxyd, Fette,

anschließender Gabe eines Calciumsalzes oder m Gegenwart einer ausreichenden Konzentration an Calciumionen, die normalerweise im Gewebe vorhanden sind, als gelartiges Depot aus.
25 Bei Verwendung von Natriumalginatlösung als Suspendiermittel für Diphtherie-Toxoid beobachtete Amies bei Versuchstieren einen erhöhten Antikörper-Titer im Vergleich zu Suspensionen in Kochsalzlösung ohne Hilfsmittel. Gegenüber Suspensionen

Lanolin in Öl, Cholesterin, Calcium- und Magnesium- 30 mit Aluminiumphosphat (Alaun) war jedoch keine salze, bakterielle Produkte wie Typhoid-Vaccine Erhöhung der Antitoxinbildung zu verzeichnen; im (Ramon, Mitarbeiter) und Staphylococcentoxin Gegenteil zeigte sich das Alginat als halb so wirksam (Burky). Tuberkelbazillen (Freund, Mitarbeiter) wie der Alaun. Die Ergebnisse von Arbeiten mit sowie heterophile Antikörperseren (Kalinen, Mit- anderen Antigenen waren so zweideutig, daß sie nicht arbeiter) und sogar Tapioca (Ramon). Die meist- 35 referiert wurden. Nach der Veröffentlichung der verwendeten Hilfsmittel sind öl-in-Wasser-Emulsio- Arbeiten von Amies wurden Alginate sodann nicht nen und alaunartige Stoffe. Beide Klassen werden mehr praktisch verwendet. Slavin (Nature, 165, heute bei der menschlichen Immunisierung durch S. 115 [1950]) berichtet noch, daß er bei einer einzel-Einführung von Antigenen verwendet. Jedoch findet nen intraperitonealen Injektion einer mit Natriumkeine der genannten Substanzen breite Verwendung, 40 alginat bereiteten Bakterienvaccine keine befriedende da alle durch spezielle Nachteile beschränkt sind. Antikörperreaktion auslösen konnte. Zum Beispiel wird in der Literatur berichtet, daß Es wurde gefunden, daß zwischen verschiedenen

Öl-in-Wasser-Emulsionen von Antigenen und Vac- Alginatmolekülen bedeutende und entscheidende einen die Tendenz zeigen, die Bildung von Knötchen, Unterschiede bestehen, die nicht nur die Ursache sterilen Abszessen und anderen Hautveränderungen 45 wesentlicher physikalischer Unterschiede sind, welche zu verursachen. Auch dem Alaun werden derartige die Alginatmoleküle selbst und deren Lösungen Wirkungen zugeschrieben, wohingegen das Freund- kennzeichnen, sondern die auch für vorliegende sehe Hilfsmittel (mit Tuberkelbazillen), das unter Zwecke mit Vorteil ausgenutzt werden können, allen bisher bekannten Mitteln den Antikörper-Titer Als wesentlich ist die Tatsache zu nennen, daß die

am wirksamsten erhöht, wegen möglicher carcinogener 50 erfindungsgemäßen Natriumalginatlösungen frei flie-Erscheinungen und dem Verlust der diagnostischen ßend sind und in Konzentrationen von 5% (Gew./ Bedeutung eines anschließenden Tuberkulintests Vol.) oder sogar darüber eine Nadel der Stärke 24 nicht verwendet wird. leicht passieren, während Amies seine Natriumalgi-

. Die Wirkungsweise, nach welcher derartige Hilfs- natlösung zu diesem Zweck auf 1 %> (Gew./Vol.) vermittel bei Vaccinen die Antikörperproduktion er- 55 dünnen mußte.

höhen und verlängern, ist nicht bekannt. Zahlreiche Die zum Zeitpunkt der Arbeiten von Amies zuHypothesen wurden bereits vorgeschlagen, so gänglichen Natriumalginatlösungen und die erfin-(a) Schutz des Antigens gegen Zerstörung durch dungsgemäß verwendeten Lösungen unterscheiden Enzyme oder andere Reaktionen des Körpers, (b) die sich nicht nur hinsichtlich der Viskosität, sondern langsame, kontinuierliche Freisetzung des Antigens 60 auch in anderen physikalischen und chemischen von der Impfstelle aus durch eine Depotwirkung oder Eigenschaften, die auf einen grundlegenden UnterStimulierung von Gewebebeschädigungen oder (c) die schied hindeuten. Im Fiske-Osmometer ergeben die Zellreaktion, die durch das Hilfsmittel selbst oder erfindungsgemäß verwendeten Alginate eine MiIIiein mit ihm zusammenwirkendes Antigen hervor- osmolarität von weniger als 150 und vorzugsweise gerufen wird. In dieser Hinsicht ist die Beobachtung 65 von 100 bis 125, während die Milliosmolarität bei interessant, daß der Effekt von Alaun und Tapioca den bisher erhältlichen Alginaten wesentlich höher von führenden Forschern auf denselben Mechanis- lag. Die vorstehend erwähnten Unterschiede sind mus zurückgeführt wird (s. T op ley, Wilson, Princi- von weiteren unterscheidenden physikalischen und

chemischen Eigenschaften begleitet, die bei den erfindungsgemäß verwendeten und den bisher erhältlichen Alginaten zu verzeichnen sind.

Während das Maß dieser Unterschiede weder bekannt noch verständlich ist, läßt sich doch schon mit Sicherheit sagen, daß diese Unterschiede, wie auf verschiedene Weise belegt, überraschend groß sind, auch im Hinblick auf die bei der Verwendung gemäß vorliegender Erfindung erzielten Ergebnisse.

Das erfindungsgemäß verwendete, lösliche Alginat wie z. B. Natriumalginat hat folgende Eigenschaften:

(a) in 5°/oiger wäßriger Lösung (Gew./Vol.) passiert es leicht eine Injektionsnadel Nr. 24;

(b) in 4°/oiger wäßriger Lösung (Gew./Vol.) besitzt es eine Viskosität von weniger als 50, im allgemeinen weniger als 30 und vorzugsweise weniger als 20 cSt;

(c) der pjj-Wert kann in 4°/oiger Lösung stark schwanken, liegt aber im allgemeinen zwischen 7,0 und 7,8 und vorzugsweise zwischen 7,2 und 7,6;

(d) ein Äquivalentgewicht unter 250, im allgemeinen unter 225 und vorzugsweise, zwischen 188 und 220;

(e) eine Milliosmolarität von weniger als 150 pro Kilogramm Wasser, vorzugsweise von 100 bis 125, gemessen im Fiske-Osmometer;

(f) Gehalt an Spurenelementen und anderen Kationen in physiologisch verträglichen Mengen.

Die Erfindung betrifft somit neue Träger für Vaccine- und Antigen-Zusammensetzungen, die ein lösliches Alginat mit den genannten neuen Eigenschaften enthalten und sich zur intramuskulären, intradermalen oder subkutanen Verabreichung eignen unter Bildung von erhöhten Antikörper-Titern.

In der Literatur findet sich reichliches Material über Alginsäure und die Alginate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und Reinigung durch Hydrolyse von Algen. Bei der sauren Hydrolyse wird das Molekül durch Abbau der Polymerkette verändert. Es wird angenommen, daß das erfindungsgemäß zur Verwendung gelangende Alginat eine verhältnismäßig kurze durchschnittliche Kettenlänge aufweist. Es wird durch saure Hydrolyse von Alginsäure gewöhnlicher Kettenlänge und anschließende Umwandlung in das gewünschte Salz, das mit der verminderten Kettenlänge die vorstehend genannten Bedingungen erfüllt, erhalten. Auch andere Verfahren zum Abbau der Alginsäure-Polymerkette und/oder Bildung'der Alginate mit den genannten Eigenschaften aus normal erhältlicher Alginsäure und entsprechenden Alginaten können verwendet werden. Auch können verschiedene Verfahren zum Abtrennen und Fraktionieren von Alginsäure und Alginaten mit relativ kurzer durchschnittlicher Kettenlänge aus verwandten Produkten angewandt werden, wobei lediglich die Voraussetzung besteht, daß am Schluß die vorstehend genannten Eigenschaften der Alginate vorliegen. Das Alginat wird dann in üblicher Weise in Lösung gebracht. In welcher Weise hierbei zu verfahren ist, kann der Veröffentlichung »Propecties of Alginates«, herausgegeben von der Alginate Industries, Ltd., Walter House, Bedfort St., Strand, London W. C. 2, entnommen werden. Eine geeignete Alginatlösung von 4% (Gew./Vol.), die die geforderten Eigenschaften aufweist, ist im Handel erhältlich (Medical Alginates, Ltd., Perivale, Middlesex, England).

Die Herstellung einer geeigneten Alginatlösung kann wie folgt vorgenommen werden: 4 kg Natriumalginat oder sonstiges lösliches Alginat in Pulverform werden zu 100 1 pyrogenfreiem destilliertem Wasser gegeben, das Gemisch wird mechanisch gerührt und mit 1,5 kg Entfärbungskohle versetzt. Nach etwa 5tägigem Stehen in steriler Atmosphäre wird eine Probe entnommen und gegenüber Standardlösungen geprüft. Falls die Eigenschaften nicht innerhalb der

ίο vorbestimmten Grenzen liegen, werden sie sodann korrigiert. Die eingestellte Lösung wird zwecks Entfernung der Kohle filtriert und dann durch ein bakteriologisches Filter gegeben, in entsprechende Behälter abgefüllt und im Autoklav unter entsprechenden Temperatur- und Druckbedingungen, z. B. 15 Minuten bei 1,1 at sterilisiert. Das Produkt ist eine transparente, sterile, pyrogenfreie, als Hilfsmittel für Vaccine- und Antigen-Zusammensetzungen geeignete Lösung.

In den folgenden Beispielen wurde eine 4 °/o (Gew./ Vol.) Natriumalginat enthaltende Lösung verwendet. Sie besaß folgende Eigenschaften:

(a) Sie passierte leicht eine Nadel Nr. 24 (gauge);

(b) die Viskosität betrug höchstens 20 cSt;

(c) p_H-Wert zwischen 7,2 und 7,6;

(d) Äquivalentgewicht zwischen 188 und 220;

(e) Milliosmolarität, im Fiske-Osmometer gemessen, etwa 111,5;

(f) keine Absorptionsmaxima zwischen 1000 und 400 ΐημ und nur schwache Absorption direkt oder nahe bei 270 πΐμ (die bisher erhältlichen Natriumalginate zeigten ein deutliches Absorptionsmaximum bei 270 πΐμ);

(g) Gehalt an Spurenelementen in physiologisch verträglichen Mengen (Blei <C 1 Teil je Million, Kupfer = 1 Teil je Million, Arsen = 0) und ebenfalls physiologisch verträgliche Mengen anderer Kationen (Na⁺ = 161 Milliäquivalent, Ca⁺+= 8,6 Milliäquivalent).

Eine Verdünnung oder Einengung der Lösung im. Rahmen von 1 bis 5¹Vo beseitigt weder die Verträglichkeit noch die vorteilhaften Ergebnisse bei der Verwendung; jedoch werden Lösungen von mehr als 2 °/o und insbesondere von etwa 4 °/o bevorzugt.

Die erfolgreiche Herstellung von Antigen- und Vaccine-Zusammensetzungen mit Alginat als HiMsstoff fordert die Kenntnis des Depoteffekts, der durch Umwandlung des Natriumalginats (löslich) in das Calciumalginat (gelförmig) bewirkt wird. Daher muß mindestens der Calciumgehalt und vorzugsweise Calcium- und Natriumgehalt der Antigen- oder Vaccinlösung oder -suspension bekannt sein.

Die Ausfällung des Alginats erfolgt auf Grund der Anwesenheit von Calciumionen oder anderen unlöslich machenden Ionen, die normalerweise im Gewebe vorliegen oder vor, gleichzeitig mit oder nach Vergabe des alginathaltigen Vaccins oder Antigens an die Stelle der Injektion gebracht werden oder in der mit Alginat versetzten Vaccine- oder Antigen-Zusammensetzung bereits, jedoch in Form eines Chelats, vorliegen.

Selbstverständlich soll die Vaccine- oder Antigen-Zusammensetzung, die dem löslichen Alginat, ζ. Β.

Natriumalginat, zugesetzt wird, keine unlöslich machenden Ionen, wie'z.B. Calciumionen, in eine Ausfällung bewirkenden Mengen enthalten, ehe die Injektion vorgenommen werden kann. Da yerschie-

dene Vaccine und Antigene verschiedene Herstellungsverfahren erfordern, ist die Konzentration an (am ehesten vorhandenen) Calciumionen in diesen Präparaten von Fall zu Fall zu bestimmen.

Falls die Konzentration an Natriumionen oder anderen, löslich machenden Ionen in dem Vaccin- oder Antigenpräparat zu hoch ist, kann von der alginathaltigen Zusammensetzung nach der Injektion nicht leicht ein Depot angelegt werden auf Grund

auch wenn die Aufspaltung bereits in der Zusammensetzung vorliegender chelatartig gebundener, unlöslich machender Ionen für diesen Vorgang verantwortlich ist, da die Bildung von unlöslichem Gel 5 zu diesem Zeitpunkt die Erzielung der Vorteile der Erfindung behindert. Sollte sich etwas Gel bilden, so kann dieses abfiltriert oder homogenisiert werden; ein klares, gelfreies Produkt ist jedoch bei weitem vorzuziehen. Auch die Konzentration der Alginat

der Konkurrenz zwischen Calciumionen und anderen io löslich machenden Ionen muß berücksichtigt werden, unlöslich machenden Ionen im Gewebe und über- abgesehen von der notwendigen physiologischen Verschüssigen Natriumionen oder anderen löslich träglichkeit des Gesamtionengehalts der Zusammenmachenden Ionen in der alginathaltigen Zusammen- Setzung, sowohl, wenn man sich auf die Konzentrasetzung, falls nicht chelatartig gebundene Calcium- tion der natürlich vorhandenen oder der Injektionsionen od. dgl. vorhanden sind oder andere unlöslich 15 stelle zugeführten unlöslichmachenden Ionen oder machende Ionen an die Stelle der Injektion verbracht ihre Anwesenheit in chelatartig gebundener Form werden. verläßt, da die relativen Mengen von unlöslich-

Wie bereits erwähnt, erfordern verschiedene Vac- machenden und löslichmachenden Ionen, die gegen-

cinen und Antigene verschiedene Herstellungsmetho- über der vorhandenen Alginsäure konkurrieren,

den, und auch die Konzentration der Natriumionen ao darüber entscheiden, ob letztlich genügend unlöslich

wird vorzugsweise in jedem Fall bestimmt. machende Ionen vorhanden sind, um nach der Injek-

Calciumionen oder andere unlöslich machende tion den gewünschten Depoteffekt zu bewirken. Die Ionen können der alginathaltigen Vaccine- oder Bestimmung der Konzentration an löslich und unlös-Antigen-Zusammensetzung chelatförmig gebunden lieh machenden Ionen ist leicht durchführbar und zugesetzt werden, ohne daß eine Ausfällung von 25 stellt für den Fachmann keine Schwierigkeit dar. Es unlöslichem Alginat erfolgt. Da das chelatbildende ist lediglich notwendig, während der Herstellung der Mittel an der Stelle der Injektion durch körpereigene Zusammensetzung zur Bildung eines Niederschlags Stoffe gespalten wird, erfolgt bei der Injektion der- ungenügende Mengen an nicht chelatartig gebundeartiger Zusammensetzungen in das Gewebe eine Frei- nen, unlöslich machenden Ionen aufrechtzuerhalten, setzung der Calciumionen oder anderer Ionen, die 30 dagegen an der Injektionsstelle für eine die Depotdas Alginat unlöslich machen oder ausfällen, die so- bildung aus unlöslichem Alginat bewirkende Konzen-

dann in situ zur Bildung eines Depots aus unlöslichem Alginatgel befähigt sind.

Die Calcium- und Natriumionenkonzentration der

tration an nicht chelatartig gebundenen, unlöslich machenden Ionen Sorge zu tragen. Nicht toxische Alginate, die an Stelle des Natriumsalzes verwendet

4%igen Alginatlösung betrug in den vorliegenden 35 werden können, sind, unter der Voraussetzung der Beispielen 8,6 bzw. 161 Milliäquivalent (Flammen- vorstehend beschriebenen Eigenschaften, das Kalium-

und Ammoniumalginat und ähnliche lösliche Salze mit nicht toxischen Kationen.

An Stelle des Calciumalginats können auch andere

photometer).

Es wurde z. B. auch gefunden (s. Beispiel 2), daß
eine Konzentration von 75 Miliäquivalent Natriumionen in der Vaccine von S. typhosa nicht ausreichte, 40 unlösliche Alginate in situ gebildet werden, z. B. um die Wirkung einer Calciumchloridlösung mit bis Salze der anderen Erdalkalimetalle wie Magnesium, zu 100 Milliäquivalent Calciumionen unter Fällung Barium und Strontium. Diese Metalle können in von Calciumalginat zu unterbinden. Form organischer oder anorganischer Salze zugeführt

Die Herstellung der lösliches Alginat enthaltenden werden. Zur Zufuhr dieser Metalle geeignete Salze Vaccine- oder Antigen-Zusammensetzung erfolgt 45 sind z. B. die Chloride, Carbonate, Lactate, Citrate, durch Mischen des Alginate oder der Alginatlösung Gluconate, Acetate, Propionate. Diese Materialien mit der entsprechenden Antigen- oder Vaccine- können allgemein als physiologisch verträgliche Algi-Lösung oder -Suspension und Einstellen des p_H-Werts natfällungsmittel bezeichnet werden. Sie können vor, auf einen physiologisch verträglichen Wert, z.B. nach oder gleichzeitig mit der alginathaltigen Vaccinezwischen 7,0 und 7,8 sowie der verschiedenen Be- 50 oder Antigen-Zusammensetzung an oder in der Nähe standteile auf die jeweils vorbestimmte Konzentration. der Stelle, wo letztere injiziert wird, in Form einer Konservierungsmittel können zu diesem oder einem sterilen, nicht pyrogenen Lösung oder Suspension sonstigen geeigneten Zeitpunkt des Verfahrens zu- ebenfalls injiziert werden, um die Ausfällung des gegeben werden. Während dieses Mischvorganges unlöslichen Alginats in situ im tierischen Körper muß die Konzentration an nicht chelatartig gebunde- 55 hervorzurufen. Das unlöslich machende Kation kann nen, das Alginat unlöslich machenden Ionen wie auch in der Antigen- oder Vaccine-Zusammensetzung Ca⁺⁺, die meist im Alginat oder der Alginatlösung in komplex oder chelatartig gebundener Form vorvorliegen, unter der eine Ausfällung bewirkenden liegen, die in der Zusammensetzung stabil ist, jedoch Konzentration gehalten werden. Die Menge an vor- nach der Injektion durch Enzyme oder sonstige handenem Calcium oder anderen unlöslich machen- 60 Reaktionen des Körpers gespalten wird, wobei das den Ionen kann leicht durch Titration bestimmt unlöslich machende Kation in situ freigesetzt wird, werden. Die Aufrechterhaltung einer unter der fällend um das gewünschte, die Vaccine oder das Antigen wirkenden Menge liegenden Konzentration an nicht potenzierende Alginatdepot zu bilden, chelatartig gebundenen, unlöslich machenden Ionen Unter den gewünschtenfalls in üblichen Konzenist erforderlich, sowohl wenn bei Injektion der Zu- 65 trationen zur Sonservierung der erfindungsgemäßen sammensetzung natürlich vorhandene oder der Injek- Zusammensetzung verwendbaren Mitteln sind die tionsstelle zugeführte unlöslich machende Ionen für p-Amino-benzoesäureester, sechswertige Alkohole die Depotbildung in situ verantwortlich sind, wie wie Sorbit, Mannit, Inosit oder Dulcit oder Phenole

wie Phenol selbst, Kresol, Chlorkresol oder Chlorhexol, Formaldehyd, Quecksilberverbindungen wie die Merthiolate u. dgl. zu nennen. Antibiotika und Fungizide können auch zugesetzt werden, falls ihre Anwesenheit die primäre Wirkung der Vaccine- oder Antigen-Zusammensetzung nicht stört.

Die Konservierungsmittel müssen physiologisch verträglich sein. Die Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung erfolgt durch parenterale Injektion intramuskulär, intradermal oder subkutan, und zwar sowohl bei teilchenförmigen wie auch gelösten Vaccinen oder Antigenen. Wie vorliegend und insbesondere in den Beispielen beschrieben, ist die einmalige Injektion der mit Hilfsmittel versehenen Vaccine- oder Antigen-Zusammensetzung in den lebenden tierischen Körper gewöhnlich ausreichend, um die gewünschten, bisher unerreichten Antikörper-Titer zu erzielen. Die zusätzliche Anwendung von Alginat unlöslich machenden Ionen (welche nicht schon natürlicherweise an der Stelle der Injektion vorhanden sind), entweder durch Zusatz chelatartig gebundener Ionen, die von Reaktionen des Körpers freigesetzt werden, oder durch anderweitigen Zusatz von nicht chelatartig gebundenen, Alginat unlöslich machenden Ionen an der Injektionsstelle dient nur zur weiteren Erhöhung der Wirkung der Grundzusammensetzung bei der Erzeugung des Antikörper-Titers. :

Ist das aktive Material in der Vaccine- oder Antigen-Zusammensetzung nicht teilchenförmig, so herrscht eine veränderte Situation. Obgleich erfindungsgemäß alginathaltige, nicht teilchenförmige Vaccine- oder Antigen-Zusammensetzungen neu sind und die vorliegend verwendeten Alginate sich von

ίο den bisher gebräuchlichen stark unterscheiden, ist zu sagen, daß die Erhöhung des Antikörper-Titers hier nicht bedeutend ist, falls man nicht zusätzliche, Alginat unlöslich machende Ionen über die natürlicherweise an der Stelle der Injektion verfügbare

x5 Menge hinaus vorsieht. Enthalten jedoch diese aus nicht teilchenförmigen! Vaccine- oder Antigenmaterial gebildeten Zusammensetzungen Alginat unlöslich machende Ionen in chelatartig gebundener, durch Reaktionen des Körpers aufspaltbarer Form oder werden derartige Ionen der Injektionsstelle anderweitig zugeführt, so sind die Ergebnisse wiederum äußerst günstig gegenüber den mit bekannten Hilfsmitteln erzielten Ergebnissen.
Eine Zusammenfassung der erfindungsgemäßen Möglichkeiten ergibt folgendes:

Art der Vaccine oder des antikörperaktiven Prinzips	Art der Injektion	Zusatz von Alginat unlöslich machenden Ionen *
Teilchenförmig Nicht teilchenförmig	IM, ID, SK IM, ID, SK	gewöhnlich nicht notwendig; hervorragende Antikörper- Titer ohne, jedoch weitere Erhöhung mit Zusatz unlös lich machender Ionen stets erforderlich für gute Antikörper-Titer

* Entweder chelatartig vorliegend und dann gespalten oder durch vor, nach oder gleichzeitig mit der Vaccine- oder Antigen-Injektion erfolgende Injektion.

Präparat 1 bis 4

(1) Ein Hilfsmittel nach Freund wurde hergestellt, indem man 2 Volumteile weißes Mineralöl (Bayol F) mit 1 Volumteil gereinigtem Lanolin (Falba) mischte und diesem Gemisch in der Hitze abgetötete, lyophilisierte Zellen von M. tuberculosis, menschlicher Stamm H 37 Ra, in solcher Menge zusetzte, daß eine Endkonzentration von 2 mg Zellmaterial pro 6 ml Mineralöl-Lanolingemisch erhalten wurde.

(2) Ein Hilfsmittel aus Alaun wurde durch Mischen gleicher Volumina einer l%igen Aluminium-Ammoniumsulfat-Lösung und lVoigem Ammoniak hergestellt, wobei man den Niederschlag beim Stehen über Nacht absetzen ließ. Er wurde dann gesammelt und mit destilliertem Wasser von Ammoniumionen freigewaschen. Der durch Zentrifugieren von suspendierender Flüssigkeit befreite Niederschlag stellt ein dickes Gel dar, das noch pipettiert werden kann.

(3) Das Natriumalginat enthaltende Hilfsmittel wurde als reizlose, pyrogenfreie 4°/oige Lösung mit einer Viskosität von etwa 20 cSt, einem p_H-Wert zwischen 7,2 und 7,6, minimalem Gehalt an Blei (< 1 Teil je Million), Kupfer (1 Teil je Million) und Arsen (0), einem Äquivalentgewicht zwischen 188 und 200, einer Milliosmolarität (Fiske) pro Kilogramm Wasser von 111,5 hergestellt, die im Bereich von 270 m|x nur schwache Absorption und zwischen 1000 und 400 πΐμ keine Absorption zeigte.

(4) Es wurde eine Zellsuspension von Salmonella typhosa im Antigenzustand 0 hergestellt, indem man Hirn-Herz-Agarschrägnährböden mit einer Kultur von S. typhosa beimpfte und nach 18stündiger Inkubation bei 37° C die Kultur mit normaler Kochsalzlösung vom Schrägnährboden abwusch. Diese Suspension wurde zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, während die Zellen in frischer Salzlösung wieder suspendiert wurden. Dieser Waschvorgang wurde so lange wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit klar war. Dann wurden die Zellen nochmals zentrifugiert und danach dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Abtötung erfolgte durch 1 stündige Behandlung in einem Wasserbad bei 60° C. Die Anzahl der Zellen wurde nephelometrisch bestimmt.

Beispiel 1

(a) Die Zellsuspension von S. typhosa wurde dem Hilfsmittel nach Freund im Verhältnis 1 Volumteil Zellsuspension zu 3 Volumteilen Hilfsmittel zugesetzt, wobei die Endkonzentration 8,0 · 10⁸ Zellen je Milliliter betrug. 1 ml dieser Suspension wurde drei 2 kg schweren Kaninchen intramuskulär injiziert. Die Injektionen erfolgten in die Oberschenkelmuskulatur, wobei wechselweise das rechte und das linke Bein verwendet wurde. Die Injektionen erfolgten insgesamt dreimal je Tier in Abständen von einer Woche. Die Tiere wurden durch Herzpunktion 1 Woche nach der letzten Injektion entblutet.

(b) Die S. typhosa-Vaccine in Alaun wurde hergestellt, indem man gleiche Volumina an Zellsuspension

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dem gelatinösen Alaunpräparat zugab, wobei die Endkonzentration im fertigen Gemisch 8,0 ■ 10⁸ Zellen je Milliliter betrug. Die Injektion und das Entbluten der Versuchstiere erfolgten wie unter (a) angegeben.

(c) Die Zellsuspension in der Natriumalginatlösung wurde hergestellt, indem man eine Suspension von S. typhosa zentrifugierte, wobei die überstehende Flüssigkeit verworfen wurde, um einen Zellkuchen zu erhalten. Dieser wurde mit der 4°/oigen Natriumalginatlösung in solchen Mengen versetzt, daß je Milliliter der resultierenden Suspension 8,0 · 10⁸ Zellen vorlagen. Injektion und Entbluten der Versuchstiere siehe unter (a).

(d) Eine vierte Gruppe von 2 kg schweren Kaninchen wurde mit einer Suspension von S. typhosa in destilliertem Wasser (8,0 · 10⁸ Zellen je Milliliter) in der unter (a) beschriebenen Weise behandelt.

Ergebnisse

Die Titer der Seren aus dem Blut der Tiere wurden bestimmt, indem man 0,5 ml des Serums mit 0,5 ml Salzlösung in üblicher Weise verdünnte und jeder dieser Lösungen 0,5 ml einer Suspension von S. typhosa mit 1,8 · 10⁹ Zellen je Milliliter zusetzte. Die Reagenzgläser wurden 2 Stunden bei 37° C und etwa 18 Stunden bei 4° C bebrütet. Der Endpunkt der Agglutination wurde durch Untersuchung der Röhrchen nach 3minutigem Zentrifugieren mit 1500 UpM bestimmt. Die Bestimmung des Titers erfolgt, indem man die Bodenfläche des Glases leicht anschlägt und die physikalischen Eigenschaften des Sediments aus Bakterien beim Hochsteigen aus dem Zellkuchen beobachtet. Die Agglutination wurde als positiv bezeichnet, wenn eindeutig erkennbare Agglomerate gefunden wurden. Folgende Titer wurden erhalten:

Tabelle I

Antikörperproduktion auf S. typhosa mit verschiedenen Hilfsmitteln

Kaninchen Nr.	Hilfsmittel	Alaun	Titer	Durch schnittlicher Titer
TA 13	Freund	Alaun	1 :64
TA 19	Freund	Alaun	1:128	1:106
TA 75	Freund	Natriumalginat	1: 128
TB 59	—	Natriumalginat	1:4
TB 64	-—.	Natriumalginat	1:8	1:6
TB 95	—	1:8
TC 65	1:16
TC 74	1:16	1:21
TC 47	1 :32
TD 26	1:256
TD 35	1 :512	1:426
TD4	1 :512

Der durchschnittliche Titer ist bei den drei mit alaunhaltiger Zellsuspension behandelten Tieren etwa drei- bis viermal so hoch wie bei den ohne Hilfsmittel behandelten. Wie zu erwarten, war auch das Hilfsmittel nach Freund dem Alaun überlegen und lieferte einen etwa fünfmal so hohen Titer als letzterer. Mit Natriumalginat wurde ein Antikörper-Titer gefunden, der etwa fünfmal so hoch wie der mit dem Freundschen Hilfsmittel und etwa einundzwanzigmal so hoch wie der mit Alaun erzielte Titer war.

Präparat 5

Es wurde als unwahrscheinlich betrachtet, daß im Gewebe der Versuchstiere genügend Calciumionen zur Ausfällung des Calciumalginats vorlagen. Diese Überlegung wurde unterstützt durch Titrationsversuche, bei welchen die notwendigen Calciumkonzentrationen zur Ausfällung von 2- und 4°/i>igen (Gew./ Vol.) Natriumalginatlösungen bestimmt wurden.

Aus Tabelle II geht hervor, daß die Gelierung einer ursprünglich 4°/oigen, entweder mit Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung auf 2°/o verdünnten Natriumalginatlösung mit 35 bis 55 Milliäquivalent Ca⁺+ (als CaCl₂) eintritt, wenn Ca⁺+- Lösungen im Verhältnis 1 :1 zugegeben werden.

Tabelle II

Titration von Natriumalginat mit CaCl.,

(Lösungen in Kolonne A, B und C

in gleichen Mengen [1 ml zu 1 ml]

Ca⁺+-Lösungen zugesetzt)

25	CaCl₂	(A)	(B)	(C)
	(Mäq.Ca++)	4⁰O Na-alginat	4" 0 Na-alginat
	+ dest. H.,O	+ Kochsalz	4 Vo Na-
	(1:1)"	lösung (1:1)	alginat
100	(Endkonzen	(Endkonzen	(unverdünnt)
90	tration = 2" 0)	tration = 2 "/0)
80	₊	₊	₊
35 ⁷⁰	-f-	-j-	+
60	+	-f	+
55	+	+	+
50		-f-	-f-
45		+	±
40 40	+	+	—
35		+	—
30	±	+	—
20	—	±	—
10	—	—	—
4S 5	—	—	—
—	—	—
—	—	—

4- = Gelbildung.

— = keine Gelbildung.

Beispiel 2

Um größere Mengen der S. typhosa-Vaccine mit Calciumalginat zu deponieren, wurde folgender Versuch unternommen, bei welchem eine Calciumchloridlösung unmittelbar nach der natriumalginathaltigen Vaccine injiziert wurde:

Als Versuchstiere dienten drei Kaninchen; die Injektionen und das Entbluten erfolgten wie im Beispiel 1 beschrieben. Jede injizierte Probe enthielt wiederum 8,0 · 10⁸ Zellen je Milliliter, und in jedem Fall wurde 1 ml der in 4°/oiger Natriumalginatlösung suspendierten S. typhosa-Vaccine injiziert. Die Nadel verblieb in der Einstichstelle, während die Spritze durch eine andere ersetzt wurde, die eine Calciumchloridlösung mit 75 Milliäquivalent Calcium enthielt und von der sodann 1 ml injiziert wurde.

Die gefundenen Titer sind in Tabelle III wiedergegeben. Die Titer liegen wesentlich über den mit anderen Hilfsmitteln erhaltenen Werten (s. Tabelle I)

und sind nahezu dreimal so hoch wie bei Natriumalginat ohne CaCU-Zusatz.

Tabelle III

Mit S. typhosa-Vaccine in 4 °/o Natriumalginat

und anschließend mit CaCl₂ in situ

injizierte Kaninchen

Kaninchen Nr.	Titer	Durchschnitt
1 2 3	1:1024 1:4096 1:2048	1:2389

Beispiel 3

Parallele Versuche wurden durchgeführt mit Kaninchen, die einerseits mit einer Vaccine-Suspension von Poliomyelitis, Stamm Nr. 2, enthaltend Freundsches Hilfsmittel, und andrerseits mit demselben Stamm in 4°/oiger Natriumalginatlösung gemäß Beispiel 1 geimpft worden waren.

Der Vergleich der Antikörper-Titer erfolgte mit Hilfe von Gewebskulturen von Heiazellen bei verschiedenen Verdünnungen äquivalenter Serumproben, wobei der Titer am Grad der Verdünnung, bei welcher wirksame Inhibierung auftrat, gemessen wurde; positive Inhibierung wurde bei 5O°/oiger Reduktion bei der Zählung auf dem Objektträger angenommen.

Die durchschnittliche Verdünnung, bei der positive Inhibierung eintrat, war folgende:

Vaccine mit Hilfsmittel

nach Freund

1:400

mit Natriumalginat 1: 2000

Das Natriumalginat war somit bei der Erhöhung des Antikörper-Titers mindestens fünfmal so wirksam wie das Freundsche Hilfsmittel.

Beispiel 4

Unter den weiteren Vaccine- und Antigen-Zusammensetzungen, von denen zahlreiche heute bekannt und frei erhältlich sind, welche abgetötete, abgeschwächte oder lebende Mikroorganismen oder organische Antigene enthalten und deren Wirksamkeit bezüglich des Antikörper-Titers durch Verabreichung in der erfindungsgemäßen, 1 bis 5 Gewichtsprozent enthaltenden Zusammensetzung wesentlich gesteigert wird, sind z. B. zu nennen: Vaccinen: Pocken-, Gelbfieber-, Staupe-, Schweinecholera-, Hühnerpokken-Vaccine, Antigifte (z. B. Latrodectus Mactans, Crotalidae), Scharlachvaccine, Diphtherie-Toxoid, Tetanustoxoid, Taubenpocken-, Keuchhusten-(H. pertussis), Influenza-, Tollwutvaccine, Antihemophilus-Influenza-Serum, Mumps-, Masern-, Poliomyelitisglobulin (Serum oder Immun) Geflügelpest-Vaccinen.

Antigene: Antigene des Pollens von Ambrosiagräsern, anderer Pollen wie Heufieberpollen, Tuberkulin-, Mumps-, Staub-, Milchantigene oder Fraktionen, Bestandteile, Abbau- oder Hydrolyseprodukte von Mikroorganismen und andere allergene Produkte. Im Bereich der Allergien werden schützende oder reizvermindernde Antikörper normalerweise nach der Injektion von Antigenen gebildet.

Beispiel 5

Ein aus 50 mg elektrophoretisch homogenem menschlichem y-Globulin bestehendes lösliches Antigen wurde in dem 4%igen Natriumalginat-Hilfsmittel der vorangehenden Beispiele gelöst. Diese Zusammensetzung wurde Kaninchen in drei Dosen von je 1 ml in Abständen von je 1 Woche injiziert. 1 Woche nach der letzten Injektion wurden die Kaninchen entblutet.

Weitere Kaninchen wurden bei gleichen Bedingungen mit demselben Antigen, jedoch mit Hilfsmittel nach Freund, mit Alaun und ohne Hilfsmittel, be-

Lo handelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Antikörperbildung auf menschliches y-Globulin
in mit Hilfsmitteln

	Hilfsmittel	Alaun	Antikörper-	Titer- durch- schnitt
Kaninchen Nr. 20		Alaun	Stickstoff je Milliliter . Serum (in Mikro-
	Freund	Alaun	gramm)
HE 28	Freund	Natriumalginat	129	106
HE 46	Freund	Natriumalginat	73
^a5 HE 44	—	Natriumalginat	118
HF 25		5	6
HF 70	—	3
HF 87	12
HG 29	56	49
3° HG 82	51
HG 92	41
HH 16	25	18
HH 60	9
HH 14	21

Im vorstehenden Fall war das Natriumalginat als Hilfsmittel nicht wirksamer als der Alaun. Die Ergebnisse damit waren jedoch denen bei Versuchen ohne Hilfsmittel überlegen.

Durch Injektion von CaCl₂-LOSiUIg in situ gemäß Beispiel 2 im Anschluß an die Injektion der Natriumalginat-y-Globulin-Zusammensetzung wird jedoch eine wesentlich höhere Antikörperbildung als mit üblichen Hilfsmitteln hervorgerufen. Dieselben vorteilhaften Ergebnisse erhält man bei Einverleibung chelatartig gebundener Calciumionen in die Natriumalginat -γ- Globulin - Zusammensetzung gemäß Beispiel 6.

Beispiel 6

Calciumionen können der Natriumalginatlösung auch in chelatartig gebundener Form zugesetzt werden, die die Ausfällung von Calciumalginat als Gel verhindert. Äthylendiamintetraessigsäure (ÄDTE) reagiert z. B. mit den meisten Metallionen unter Bildung nichtionischer Chelate. Mischt man eine CaI-ciumchloridlösung mit ÄDTE, so erhält man ein lösliches Produkt, das bei Zusatz zu der Natriumalginatlösung keine Fällung von Calciumalginat hervorruft. Die entsprechende Zusammensetzung aus Natriumalginat, CaCl₂-Chelat und Antigen oder Vaccine wird dann parenteral (intradermal, subkutan oder intramuskulär) injiziert. Unter dem Einfluß der Gewebs- und Körperflüssigkeiten wird das Calcium freigesetzt und in Ionenform zur Umsetzung mit dem Natriumalginat zur Verfügung gestellt. Dabei wird das erwünschte Vaccine- oder Antigendepot gebildet, ohne daß eine zweite Injektion zu diesem Zweck

nötig wäre. Die so verabreichten Antigene oder Vaccinen können teilchenförmig oder nicht teilchenförmig sein. Die Äthylendiamintetraessigsäure kann selbstverständlich auch durch andere physiologisch verträgliche Chelatbildner ersetzt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Träger für intramuskulär, intradermal oder intrakutan injizierbare Vaccine- und Antigen-Zusammensetzungen, der aus einer wäßrigen Lösung eines Alginate besteht, dadurch gekennzeichnet, daß das Alginat in einer Konzentration von etwa 1 bis 5% (Gew./Vol.) vorliegt und

(a) in 5°/oiger wäßriger Lösung (Gew./Vol.) leicht eine Nadel Nr. 24 passiert;

(b) in 4°/oiger wäßriger Lösung (Gew./Vol.) eine Viskosität von weniger als 50 cSt aufweist;

(c) ein Äquivalentgewicht unter 250 hat; ao

(d) eine Milliosmolarität von weniger als 150 pro Kilogramm Wasser (im Fiske-Osmometer) zeigt.

2. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er Natriumalginat mit folgenden Eigenschaften enthält:

(a) in 4°/oiger wäßriger Lösung (Gew./Vol.) passiert es leicht eine Nadel Nr. 24;

(b) in 4°/oiger wäßriger Lösung (Gew./Vol.) zeigt es eine Viskosität von höchstens 20 cSt;

(c) der p_H-Wert der 4%igen Lösung liegt zwischen 7,2 und 7,6;

(d) das Äquivalentgewicht liegt zwischen 188 und 220;

(e) die Milliosmolarität (Fiske-Osmometer) ist etwa 111,5;

(f) keine Absorptionsmaxima (Beckmann DK-2) zwischen 1000 und 400 ηΐμ und nur vernachlässigbare Absorption zwischen 200 und 400 ΐημ bei 270 παμ.

3. Träger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er Alginat unlöslich machende Ionen in physiologisch verträglicher chelatartig gebundener Form enthält.