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Verfahren zur Herstellung von Corticotropinpräparaten mit verlängerter Wirksamkeit
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Ein Präparat mit verlängerter Wirksamkeit des Corticotropins enthält gemäss der Erfindung eine wässerige Suspension mit einem Gehalt von 20 bis 500 USP-Subkutaneinheiten pro ml des Corticotropins, 0, l-2, 5 mg Tannat je 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins, wenigstens 0, 25 mg Zink je 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins und 6 - 60 mg partiell hydrolysierte Gelatine je 100 USP- Subkutaneinheiten des Corticotropins. Wenigstens ein Teil dieser wässerigen Suspension besteht jedoch aus einem Zink-Corticotropin-Gelatine-Tannat-Komplex.
Nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung enthält einCorticotropinpräparat, das ebenfalls eine verlängerte Wirksamkeit nach subkutaner oder intramuskulärer Verabfolgung aufweist, in wässeriger Suspension je ml 200 - 500 USP-Subkutaneinheiten Corticotropin, das Rinderhypophysengewebe ent-
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Zink je 100 USP-Subkutaneinheiten von Corticotropin, wobei jedoch wenigstens ein Teil dieser wässerigen Suspension aus einem Zink-Corticotropin-Tannat-Komplex besteht.
Es wurde ferner gefunden, dass Corticotropin, das Hypophysengewebe von Schweinen entstammt, nach Vermischen mit einem Zinksalz und Gerbsäure einen Zink-Corticotropin-Tannat-Komplex bildet, der bei subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung im wesentlichen inaktiv ist, d. h. die Wirksamkeit desselben besitzt eine so erhöhte Dauer, dass kein klinisch feststellbarer Effekt vorliegt. Durch Anwendung von ACTH aus Schweinen im Zink-Corticotropin-Gelatine-Tannat werden jedoch diese Schwierigkeiten beseitigt. Anderseits wurde gefunden, dass mit Rinder-ACTH ein Zink-Corticotropin-Komplex erhalten wird, der die gewünschte verlängerte und geregelte Wirksamkeit nach subkutaner oder intramuskulärer Injektion zeigt.
Die Bezeichnung"USP-Subkutaneinheiten"bezieht sich auf die subkutanen Corticotropin-Tests und die entsprechenden Einheiten, wie sie in der United States Pharmacopöe XV angegeben sind.
Das erfindungsgemäss hergestellte Corticotropinpräparat ist zur Verabfolgung bei Tieren und Mensehen auf beliebigem Wege geeignet ; da aber die Basis für die verlängerte Wirkung desselben die Bildung eines Gewebedepots ist, erfolgt die Verabreichung desselben vorzugsweise parenteral auf anderem als dem intravenösen Wege. Eine besonders wünschenswerte verlängerte Corticotropinwirkung ist erzielbar, wenn diese Präparate subkutan oder intramuskulär verabreicht werden.
Das Corticotropin, welches in diesen Corticotropinpräparaten verwendet werden kann, umfasst sowohl hoch-als auch geringwirksame Stoffe und das beschriebene Verfahren ist sowohl aufCorticotropinsubstan- zen aus tierischen Hypophysen als auch auf synthetisch hergestellte aktive Substanzen anwendbar ; beide Gruppen von Substanzen werden nachstehend mit Corticotropin bezeichnet. Bessere Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn das in diesen Präparaten enthaltene Corticotropin eine hohe Reinheit hat und eine Wirksamkeit von wenigstens 20 USP-Subkutaneinheiten je mg aufweist. Besonders günstige Resultate können erreicht werden, wenn Corticotropin mit einer Wirksamkeit von wenigstens 40 USP-Subkutaneinheiten je mg verwendet wird.
Wenngleich das bei der praktischen Durchführung der Erfindung verwendete Corticotropln Hypophysen irgendeiner Tierart entstammen kann, werden bessere Ergebnisse erhalten, wenn ein von Rinder- und Schweinehypophysengewebe gewonnenes Produkt verwendet wird und es Ist besonders günstig, Corticotropin aus Schweinehypophysen einzusetzen.
EinBeispiel für im Rahmen des erfindungsgemässenverfahrens verwendbaresCorticotropin ist das Cor-
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Eluierung an Cellulosematerialien vorgenommen wird.
Wenngleich das Corticotropin in den wässerigen Suspensionen in einer Konzentration von 20 bis 500 USP-Subkutaneinheiten pro ems vorliegen kann, wird es für praktische Zwecke bevorzugt, das Corticotropin in einer Konzentration von 40 bis 100 USP-Subkutaneinheiten je cm'anzuwenden.
Der Tannatbestandteil dieser Corticotropinpräparate kann pharmazeutisch reine Gerbsäure sein.
Wenngleich das Tannat in diesen Präparaten mit einer Konzentration von 0, 1 bis 2"5 mugje 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins enthalten sein kann, können bessere Ergebnisse mit einer Konzentrat- tion von 0,2 bis 1, 0 mg je 100 USP-Subkutaneinheiten von Corticotropin erhalten werden und besonders günstige Ergebnisse werden erzielt, wenn Gerbsäure in einer Konzentration von 0, 4 mg je 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins vorliegt.
Der Zinkbestandteil dieser Corticotropinpräparate kann von einem beliebigen Zinksalz abgeleitet sein ; vorzugsweise wird aber ein wasserlösliches Zinksalz, wie z. B. Zinkazetat, verwendet. Wenn auch das in diesen wässerigen Suspensionen enthaltene Zink in'Konzentrationen von wenigstens 0, 25 mg je 100 USPSubkutaneinheiten des Corticotropins vorliegen soll, wird für praktische Zwecke vorzugsweise Zink in einer Konzentration von 0, 5 bis 2,0 mg je 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins angewendet.
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Bei Verträglichkeitsversuchen mit Tieren wurde festgestellt, dass ein Zink-Corticotropin-TannatKomplex durch die Gewebe inaktivierbar zu sein scheint. Dieser Gewebeinaktivierungseffekt wirkt der Absorption des Corticotropins durch den Blutstrom aus einem in dem Gewebe gebildeten Depot entgegen.
Dementsprechend wird eine verringerte Übergangsgeschwindigkeit von Corticotropin in den Blutstrom erhalten und es kann ein Blutspiegelwert erreicht werden, der unterhalb jenes Wertes liegt, auf welchen die Nebenniere gegenüber exogenem Corticotropin anspricht. In vielen Fällen kann daher kein merkbarer Effekt bei der Verabreichung des Corticotropins auf die Nebenniere beobachtet werden, und dies kann auf
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dieses Komplexes in partiell hydrolysierte Gelatine dem Auftreten dieser Gewebeinaktivierung entgegengewirkt werden kann.
Ferner kann die in diesem Komplex enthaltene Gelatinemenge geregelt werden, um die Veränderung der Geschwindigkeit zu beeinflussen, mit welcher das Corticotropin in den Blutstrom freigesetzt wird und dementsprechend kann sie innerhalb jener Grenzen eingestellt werden, die der Dauer der Wirkung des Cordcotropinpr parares entsprechen. Gleichzeitig wird durch den Einschluss dieses Komplexes in Gelatine eine erhöhte Corticotropinaktivität ohne offensichtliche Beeinflussung der Wirkungsdauer der Mischung erreicht. Zusätzlich dient diese Gelatinekomponente zur Erhöhung der Stabilität nicht nur der Mischung, sondern Insbesondere des Tannatbestandteiles. Der Gelatinebestandteil dient schliess- lich zur Verringerung etwaiger örtlicher Reizerscheinungen, die ansonsten bei Anwendung des Komplexes beobachtet werden können.
Der Gelatinebestandteil dieses Corticotropinpräparates soll pharmazeutisch rein und nicht antigen sein. Die partielle Hydrolyse der Gelatine kann durch Autoklavieren einer geeigneten Gelatinelösung bei einem Druck von etwa 1, 05 kg/cmz während etwa 8 Stunden erreicht werden.
Die Gelatine kann in diesen Mischungen in einer Konzentration von 2 bis 60 mg je 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins vorliegen ; bessere Ergebnisse werden jedoch bei Konzentrationen derselben von 6 bis 20 mg je 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins erzielt und ganz besonders günstige Ergebnisse werden mit etwa 15 mg Gelatine pro 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins erhalten.
Es ist möglich, durch Einregelung der Konzentrationen der Zink- und Tannatkomponenten ebenso wie durch die vorstehend beschriebene Variation der Gelatinekomponente die Dauer der mit diesem Gortig cotropinpräparat erzielten Wirkung über ein beträchtliches Intervall zu variieren.
Zweckmässig werden die Corticotropinpräparate gemäss der Erfindung auf einen pH-Wert von 4 bis 8 eingestellt und insbesondere soll die wässerige Suspension einen PH-Wert von etwa 5 haben.
Wenigstens ein Teil der vier Hauptbestandteile der wässerigen Suspensionen, nämlich Zink, Corticotropin, Tannat und Gelatine, soll in Form des wasserlöslichen Komplexes vorliegen. Mit der Bezeichnung "wässerige Suspension"soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Corticotropinpräparat bezeichnet werden, das eine feste Phase und eine flüssige (wässerige) Phase enthalten soll, worin die feste Phase in der wässerigen Phase dispergierbar ist. Ferner ist durch den Ausdruck "in Wasser unlöslicher Komplex" zum Ausdruck gebracht, dass die feste Phase wenigstens einen Teil der 4 Hauptbestandteile in solcher physikalischer oder chemischer Kombination enthält, dass der Komplex abtrennbar ist.
Ein Teil irgendwelcher der Hauptbestandteile dieser Corticotropinpräparate kann in diesen Corticotropinpräparaten als Bestandteil der flüssigen Phase vorliegen und in manchen Fällen kann es wünschenswert sein, wenn Corticotropin in diesen Mischungen sowohl in löslicher als unlöslicher Form vorliegt, so dass sowohl ein sofortiger als auch ein verzögerter Corticotropin-Effekt erzielt wird.
Die Herstellung dieser Corticotropinpräparate und insbesondere die Herstellung dieses wasserlöslichen Komplexes umfasst allgemein das Mischen der Hauptbestandteile in einem wässerigen Medium, bis die Vereinigung wenigstens eines Teiles dieser Bestandteile erreicht ist. Dementsprechend wird das Ausgangsmaterial üblicherweise eine wässerige Lösung sein, welche die gewünschte Konzentration an Corticotropin enthält. Es wurde jedoch gefunden, dass die Reihenfolge, in der die übrigen Bestandteile mit dieser wässerigen Corticotropinlösung vereinigt werden, variiert werden kann, um die Eigenschaften des erhaltenen Produktes zu ändern.
Einerseits kann, falls die wässerige Corticotropinlösung zuerst mit Gerbsäure kombiniert wird, der nachfolgende Zusatz des Zinkbestandteiles innerhalb eines relativ weiten pH-Bereiches durchgeführt werden. Wird anderseits die wässerige Corticotropinlösung zuerst mit dem Zinksalz vereinigt, so soll die anschliessende Zugabe der Gerbsäure bei einem alkalischen pH-Wert von etwa 7, 4 erfolgen.
Es ist zweckmässig, den Gelatinebestandteil als letzten zuzugeben, aber er kann auch zuerst mit dem Corticotropin vermischt werden. Die Mengen an Zink und Gerbsäure können in Abhängigkeit von der Grössenordnung an zugesetztem ACTH, Gelatine und andern Stabilisatoren oder Schutzstoffen variieren.
In diesen Corticotropinpräparaten können auch gewisse weitere Bestandteile enthalten sein, insbeson-
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dere um die Stabilität und die Lagerfähigkeit der Präparate zu erhöhen. Beispielsweise dient Cystein dazu, alle Hauptbestandteile der Mischung zu stabilisieren. Zuerst wird durch das Cystein ein Unlöslichmachen von löslichem Zink im Präparat hervorgerufen, wobei die örtliche Reizwirkung, die durch das Zinkion verursacht werden kann, vermindert wird. Ferner scheint Cystein chemische Veränderungen in der Gerbsäure, beim ACTH und den Gelatinebestandteilen dieser Mischung zu verzögern. Das Cystein vereinigt sich scheinbar mit diesem wasserunlöslichen Komplex, bleibt an der Injektionsstelle zurück und kann antioxydative Wirkungen im Gewebe ausüben.
Das Cystein kann in diesen wässerigen Suspensionen in einer Konzentration von 0,2 bis 2,0 mg pro 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins enthalten sein. Bessere Ergebnisse werden jedoch erzielt, wenn eine Cysteinkonzentration von etwa 1 mg pro 100 USP-Subkutaneinheiten des Corticotropins angewendet wird.
Ferner können den Corticotropinpräparaten, insbesondere wenn sie als Injektionspräparat für mehrfache Verwendung vorgesehen sind, antibakteriell wirkende Mittel, wie Methyl- und Propyl-p-oxybenzoat zugesetzt werden. Zufriedenstellende Ergebnisse werden erzielt, wenn das Methyl-p-oxybenzoat in einer Konzentration von etwa 0, 1 bis 0, 2 Gew.-% angewendet wird, während das Propyl-p-oxybenzoat in diesen wässerigen Suspensionen in einer Konzentration von etwa 0, 01 bis 0,02 Gew.-% vorliegen kann, Phenol kann ebenfalls verwendet werden.
Beispiel 1 : 500 mg nach dem Oxycelluloseverfahren gereinigte Rinder-Corticotropinsubstanz werden mit 50 ml Wasser gemischt. Es wird 1, 00/0 Thioharnstoff zugegeben und der pH-Wert wird mit roziger Natriumhydroxydlösung auf 6, 5 eingestellt. Die Mischung wird in eine Glasflasche gefüllt und verschlossen. Dann wird der Behälter mit seinem Inhalt in einen Heissluftofen 6 Stunden auf eine Temperatur von 100 I : 50 C gebracht. Nach Herausnahme aus dem Ofen wird die Flüssigkeit auf etwa 300 C abgekühlt und durch ein mittleres Sinterglasfilter filtriert. Die Fällung wird mit Wasser gewaschen, bis das Volumen des Filtrats 50 ml beträgt. Zu den 50 ml der Corticotroplnlösung werden 12 ml einer 5,0%igen Lösung von kristallisiertem Zinkazetat gegeben.
Der pH-Wert wird mit einer 3% igen Natriumhydroxydiö- sung auf 7, 5 eingestellt und die Mischung wird eine halbe Stunde stehen gelassen. Dann wird die Mischung zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert. Die das Corticotropin enthaltende Fällung wird erneut in 50 ml Wasser, die 2,0 g teilweise hydrolysierte Gelatine enthalten, suspendiert.
Zu der entstehenden Suspension werden 24 ml einer llvigen Gerbsäurelösung gegeben. Dann wird der pH-Wert der Lösung mit einer 3% igen Natriumhydroxydiösung auf 6, 0 eingestellt. Es werden 24 ml einer l, Obigen Cysteinlösung zugegeben und der pH-Wert erneut auf 6,0 eimeguliert. Schliesslich werden noch 2 ml Glycerin, 0, 6 g Phenol und so viel Wasser zugefügt, um ein Volumen von 120 ml mit einem pH-Wert von 6,1 herzustellen. Die Suspension wird gut durchgemischt und in Ampullen zu 2, 2 ml abgefüllt. Die Luft aus diesen Ampullen wird mit Stickstoff verdrängt und die Behälter werden zugestopft und verschlossen. Die Sterilisation erfolgt durch Autoklavieren auf 116-1210 C während 15 Minuten.
Die Endprodukte erweisen sich bei Prüfung nach den USP-Methoden als steril und die Wirksamkeit, welche nach der USP-Subkutantestmethode durchgeführt worden war, ergab 104, 0 8, 4 Einheiten je mL Aus diesen Angaben geht hervor, dass nach dem Autoklavieren kein Wirksamkeitsverlust eingetreten war.
Die physikalischen Eigenschaften waren ausgezeichnet. Dieses Produkt zeigte nach Verabfolgung einer einzigen Injektion eine Nebennierenstimulierung durch mehr als 96 Stunden.
Beispiel 2 : 500 mg nach dem Oxycelluloseverfahren gereinigtesRinder-Corticotropin werden mit 25 ml Wasser vermischt. Dann werden 0, 25% Pyridoxinhydrochlorid zugesetzt und der pH-Wert wird mit Natriumhydroxyd auf 4, 7 eingestellt. Diese Mischung wird 4 1/4 Stunden auf 95 - 100o C erhitzt, dann abgekühlt und mit Wasser auf 70 ml verdünnt. Der pH-Wert wird mitNatriumhydroxyd auf 6, 5 eingestellt und das Präparat zwecks Entfernung der bei pH 6, 5 unlöslichen Stoffe filtriert. Zu dem Filtrat werden 560 mg kristallinesZinkazetat gegeben und der pH-Wert wird mit 3%iger Natriumhydroxydlösung auf 7, 5 eingestellt. Dann wird die Mischung zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Das niedergeschlagene Zink-Corticotropin wird erneut in 70 ml Wasser, das 2, 5 g partiell hydrolysierte Gelatine enthält, suspendiert.
Es werden 11, 2 ml einer 0, zien Gerbsäurelösung zugegeben, worauf man 14 ml
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zusetzt. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxyd auf 6,0 eingestellt. Die Suspension wird in Ampullen in Mengen zu je 2, 3 ml abgefüllt, verschlossen und dann unter eirem Dampfdruck von 1, 05 kg/cm3 (116- 1210 C) 15 Minuten erhitzt.
Das erhaltene Endprodukt erwies sich als steril. Wirksamkeitsbestimmungen nach dem ÜSP-Subkutan-
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5 : 1 : 9, 2Beispiel 3 : Rohes ACTH wird durch Salzsäure-Azetonextraktion aus Hypophysen von Schweinen hergestellt. Das rohe ACTH wird dem Oxycelluloseabsorptionsverfahren unterworfen. 400 ml des über Oxycelluloae gereinigten ACTH werden mit Wasser und Pyridoxinhydrochlorid bei einem PW Wert von4. 7 gemischt und 5 Stunden auf 95. 1000 C erhitzt. Nach Abkühlen auf etwa 500 C wird filtriert, um die unlöslichen Anteile zu entfernen. Das Fällungsprodukt wird so lange mit Wasser gewaschen, bis das Gesamtvolumen desFiltrats 40 ml beträgt. Dieses wird durch ein 02 Selas-Filtrierröhrchen steril filtriert. Zu dem Filtrat werden 1, 28 mg Gerbsäure in 25 ml Wasser gegeben.
Dann werden 1, 056 g kristallines Zinkazetat und 9, 6 g teilweise hydrolysierte Gelatine in je 25 ml Wasser zugegeben, wobei die Zugabe getrennt durch sterile Filtrierröhrchen erfolgte. Dann werden durch Sterilfiltration 200 ml warmes Wasser,
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ben. Nach jeder Filtration werden 10 ml Wasser zugesetzt, um die vorherigen Bestandteile aus dem Filtrierröhrchen auszuwaschen. Das Endvolumen der sterilen Suspension beträgt 320 ml. Die Suspension wird aseptisch in Mengen zu 2, 5 ml in 6 ml Weithalsampullen abgefüllt und die Ampullen werden aseptisch zugestopft. Die Ampullen werden einer Gefrierbehandlung und Trocknung im Vakuum unterworfen sowie aseptisch mit üblichen Aluminiumkappen verschlossen.
Die Endprodukte erwiesen sich bei der Prüfung als steril. Durch Zugabe von l, 0 bis 5, 0 ml Wasser oder Salzlösung wird eine ausgezeichnete gleichmässige Suspension des unlöslichen ACTH-Komplexes er-
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le vorlagen. Das mit Salzlösung ergänzte Produkt bewirkte nach einer einzigen Injektion eine kontinuierliche Nebennierenstimulierung während 48 - 72 Stunden. Die lokale Verträglichkeit war ausgezeichnet.
Beispiel 4 : Das Produkt wird gemäss Beispiel 3 hergestellt. Gleichzeitig mit dem Zusatz des Cysteins und Methyl-sowie Propylester der p-Oxybenzoesäure wird auch Gelatine zugesetzt, u. zw. 6, 25 ml einer 321eigen wässerigen Lösung von Gelatine, die vorher etwa 4-8 Stunden bei 1200 C autoklaviert worden war. Diese Menge von Gelatine lieferte etwa 6 mg partiell hydrolysierte Gelatine je ml Endprodukt.
Nach dem Lyophilisieren liess sich diesesProdukt ausserordentlich gut wieder zu fertigen Injektionslö- sungen herstellen und ergab. eine stärkere Nebennierenstimulierung nach Injizierung als ein nach dem Bei- spiel 3 hergestelltes Produkt. In der Dauer der Wirksamkeit zeigte sich keine wesentliche Änderung.
Beispiel S : Rohes ACTH wird durch Chlorwasserstoffsäure-Azetonextraktion aus Hypophysen von Schweinen hergestellt. Das rohe ACTH wird dem Oxycelluloseadsorptionsverfahren unterworfen. 400 mg des durch das Oxycelluloseverfahren gereinigten ACTH werden mit Wasser und Pyridoxinhydrochlorid bei einem pH-Wert von 4,7 vermischt und 5 Stunden'auf 95-1000 C erhitzt. Nach Abkühlen auf etwaSOC werden die unlöslichen inaktiven Bestandteile abfiltriert. DasFällungsprodukt wird mit Wasser gewaschen, bis das Gesamtvolumen des Filtrats 40 ml beträgt. Dieses Filtrat wird steril durch ein 02 Selas-Filter- röhrchen filtriert.
Zu dem Filtrat werden durch das Filterröhrchen 256 mg Gerbsäure in 25 m1 Wasser zugegeben, um eine Konzentration von 0, 8 mg Gerbsäure je m1 Endprodukt einzustellen. Dann werden 1, 056 g kristallisiertes Zinkazetat und 9, 6 g teilweise hydrolysierte Gelatine je in 25 ml Wasser gelöst und getrennt durch das sterile Filtrierröhrchen zugegeben. Ferner werden durch sterile Filtration 200 ml warmes Wasser zugeführt, das 640 mg Cystein, 600 mg Methyl-und 60 mg Propylester der p-Oxybenzoesäure enthält. Nach jeder Filtration wird mit 10 ml Wasser nachgewaschen, um die vorherigen Bestandteile aus dem Filterröhrchen zu entfernen. Das Endvolumen der sterilen Suspension beträgt 320 ml.
Die Suspension wird aseptisch in Mengen zu je 2,5 ml in 6 ml Weithalsampullen abgefüllt und die Ampullen werden unter aseptischen Bedingungen zugestopft. Die Ampullen werden abgekühlt und im Vakuum getrocknet, worauf unter aseptischen Bedingungen mit den üblichen Aluminiumverschlüssen verschlossen wird.
Das so erhaltene Produkt ergibt nach subkutaner Verabreichung einer einzigen Dosis eine Nebennierenstimullerung durch mehr als 96 Stunden.
Beispiel 6 : Es wird nach Beispiel 5 mit der Abänderung gearbeitet, dass zu dem 40 betragen den sterilen Filtrat durch dasfilnderröhrcheii 128 mg Gerbsäure in 25 ml Wasser zugegeben werden. Dann werden 0, 528 g kristallisiertes Zinkazetat und 9, 6 g teilweise hydrolysierte Gelatine je in 25 ml Wasser
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Verarbeitunghergestellten Endproduktes enthielt.
Beispiel 7 : Es wird nach Beispiel 6 mit der Abänderung gearbeitet, dass nach der Zugabe von
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128 mg Gerbsäure in 25 ml Wasser eine solche Menge Aluminiumchlorid zugegeben wird, dass eine Konzentration von 1, 0 mg Aluminiumionen je ml Endprodukt vorlag. Ferner wird partiell hydrolysierte Gelatine in einer solchen Menge zugesetzt, dass in der Endsuspension 8 mg Gelatine je 100 USP-Subkutanein- heiten des Corticotropins vorlagen. Der pH-Wert wurde mit Natriumhydroxyd auf 5, 0 eingestellt. Dann wird unter Zusatz der 200 ml wässerigen Lösung wie in Beispiel 6 weitergearbeitet.
Beispiel 8 : 40 cm einer wässerigen Lösung von Rinder-ACTH, die 640 Einheiten ACTH je cm3 enthielt, werden durch ein Selas-Filtriearöhrchen in einen sterilen Behälter filtriert. 25 cm3 einer wässerigen 120 mg Gerbsäure enthaltenden Lösung werden ebenfalls in den sterilen Behälter filtriert.
Anschliessend werden 1, 056 g Zinkazetat in 25 cm3 Wasser in den sterilen Behälter filtriert ; nach jeder Filtration wird dasSelas-Filtrierröhrchen mit 10 cm3 Wasser nachgewaschen. Dann wirdeine wässerige Lösung der nachstehenden Zusammensetzung in den sterilen Behälter filtriert.
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<tb>
<tb>
Cystein <SEP> 320 <SEP> mg
<tb> Methylester <SEP> der <SEP> p-Oxybenzoesäure <SEP> 600 <SEP> mg
<tb> Propylester <SEP> der <SEP> p-Oxybenzoesäure <SEP> 60 <SEP> mg
<tb> eine <SEP> wässerige <SEP> Lösung, <SEP> die <SEP> 32'%'durch <SEP> 8-stündiges <SEP>
<tb> Autol1 <SEP> : <SEP> lavieren <SEP> hydrolysierte <SEP> Gelatine <SEP> enthalt <SEP> 6,25 <SEP> cm3
<tb> Wasser <SEP> 95 <SEP> cm
<tb>
In den sterilen Behälter wird eine solche Wassermenge filtriert, dass das Endvolumen in dem Behälter 320 cm3 beträgt.
Die entstehende flüssige Suspension wird in 6 cm3 Ampullen in Mengen zu je 2, 5 cm'l abgefüllt. Die gefüllten Ampullen werden der Lyophilisierung unterworfen. Bei der Analyse wird eine Aktivität je Ampulle von 233 ACTH-Einheiten festgestellt. Dieses Produkt gab bei der klinischen Erprobung eine höhere ACTH-Aktivität als ein Vergleichsprodukt ohne Gelatine. Ferner ergab das Produkt eine Wirkungsdauer von etwa 48 Stunden, wobei im klinischen Versuch eine Wirkungsdauer von etwa 72 Stunden festgestellt wurde.
Beispiel 9 : Das Produkt wird nach der Methode des Beispiels 2 mit der Abänderung hergestellt, dass das ACTH mit einer Wirksamkeit von etwa 150 Einheiten je mg an Stelle des dort beschriebenen ACTH mit einer Wirksamkeit von etwa 75 Einheiten je mg verwendet wird. Demgemäss wird ein Präparat mit einer doppelten ACTH-Aktivität im Vergleich zu jener des Beispiels 2 erhalten.
Es wurde gefunden, dass die relativen Mengen von Zink, Gerbsäure und ACTH in der vorstehend angegebenen Zusammensetzung variiert werden können, um eine Absorptionsregelung über Zeiträume von 1 bis etwa 6 Tage und mehr zu erzielen.
Beispiel 10 : Das folgende Verfahren wurde angewendet, um die Wirksamkeit bei subkutaner Verabreichung eines aus Rinderhypophysengewebe gewonnenen ACTH zu erhöhen. 1 g Rinder-ACTH, das durch Behandlung nach dem Oxycelluloseverfahren gemäss der in der USA-Patentschrift Nr. 2, 1'f69, 536 beschriebenen Methode hergestellt worden ist, wird mit 100 ml destilliertem Wasser gemischt. Zu der entstehenden Lösung wird 1 g Thioharnstoff gegeben und diese Lösung wird unter Verwendung einer 20% igen Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6, 5 eingestellt.
Diese Mischung wird 6 Stunden auf eine Temperatur von 1000 C erhitzt ; anschliessend wird abgekühlt und durch ein mittleres Sinterglasfilter filtriert. Die abgeschiedene Fällung wird mit Wasser gewaschen, wobei eine solche Wassermenge angewendet wird, dass das Volumen des Filtrats auf 100 ml ansteigt. Die Fällung, die verglichen mit der ACTH-Aktivität verhältnismässig inaktiv ist, wird verworfen.
Zu 50 ml des vorstehend angegebenen Filtrats werden 12 m1 einer Saigon Lösung von 2 Mole Kristallwasser enthaltendem Zinkazetat gegeben. Die entstehende Lösung wird mit 3%igerNatriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. Die dabei entstehende Fällung (Zink-ACTH) wird von der überstehenden Flüssigkeit durch Filtration getrennt. Die abgeschiedene Fällung wird in 5 ml Wasser suspendiert, worauf die entstandene Mischung mit Eisessig auf einen PH-Wert von 5 eingestellt wird.
Beispiel 11 : Zur Herstellung einer wässerigen Suspension von Zink-ACTH-Tannat für parenterale Verabreichung wurde die folgende Methode angewendet : Zu 50 ml einer Zink-ACTH-Mischung, die nach dem Verfahren des Beispiels 10 hergestellt worden war, werden 24 ml einer 1%i n Gerbsäurelösung gegeben. Die entstehende Mischung wird unter Verwendung 3% iger Natriumhydroxydiösung auf einen pH-Wert von 6 eingestellt.
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Zu dieser Mischung werden 24 ml einer loigen Cystin1ösung gegeben, und diese Mischung wird auf einen PH- Wert von 6 eingestellt. Dann, werden 2 ml Glycerin und 0,6 g Phenol zur Mischung gegeben, sowie eine solche Menge Wasser, die zur Einstellung des Gesamtvolumens auf 120 ml notwendig ist.
Die entstehende Suspension wird in 2 ml-Ampullen abgefüllt, mit einer Schutzatmosphäre aus Stickstoff versehen, verschlossen und im Autoklaven unter einem Druck von 1,05 kg/cm2 15 Minuten sterilisiert.
Das Endprodukt wurde durch Anwendung des USP-Subkutantests auf ACTH-Aktivität untersucht. Da-
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enthielten.
Im wesentlichen die gesamte ACTH-Aktivität war in dem unlöslichen Komplex enthalten, was aus Analysenergebnissen hervorgeht, bei welchen festgestellt wurde, dass weniger als 2 USP-Einheiten des ACTH in der filtrierten, überstehenden Flüssigkeit enthalten waren.
Die ACTH-Präpara. te waren wie nachfolgend angegeben zusammengesetzt. Die angegebenen Mengen beziehen sich auf ml der Suspension.
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<tb>
<tb>
Bestandteil <SEP> Konzentration <SEP> (je <SEP> ml)
<tb> ACTH <SEP> 76 <SEP> USP-Einheiten
<tb> Zink <SEP> 1,3 <SEP> mg <SEP> (im <SEP> Versuch <SEP> ermittelt)
<tb> Gerbsäure <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Cystein <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Glycerin <SEP> 1, <SEP> 6%
<tb> Phenol <SEP> 0, <SEP> 50 <SEP> ; <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Beispiel12 :BeiderHerstellungeinerwässerigenSuspensionvonZink-ACTH-Tannatkannauch das folgende Verfahren angewendet werden : 10 ml nach dem Verfahren des Beispiels 11 hergestelltes Rinder-ACTH wird auf einen pH-Wert von 7, S eingestellt. Zu dieser Suspension werden 12 mg Gerbsäure in 0, 5 ml Wasser gegeben. Dann wird zu der Mischung 1 m1 einer 20% Glycerin und 6%Phenol enthaltenden Lösung gegeben sowie 0,5 ml einer 4, 81eigen Lösung von Cystein.
Die Zusammensetzung des fertiggestellten Präparates war die folgende :
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<tb>
<tb> Bestandteil <SEP> Konzentration <SEP> (je <SEP> ml)
<tb> ACTH <SEP> SO <SEP> USP-Einheiten <SEP>
<tb> Zink <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Gerbsäure <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> Cystein <SEP> 2 <SEP> mg
<tb> Glycerin <SEP> 1, <SEP> 610 <SEP>
<tb> Phenol <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb>
Beispiel 13: Das folgende Verfahren wird zur Herstellung einer wässerigen Suspension des ZinkACTH-Tannats angewendet : 0, 5 g Rinder-ACTH, das durch Behandlung mit Oxycellulose gemäss dem Verfahren der USA-Patentschrift Nr. 2, 669, 536 hergestellt worden ist, werden mit 25 ml destilliertem Wasser gemischt. Zu dieser Lösung werden 0, 25% Pyridoxinhydrochlorid gegeben.
Diese Mischung wird dann 4 1/4 Stunden auf 1000 C
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Mischung wird mit wässeriger Natriumhydroxydlösung auf einen PH-Wert von 6, 5 eingestellt und die dabei entstandene Fällung wird von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und verworfen.
Zu den 70 ml des so erhaltenen Filtrats werden 560 mg Zinkazetat mit 2 Molen Kristallwasser zugegeben. Dann wird die entstandene Lösung mit Natriumhydroxyd auf einen PH-Wert von 7, 5 eingestellt. Die dabei erhaltene Suspension wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Die abgeschiedene Fällung wird in 70 ml Wasser suspendiert.
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Zu 67 ml der vorstehend genannten Suspension werden 11,2 m1 einer 1,5%igen Lösung von Gerbsäure, 14 m1 einer Zeigen wässerigen Cysteinlösung und 30 ml einer Lösung, die 0,7 g Phenol und 2,5 ml Glycerin enthielt, gegeben. Die entstandene Mischung wird mit einer 3%igen wässerigen Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6 eingestellt.
Die Mischung wird in 2 m1 Ampullen abgefüllt. Die gefüllten Ampullen werden verschlossen und 15 Minuten zwecks Sterilisation bei einem Druck von 1, 05 kg/cm autoMaviert. Die so erhaltenen Präparate hatten folgende Zusammensetzung :
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<tb>
<tb> Bestandteil <SEP> Konzentration <SEP> (je <SEP> ml)
<tb> RIader-ACTH <SEP> 97,5 <SEP> ¯ <SEP> 9,2 <SEP> USP-Einheiten
<tb> Zink <SEP> 1, <SEP> 1 <SEP> mg <SEP> (im <SEP> Versuch <SEP> ermittelt)
<tb> Gerbsäure <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> mg
<tb> Cystein <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> mg <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> eo
<tb> Phenol <SEP> 0, <SEP> 5%
<tb>
Klinische Erprobungen beim Menschen ergaben, dass diese Präparate etwa 48 Stunden Aktivität zeigten und eine ausgezeichnete Wirksamkeit aufwiesen, die auf Grund der Steroidausscheidung durch den Harn gemessen wurde.
Beispiel 14 : Nachstehend werden die Zink-ACTH-Tannat-Präparate, wie sie in den Beispielen 10,11 und 12 beschrieben sind, verglichen.
60 hypophysesektomierte Ratten werden willkürlich in drei Gruppen zu je 20 Ratten eingeteilt. Jeder Gruppe der Ratten wurde subkutan 0, 1 ml des zu prüfenden Präparates verabreicht. Nach geeigneten Zeitintervallen bis zu 96 Stunden nach der Injektion wurden Gruppen von je 4 Ratten getötet. Die in der Nebenniere enthaltene Ascorbinsäure, das Thymusgewicht und das Nebennierengewicht wurden bestimmt.
Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben, in der die Präparate durch Angabe der Beispielnummer, gemäss welchem diese Präparate erhalten worden waren, gekennzeichnet sind.
Mittelwert der in der Nebenniere enthaltenen Ascorbinsäure in tg/mg
EMI8.2
<tb>
<tb> Präparat <SEP> gem. <SEP>
<tb>
Beispiel <SEP> Nr. <SEP> 7 <SEP> Stunden <SEP> 24 <SEP> Stunden <SEP> 48 <SEP> Stunden <SEP> 72 <SEP> Stunden <SEP> 96 <SEP> Stunden
<tb> 10 <SEP> 4, <SEP> 03 <SEP> 2,59 <SEP> 2,20 <SEP> 2, <SEP> 93 <SEP> 2, <SEP> 04 <SEP>
<tb> 11 <SEP> 1,86 <SEP> 1, <SEP> 87 <SEP> 1, <SEP> 46 <SEP> 2,51 <SEP> 2,19
<tb> 12 <SEP> 1, <SEP> 44 <SEP> 1, <SEP> 32 <SEP> 1, <SEP> 24 <SEP> 1, <SEP> 86 <SEP> 2, <SEP> 04 <SEP>
<tb>
Mittleres Thymusgewicht in mg
EMI8.3
<tb>
<tb> Präparat <SEP> gem.
<tb>
Beispiel <SEP> Nr. <SEP> 7 <SEP> Stunden <SEP> 24 <SEP> Stunden <SEP> 48 <SEP> Stunden <SEP> 72 <SEP> Stunden <SEP> 96 <SEP> Stunden
<tb> 10 <SEP> 341 <SEP> 285 <SEP> 149 <SEP> 105 <SEP> 40
<tb> 11 <SEP> 294 <SEP> 283 <SEP> 90 <SEP> 62 <SEP> 39
<tb> 12 <SEP> 300 <SEP> 174 <SEP> 80 <SEP> 38 <SEP> 34
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
Mittleres Nebennierengewicht in mg
EMI9.1
<tb>
<tb> Präparat <SEP> gem.
<tb>
Beispiel <SEP> Nr. <SEP> 7 <SEP> Stunden <SEP> 24 <SEP> Stunden <SEP> 48 <SEP> Stunden <SEP> 72 <SEP> Stunden <SEP> 96 <SEP> Stunden
<tb> 10 <SEP> 24,7 <SEP> 27, <SEP> 8 <SEP> 37, <SEP> 9 <SEP> 33, <SEP> 1 <SEP> 42, <SEP> 4
<tb> 11 <SEP> 27,2 <SEP> 32, <SEP> 9 <SEP> 39,9 <SEP> 37,1 <SEP> 45, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 12 <SEP> 27,1 <SEP> 36, <SEP> 5 <SEP> 47, <SEP> 4 <SEP> 42, <SEP> 3 <SEP> 48, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung eines CorticotropinprÅaparates mit verlängerter Wirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Gewinnung einer wässerigen Suspension eines in Wasser unlöslichen Zink- Corticotropin-Tanat- bzw.
Zink-Cotticotropin-Gelatine-Tannatkomplexes in wässerigerLösung Corticotropin, Gerbsäure sowie ein Zinksalz und gegebenenfalls teilweise hydrolysierte Gelatine vermischt.
EMI9.2