DE2751717C2

DE2751717C2 -

Info

Publication number: DE2751717C2
Application number: DE2751717A
Authority: DE
Inventors: Myer Louis Dr. Oakland Calif. Us Coval
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-12-03
Filing date: 1977-11-19
Publication date: 1991-01-24
Also published as: BE861463A; DK529377A; SE7713719L; US4124576A; ES464681A1; AR215037A1; IE46104B1; CA1100872A; AT361119B; YU276577A; SE443294B; NL7713362A; DE2751717A1; FR2372841B1; NZ185846A; AU3119677A; PT67350B; JPS5372816A; IE46104L; FI60022C

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung eines praktisch von antikomplementärer Aktivität freien und für die intravenöse Verabreichung geeigneten Gamma-Globulins und gemäß Anspruch 8 Arzneimittel, die das dabei erhältliche Gamma-Globulin enthalten. Die Ansprüche 2 bis 7 betreffen Ausgestaltungen des Verfahrens.

Die Immuno-Globulin-G-Fraktion aus gesammeltem menschlichem Plasma enthält Antikörper gegen viele Viren und Bakterien. Immunoglobuline sind wirksam bei der klinischen Behandlung einer breiten Palette von Krankheitszuständen, beispielsweise bei

1. der Prophylaxe und Therapie von Infektionen bei Personen mit genetischen und nososomischen Antikörper-Mangelzuständen, speziell bei Staphylokokken-, Pneumokokken-, Streptokokken- und H.-influenzae-Infektionen,
2. der Prophylaxe bei Patienten mit normalem Immuno-Globulin- Spiegel gegen Virus-Infektionen, z. B. gegen Hepatitis-, Polio-, Masern-, Röteln-, Tollwut-, Herpes- und Parotitis- Infektionen oder bei der Prophylaxe gegen Tetanus und bei vorliegender Rh-Unverträglichkeit, des weiteren
3. der Therapie von schweren bakteriellen Infektionen: Staphylokokken, Coli, Pseudomonas, Pyocyanaeus septicemia und auch bei der Therapie einiger Virusinfektionen, wie z. B. Herpes Zoster.

Sämtliche klinischen Möglichkeiten für die Anwendung des Immunoglobulins sind aus folgenden Gründen noch nicht realisiert worden: Millionen von Immunoglobulin-Dosen sind bereits intramuskulär mit den weiter unten beschriebenen Folgen verabreicht worden; die intravenös verabreichten Präparate werden aber sehr schnell abgebaut, hinzu kommt, daß zu niedere Dosen angewendet wurden. Die meisten antibakteriellen Antikörper des Human-Gamma-Globulins sind gegen Mikroorganismen, die den oberen Respirationstrakt, die Haut und den Gastrointestinaltrakt bewohnen, gerichtet. Die Menge Gammaglobulin, die benötigt wird, um eine experimentelle in-vivo- Infektion zu bewältigen, ist proportional der Anzahl infektiöser Organismen in dem Inokualt. Diese Tatsache wurde im Falle von Pseudomonas aeruginosa, E. Coli, Proteus und Staphylokokkus aureus bewiesen. Die benötigte Menge Gamma-Globulin ist aber auch proportional dem jeweils vorliegenden spezifischen Antikörper-Spiegel. Mit Chloramphenicol ergibt sich eine synergistische Wirkung ,aber mit anderen Antikörpern ergibt sich nur ein additiver Effekt.

Human-Immuno-Globuline wurden zuerst in großem Maßstab im Zetiraum von 1945 bis 1950 in Harvard im Labor von F. J. Cohn isoliert. Sehr bald wurde beobachtet, daß eine intravenöse Injektion dieser Präparate Schockreaktionen bei manchen Patienten hervorrief, und später wurde festgestellt, daß die antikomplementäre Aktivität von Ig G-Präparaten für diese Schockreaktionen verantwortlich ist. Diese antikomplementäre Aktivität geht auf Ig G-Aggregate zurück, die sich während der Fraktionierung gebildet haben.

Mit Rücksicht auf diese mit der intravenösen Verabreichung von Immuno-Globulinen verbundenen Schockreaktionen wurden diese therapeutisch wertvollen Stoffe statt dessen intramuskulär verabreicht. Jedoch hat die intramuskuläre Verabreichung von Immuno-Globulinen viele Schranken:

a) Sie ist schmerzhaft,
b) die Menge, die verabreicht werden kann, ist begrenzt,
c) die Proteolyse am Ort der Injektion vermindert das verfügbare Ig G und
d) maximale Blutspiegel werden erst nach drei bis vier Tagen erzielt, was ein ernsthafter Nachteil in jenen Fällen darstellt, die hohe Blutspiegel gleich nach der Injektion erfordern.

Darüber hinaus gibt die intravenöse Verabreichung von Immunoglobulinen breitere klinische Anwendungsmöglichkeiten, da die volle Dosis an Ig G sogleich in den Blutstrom gelangt, ohne daß ein Abbau an der Injektionsstelle eintritt und dann bedeutend höhere Blutspiegel erreicht werden können. Diese Überlegungen haben die Suche nach Methoden zur Herstellung von Ig G mit niederer antikomplementärer Aktivität, welches für intravenöse Anwendung geeignet ist, beschleunigt. Die entwickelten Methoden basieren auf einer proteolytischen oder chemischen Behandlung zur Beseitigung der antikomplementären Eigenschaften der Aggregate.

Es sind folgende Herstellungsverfahren bekannt:

1. Pepsinbehandlung von Immuno-Globulinen. Das Protein wird weitgehend zu Antikörper-Fragmenten [5 S, F (ab′)₂] abgebaut. Seine Brauchbarkeit zur Bekämpfung bakterieller Infektionen ist dadurch begrenzt, daß es eine nur kurze Halbwertzeit (etwa 30 Stunden im Vergleich zu 20 bis 30 Tagen für negatives Ig G) besitzt. Nach der Kombination mit Antigenen fixierten die 5 S- Fragemente kein Kompliment. Es findet in der Prophylaxe keine Anwendung.
2. Mit Plasmin behandeltes Immuno-Globulin. Mehr als 60% dieses Präparats werden zu Fragmenten (F ab und F c) abgebaut. Das verbleibende 7S-Globulin hat eine normale Halbwertzeit (drei bis vier Wochen), aber das Antikörper-Spektrum ist beschränkt.
3. Bei einem pH-Wert von 4 behandeltes Immuno-Globulin. Dieses Präparat hat die Tendenz, bei der Lagerung antikomplementär zu werden. Seine Verträglichkeit ist daher begrenzt, und hohe Dosen können nicht verabreicht werden. Die Halbwertzeit ist ein wenig geringer (12 bis 14 Tage) und die antibakterielle Aktivität auf einen nicht vorhersehbaren Grad reduziert.
4. Mit β-Propiolacton behandeltes Immuno-Globulin. Die Moleküle sind stark abgewandelt, wodurch sie wahrscheinlich neue Antigen-Determinanten bilden. Die Halbwertzeit ist etwa 10 Tage. Die bakteriolytische Aktivität ist herabgesetzt.

Die vier Ig G-Unterklassen haben eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegen Proteolyse. Die Pepsin-, Plasmin- und pH-4-(Pepsin)- Präparate unterscheiden sich demgemäß beträchtlich von unbehandeltem Ig G in ihrer Unterklassen-Verteilung.

Wie bereits erwähnt, ist die unerwünschte, antikomplementäre Aktivität, welche die Ursache für die Schockreaktion bei der intravenösen Verabreichung von Ig G bildet, durch die Anwesenheit von Aggregaten bedingt, welche während der Fraktionierung durch die angewandten Fraktionierungs-Methoden entstehen. Bei den oben beschriebenen Präparaten werden diese Aggregate nach ihrer Bildung zerstört, in den meisten Fällen entweder durch chemischen oder enzymatischen Abbau. Dieser Abbau führt aber auch zu einer gewissen Degradation des Ig G und demzufolge zu einem Verlust an Aktivität; so sind solche Präparate nicht so aktiv wie gewünscht. Wenig Arbeit ist in die Entwicklung von Methoden gesteckt worden, die die Bildung von Aggregaten verhindern und Ig G-Präparate bereitstellen, die im wesentlichen keine antikomplementäre Aktivität aufweisen. Kürzlich ist in der DE-A 23 57 800 eine Methode zur Herstellung von für die intravenöse Verabreichung geeignetem Gamma-Globulin veröffentlicht worden. Dieses Verfahren erfordert, ebenso wie andere veröffentlichte Verfahren zur Herstellung von Gamma-Globulin, als Ausgangsmaterial eine relativ reine Gamma-Globulin-Fraktion. Jedoch bedeutsamer ist, daß das nach dieser Methode erhaltene Gamma- Globulin immer noch eine außergewöhnlich hohe antikomplementäre Aktivität bei intravenöser Anwendung besitzt.

Es wurde auch beschrieben (vgl. US-A 37 63 135), ein für intravenöse Injektionen geeignetes Material aus Fraktion III herzustellen, jedoch ergibt das Verfahren der vorliegenden Erfindung eine wesentlich höhere Ausbeute, und das Produkt hat einen wesentlich geringeren Gehalt an antikomplementärem Material.

Es gibt "Food and Drug-Administration"(FDA)-Standards für intramuskuläres Gamma-Globulin, aber nicht für intravenöses Gamma- Globulin. Solche Standards sind jedoch erforderlich, um zwischen Gamma-Globulin, das schockähnliche Reaktionen bei der Anwendung auf intravenösem Weg bei empfindlichen Personen verursacht, und Gamma-Globulin, da solche Reaktionen nicht hervorruft, unterscheiden zu können.

Während der letzten fünfzehn Jahre ist nachgewiesen worden, daß - sogar bei hochempfindlichen Empfängern - keine klinischen Symptome beobachtet werden, wenn die Höhe der antikomplementären Aktivität nur genügend niedrig ist. Bezieht man sich auf die Einheiten des Standard-Tests von Mayer (Experimental Immunochemistry, E. A. Kabat und M. M. Mayer, zweite Auflage, S. 133, Thomas, Springfield, Illinois, 1961), so liegt die sichere Konzentration bei 0,04 bis 0,02 Einheiten oder weniger an antikomplementärem Material pro Milligramm Immuno-Globulin G, sie kann auch etwas höher als 0,04 sein; aber Reaktionen werden in der Regel erst beobachtet, wenn die Höhe bei 0,4 Einheiten pro Milligramm liegt. Die Verwendbarkeit von Gamma-Globulin-Präparaten für eine intravenöse Anwendung, die die Abwesenheit von Nebenreaktionen erfordert, setzt ein besonders niedriges Niveau an antikomplementärer Aktivität voraus. Es ist notwendig, die physiologische Antikörper- Aktivität und Spezifizität zu erhalten, um ein klinisch sicheres und wirksames Präparat bereitzustellen.

In der DE-A 26 06 118 wird ein Verfahren beschrieben, das zu einem für die intravenöse Injektion geeigneten Produkt mit weniger als 0,020 Einheiten an antikomplementärem Material führt. Dieses wurde nach der Methode von Kabat und Mayer, Experimental Immunochemistry, 2. Aufl., Seite 224 (1961, Thomas-Verl., Springfield, Illinois) bestimmt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines für die intravenöse Verabreichung geeigneten Gamma- Globulins, dessen antikomplementäre Aktivität noch geringer als beim letztgenannten bekannten Verfahren ist bzw., das praktisch frei von antikomplementärer Aktivität ist.

Diese Aufgabe wird durch das in den Patentansprüchen beschriebene Verfahren, das den Gegenstand der Erfindung bildet, gelöst.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird somit ein Gamma-Globulin erhalten, bei welchem die Eigenschaften des aktiven Gamma-Globulinmoleküls erhalten bleiben und das im wesentlichen keine Aggregate mit antikomplementärer Aktivität aufweist, wodurch das erhaltene Produkt sicher und wirksam für die intravenöse Anwendung wird. Das durch das erfindungsgemäße Verfahren bereitgestellte Gamma-Globulin weist eine biologische Halbwertzeit von 3 bis 4 Wochen auf. Es hat die Fähigkeit, Komplemente zu fixieren, und wenn es mit dem korrespondierenden Antigen kombiniert wird, und behält im wesentlichen ein unverändertes Antikörper-Spektrum bei, immer im Vergleich zu den Plasmaarten und Mengen an Gamma-Globulin-Antikörpern, die im Ausgangs-Plasma-Pool und in dem Standard-Gamma-Globulin, das nach Cohn's klassischer Äthanol- Fraktionierung von Plasma erhalten wurde, enthalten sind. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß das Gamma-Globulin ausgehend von leicht verfügbaren Blutprotein-Fraktionen geschaffen werden kann.

Durch die Fraktionierungsbedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Produkt erhalten, dessen pH innerhalb des physiologischen Bereiches liegt und dessen antikomplementäre Aktivität selbst während Lyophylisierung nicht steigt. Letzteres war ein Nachteil aller bekannten Produkte.

Die antikomplementäre Aktivität des vorliegenden Verfahrensproduktes ist so niedrig, daß sie mittels der Methode von Kabat und Mayer (Loc. cit) nicht mehr bestimmt werden kann. In einer neuen Bestimmungsmethode müssen die Bedingungen der bekannten Methode in der Weise geändert werden, daß die Zahl der Erythrocyten auf ein Zehntel verringert wird. Das Komplement wurde entsprechend herabgesetzt, und diese Methode ist 10-11× empfindlicher. Auf diese Weise kann man das antikomplementäre Material des durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Produktes bestimmen. Es sind 0,0005 bis 0,0025 Einheiten pro mg, während das nach dem Verfahren der DE-A 26 06 118 erhaltene Produkt noch 0,010 bis 0,020 Einheiten pro mg an antikomplementärem Material enthält. Erfindungsgemäß läßt sich daher ein gefriergetrocknetes Präparat herstellen, das eine lange Lebensdauer hat und leicht in eine gebrauchsfertige Form gebracht werden kann.

In Übereinstimmung mit einem Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wrid das Gamma-Globulin aus der leicht zugänglichen Plasma-Protein-Fraktion II+III von Cohn et al. [vgl. J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475 (1946) erhalten. Diese Fraktion, die nahezu alle Immuno-Globuline neben anderen Proteinen enthält, wird neuen Fraktionierungs-Techniken unterworfen, welche die Bildung von Aggregaten, die bei Anwendung der bekannte Fraktionierungsmaßnahmen entstehen, verhindern und die zu einem aktiven Gamma- Globulin führen, welches praktisch völlig bar jeder antikomplementären Aktivität und damit für die intravenöse Verabreichung geeignet ist.

Eine andere wertvolle Rohmaterial-Quelle ist das Material der Fraktion II, das leicht als Immun-Serumglobulin zugänglich ist. Dieses Material ist billig, es ist als gefriergetrocknetes Pulver oder gefrorene Paste stabil und ist frei von Hepatitis-Viren. Es kann in der gleichen Weise wie das Material der Fraktion II+III behandelt werden.

Noch ein weiteres wertvolles Ausgangsmaterial ist ein Placenta- Extrakt, der entsprechende Fraktionen enthält.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Paste, bestehend aus den Plasma-Proteinen der Fraktionen II oder II+III, mit Wasser bei einem pH von etwa 4,9 bis 6,0, vorzugsweise 5,1 extrahiert. Man verwendet pyrogenfreies Wasser in einem Volumen von 25 bis 45 Liter, vorzugsweise 30 Liter pro kg der Paste, die einen Proteingehalt von etwa 25 bis 30% aufweist. Jede nichttoxische, pharmazeutisch akzeptable organische oder anorganische Säure, wie Essig-, Milch-, Zitronen-, Salz oder Schwefelsäure oder ähnliche Säuren, kann verwendet werden, um den pH einzustellen. Das wasserunlösliche Material wird abgetrennt und das Filtrat dann fraktionierten Fällungen unterworfen. Zunächst mit Polyäthylenglykol bei einer Konzentration von 4%, dann mit Äthanol bei Konzentrationen von 4 bis 12%, vorzugsweise bei etwa 6%, und zuletzt mit Polyäthylenglykol bei 12%, das letztere bei einem pH von etwa 8,0. Die ersten zwei fraktionierten Fällungen beseitigen Verunreinigungen, und die letzte Fällung ergibt das gewünschte Gamma-Globulin der vorliegenden Erfindung. Bevozugt wird ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 4000 bis 12 000. Jede nichttoxische, pharmazeutisch akzeptable anorganische Base kann benützt werden, um den pH auf etwa 8,0 einzustellen. Das Verfahren kann bei einer Tempratur von etwa -10° bis +20°C ausgeführt werden.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältliche Gamma-Globulin kann leicht in die Form von pharmazeutischen Präparaten, die sich zur intravenösen Verabreichung eignen, gebracht werden. Bei der Formulierung solcher Präparate wird das Gamma-Globulin in einer auf etwa pH 5,4-6,7 gepufferten und Glycin, Albumin und ein nichtionisches Tensid enthaltenden wäßrigen Lösung aufgelöst. Der pH des Präparates wird dann, wie gewünscht, auf einen Wert zwischen 5,4 und 6,7 gebracht und die Konzentration an Gamma-Globulin in dem Präparat auf 5% eingestellt. Geeignete Puffer schließen Phosphat- und Natriumacetat/ Essigsäure-Systeme ein.

Um jegliche Denaturierung des gelösten Produktes an einer Flüssigkeit/ Gas- oder Flüssigkeit/Feststoff-Grenzfläche zu verhindern oder zu reduzieren, ist es vorteilhaft, dem pharmazeutischen Präparat ein Tensid zuzusetzen. Geeignete Tenside sind nichtionische Tenside, wie die Block-Copolymeren von Propylen- und Äthylenoxiden, wie z. B. Pluronic 68 (Poloxamer 188), und Partialester von Sorbit und Polyoxyäthylenoxid mit langkettigen Fettsäuren, wie die Tweens® 20, 40, 60, 80 und 95 (Polysorbate 20, 40, 60, 80 und 95), wasserlösliche Substanzen, die in der 1973er Ausgabe des CFTA Cosmetic Ingredient Dictionary's der Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association Inc. beschrieben sind, und Fluoro-Tenside, wie z. B. Zonyl FSA, FSB, FSC und FSN. Diese nichtionischen Tenside stabilisieren Proteine gegen Oberflächen-Denaturierung und enthalten als Struktur keinerlei chemische Gruppen, welche auf andere Weise mit Proteinen in Wechselwirkung treten oder sie denaturieren könnten.

Das erfindungsgemäß herstellbare Gamma-Globulin hat, wenn es als pharmazeutisches Präparat gemäß der vorliegenden Erfindung aufbewahrt wird, eine längere Halbwertzeit als die anderen jetzt auf dem Mark befindlichen Gamma-Globulin-Präparate. Das Gamma-Globulin der vorliegenden Erfindung hat sich als wertvoll bei der intravenösen Verabreichung bei allen Gelegenheit und unter allen Bedingungen erwiesen, bei denen eine intravenöse Verabreichung gefordert war, ohne daß hierbei die üblichen unerwünschten Effekte, die sonst mit der intravenösen Verabreichung von Gamma-Globulin einhergehen, auftraten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Paste der Cohn-Fraktionen II+III wird bei 0-5°C in pyrogenfreiem destilliertem Wasser - Konzentration 30 Liter pro kg Paste - suspendiert. (Ein Bereich von 20 bis 50 Liter kann benützt werden.) Der pH der Suspension wird dann auf 5,1 (Bereich 4,9 bis 6,0) mit verdünnter Essigsäure eingestellt (andere Säuren als die erwähnte können eingesetzt werden). Die Suspension wird daraufhin bei 0-5°C filtriert oder zentrifugiert und der Rückstand verworfen. Das Filtrat wird auf eine Konzentration von 4% Polyäthylenglykol 4000 (PEG 4000) gebracht (PEG 6000 und 12 000 können, in anderen Konzentrationsbereichen, ebenfalls verwendet werden). Der Niederschlag, der sich während einer Stunde bildet, wird wie bei der vorhergehenden Stufe verworfen. Das Filtrat wird dann auf eine 6%ige (Bereich 4 bis 12%) Äthanol-Konzentration gebracht, wobei der Zusatz vorsichtig bei -2°C (Bereich 0 bis -6°C) erfolgt. Der Niederschlag wird ebenfalls nach 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise nach 2 Stunden entfernt.

Die Lösung wird sodann 0,01molar an Kochsalz gemacht und der pH mit 1%iger Natronlauge auf 8,0 (Bereich 7 bis 8,2) eingestellt. Der Niederschlag, der sich durch Zusatz von Äthanol bis zu einer Konzentration von 25% oder von Polyäthylenglykol 4000 bis zu 10-12%, vorzugsweise 12%, bildet, wird durch kontinuierliches Durchfluß-Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit entfernt. Die so erhaltene Paste wird in folgender Lösung aufgelöst, die wie folgt erhalten wird: 5 bis 25 mg/ml erhitztes Human-Albumin, vorzugsweise 5-10 mg/ml, 0,025 Mol/Liter Natriumacetat, 0,15 Mol/Liter Glycin und 1-2 g/100 ml, vorzugsweise 2 g/100 ml, Mannit werden in Wasser gelöst und die Lösung mit Essigsäure auf pH 5,1 eingestellt. Lactose kann anstelle von Mannit verwendet werden. Die erhaltene Lösung, die 5-6% Ig G enthält, kann lyophilisiert oder als Flüssigkeit bei Temperaturen unter 10°C aufbewahrt werden. Wenn sie als Flüssigkeit aufbewahrt wird, so wird in der zum Auflösen benutzten Lösung das Mannit weggelassen.

Die Lösung kann lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet werden, und zwar in folgender Weise: Der Ph wird auf 6,4 bis 6,6 mit 1%igem Natriumhydroxid eingestellt. Die Lösung wird, nach Abfüllen der gewünschten Mengen in Fläschchen, schnell schalen-gefroren und die Lyophilisation dann nach gängigen Verfahren durchgeführt, wobei eine Überhitzung nach Entfernung des Wassers sorgfältig vermieden wird. Das lyophilisierte Produkt läßt sich jederzeit wieder zu einer 5- bis 6%igen Gamma-Globulin-Lösung auflösen. Die Lösung ist, gefroren oder bei Temperaturen bis 10°C, für mindestens 1 Jahr und das gefriergetrocknete Pulver für mindestens 2 Jahre stabil.

Die erhaltene Reinheit ist mindestens 97% mit der einzigen auffindbaren Verunreinigung Albumin. Die antikomplementäre Aktivität liegt unter 0,01 Einheiten pro mg Gamma-Globulin (im Bereich 0,0005 bis 0,0025 Einheiten). Die Einheiten werden nach dem "Zwei Einheiten-Test" von Mayer, vgl. oben, gemessen.

Beispiel 2

In pyrogenfreiem destilliertem Wasser, das 1 bis 4%, vorzugsweise 2% Polyäthylenglykol 4000 und 0,1 bis 1%, vorzugsweise 0,2% Humanalbumin enthält, wird Cohn-Fraktion-II-Paste oder Pulver bei 0-5°C gelöst, so daß eine Lösung mit einem Proteingehalt von 1-5%, vorzugsweise 2% entsteht. Der pH wird auf 5,1 (Bereich 4,9 bis 6,0, vorzugsweise 5,0 bis 5,8) eingestellt und der resultierende Niederschlag, der nach einer Stunde gebildet wird, wird durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Die Polyäthylenglykol- (PEG-)Konzentration des Filtrats wird mittels einer 50%igen PEG- 4000-Lösung oder mit trockenem PEG-4000-Pulver auf 4% erhöht. Der innerhalb einer Stunde gebildete Niederschlag wird entfernt. Dann wird Äthanol bis zu einer Konzentration von 6% langsam zugesetzt, so daß die Temperatur nicht über 2°C steigt. Der gebildete Niederschlag wird nach 1-12 Stunden, vorzugsweise 12 Stunden entfernt. Der pH wird dann auf 8,0 (Bereich 6,8-8,1) erhöht. Der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, nachdem man den Äthanol-Gehalt auf 25% erhöht hat, und unter den gleichen Bedingungen wie im ersten Beispiel wieder aufgelöst. Das Produkt enthält über 99% Gamma-Globulin, gemessen vor dem Zusatz von Albumin zu der zum Wiederauflösen benutzten Lösung. Es ergibt sich keine wahrnehmbare Hemmung der Hämolyse, wenn 50 mg des Gamma-Globulins pro ml (eine 5%ige Lösung) im Standard-Test von Mayer getestet werden; d. h., die antikomplementäre Aktivität liegt unter 0,01 Einheiten pro mg Ig G. Die zum Schluß erhaltene Lösung enthält nur das zugesetzte Albumin, das zuvor in bekannter Weise erhitzt worden ist, um jegliche Hepatitis-B-Viren zu entfernen. Keine anderen Proteine können mit konventionellen Techniken, wie z. B. Celluloseacetat-Elektrophorese, Immun-Elektrophorese oder Immunodiffusion, festgestellt werden.

Beispiel 3

Placentares Gamma-Globulin, das durch bekannte Maßnahmen isoliert worden ist, kann wie im Beispiel 2 aufgearbeitet werden.

Weil placentares Gamma-Globulin, das in bekannter Weise isoliert worden ist, einige wenige Prozent Verunreinigungen enthält, die Plasma-Proteine sind, wird zusätzliche Sorgfalt darauf verwendet, alles unlösliche Material in jeder Stufe zu entfernen, insbesondere unlösliches Material abzuschwemmen, bevor der pH in der ersten und allen weiteren Stufen eingestellt wird. Das Filtrat der 6%igen Äthanol-Lösung wird wie im ersten Beispiel 0,01molar an Kochsalz gemacht. Die anderen Schritte sind alle wie in Beispiel 2 angegeben. Die Reinheit des Produktes ist mindestens 98% an Gamma-Globulin, gemessen (vor dem Zusatz der zum Auflösen verwendeten Lösung, die 5-10 mg/ml Albumin enthält) mit denselben Techniken wie in Beispiel 2.

Dieselben Auflöse-Lösungen wie in Beispiel 1 werden verwendet, wobei Mannit weggelassen wird, wenn das Produkt eine Lösung sein und nicht lyophilisiert werden soll.

Beispiel 4

Immuno-Globulin-G-Paste oder Fraktion II oder getrocknetes Fraktion-II-Pulver placentaren Ursprungs kann benützt werden, um ein zur intravenösen Anwendung geeignetes, hoch gereinigtes Produkt herzustellen. Folgende Maßnahmen werden durchgeführt:

1. Die Paste oder das Pulver wird bis zu einer Konzentration von 1% (Bereich 0,3-5%) in Wasser suspendiert, welchem 2% Polyäthylenglykol 4000 (PEG 2000, 6000, 8000 und 12 000 - durchschnittliches Molekulargewicht - können ebenfalls benützt werden) und 0,2% erhitztes Human-Albumin bei 1°C (Bereich 0-5°C) zugesetzt sind. Das unlösliche aufschwimmende Material wird durch Abschöpfen entfernt.
2. Der pH wird dann auf 5,1 (Bereich 4,9-6,0) mit Essig- oder Salzsäure oder Zitronensäure oder anderen Säuren eingestellt. Der Niederschlag wird bei 1°C nach einer Stunde entfernt, und zwar druch Filtrieren oder Zentrifugieren.
3. Die Polyäthylenglykol-4000-Konzentration wird dann auf 4% erhöht. Das aufschwimmende Material wird wiederum entfernt. Später wird der sich bildende Niederschlag durch Filtrieren oder Zentrifugieren ebenfalls entfernt.
4. Äthanol wird bis zu einer Konzentration von 6% (Bereich 2-12%) langsam bei -6°C (Bereich +2 bis -15°C) zugesetzt.
5. Der Niederschlag und das aufgeschwommene Material werden wie bei den vorhergehenden Stufen entfernt.
6. Kochsalz wird bis zu einer Konzentration von 0,01 N (Bereich 0,0025-0,15 N) zugesetzt.
7. Der pH wird dann auf 8,0 (Bereich 7-8) angehoben.
8. Äthanol wird langsam bei -6°C bis zu einer Endkonzentration von 25% zugesetzt.
9. Der Niederschlag wird mittels Zentrifugieren gesammelt.
10. Der Niederschlag wird bis zu einer Endkonzentration von 5-6% auf der Basis von Bestimmungen mit bekannten Gewichten der Paste und bekannten Volumina in der Lösung, die folgendes enthält, aufgelöst: 6,5% erhitztes Human-Albumin (Bereich 0,3- 5%), Natriumacetat (0,125 oder 0,025 N), Glycin 0,15 N, pH 5,1 (eingestellt mit Essigsäure). Der pH der aufgelösten Paste wird mit Alkali, wie z. B. 1%iger Natronlauge oder Kalilauge oder Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, auf 6,6 eingestellt.
11. Wenn die Lösung lyophilisiert werden soll, werden 2% Mannit (Bereich 1-3%) zugesetzt.
12. Die resultierende Lösung bzw. das gefriergetrocknete Pulver enthält keine bekannten Verunreinigungen und hat weniger als 0,003 Einheiten an antikomplementärer Aktivität in dem "Zwei- Einheiten-Komplement-Test" von Mayer.
13. Wenn der Niederschlag von Stufe 9 analysiert wird, enthält er mehr als 98% Gamma-Globulin.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines praktisch von antikomplementärer Aktivität freien und für die intravenöse Verabreichung geeigneten Gamma-Globulins, dessen Antikörperspektrum und Unterklassen-Verteilung gegenüber dem als Ausgangsmaterial verwendeten Plasma praktisch unverändert ist, dadurch gekennzeichnet, daß eine Paste von Cohn-Fraktionen II oder II+III oder von diese enthaltendem Placenta- Extrakt mit pyrogenfreiem Wasser bei einem pH-Wert von 4,9 bis 6 extrahiert wird, der filtrierte Extrakt mit Polyäthylenglykol bis zu einer Konzentration von 4% (Gewicht/Volumen) und anschließend mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 4 bis 12% (Gewicht/Volumen) bei -6 bis +10°C versetzt wird, wobei jedesmal die ausgefallenen Verunreinigungen abgetrennt werden und anschließend aus dem Filtrat bei pH 7 bis 8,2 durch Erhöhung der Polyäthylenglykolkonzentration auf bis zu 12% (Gewicht/Volumen) bzw. durch Erhöhung der Äthanolkonzentration auf bis zu 25% (Volumen/Volumen) das gewünschte Gamma-Globulin bei einer Temperatur zwischen -6 und +20°C ausgefällt und isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung der Verunreinigungen mittels Polyäthylenglykol und anschließend Äthanol bei einem pH-Wert von 5,1 erfolgt.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Polyäthylenglykol ein Molekulargewicht von 4000 bis 6000 besitzt.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung der Verunreinigungen das Polyäthylenglykol in einer Konzentration von 4%, das Äthanol in einer Konzentration von 6% bei einer Temperatur von -2°C zur Anwendung kommen und nach Einstellung eines pH-Wertes von 8,0 die Lösung 0,01molar an Kochsalz gemacht und bei -6°C mit Polyäthylenglykol 4000 bis zu einer Konzentration von 12% (Gewicht/Volumen) oder mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 25% (Volumen/Volumen) zur Fällung des Gamma-Globulins versetzt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die erhaltene Gamma-Globulin-Paste zusammen mit Human- Albumin, Natriumacetat, Glycin und gegebenenfalls Mannit in eine wäßrige Lösung mit einem pH-Wert von 5,0 bis 5,5 gebracht wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die so hergestellte Lösung, die auch Mannit enthält, anschließend mittels einer Base auf einen pH-Wert von 6,4 bis 6,6 gebracht, anschließend gefriergetrocknet bzw. lyophilisiert wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgangssuspension mittels Wasser hergestellt wird, welches etwa 2% Polyäthylenglykol und etwa 0,2% Albumin enthält.

8. Arzneimittel, enthaltend Gamma-Globuline, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 7.