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PATENTANSPRÜCHE
1. Ein im wesentlichen von antikomplementärer Aktivität freies und für die intravenöse Verabreichung geeignetes Gamma-Globulin, welches praktisch frei ist von Aggregaten und Abbauprodukten F (ab)1, F (ab)2 oder Fc und sich in Wasser zu klaren und farblosen Lösungen Iöst, dadurch gekennzeichnet, dass dessen antikomplementäre Aktivität kleiner als 0,01 Einheiten pro mg Gamma-Globulin ist.
2. Gamma-Globulin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Sedimentationskoeffizienten von 7 S besitzt.
3. Gamma-Globulin nach Anspruch 1 oder 2 mit einer antikomplementären Aktivität von 0,0005 bis 0,0025 Einheiten pro mg Gamma-Globulin.
4. Gamma-Globulin nach Anspruch 1 in lyophilisierter Form.
5. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend ein Gamma Globulin nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Ein für intravenöse Verabreichung geeignetes Gamma Globulin kann aus der einfach zugänglichen Plasma-Protein Paste der Fraktionen II + III oder aus einer Cohn-Fraktion II-Paste oder einem Cohn-Fraktion II-Pulver oder aus einem die entsprechenden Fraktionen enthaltenden Placenta Extrakt bereitgestellt werden. Die Fraktion II oder II + III Masse oder die entsprechenden Fraktionen aus Placenta Extrakt können mit Wasser bei einem pH von 4,9 bis 6,0 extrahiert werden, Verunreinigungen können fraktioniert durch Zusetzen von Polyäthylenglykol bis zu einer Konzentration von 4% (Gewicht/Volumen) und in einer zweiten Stufe von 4 bis 12%, vorzugsweise von 6%, (Gewicht/Volumen) Äthanol gefällt werden.
Das gewünschte Gamma Globulin kann dann bei einem pH-Wert von 6,8 bis 8,2, vorzugsweise von 8,0%, durch Zugabe von Polyäthylenglykol bis zu einer Konzentration von 12% (Gewicht/Volumen) oder von Äthanol bis zu einer Konzentration von 25% (Volumen/Volumen) gefällt werden.
Die Erfindung betrifft Gamma-Globuline bzw. diese enthaltende Präparate, die sich für die intravenöse Verabreichung eignen, wie sie in den Patentansprüchen 1 und 5 angegeben sind. Bevorzugte Ausführungsformen des Gamma Globulins sind in den Patentansprüchen 2, 3 und 4 angegeben.
Die Immuno-Globulin-G-Fraktion aus gesammeltem menschlichem Plasma enthält Antikörper gegen viele Viren und Bakterien. Immunoglobuline sind wirksam bei der klinischen Behandlung einer breiten Palette von Krankheitszuständen, beispielsweise bei
1. der Prophylaxe und Therapie von Infektionen bei Personen mit genetischen und nososomischen Antikörper Mangelzuständen, speziell bei Staphylokokken-, Pneumo kokken-, Streptokokken- und H. influenzae-Infektionen;
2. der Prophylaxe bei Patienten mit normalem Immuno Globulin-Spiegel gegen Virus-Infektionen, z.B. gegen Hepatitis-, Polio-, Masern-, Röteln-, Tollwut-, Herpes- und Parotitis-, Infektionen oder bei der Prophylaxe gegen Tetanus und bei vorliegender Rh-Unverträglichkeit, desweiteren
3. der Therapie von schweren bakteriellen Infektionen:
: Staphylokokken, Coli, Pseudomonas, Pyocyanaeus septicemia und auch bei der Therapie einiger Virusinfektionen wie z. B. Herpes Zoster.
Sämtliche klinische Möglichkeiten für die Anwendung des Immunoglobulins sind aus den folgenden Gründen noch nicht realisiert worden: Millionen von Immunoglobulin Dosen sind bereits intramuskulär mit den weiter unten beschriebenen Folgen verabreicht worden; die intravenös verabreichten Präparate werden aber sehr schnell abgebaut, hinzu kommt, dass zu niedere Dosen angewendet wurden.
Die meisten antibakteriellen Antikörper des Human Gamma-Globulins sind gegen Mikroorganismen, die den oberen Respirationstrakt, die Haut und den Gastrointestinaltrakt bewohnen, gerichtet. Die Menge Gammaglobulin, die benötigt wird, um eine experimentelle in vivo-Infektion zu bewältigen, ist proportional der Anzahl infektiöser Organismen in dem Inokulat. Diese Tatsache wurde im Falle von Pseudomonas aeruginosa, E. Coli, Proteus und Staphylokokkus aureus bewiesen. Die benötigte Menge Gamma Globulin ist aber auch proportional dem jeweils vorliegenden spezifischen Antikörper-Spiegel. Mit Chloramphenicol ergibt sich eine synergistische Wirkung, aber mit anderen Antikörpern ergibt sich nur ein additiver Effekt.
Human-Immuno-Globuline wurden zuerst in grossem Massstab im Zeitraum von 1945 bis 1950 in Harvard im Labor von F.J. Cohn isoliert. Sehr bald wurde beobachtet, dass eine intravenöse Injektion dieser Präparate Schockreaktionen bei manchen Patienten hervorrief und später wurde festgestellt, dass die antikomplementäre Aktivität von Ig G Präparaten für diese Schockreaktionen verantwortlich ist.
Diese antikomplementäre Aktivität geht auf Ig G-Aggregate zurück, die sich während der Fraktionierung gebildet haben.
Mit Rücksicht auf diese mit der intravenösen Verabreichung von Immuno-Globulinen verbundenen Schockreaktionen wurden diese therapeutisch wertvollen Stoffe stattdessen intramuskulär verabreicht. Jedoch hat die intramuskuläre Verabreichung von Immuno-Globulinen viele Schranken: a) sie ist schmerzhaft, b) die Menge, die verabreicht werden kann, ist begrenzt, c) die Proteolyse am Ort der Injektion vermindert das verfüg bare Ig G und d) maximale Blutspiegel werden erst nach drei bis vier Tagen erzielt, was ein ernsthafter Nachteil in jenen Fällen dar stellt, die hohe Blutspiegel gleich nach der Injektion er fordern.
Darüber hinaus gibt die intravenöse Verabreichung von Immunoglobulinen breitere klinische Anwendungsmöglichkeiten, da die volle Dosis an Ig G sogleich in den Blutstrom gelangt, ohne dass ein Abbau an der Injektionsstelle eintritt und dann bedeutend höhere Blutspiegel erreicht werden können. Diese Überlegungen haben die Suche nach Methoden zur Herstellung von Ig G mit niederer antikomplementärer Aktivität, welches für intravenöse Anwendung geeignet ist, beschleunigt. Die entwickelten Methoden basieren auf einer proteolytischen oder chemischen Behandlung zur Beseitigung der antikomplementären Eigenschaften der Aggregate.
Es sind folgende Herstellungsverfahren bekannt:
1. Pepsinbehandlung von Immuno-Globulinen. Das Protein wird weitgehend zu Antikörper-Fragmenten (5 S, F (ab')2) abgebaut. Seine Brauchbarkeit zur Bekämpfung bakterieller Infektionen ist dadurch begrenzt, dass es eine nur kurze Halbwertszeit (etwa 30 Stunden im Vergleich zu 20 bis 30 Tagen für negatives Ig G) besitzt. Nach der Kombination mit Antigenen fixierten die 5 S-Fragmente kein Kompliment. Es findet in der Prophylaxe keine Anwendung.
2. Mit Plasmin behandeltes Immuno-Globulin. Mehr als 60% dieses Präparates werden zu Fragmenten (F ab und F c) abgebaut. Das verbleibende 7S-Globulin hat eine normale Halbwertzeit (drei bis vier Wochen), aber das Antikörper-Spektrum ist beschränkt.
3. Bei einem pH-Wert von 4 behandeltes Immuno Globulin. Dieses Präparat hat die Tendenz, bei der Lage
rung antikomplementär zu werden. Seine Verträglichkeit ist daher begrenzt und hohe Dosen können nicht verabreicht werden. Die Halbwertzeit ist ein wenig geringer (12 bis 14 Tage) und die antibakterielle Aktivität auf einen nicht vorhersehbaren Grad reduziert.
4. Mit ss-Propiolacton behandeltes Immuno-Globulin.
Die Moleküle sind stark abgewandelt, wodurch sie wahrscheinlich neue Antigen-Determinanten bilden. Die Halbwertzeit ist etwa 10 Tage. Die bakteriolytische Aktivität ist herabgesetzt.
Die vier Ig G-Unterklassen haben eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegen Proteolyse. Die Pepsin-, Plasminund pH-4-(Pepsin)-Präparate unterscheiden sich demgemäss beträchtlich von unbehandeltem Ig G in ihrer Unterklassen Verteilung.
Wie bereits erwähnt, ist die unerwünschte, antikomplementäre Aktivität, welche die Ursache für die Schockreaktion bei der intravenösen Verabreichung von Ig G bildet, durch die Anwesenheit von Aggregaten bedingt, welche während der Fraktionierung durch die angewandten Fraktionierungs-Methoden entstehen. Bei den oben beschriebenen Präparaten werden diese Aggregate nach ihrer Bildung zerstört, in den meisten Fällen entweder durch chemischen oder enzymatischen Abbau. Dieser Abbau führt aber auch zu einer gewissen Degradation des Ig G und demzufolge zu einem Verlust an Aktivität; so sind solche Präparate nicht so aktiv wie gewünscht. Wenig Arbeit ist in die Entwicklung von Methoden gesteckt worden, die die Bildung von Aggregaten verhindern und Ig G-Präparate bereitstellen, die im wesentlichen keine antikomplementäre Aktivität aufweisen.
Kürzlich ist in der DT-OS 2 357 800, veröffentlicht am 6.
Juni 1974, eine Methode zur Herstellung von für die intravenöse Verabreichung geeignetem Gamma-Globulin veröffentlicht worden. Dieses Verfahren erfordert, ebenso wie andere veröffentlichte Verfahren zur Herstellung von Gamma Globulin, als Ausgangsmaterial eine relativ reine Gamma Globulin-Fraktion. Jedoch bedeutsamer ist, dass das nach dieser Methode erhaltene Gamma-Globulin immer noch eine aussergewöhnlich hohe antikomplementäre Aktivität bei intravenöser Anwendung besitzt.
Es wurde auch vorgeschlagen (vgl. US-Patent 3 763 135), ein für intravenöse Injektionen geeignetes Material aus Fraktion III herzustellen, jedoch ergibt z. B. ein neues, im folgenden beschriebenes, Verfahren eine wesentlich höhere Ausbeute, und das Produkt hat einen wesentlich geringeren Gehalt an antikomplementärem Material.
Es gibt Food and Drug-Administration (FDA)-Standards für intramuskuläres Gamma-Globulin, aber nicht für intravenöses Gamma-Globulin. Solche Standards sind jedoch erforderlich, um zwischen Gamma-Globulin, das schockähnliche Reaktionen bei der Anwendung auf intravenösem Wege bei empfindlichen Personen verursacht, und Gamma-Globulin, das solche Reaktionen nicht hervorruft, unterscheiden zu können.
Während der letzten fünfzehn Jahre ist nachgewiesen worden, dass - sogar bei hochempfindlichen Empfängern keine klinischen Symptome beobachtet werden, wenn die Höhe der antikomplementären Aktivität nur genügend niedrig ist. Bezieht man sich auf die Einheiten des Standard Tests von Mayer (Experimental Immunochemistry, E.A.
Kabat und M.M. Mayer, zweite Auflage, S. 133, Thomas Springfield, Illinois, 1961), so liegt die sichere Konzentration bei 0,04 bis 0,02 Einheiten oder weniger an komplementärem Material pro Milligramm Immuno-Globulin G, sie kann auch etwas höher als 0,04 sein; aber Reaktionen werden in der Regel erst beobachtet, wenn die Höhe bei 0,4 Einheiten pro Milligramm liegt. Die Verwendbarkeit von Gamma Globulin-Präparaten für eine intravenöse Anwendung, die die Abwesenheit von Nebenreaktionen erfordert, setzt ein besonders niedriges Niveau an antikomplementärer Aktivität voraus. Es ist notwendig, die physiologische Antikörper Aktivität und Spezifität zu erhalten, um ein klinisch sicheres und wirksames Präparat bereitzustellen.
Es wird ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemässen Gamma-Globulins vorgeschlagen, bei welchem die Eigenschaften des aktiven Gamma-Globulin-Moleküls erhalten bleibt, und das im wesentlichen keine Aggregate mit antikomplementärer Aktivität aufweist, wodurch das Produkt sicher und wirksam für die intravenöse Anwendung wird.
Es ist demnach ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Gamma-Globulin zur Verfügung zu stellen, das für die intravenöse Injektion geeignet ist und welches in vitro im wesentlichen keine antikomplementäre Aktivität mehr aufweist.
Das für die intravenöse Injektion geeignete Gamma Globulin hat eine biologische Halbwertzeit von 3 bis 4 Wochen.
Das für die intravenöse Injektion geeignete Gamma Globulin hat die Fähigkeit, Komplemente zu fixieren, wenn es mit dem korrespondierenden Antigen kombiniert wird, und behält ein im wesentlichen unverändertes Antikörper Spektrum bei, immer im Vergleich zu den Plasmaarten und Mengen an Gamma-Globulin-Antikörpern, die im Ausgangs-Plasma-Pool und in dem Standard-Gamma-Globulin, das nach Cohn's klassischer Äthanol-Fraktionierung von Plasma erhalten wurde, enthalten sind.
Aus der DE-OS 2 606 118 ist ein Verfahren bekannt, das zu einem für die intravenöse Injektion geeignetem Produkt mit weniger als 0,020 Einheiten an antikomplementärem Material führt. Dieses wurde nach der Methode von Kabat und Mayer, Experimental Immunochemistry, 2. Aufl. Seite 224 (1961 Thomas-Verl. Springfield, Illinois) bestimmt.
Nach einem neuen Verfahren wird jedoch durch geänderte Fraktionierungsbedingungen ein Produkt erhalten, dessen pH innerhalb des physiologischen Bereichs liegt und dessen antikomplementäre Aktivität selbst während der Lyophilisierung nicht steigt. Letzteres war ein Nachteil aller bekannten Produkte.
Die antikomplementäre Aktivität des vorliegenden Produktes ist so niedrig, dass sie mittels der obengenannten Methode nicht mehr bestimmt werden kann. In einer neuen Bestimmungsmethode müssen die Bedingungen der obigen bekannten Methode in der Weise geändert werden, dass die Zahl der Erythrocyten auf ein Zehntel verringert wird. Das Komplement wurde entsprechend herabgesetzt und die Methode dadurch 101 lx so empfindlich gemacht. Auf diese Weise kann man das antikomplementäre Material des erfindungsgemässen Produktes bestimmen: es sind weniger als 0,01, vorzugsweise 0,0005 bis 0,0025, Einheiten pro mg, während das Produkt der obenbezeichneten DE-OS 0,010 bis 0,020 Einheiten pro mg an antikomplementärem Material enthält.
Man kann daher ein gefriergetrocknetes Präparat herstellen, das eine lange Lebensdauer hat und leicht in eine gebrauchsfertige Form gebracht werden kann.
In Übereinstimmung mit einem Aspekt eines neuen Verfahrens wird das Gamma-Globulin aus der leicht zugänglichen Plasma-Protein-Fraktion 11+111 von Cohn et al. (vgl.
J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475 /(1946/) erhalten. Diese Fraktion, die nahezu alle Immuno-Globuline neben anderen Proteinen enthält, wird neuen Fraktionierungs-Techniken unterworfen, welche die Bildung von Aggregaten, die bei Anwendung der bekannten Fraktionierungsmassnahmen entstehen, verhindern und die zu einem aktiven Gamma Globulin führen, welches praktisch völlig bar jeder antikom plementären Aktivität und damit für die intravenöse Verabreichung geeignet ist.
Eine andere wertvolle Rohmaterial-Quelle ist das Material der Fraktion II, das leicht als Immun-Serumglobulin zugänglich ist. Dieses Material ist billig, es ist als gefriergetrocknetes Pulver oder gefrorene Paste stabil und ist frei von Hepatitis-Viren. Es kann in der gleichen Weise wie das Material der Fraktion 11+111 behandelt werden.
Noch ein weiteres wertvolles Ausgangsmaterial ist ein Placenta-Extrakt, der entsprechende Fraktionen enthält.
Nach einem neuen, im folgenden beschriebenen, Verfahren wird eine Paste, bestehend aus den Plasma-Proteinen der Fraktionen II + III oder eine Paste oder ein Pulver, bestehend aus den Plasma-Proteinen der Fraktion II, mit Wasser bei einem pH von 4,9 bis 6,0, vorzugsweise 5,1, extrahiert.
Man verwendet pyrogenfreies Wasser, im allgemeinen in einem Volumen von 25 bis 45 Liter, vorzugsweise 30 Liter pro kg der Paste oder des Pulvers, die/das bevorzugt einen Proteingehalt von 25 bis 30% aufweist. Die Ionenstärke ist so eingestellt, dass die Lösung eine Leitfähigkeit von etwa 300 x 10-6 1Q- l aufweist. Jede nicht-toxische, pharmazeutisch akzeptable organische oder anorganische Säure, wie Essig-, Milch-, Zitronen-, Salz- oder Schwefelsäure oder ähnliche Säuren, kann verwendet werden, um den pH einzustellen. Das wasserunlösliche Material wird abgetrennt und das Filtrat dann fraktionierten Fällungen unterworfen.
Zunächst mit Polyäthylenglykol bei einer Konzentration von 4% (Gewicht/Volumen), dann mit Äthanol bei Konzentrationen von 4 bis 12% (Gewicht/Volumen), vorzugsweise von 6%, und zuletzt durch Erhöhen der Polyäthylenglykolkonzentration auf bis zu 12% (Gewicht/Volumen) oder durch Erhöhung der Äthanolkonzentration auf bis zu 25% (Volu- men/Volumen), das letztere bei einem pH von 6,8 bis 8,2, vorzugsweise von 8,0. Die ersten zwei fraktionierten Fällungen beseitigen Verunreinigungen und die letzte Fällung ergibt das gewünschte Gamma-Globulin der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugt wird ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4000 bis 12000. Jede nicht-toxische, pharmazeutisch akzeptable anorganische Base kann benützt werden, um den pH-auf 6,8 bis 8,2, vorzugsweise auf 8,0, einzustellen. Das Verfahren kann bei einer Temperatur von - 10 bis + 20 "C ausgeführt werden.
Das Verfahren ist im einzelnen in den Beispielen beschrieben.
Spezielle Ausführungsformen des oben beschriebenen Verfahrens, nach dem das erfindungsgemässe Gamma Globulin beispielsweise hergestellt werden kann, sind im folgenden beschrieben.
Herstellungsbeispiel 1
Paste der Cohn-Fraktionen II + tII wird bei 0-5 "C in pyrogenfreiem destilliertem Wasser - Konzentration 30 Liter pro kg - Paste - suspendiert. (Ein Bereich von 20 bis 50 Liter kann benützt werden). Der pH der Suspension wird dann auf 5.1 (Bereich 4.9 bis 6.0) mit verdünnter Essigsäure eingestellt (andere Säuren als die erwähnte können eingesetzt werden). Die Suspension wird daraufhin bei OS "C filtriert oder zentrifugiert und der Rückstand verworfen. Das Filtrat wird auf eine Konzentration von 4% Polyäthylenglykol 4000 (PEG 4000) gebracht (PEG 6000 und 12000 können, in anderen Konzentrationsbereichen, ebenfalls verwendet werden). Der Niederschlag, der sich während einer Stunde bildet, wird wie bei der vorhergehenden Stufe verworfen.
Das Filtrat wird dann aufeine 6%ige (Bereich 4 bis 12%) Äthanol-Konzentration gebracht, wobei der Zusatz vorsichtig bei - 2 "C (Bereich 20 bis 10 "C) erfolgt. Der Niederschlag wird ebenfalls nach 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise nach 2 Stunden entfernt.
Die Lösung wird sodann 0,01 molar an Kochsalz gemacht und der pH mit 1 %iger Natronlauge auf 8.0 (Bereich 6,8 bis 8,2) eingestellt. Der Niederschlag, der sich durch Zusatz von Äthanol bis zu einer Konzentration von 25%, oder von Polyäthylenglykol 4000 bis zu 10-12%, vorzugsweise 12%, bildet, wird durch kontinuierliches Durchfluss-Zentrifugieren bei hoher Geschwindigkeit entfernt. Die so erhaltene Paste wird in folgender Lösung aufgelöst, die wie folgt erhalten wird: 5 bis 25 mg/ml erhitztes Human-Albumin, vorzugsweise 5-10 mg/ml, 0,025 Mol/Liter Natriumacetat, 0,15 Mol/Liter Glycin und 1-2 g/100ml, vorzugsweise 2 g/l00ml, Mannit werden in Wasser gelöst und die Lösung mit Essigsäure auf pH 5.1 eingestellt. Lactose kann anstelle von Mannit verwendet werden.
Die erhaltene Lösung, die 56% Ig G enthält, kann lyophilisiert oder als Flüssigkeit bei Temperaturen unter 10 C aufbewahrt werden. Wenn sie als Flüssigkeit aufbewahrt wird, so wird in der zum Auflösen benutzten Lösung das Mannit weggelassen.
Die Lösung kann lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet werden, und zwar in folgender Weise: Der pH wird auf 6,4 bis 6,6 mit I hOigem Natriumhydroxid eingestellt. Die Lösung wird, nach Abfüllen der gewünschten Mengen in Flaschchen, schnell schalen-gefroren und die Lyophilisation dann nach gängigen Verfahren durchgeführt, wobei eine Überhitzung nach Entfernung des Wassers sorgfältig vermieden wird. Das lyophilisierte Produkt lässt sich jederzeit wieder zu einer 5 bis 6%gen Gamma-Globulin-Lösung auflösen. Die Lösung ist, gefroren oder bei Temperaturen bis 10 "C, für mindestens 1 Jahr und das gefriergetrocknete Pulver für mindestens 2 Jahre stabil.
Die erhaltene Reinheit ist mindestens 97% mit der einzigen auffindbaren Verunreinigung Albumin. Die antikomple mentäre Aktivität liegt unter 0,01 Einheiten pro mg Gamma Globulin (im Bereich 0,0005 bis 0,0025 Einheiten). Die Einheiten werden nach dem Zwei Einheiten-Test von Mayer, vgl. oben, gemessen.
Herstellungsbeispiel 2
In pyragenfreiem destilliertem Wasser das 1 bis 4%, vor zugsweise 2% Polyäthylenglykol 4000 und 0,1 bis 1%, vorzugsweise 0,2% Humanalbumin enthält, wird Cohn-Fraktion-II-Paste oder Pulver bei OS CC gelöst, so dass eine Lösung mit einem Proteingehalt von 1-5%, vorzugsweise 2%, entsteht. Der pH wird auf 5.1 (Bereich 4,9 bis 6,0, vorzugsweise 5,0 bis 5,8) eingestellt und der resultierende Niederschlag, der nach einer Stunde gebildet wird, wird durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Die Polyäthylengly kol-(PEG)-Konzentration des Filtrats wird mittels einer 50%igen PEG-4000-Lösung oder mit trockenem PEG-4000 Pulver auf 4% erhöht. Der innerhalb einer Stunde gebildete Niederschlag wird entfernt.
Dann wird Äthanol bis zu einer Konzentration von 6% langsam zugesetzt, so dass die Temperatur nicht über 2 CC steigt. Der gebildete Niederschlag wird nach 1-12 Stunden, vorzugsweise 12 Stunden, entfernt.
Der pH wird dann auf 8.0 (Bereich 6,8-8,2) erhöht.
Der resultierende Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, nachdem man den Äthanol-Gehalt auf 25% erhöht hat, und unter den gleichen Bedingungen wie im ersten Beispiel wiederaufgelöst. Das Produkt enthält über 99% Gamma-Globulin, gemessen vor dem Zusatz von Albumin zu der zum Wiederauflösen benutzten Lösung. Es ergibt sich keine wahrnehmbare Hemmung der Hämolyse, wenn 50 mg des Gamma-Globulins pro ml (eine 5%ige Lösung) im Standard-Test von Mayer getestet werden; d.h. die antikomplementäre Aktivität liegt unter 0,01 Einheiten pro mg Ig G.
Die zum Schluss erhaltene Lösung enthält nur das zugesetzte Albumin, das zuvor in bekannter Weise erhitzt worden ist um jegliche Hepatitis-B-Viren zu entfernen Keine anderen Proteine können mit konventionellen Techniken wie z. B.
Celluloseacetat-Elektrophorese, Immun-Elektrophorese oder Immunodiffusion, festgestellt werden.
Herstellungsbeispiel 3
Placentares Gamma-Globulin, das durch bekannte Massnahmen isoliert worden ist, kann wie im Beispiel 2 aufgearbeitet werden. Weil placentares Gamma-Globulin, das in bekannter Weise isoliert worden ist, einige wenige Prozent Verunreinigungen enthält, die Plasma-Proteine sind, wird zusätzliche Sorgfalt darauf verwendet, alles unlösliche Material in jeder Stufe zu entfernen, insbesondere unlösliches Material abzuschwemmen, bevor der pH in der ersten und allen weiteren Stufen eingestellt wird. Das Filtrat der 6%gen Äthanol-Lösung wird wie im ersten Beispiel 0,01 molar an Kochsalz gemacht. Die anderen Schritte sind alle wie in Beispiel 2 angegeben.
Die Reinheit des Produktes ist mindestens 98% an Gamma-Globulin, gemessen (vor dem Zusatz der zum Auflösen verwendeten Lösung, die 5-10 mg/ml Albumin enthält) mit denselben Techniken wie in Beispiel 2.
Dieselben Auflöse-Lösungen wie in Beispiel 1 werden verwendet, wobei Mannit weggelassen wird, wenn das Produkt eine Lösung sein und nicht lyophilisiert werden soll.
Herstellungsbeispiel 4
Immuno-Globulin-G-Paste oder Fraktion II, oder getrocknetes Fraktion II-Pulver plazentaren Ursprungs kann, benützt werden, um ein zur intravenösen Anwendung geeignetes, hoch gereinigtes, Produkt herzustellen. Folgende Massnahmen werden durchgeführt:
1. Die Paste oder das Pulver wird bis zu einer Konzentration von 1% (Bereich 0,3-5%) in Wasser suspendiert, welchem 2% Polyäthylenglykol 4000 (PEG 2000, 6000, 8000 und 12000 - durchschnittliches Molekulargewicht - können ebenfalls benützt werden) und 0,2% erhitztes Human-Albumin bei 1 "C (Bereich 20 bis 18 "C) zugesetzt sind. Das unlösliche aufschwimmende Material wird durch Abschöpfen entfernt.
2. Der pH wird dann auf 5.1 (Bereich 4.9-6.0) mit Essigoder Salzsäure oder Zitronensäure oder anderen Säuren eingestellt. Der Niederschlag wird bei 1 "C nach einer Stunde entfernt, und zwar durch Filtrieren oder Zentrifugieren.
3. Die Polyäthylenglykol 4000-Konzentration wird dann auf 4% erhöht. Das aufschwimmende Material wird wiederum entfernt. Später wird der sich bildende Niederschlag durch Filtrieren oder Zentrifugieren ebenfalls entfernt.
4. Äthanol wird bis zu einer Konzentration von 6% (Bereich 4-12%) langsam bei -6 "C (Bereich +20 bis - 10 "C) zugesetzt.
5. Der Niederschlag und das aufgeschwommene Material werden wie bei den vorhergehenden Stufen entfernt.
6. Kochsalz wird bis zu einer Konzentration von 0,01 N (Bereich 0,0025-0,15 N) zugesetzt.
7. Der pH wird dann auf 8.0 (Bereich 6,8 bis 8,2) angehoben.
8. Äthanol wird langsam bei - 6 "C bis zu einer Endkonzentration von 25% zugesetzt.
9. Der Niederschlag wird mittels Zentrifugieren gesammelt.
10. Der Niederschlag wird bis zu einer Endkonzentration von 5-6% auf der Basis von Bestimmungen mit bekannten Gewichten der Paste und bekannten Volumina in der Lösung, die folgendes enthält, aufgelöst: 6,5% erhitztes Human-Albumin (Bereich 0,3-5%), Natriumacetat (0,0125 oder 0,025 N), Glycin 0,15 N, pH 5.1 (eingestellt mit Essigsäure). Der pH der aufgelösten Paste wird mit Alkali, wie z.B. I %iger Natronlauge oder Kalilauge oder Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, auf 6.6 eingestellt.
11. Wenn die Lösung lyophilisiert werden soll, werden 2% Mannit (Bereich 1-3%) zugesetzt.
12. Die resultierende Lösung bzw. das gefriergetrocknete Pulver enthält keine bekannten Verunreinigungen und hat weniger als 0,003 Einheiten an antikomplementärer Aktivität in dem Zwei-Einheiten-Komplement-Test von Mayer.
13. Wenn der Niederschlag von Stufe 9 analysiert wird, enthält er mehr als 98% Gamma-Globulin.
Das Gamma-Globulin dieser Erfindung kann leicht in die Form von pharmazeutischen Präparaten, die sich zur intravenösen Verabreichung eignen, gebracht werden. Bei der Formulierung solcher Präparate wird das Gamma-Globulin im allgemeinen in einer auf etwa pH 5,4 bis 6,7 gepufferten und Glycin, Albumin und ein nicht-ionisches Tensid enthaltenden wässrigen Lösung aufgelöst. Der pH des Präparates wird dann in der Regel, wie gewünscht, auf einen Wert zwischen 5,4 und 6,7 gebracht und die Konzentration an Gamma-Globulin in dem Präparat auf 5% eingestellt. Geeignete Puffer schliessen Phosphat- und Natriumacetat/Essigsäure Systeme ein.
Um jegliche Denaturierung des gelösten Produktes an einer Flüssigkeit/Gas- oder Flüssigkeit/Feststoff-Grenzfläche zu verhindern oder zu reduzieren, ist es vorteilhaft, dem pharmazeutischen Präparat ein Tensid zuzusetzen. Geeignete Tenside sind nichtionische Tenside, wie die Block Copolymeren von Propylen- und Äthylenoxiden wie z.B.
Pluronic 68 (Poloxamer 188), und Partialester von Sorbit und Polyoxyäthylenoxid mit langkettigen Fettsäuren, wie die TweensR 20, 40, 60, 80 und 95 (Polysorbate 20, 40, 60, 80 und 95), wasserlösliche Substanzen, die in der 1973er Ausgabe des CFTA Cosmetic Ingredient Dictionary's der Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association Inc. beschrieben sind, und Fluoro-Tenside wie z. B. Zonyl FSA, FSB, FSC und FSN. Diese nichtionischen Tenside stabilisieren Proteine gegen Oberflächen-Denaturierung und enthalten als Struktur keinerlei chemische Gruppen, welche auf andere Weise mit Proteinen in Wechselwirkung treten oder sie denaturieren könnten.
Das Gamma-Globulin der vorliegenden Erfindung hat, wenn es als pharmazeutisches Präparat gemäss der vorliegenden Erfindung aufbewahrt wird, eine längere Halbwertzeit als die anderen jetzt auf dem Markt befindlichen Gamma-Globulin-Präparate. Das Gamma-Globulin der vorliegenden Erfindung hat sich als wertvoll bei der intravenösen Verabreichung bei allen Gelegenheiten und unter allen Bedingungen erwiesen, bei denen eine intravenöse Verabreichung gefordert war ohne dass hierbei die üblichen unerwünschten Effekte, die sonst mit der intravenösen Verabreichung von Gamma-Globulin einhergehen, auftraten.
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PATENT CLAIMS
1. An essentially anti-complementary activity-free and suitable for intravenous administration gamma globulin, which is practically free of aggregates and degradation products F (ab) 1, F (ab) 2 or Fc and which dissolves in water to clear and colorless solutions , characterized in that its anti-complementary activity is less than 0.01 units per mg of gamma globulin.
2. Gamma globulin according to claim 1, characterized in that it has a sedimentation coefficient of 7 S.
3. Gamma globulin according to claim 1 or 2 with an anti-complementary activity of 0.0005 to 0.0025 units per mg gamma globulin.
4. Gamma globulin according to claim 1 in lyophilized form.
5. Pharmaceutical preparation containing a gamma globulin according to any one of claims 1 to 4.
A gamma globulin suitable for intravenous administration can be provided from the easily accessible plasma protein paste of fractions II + III or from a Cohn fraction II paste or a Cohn fraction II powder or from a placenta extract containing the corresponding fractions. Fraction II or II + III mass or the corresponding fractions from placenta extract can be extracted with water at a pH of 4.9 to 6.0, impurities can be fractionated by adding polyethylene glycol up to a concentration of 4% (weight / volume ) and in a second stage from 4 to 12%, preferably from 6% (weight / volume) ethanol.
The desired gamma globulin can then be at a pH of 6.8 to 8.2, preferably 8.0%, by adding polyethylene glycol to a concentration of 12% (weight / volume) or ethanol to a concentration of 25% (volume / volume).
The invention relates to gamma globulins or preparations containing them, which are suitable for intravenous administration, as specified in claims 1 and 5. Preferred embodiments of the gamma globulin are given in claims 2, 3 and 4.
The immunoglobulin G fraction from collected human plasma contains antibodies against many viruses and bacteria. Immunoglobulins are effective in the clinical treatment of a wide range of conditions, for example
1. the prophylaxis and therapy of infections in persons with genetic and nososomic antibody deficiency states, especially in staphylococcal, pneumococcal, streptococcal and H. influenzae infections;
2. prophylaxis in patients with normal immunoglobulin levels against virus infections, e.g. against hepatitis, polio, measles, rubella, rabies, herpes and parotitis, infections or in the prophylaxis against tetanus and in the presence of Rh intolerance, furthermore
3. Therapy of severe bacterial infections:
: Staphylococci, coli, Pseudomonas, Pyocyanaeus septicemia and also in the therapy of some viral infections such as. B. Herpes zoster.
All clinical possibilities for the use of immunoglobulin have not yet been realized for the following reasons: millions of doses of immunoglobulin have already been administered intramuscularly with the consequences described below; however, the intravenously administered preparations are broken down very quickly, in addition to the fact that doses that were too low were used.
Most of the antibacterial antibodies in human gamma globulin are directed against microorganisms that inhabit the upper respiratory tract, the skin and the gastrointestinal tract. The amount of gamma globulin required to cope with an experimental in vivo infection is proportional to the number of infectious organisms in the inoculate. This fact has been proven in the case of Pseudomonas aeruginosa, E. Coli, Proteus and Staphylococcus aureus. The amount of gamma globulin required is also proportional to the specific antibody level present. With chloramphenicol there is a synergistic effect, but with other antibodies there is only an additive effect.
Human immunoglobulins were first used on a large scale in the period from 1945 to 1950 in Harvard in the laboratory of F.J. Cohn isolated. It was soon observed that intravenous injection of these preparations caused shock reactions in some patients and later it was found that the anti-complementary activity of Ig G preparations is responsible for these shock reactions.
This anti-complementary activity is due to Ig G aggregates that formed during the fractionation.
In view of these shock reactions associated with intravenous administration of immunoglobulins, these therapeutically valuable substances were instead administered intramuscularly. However, intramuscular administration of immunoglobulins has many limitations: a) it is painful, b) the amount that can be administered is limited, c) proteolysis at the site of injection reduces the available Ig G and d) maximum blood levels are only achieved after three to four days, which is a serious disadvantage in those cases that require high blood levels immediately after the injection.
In addition, the intravenous administration of immunoglobulins has broader clinical applications, since the full dose of Ig G gets into the bloodstream immediately, without breaking down at the injection site and then significantly higher blood levels can be reached. These considerations have accelerated the search for methods for producing Ig G with low anticomplementary activity, which is suitable for intravenous use. The developed methods are based on a proteolytic or chemical treatment to remove the anti-complementary properties of the aggregates.
The following manufacturing processes are known:
1. Pepsin treatment of immunoglobulins. The protein is largely broken down into antibody fragments (5 S, F (ab ') 2). Its usefulness in combating bacterial infections is limited by the fact that it has a short half-life (about 30 hours compared to 20 to 30 days for negative Ig G). The 5 S fragments did not fix a compliment after combination with antigens. It is not used in prophylaxis.
2. Immunoglobulin treated with plasmin. More than 60% of this preparation is broken down into fragments (F ab and F c). The remaining 7S globulin has a normal half-life (three to four weeks), but the antibody spectrum is limited.
3. Immunoglobulin treated at pH 4. This preparation tends to be able to
to become anti-complementary. Its tolerance is therefore limited and high doses cannot be administered. The half-life is slightly shorter (12 to 14 days) and the antibacterial activity is reduced to an unpredictable level.
4. Immunoglobulin treated with ss-propiolactone.
The molecules are highly modified, which is likely to create new antigen determinants. The half-life is about 10 days. Bacteriolytic activity is reduced.
The four Ig G subclasses have different sensitivity to proteolysis. The pepsin, plasmin and pH-4 (pepsin) preparations therefore differ considerably from untreated Ig G in their subclass distribution.
As already mentioned, the undesirable, anti-complementary activity which forms the cause of the shock reaction when intravenously administering Ig G is due to the presence of aggregates which arise during the fractionation by the fractionation methods used. In the preparations described above, these aggregates are destroyed after their formation, in most cases either by chemical or enzymatic degradation. However, this breakdown also leads to a certain degradation of the Ig G and consequently to a loss of activity; such preparations are not as active as desired. Little work has gone into developing methods that prevent the formation of aggregates and provide Ig G preparations that have essentially no anti-complementary activity.
Recently in DT-OS 2 357 800, published on 6
June 1974, a method for the production of gamma globulin suitable for intravenous administration has been published. This process, like other published processes for producing gamma globulin, requires a relatively pure gamma globulin fraction as the starting material. However, it is more important that the gamma globulin obtained by this method still has an exceptionally high anticomplementary activity when administered intravenously.
It has also been proposed (see U.S. Patent 3,763,135) to make a material suitable for intravenous injection from Fraction III, but e.g. B. a new, described below, a much higher yield, and the product has a significantly lower content of anti-complementary material.
There are Food and Drug Administration (FDA) standards for intramuscular gamma globulin, but not for intravenous gamma globulin. However, such standards are required to distinguish between gamma globulin, which causes shock-like reactions when used intravenously in sensitive individuals, and gamma globulin, which does not cause such reactions.
Over the past fifteen years, it has been demonstrated that - even in highly sensitive recipients - no clinical symptoms are observed if the level of anticomplementary activity is low enough. If one refers to the units of the standard test from Mayer (Experimental Immunochemistry, E.A.
Kabat and M.M. Mayer, second edition, p. 133, Thomas Springfield, Illinois, 1961), the safe concentration is 0.04 to 0.02 units or less of complementary material per milligram of immunoglobulin G, it can also be somewhat higher than 0 , Be 04; but reactions are usually only observed when the level is 0.4 units per milligram. The availability of gamma globulin preparations for intravenous use, which requires the absence of side reactions, requires a particularly low level of anticomplementary activity. It is necessary to maintain the physiological antibody activity and specificity in order to provide a clinically safe and effective preparation.
A method for producing a gamma globulin according to the invention is proposed in which the properties of the active gamma globulin molecule are retained and which has essentially no aggregates with anticomplementary activity, as a result of which the product becomes safe and effective for intravenous use.
It is therefore an object of the present invention to provide a gamma globulin which is suitable for intravenous injection and which has essentially no anticomplementary activity in vitro.
The gamma globulin suitable for intravenous injection has a biological half-life of 3 to 4 weeks.
The gamma globulin suitable for intravenous injection has the ability to fix complement when combined with the corresponding antigen, and maintains an essentially unchanged antibody spectrum, always compared to the plasma types and amounts of gamma globulin antibodies, which are contained in the starting plasma pool and in the standard gamma globulin, which was obtained from Cohn's classic ethanol fractionation of plasma.
From DE-OS 2 606 118 a method is known which leads to a product suitable for intravenous injection with less than 0.020 units of anticomplementary material. This was determined using the method of Kabat and Mayer, Experimental Immunochemistry, 2nd ed. Page 224 (1961 Thomas-Verl. Springfield, Illinois).
According to a new method, however, changes in the fractionation conditions result in a product whose pH is within the physiological range and whose anti-complementary activity does not increase even during the lyophilization. The latter was a disadvantage of all known products.
The anti-complementary activity of the present product is so low that it can no longer be determined using the above-mentioned method. In a new method of determination, the conditions of the above known method have to be changed in such a way that the number of erythrocytes is reduced to one tenth. The complement was reduced accordingly, making the method 101 lx so sensitive. In this way, the anti-complementary material of the product according to the invention can be determined: it is less than 0.01, preferably 0.0005 to 0.0025, units per mg, while the product of the above-mentioned DE-OS 0.010 to 0.020 units per mg of anti-complementary Contains material.
It is therefore possible to produce a freeze-dried preparation that has a long lifespan and can be easily converted into a ready-to-use form.
In accordance with one aspect of a new method, the gamma globulin is obtained from the easily accessible plasma protein fraction 11 + 111 from Cohn et al. (see.
J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475 / (1946 /). This fraction, which contains almost all immunoglobulins alongside other proteins, is subjected to new fractionation techniques which prevent the formation of aggregates which result from the use of the known fractionation measures and which lead to an active gamma globulin which is practically completely without anyone antikom complementary activity and thus suitable for intravenous administration.
Another valuable raw material source is Fraction II material, which is easily accessible as immune serum globulin. This material is cheap, it is stable as a freeze-dried powder or frozen paste and is free from hepatitis viruses. It can be treated in the same way as the material of fraction 11 + 111.
Another valuable raw material is a placenta extract that contains the appropriate fractions.
According to a new method, described below, a paste consisting of the plasma proteins of fractions II + III or a paste or a powder consisting of the plasma proteins of fraction II is mixed with water at a pH of 4.9 to 6.0, preferably 5.1, extracted.
Pyrogen-free water is used, generally in a volume of 25 to 45 liters, preferably 30 liters per kg of the paste or powder, which preferably has a protein content of 25 to 30%. The ionic strength is set so that the solution has a conductivity of approximately 300 x 10-6 1Q- l. Any non-toxic, pharmaceutically acceptable organic or inorganic acid such as acetic, lactic, citric, hydrochloric or sulfuric acid or similar acids can be used to adjust the pH. The water-insoluble material is separated off and the filtrate is then subjected to fractional precipitation.
First with polyethylene glycol at a concentration of 4% (weight / volume), then with ethanol at concentrations from 4 to 12% (weight / volume), preferably 6%, and finally by increasing the polyethylene glycol concentration to up to 12% (weight / Volume) or by increasing the ethanol concentration up to 25% (volume / volume), the latter at a pH of 6.8 to 8.2, preferably 8.0. The first two fractional precipitates remove contaminants and the last precipitate gives the desired gamma globulin of the present invention.
A polyethylene glycol having a molecular weight of 4,000 to 12,000 is preferred. Any non-toxic, pharmaceutically acceptable inorganic base can be used to adjust the pH to 6.8 to 8.2, preferably 8.0. The process can be carried out at a temperature of - 10 to + 20 "C.
The procedure is described in detail in the examples.
Special embodiments of the method described above, according to which the gamma globulin according to the invention can be produced, for example, are described below.
Production Example 1
Paste of the Cohn fractions II + tII is suspended at 0-5 "C in pyrogen-free distilled water - concentration 30 liters per kg - paste. (A range of 20 to 50 liters can be used). The pH of the suspension is then raised 5.1 (range 4.9 to 6.0) with dilute acetic acid (acids other than those mentioned can be used). The suspension is then filtered at OS "C or centrifuged and the residue is discarded. The filtrate is brought to a concentration of 4% polyethylene glycol 4000 (PEG 4000) (PEG 6000 and 12000 can also be used in other concentration ranges). The precipitate that forms over an hour is discarded as in the previous step.
The filtrate is then brought to a 6% (range 4 to 12%) ethanol concentration, the addition being careful at -2 "C (range 20 to 10" C). The precipitate is also removed after 1 to 24 hours, preferably after 2 hours.
The solution is then made 0.01 molar in sodium chloride and the pH is adjusted to 8.0 (range 6.8 to 8.2) with 1% sodium hydroxide solution. The precipitate, which is formed by adding ethanol up to a concentration of 25%, or polyethylene glycol 4000 up to 10-12%, preferably 12%, is removed by continuous flow centrifugation at high speed. The paste thus obtained is dissolved in the following solution, which is obtained as follows: 5 to 25 mg / ml of heated human albumin, preferably 5-10 mg / ml, 0.025 mol / liter of sodium acetate, 0.15 mol / liter of glycine and 1 -2 g / 100 ml, preferably 2 g / 100 ml, mannitol are dissolved in water and the solution is adjusted to pH 5.1 with acetic acid. Lactose can be used instead of mannitol.
The solution obtained, which contains 56% Ig G, can be lyophilized or stored as a liquid at temperatures below 10 ° C. If stored as a liquid, the mannitol is omitted from the solution used for dissolution.
The solution can be lyophilized or freeze-dried, in the following way: The pH is adjusted to 6.4 to 6.6 with 10% sodium hydroxide. After filling the desired quantities in bottles, the solution is quickly shell-frozen and the lyophilization is then carried out according to customary methods, overheating after removal of the water being carefully avoided. The lyophilized product can be dissolved again at any time to a 5 to 6% gamma globulin solution. The solution is frozen or stable at temperatures up to 10 "C for at least 1 year and the freeze-dried powder for at least 2 years.
The purity obtained is at least 97% with the only albumin found. The anti-complementary activity is below 0.01 units per mg of gamma globulin (in the range 0.0005 to 0.0025 units). The units are tested according to the Mayer two-unit test, cf. measured above.
Production Example 2
In pyragen-free distilled water which contains 1 to 4%, preferably 2% polyethylene glycol 4000 and 0.1 to 1%, preferably 0.2% human albumin, Cohn Fraction II paste or powder is dissolved at OS CC, so that a Solution with a protein content of 1-5%, preferably 2%, is formed. The pH is adjusted to 5.1 (range 4.9 to 6.0, preferably 5.0 to 5.8) and the resulting precipitate, which is formed after one hour, is separated off by filtration or centrifugation. The polyethylene glycol (PEG) concentration of the filtrate is increased to 4% by means of a 50% PEG-4000 solution or with dry PEG-4000 powder. The precipitate formed within one hour is removed.
Then ethanol is slowly added to a concentration of 6% so that the temperature does not rise above 2 CC. The precipitate formed is removed after 1-12 hours, preferably 12 hours.
The pH is then raised to 8.0 (range 6.8-8.2).
The resulting precipitate is collected by centrifugation after increasing the ethanol content to 25% and redissolved under the same conditions as in the first example. The product contains over 99% gamma globulin, measured before the addition of albumin to the redissolution solution. There is no perceptible inhibition of hemolysis when 50 mg of gamma globulin per ml (a 5% solution) is tested in the standard Mayer test; i.e. the anti-complementary activity is less than 0.01 units per mg Ig G.
The solution obtained at the end only contains the added albumin, which has previously been heated in a known manner in order to remove any hepatitis B viruses. No other proteins can be obtained using conventional techniques such as e.g. B.
Cellulose acetate electrophoresis, immune electrophoresis or immunodiffusion.
Production Example 3
Placentar gamma globulin, which has been isolated by known measures, can be worked up as in Example 2. Because placental gamma globulin, which has been isolated in a known manner, contains a few percent of impurities that are plasma proteins, additional care is taken to remove all insoluble material at each stage, especially to wash off insoluble material before the pH is in the first and all subsequent levels. The filtrate of the 6% ethanol solution is made as in the first example 0.01 molar of sodium chloride. The other steps are all as given in Example 2.
The purity of the product is at least 98% of gamma globulin, measured (before adding the dissolving solution containing 5-10 mg / ml albumin) using the same techniques as in Example 2.
The same dissolution solutions as in Example 1 are used, with mannitol being omitted if the product is to be a solution and not to be lyophilized.
Production Example 4
Immuno-globulin G paste or Fraction II, or dried Fraction II powder of placental origin can be used to prepare a highly purified product suitable for intravenous use. The following measures are carried out:
1. The paste or powder is suspended up to a concentration of 1% (range 0.3-5%) in water, which 2% polyethylene glycol 4000 (PEG 2000, 6000, 8000 and 12000 - average molecular weight - can also be used ) and 0.2% heated human albumin at 1 "C (range 20 to 18" C) are added. The insoluble floating material is removed by skimming.
2. The pH is then adjusted to 5.1 (range 4.9-6.0) with acetic or hydrochloric acid or citric acid or other acids. The precipitate is removed at 1 "C after one hour, by filtration or centrifugation.
3. The polyethylene glycol 4000 concentration is then increased to 4%. The floating material is removed again. Later, the precipitate that forms is also removed by filtration or centrifugation.
4. Add ethanol to a concentration of 6% (range 4-12%) slowly at -6 "C (range +20 to -10" C).
5. The precipitation and the floating material are removed as in the previous steps.
6. Saline is added to a concentration of 0.01 N (range 0.0025-0.15 N).
7. The pH is then raised to 8.0 (range 6.8 to 8.2).
8. Ethanol is slowly added at - 6 "C to a final concentration of 25%.
9. The precipitate is collected by centrifugation.
10. The precipitate is dissolved to a final concentration of 5-6% based on determinations with known paste weights and known volumes in the solution containing the following: 6.5% heated human albumin (range 0.3 -5%), sodium acetate (0.0125 or 0.025 N), glycine 0.15 N, pH 5.1 (adjusted with acetic acid). The pH of the dissolved paste is adjusted with alkali, e.g. I% sodium hydroxide solution or potassium hydroxide solution or tris (hydroxymethyl) aminomethane, set to 6.6.
11. If the solution is to be lyophilized, 2% mannitol (range 1-3%) is added.
12. The resulting solution or freeze-dried powder contains no known contaminants and has less than 0.003 units of anti-complementary activity in Mayer's two-unit complement test.
13. If the precipitation from level 9 is analyzed, it contains more than 98% gamma globulin.
The gamma globulin of this invention can easily be put in the form of pharmaceutical preparations suitable for intravenous administration. In formulating such preparations, the gamma globulin is generally dissolved in an aqueous solution buffered to about pH 5.4 to 6.7 and containing glycine, albumin and a non-ionic surfactant. The pH of the preparation is then, as desired, brought to a value between 5.4 and 6.7 and the concentration of gamma globulin in the preparation is adjusted to 5%. Suitable buffers include phosphate and sodium acetate / acetic acid systems.
In order to prevent or reduce any denaturation of the dissolved product at a liquid / gas or liquid / solid interface, it is advantageous to add a surfactant to the pharmaceutical preparation. Suitable surfactants are nonionic surfactants such as the block copolymers of propylene and ethylene oxides such as e.g.
Pluronic 68 (Poloxamer 188), and partial esters of sorbitol and polyoxyethylene oxide with long chain fatty acids, such as TweensR 20, 40, 60, 80 and 95 (Polysorbate 20, 40, 60, 80 and 95), water-soluble substances, which were published in the 1973 edition of the CFTA Cosmetic Ingredient Dictionary of the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association Inc. and Fluoro-Tenside such as. B. Zonyl FSA, FSB, FSC and FSN. These nonionic surfactants stabilize proteins against surface denaturation and as a structure do not contain any chemical groups, which otherwise interact with proteins or could denature them.
When stored as a pharmaceutical preparation according to the present invention, the gamma globulin of the present invention has a longer half-life than the other gamma globulin preparations now on the market. The gamma globulin of the present invention has been found to be valuable for intravenous administration on all occasions and under all conditions where intravenous administration was required without the usual undesirable effects that are otherwise associated with intravenous administration of gamma globulin , occurred.