JPS6016406B2 - Method for producing intravenously administrable gamma globulin and gamma globulin prepared thereby - Google Patents
Method for producing intravenously administrable gamma globulin and gamma globulin prepared therebyInfo
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- JPS6016406B2 JPS6016406B2 JP51093935A JP9393576A JPS6016406B2 JP S6016406 B2 JPS6016406 B2 JP S6016406B2 JP 51093935 A JP51093935 A JP 51093935A JP 9393576 A JP9393576 A JP 9393576A JP S6016406 B2 JPS6016406 B2 JP S6016406B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はガンマ・グロブリンに関するものである。[Detailed description of the invention] The present invention relates to gamma globulins.
本発明は特に静脈内注射によって投与する場合に通した
ガンマ・グロプリン製剤と同製剤の製造法に関するもの
である。混合血数から得たガンマ・グロブリンすなわち
免疫グロブリンG(1gG)は多くの感染性病源体に対
する抗体を含有している。The present invention relates to gamma globulin preparations and methods of making the same, particularly for administration by intravenous injection. Gamma globulin or immunoglobulin G (1gG) obtained from mixed blood counts contains antibodies against many infectious agents.
免疫グロブリンは種々さまざまな病状の臨床的管理に関
して効果を有する。免疫グロプリンは各種の抗体欠損状
態にある患者の感染予防もしくは治療に用いられる。免
疫グロブリンレベルが正常な患者に対しては、免疫グロ
ブリンは例えば肝炎、麻疹、風疹、水痘、流行性耳下腺
炎、黄熱病、狂犬病、庖疹、天然痘の如きウイルス感染
症、ジフテリア、百日咳、破傷風の如き細菌感染症、お
よびRh不適合などに対する予防と、抗生物質耐性菌に
よる重症感染症(ブドウ球菌および大腸菌による敗血症
、緑膿菌による敗皿症)の治療においても用いられる。
免疫グロブリンの秘めているすべての臨床的可能性は、
いまだ完全に明らかにはされていない。人免疫グロブリ
ンは、第2次世界大戦中に初めて大規模に分離されるよ
うになった。Immunoglobulins have efficacy in the clinical management of a wide variety of disease states. Immune globulins are used to prevent or treat infections in patients with various antibody deficiencies. For patients with normal immunoglobulin levels, immunoglobulins are used to treat viral infections such as hepatitis, measles, rubella, chickenpox, mumps, yellow fever, rabies, herpes, smallpox, diphtheria, and pertussis. It is also used to prevent bacterial infections such as tetanus and Rh incompatibility, and to treat severe infections caused by antibiotic-resistant bacteria (sepsis caused by Staphylococcus and Escherichia coli, sepsis caused by Pseudomonas aeruginosa).
The full clinical potential of immunoglobulins is
It has not yet been completely clarified. Human immunoglobulins first became isolated on a large scale during World War II.
時を経ずして、これらの製剤は静脈内投与によって患者
にショック反応を生じせしめることが観察され、引き続
いて1や製剤の抗補体活性がショック反応の元凶である
ということも立証された。この抗補体活性は分画工程中
に生じた1gG分子の凝集に基づくものである。免疫グ
ロブリンの静脈内投与に伴うこれらのショック反応を考
慮して、治療面で有用なこれらの物質は静脈内に代えて
筋肉内に投与された。It was soon observed that these preparations produced shock reactions in patients when administered intravenously, and it was subsequently established that the anticomplement activity of 1 and the preparations was responsible for the shock reactions. . This anti-complement activity is based on the aggregation of 1gG molecules that occurs during the fractionation process. In view of these shock reactions associated with intravenous administration of immunoglobulins, these therapeutically useful substances were administered intramuscularly instead of intravenously.
しかしながら免疫グロブリンの筋肉内投与には下記の如
き多くの制約がある。a 痛いこと、
b 投与できる量に制限があること、
c 注射部位で生じる蛋白分解作用が投与した1gG量
を減弱せしめること、d 投与3日もしくは4日後でな
ければ、血中の最高濃度に到達しないこと。However, intramuscular administration of immunoglobulin has many limitations as described below. a) it is painful, b) there is a limit to the amount that can be administered, c) the proteolytic effects that occur at the injection site attenuate the amount of 1 gG administered, and d) the maximum concentration in the blood is not reached until 3 or 4 days after administration. What not to do.
このことは投与後直ちに高レベルの1や濃度を必要とす
る症例にとって重大な障害となる。これに反し、免疫グ
ロプリンの静脈内投与は、注射部位における分解も受け
ず、投与量全体が直ちに血流中に入ること、およびかな
りの高い血中濃度が得られることなどの理由からより広
範囲な臨床応用面をもっている。This presents a significant obstacle for cases requiring high levels of 1 or concentration immediately after administration. In contrast, intravenous administration of immunoglobulin is more widespread because it is not subject to degradation at the injection site, the entire dose immediately enters the bloodstream, and significantly higher blood concentrations are obtained. It has clinical applications.
このような考えが静脈内投与に適した低抗補体活性をも
つ1gGの製造法の開発を促してきた。現在までに開発
されている方法は、凝集分子の抗補体作用を減ずるため
の蛋白分解または化学的処理に基づくものである。これ
らの製造法によって得られる製剤を例示すると下記の如
くである。1 ペプシン処理免疫グロプリン
この製剤においては、蛋白は抗体の分屑
($、F(ab′)2)となるまで大中に分解されてい
る。This idea has prompted the development of a method for producing 1gG with low anti-complement activity suitable for intravenous administration. Methods developed to date are based on proteolytic or chemical treatments to reduce the anti-complement effect of aggregated molecules. Examples of preparations obtained by these manufacturing methods are as follows. 1. Pepsin-treated immunoglobulin In this preparation, proteins are degraded into fragments of antibodies ($, F(ab')2).
短時間に(血中から)消失するため(変化を受けていな
い1gGが20〜30日間であるのに比して3q時間と
短い)この製剤の細菌感染と桔抗する効力には制約があ
る。抗原と結合したのち、$分屑は桶体を固定しない。
この製剤は予防目的に適用できない。2 プラスミン処
理免疫グ。Because it is cleared (from the blood) over a short period of time (3q hours compared to 20-30 days for unchanged 1gG), the efficacy of this preparation in combating bacterial infections is limited. . After binding to the antigen, the $ fraction does not immobilize the barrel.
This preparation is not applicable for prophylactic purposes. 2 Plasmin-treated immunization.
プリンこの製剤においては、グロプリンの60%以上が
FabおよびFc分屑に分解されている。Purines In this formulation, more than 60% of the glopurins are degraded to Fab and Fc fragments.
残存するおグロプリンは、正常な半減期(3〜4週間)
を保持しているが、抗体のスベクトラムは限られている
。3 pH4処理グロブリン
この製剤は、貯蔵中に抗補体作用をもつようになる煩向
がある。Remaining globulin has a normal half-life (3-4 weeks)
However, the antibody spectrum is limited. 3. pH4-treated globulin This formulation tends to develop anti-complementary effects during storage.
従ってその適合性は制限され、大量を投与することはで
きない。半減期は若干減少しており(12〜14日)、
抗細菌活性は測定できない程度までに滅弱している。4
8−プロピオラクトン処理グロブリン分子は大中に変
化し、新しい抗原性を生じている可能性がある。Its suitability is therefore limited and it cannot be administered in large quantities. The half-life is slightly decreased (12-14 days),
Antibacterial activity was weakened to the extent that it could not be measured. 4
8-Propiolactone-treated globulin molecules may undergo major changes, giving rise to new antigenic properties.
半減期は約10日である。溶菌活性は減少している。1
gCの4つの亜型は、蛋白分解作用に対してそれぞれ異
なる感受性を有している。Half-life is approximately 10 days. Bacteriolytic activity is reduced. 1
The four subtypes of gC have different susceptibilities to proteolytic effects.
従ってペプシン、プラスミンおよびpH4(ペプシン共
存)処理製剤は、それぞれ1gG亜型の分布量に関して
未処理1gGとは、非常に異ったものである。上記の如
く、1やの静脈内投与によってひきおこされるショック
反応の元凶である望ましくない抗補体作用は1gG中の
分子の凝集によるものでありそれは分画工程中に生成さ
れるものである。Therefore, the pepsin, plasmin and pH 4 (with pepsin) treated formulations are very different from the untreated 1gG with respect to the amount of distribution of each 1gG subtype. As mentioned above, the undesirable anti-complement effect responsible for the shock response caused by intravenous administration of 1gG is due to the aggregation of molecules in 1gG, which are generated during the fractionation process.
上記の製剤は、凝集が生成したのちのものを、主として
化学的および酵素的作用によって分解せしめる方法を用
いて得たものである。しかし、このような分解処理は、
必然的に活性の損失伴った1やの分解をも生じせしめる
ことになる。その結果、上述の如き製剤は期待する活性
を保持していない。凝集の生成を阻止し、本質的に抗補
体作用のない1g0製剤をつくり出す方法の開発は現在
まで殆んどなされていない。ごく最近1974−6−6
発行の西独公開特許第2,357,80び号で静脈内投
与に適するガンマ・グロブリン製剤の製法が発表された
。この他に発表されているガンマ・グロブリン調製法と
同様、この方法は比較的純度の高いガンマ・グロブリン
分画を原料としているところによりどころがある。しか
しながら非常に重要な点は、上記特許方法によって得た
ガンマ・グロブリンもなお静脈内投与には過大な抗補体
作用を有していることである。フラクション1から静脈
内投与に通した物質を得る方法も提案されている(アメ
リカ合衆国特許第3,763,135号)。しかし本発
明による方法のほうがはるかに収量が多く得られたもの
には、抗補体作用物質がはるかに少い。筋注用ガンマ・
グロブリンについてはFDAの基準があるが、静法用ガ
ンマ・グロブリンにはそれがない。The above-mentioned preparations are obtained using a method in which the aggregates are decomposed mainly by chemical and enzymatic action. However, this kind of decomposition process
This will inevitably lead to decomposition of 1 and 2 with a loss of activity. As a result, formulations such as those described above do not retain the expected activity. To date, little has been done to develop methods to prevent the formation of aggregates and create 1g0 formulations that are essentially anti-complementary. Very recently 1974-6-6
A method for preparing gamma globulin preparations suitable for intravenous administration was published in West German Published Patent No. 2,357,80. Like other published gamma globulin preparation methods, this method relies on the fact that it uses a relatively pure gamma globulin fraction as a raw material. However, a very important point is that the gamma globulin obtained by the patented method still has too much anti-complementary action for intravenous administration. A method for obtaining a substance suitable for intravenous administration from fraction 1 has also been proposed (US Pat. No. 3,763,135). However, the method according to the invention yields much higher yields containing much less anticomplementary active substance. Gamma for intramuscular injection
There are FDA standards for globulin, but there are no such standards for gamma globulin for static methods.
感受性の高い人体に静脈内投与した場合、ショック様反
応をひきおこすガンマ・グロブリンとそのような反応を
引き出すことのないガンマ・グロプリンとを明確に区別
するために同様の基準が必要である。過去1g主間に、
抗補体活性が十分に低いレベルのガンマ・グロブリンな
らば、たとえ高い感受性を有する患者においても何らの
臨床的症状も認められないことが立証されている。Similar criteria are needed to clearly distinguish between gamma globulins that cause a shock-like response when administered intravenously to susceptible humans and those that do not. In the past 1g main period,
It has been established that at sufficiently low levels of gamma globulin anti-complement activity, no clinical symptoms are observed, even in highly susceptible patients.
StandardNbyer 2 unit as
say ( ExperimentallmmumXh
emjstひ,E.A.Ka蛇t,M.M.Mayer
共著第2版、P133Thomas,Springie
ld社、1961年)による単位で云えば安全なしベル
として免疫グロブリンGの1地当り抗補体作用物質は0
.04から0.02単位又はそれ以下であるが、0.0
4よりも若干高いかも知れない。但し雌当り0.8単位
のレベルでは反応は常時認めるようになる。臨床上の副
作用がないことに重点を置き、ガンマ・グロブリン製剤
を静任用に適すると指摘するには、抗補体活性が特異的
に低いレベルにあるか否かにか)つている。更に臨床的
に安全かつ有効な製剤を供給するためには生理学的な抗
体活性ならびに特異性を保持する必要がある。本特許申
請の方法は正常なガンマ・グロブリン分子の性質を維持
し、本質的に分子の凝集とそれによる抗補体活性が全く
なく、それ故に静任用として安全かつ有効ならしめるよ
うな製剤を得ることを目論んできた。StandardNbyer 2 unit as
say ( ExperimentallmmumXh
emjsthi, E. A. Kabi t, M. M. Mayer
Co-authored 2nd edition, P133 Thomas, Springie
ld company, 1961), the anti-complement active substance per unit of immunoglobulin G is 0 as a safe level.
.. 04 to 0.02 units or less, but 0.0
It may be slightly higher than 4. However, at a level of 0.8 units per female, the reaction is always observed. Emphasizing the absence of clinical side effects, the suitability of gamma globulin preparations for topical use depends on whether anti-complement activity is at a specifically low level. Furthermore, in order to provide clinically safe and effective preparations, it is necessary to maintain physiological antibody activity and specificity. The patented method maintains the properties of the normal gamma globulin molecule and yields a formulation that is essentially free of molecular aggregation and consequent anti-complement activity, thus making it safe and effective for topical use. I've been thinking about it.
従って本発明の目的とするところは:
‘1’静注に通したガンマ・グロプリン製剤を供給する
こと、‘2} 生体外において、本質的に抗補体活性の
ない静注用ガンマ・グロブリン製剤を供給すること、脚
3乃至4週間の生物学的半減期を有する静柱用ガンマ
・グロプリン製剤を供聯合すること、‘4)対応する抗
原と結合した場合、楠体を固定する能力を持ち、出発原
料の混合皿糠およびコーンの古典的血糠エタノール分画
法によって得た標準ガンマ・グロブリンに存在する抗体
の種類としベルとの比較において、これと本質的に変ら
ない抗体スベクトラムを有する静注用ガンマ・グロプリ
ン製剤を供給すること、■ 静任用ガンマ・グロブリン
製剤の調製法を規定すること、■ 容易に入手できる皿
競蛋白分画より静注用ガンマ・グロブリン製剤を調製す
る方法を規定すること【71本質的に分子の凝集が発生
しないような方法で静任用ガンマ・グロブリン製剤の調
製法を規定することである。Accordingly, the objects of the present invention are: '1' To provide a gamma globulin preparation for intravenous injection; and '2) An intravenous gamma globulin preparation that essentially has no anti-complement activity in vitro. 4) Incorporating a gamma globulin preparation with a biological half-life of 3 to 4 weeks, which has the ability to immobilize the cartilage body when combined with the corresponding antigen. In comparing the types of antibodies present in the starting material mixed dish bran and the standard gamma globulin obtained by Cohn's classical blood bran ethanol fractionation method, a static antibody with an essentially unchanged antibody spectrum was found. To provide injectable gamma globulin preparations, ■ To specify methods for preparing intravenous gamma globulin preparations, and ■ To specify methods for preparing intravenous gamma globulin preparations from readily available dish protein fractions. [71] To define a method for preparing intravenous gamma globulin preparations in such a way that essentially no aggregation of the molecules occurs.
本発明は静脈内投与に適した活性ガンマ・グロブリン、
このガンマ・グロブリンの製法および、このガンマ・グ
ロプリンを含む安定な製剤を提供する。The present invention provides active gamma globulin suitable for intravenous administration,
A method for producing this gamma globulin and a stable formulation containing this gamma globulin are provided.
本発明の製法の一つに従えばこのガンマ・グロブリンは
J.Am.Chem.Soc.斑.459一475、(
1946)に記載のコーンらの方法による分画0十mか
ら容易に得られるということである。According to one of the production methods of the present invention, this gamma globulin is produced by J. Am. Chem. Soc. Spots. 459-475, (
It can be easily obtained from the fraction 00m by the method of Cohn et al. (1946).
他の交雑蛋白と共に殆んどすべての免疫グロブリンを含
むこの分画は、本発明の分画技術で処理されれば、従釆
の技術では分画処理中に生じていた分子の凝集生成を阻
止して、本質的に抗補体活性のない静脈内投与に適した
活性ガンマ・グロブリンを産する。もう一つの有用な原
料源は、人血清グロプリンとして容易に入手できる分画
Dである。This fraction, which contains almost all the immunoglobulins along with other hybrid proteins, can be treated with the fractionation technique of the present invention to prevent the formation of molecular aggregates that would occur during the fractionation process using conventional techniques. to produce active gamma globulin suitable for intravenous administration with essentially no anti-complement activity. Another useful raw material source is Fraction D, which is readily available as human serum globulin.
このものは経済的かつ、凍結乾燥粉末では安定であり肝
炎ウイルスを含まない。このものは、分画0十mと同じ
方法で処理することができる。本発明の製法は次の工程
からなっている。This product is economical, stable as a freeze-dried powder, and does not contain hepatitis viruses. This can be processed in the same way as the fraction 00m. The manufacturing method of the present invention consists of the following steps.
皿嫌蛋白分画日+m 本発明の好ましい実施様態を以下に説明する。Dish protein fractionation day + m Preferred embodiments of the invention will be described below.
血糠蛋白分画0またはD+mのベイストをおよそ4.8
より6.5、好ましくはおよそ5.5より5.9のPH
において水で抽出する。蛋白質舎量が約25なし、し3
0%のベイストk9当り約25ないし45夕好ましくは
30その発熱性物質を含まない水を使用する。毒性のな
い薬剤学的に容認できる酷酸、乳酸、塩酸、硫酸などの
如き有機または無機酸がpHの調整に便用される。水に
不落の物質は分離され、炉過液は、ポリエチレングラィ
コールを用い、順次、4W/V%、5W/V%および1
2W/V%の濃度で分別沈澱される。12W/V%濃度
のステップにおけるpHは約8.0である。Blood bran protein fraction 0 or D+m Beist is approximately 4.8
PH of about 6.5, preferably about 5.5 to 5.9
Extract with water. Protein amount is about 25%, 3%
About 25 to 45, preferably 30,000 pyrogen-free water is used per 0% Beist k9. Non-toxic, pharmaceutically acceptable organic or inorganic acids such as harsh acids, lactic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, etc. are conveniently used to adjust the pH. Substances that do not fall into water are separated, and the filtrate is made of polyethylene glycol, sequentially 4W/V%, 5W/V% and 1
It is fractionally precipitated at a concentration of 2W/V%. The pH at the 12 W/V% concentration step is approximately 8.0.
最初の2つの分別沈澱では不純物が除去され、最後の沈
澱により本発明で求めるガンマ・グロブリンが得られる
。望ましいポリエチレン・グライコールの分子量は、約
4,000から6,000である。毒性のない薬剤学的
に容認される有機または無機酸の塩がpHをおよそ80
に調整するために用いられる。操作はおよそoo乃至2
0℃の温度で実施してよいが、00乃至5℃の低温が好
ましい。操作の詳細を実施例1および2に記述する。The first two fractional precipitations remove impurities, and the final precipitation provides the gamma globulin sought in the present invention. The preferred polyethylene glycol molecular weight is about 4,000 to 6,000. A non-toxic, pharmaceutically acceptable salt of an organic or inorganic acid that lowers the pH to approximately 80
Used to adjust. The operation is approximately oo~2
It may be carried out at a temperature of 0°C, but lower temperatures of 00 to 5°C are preferred. Details of the operation are described in Examples 1 and 2.
これらの実施例は例証を記述するものであってこれによ
って限定されるものではない。実施例 1
蛋白質含量が25乃至30%の皿糠蛋白分画ロ十mベィ
ストlk9を30その発熱性物質を含まない蒸留水に懸
濁し、均一な黄色の懸濁液が得られるまで縄拝する。These examples are intended to be illustrative and not limiting. Example 1 30 m of dish bran protein fraction LK9 with a protein content of 25-30% is suspended in pyrogen-free distilled water and stirred until a homogeneous yellow suspension is obtained. .
温度は5℃に維持する。分画0十mベイストlk9当り
20の‘の10%酷酸を加え、pHを5.8まで下げる
。更に15分間擬拝したのち、2乃至3時間沈澱を静層
させる。そののち舷.9パッドの如き炉紙を用いて上清
を清澄炉過する。1モル当り4,000夕の平均分子量
を有する米国薬局方規格のポリエチレン・グラィコール
(PEG)を粉末又はフレーク状で溶液100の【当り
4夕の濃度になるように加える。The temperature is maintained at 5°C. Add 20' of 10% harsh acid per 90m Beist lk9 to lower the pH to 5.8. After praying for an additional 15 minutes, the precipitate is allowed to settle for 2 to 3 hours. After that, the gunwale. The supernatant is clarified through a clarifier using paper such as a 9 pad. USP polyethylene glycol (PEG) having an average molecular weight of 4,000 moles per mole is added in powder or flake form to a concentration of 4 moles per 100 moles of solution.
PEGが完全に溶解するまで凝梓後、生成した沈澱を1
乃至2時間静暦する。舷.9パッド又はミリポア・メン
フレンによる炉過で上情を集める。続いてPEG濃度を
5W/V%に上昇させる。After coagulating until PEG is completely dissolved, the precipitate formed is
Wait for 2 hours. The gunwale. Collect the results by filtration using a 9-pad or Millipore membrane. Subsequently, the PEG concentration is increased to 5 W/V%.
PEGは縄拝により溶解せしめ、溶液を1乃至2時間静
贋させる。そののち上清を再びM.9アスベストパツド
で炉過する。次に6%トリスハイドロオキシエチルアミ
ノメタン(THAM)を添加してpHを8に調整する。The PEG is dissolved by stirring and the solution is allowed to stand for 1 to 2 hours. Thereafter, the supernatant was redistributed to M. 9. Filter with asbestos pad. The pH is then adjusted to 8 by adding 6% tris hydroxyethylaminomethane (THAM).
ガンマ・グロブリンは引続きPEGを添加して、PEG
濃度を12%まで上昇させることにより沈澱させる。白
色の沈澱が沈降した時速心分離によってそれを集める。
かくして得られたガンマ・グロブリンは免疫学的に活性
な非修飾1&であり、Kabat及びMayer署、E
xperimentallmmumXhemistry
第2版、momas 社 P908fに記載のMay
erらの方法で測定するとき、奴当りおよそ0より0.
02単位までの抗補体活性を有し、即静脈内投与用製剤
となしうるものである。Gamma globulin is further added with PEG to make PEG.
Precipitate by increasing the concentration to 12%. A white precipitate settles out and is collected by centrifugation.
The gamma globulin thus obtained is immunologically active, unmodified 1&, Kabat and Mayer, E.
experimentallmmumXhemistry
May described in 2nd edition, Momas P908f
When measured by the method of Er et al., it is approximately 0 to 0.
It has an anti-complement activity of up to 0.02 units and can be made into a ready-to-use formulation for intravenous administration.
抗補体活性が0ということは分子の凝集がないことによ
るものである。本発明の方法において分画工程中に分子
の凝集は生じない。凝集の生成がないのは、主として分
画操作においてポリエチレン・グラィコールと低イオン
強度の溶媒を使用していることに帰せられる。これらは
、蛋白の変性を相当おさえるのに役立っている。溶媒の
電導度(300×10‐8の‐lohm‐1)が低いこ
とはそのイオン強度が低いことを示している。抗補体活
性が実際上0であることに加えて、実施例1に記述の方
法により調製したガンマ・グロブリンは俗の沈降定数を
有し、凝集物、および、F(ab).F(ab)2、F
cの如き分解物を含んでいない。Zero anti-complement activity is due to the absence of molecular aggregation. No aggregation of molecules occurs during the fractionation step in the method of the invention. The lack of formation of aggregates is primarily attributable to the use of polyethylene glycol and low ionic strength solvents in the fractionation procedure. These serve to considerably suppress protein denaturation. The low conductivity of the solvent (-lohm-1 of 300 x 10-8) indicates its low ionic strength. In addition to having virtually no anti-complement activity, the gamma globulin prepared by the method described in Example 1 has a modest sedimentation constant and is free from aggregates and F(ab). F(ab)2, F
It does not contain decomposition products such as c.
本品の水溶液は、無色澄明で他の方法で得たガンマ・グ
ロブリンの水溶液のようなオパール色やにごりはない。
消化法によって得たガンマ・グロブリンと異なり、本発
明のガンマ・グロブリンは、原料皿鍬とまったく変らな
い抗体スペクトルを持っている。本発明のガンマ・グロ
プリンにおけるサブクラスの分布(即ち、1gG.1,
2,3,4の相対量)原料血酸のそれと変っていない。
実施例 2
分画ロ2夕を3℃の4%PEG4000k溶液1夕に懸
濁する。The aqueous solution of this product is clear and colorless, and does not have the opalescent color or turbidity that aqueous gamma globulin solutions obtained by other methods have.
Unlike the gamma globulin obtained by the digestion method, the gamma globulin of the present invention has an antibody spectrum that is completely the same as that of the raw material. Distribution of subclasses in the gamma globulin of the present invention (i.e., 1gG.1,
Relative amounts of 2, 3, and 4) remain unchanged from those of raw blood acid.
Example 2 Two fractions are suspended in a 4% PEG4000k solution at 3°C.
ゆるやかに損拝し、0.05モル酷酸を加えpHを5.
1とする。数時間燈梓後、炉過し上情液を得る。次にP
EG濃度を5W/V%に上げる。縄梓によりPEGを溶
解せしめ、溶液を1時間以上静直させる。その後上情を
再び炉適する。6%THAMを添加してpHを8に調整
する。Slowly stir and add 0.05M harsh acid to adjust the pH to 5.
Set to 1. After soaking for several hours, pass through the oven to obtain the liquid. Then P
Increase the EG concentration to 5W/V%. PEG is dissolved with a rope and the solution is allowed to settle for at least 1 hour. Afterwards, he expressed his feelings again. Adjust pH to 8 by adding 6% THAM.
続いてPEGを加えて12%としガンマ・グロブリンを
沈澱させる。沈澱は静瞳せしめ遠心分離によって集める
。かくして得られたガンマ・グロブリンは実施例1に記
述のように抗補体活性を測定する。そのtiterは、
地当り0.02〜0.009単位である。本発明のガン
マ・グロプリンは直ちに静注用製剤として実用化しうる
ものである。製剤の処方において、ガンマ・グロブリン
はグリシン、アルプミンおよび非イオン系界面活性剤を
含むpH54〜67の緩衝液に溶解せしめる。調合液の
pHはpH5.4〜6.7の間の望む値に調整し、ガン
マ・グロブリン濃度は5%に調節する。適当な緩衝液と
しては、リン酸および酷酸ナトリウム山酷酸系がある。
溶液の場合、液体−空気又は液体・一団体界面で生じる
製剤の変性を防止又は減ずるために、製剤組成に界面活
性剤を添加すると都合がよい。Subsequently, PEG is added to 12% to precipitate gamma globulin. The precipitate is collected by static pupil centrifugation. The gamma globulin thus obtained is assayed for anti-complement activity as described in Example 1. The titer is
It is 0.02 to 0.009 units per land. The gamma globulin of the present invention can be immediately put to practical use as an intravenous preparation. In the formulation, gamma globulin is dissolved in a pH 54-67 buffer containing glycine, albumin, and a nonionic surfactant. The pH of the formulation is adjusted to the desired value between pH 5.4 and 6.7, and the gamma globulin concentration is adjusted to 5%. Suitable buffers include phosphoric acid and sodium chloride systems.
In the case of solutions, it is advantageous to add surfactants to the formulation composition in order to prevent or reduce denaturation of the formulation that occurs at liquid-air or liquid-mass interfaces.
好ましい界面活性剤としては、プルロニック船(ポロキ
サマー1斑)の如きプロピレンおよびエチレンオキサイ
ドのブロック・コポリマー〜ソルビトールのエ ス テ
ルある いはCTFA Cosmeticln蟹edi
ent DictioMry(Cosmetic,To
iletひaMFragame偲sMiation線、
1973手度版)に記載の水溶性物質であるTween
20,40,60,80,85(Pol$or舷te2
0,40,60,80,95)の如き長鎖脂肪酸のポリ
オキシェチレンオキサィドおよびれnyIFSA、FS
B、FSC、FSNの如きフッ素系界面活性剤などの非
イオン系界面活性剤がある。これらの非イオン系界面活
性剤は界面変性に対して蛋白質を安定化させるとともに
蛋白質に影響を及ぼしたり変性せしめるような化学反応
基を分子構造の中にまったく含んでいない。実施例mに
おいては本発明による静任用ガンマ・グロブリンを含有
する、製剤の薬剤組成について説明する。Preferred surfactants include block copolymers of propylene and ethylene oxide such as Pluronic (poloxamer 1) to esters of sorbitol or CTFA Cosmeticln.
ent DictionaryMry(Cosmetic,To
ilet hiaMFragame sMation line,
Tween, a water-soluble substance described in
20, 40, 60, 80, 85 (Pol $ or port te2
Polyoxyethylene oxides of long chain fatty acids such as 0,40,60,80,95) and nyIFSA, FS
There are nonionic surfactants such as fluorine surfactants such as B, FSC, and FSN. These nonionic surfactants stabilize proteins against interfacial denaturation and do not contain any chemically reactive groups in their molecular structures that would affect or denature proteins. Example m describes the pharmaceutical composition of a formulation containing intravenous gamma globulin according to the invention.
実施例 m
実施例1において調製した沈澱を
アルプミン :5夕/そ
Tween80:0.1%
グリシン :0.18M
酷酸ナトリウム:0.029M
酷 酸 :0.012M
を含む溶液(5℃)に、できるだけ泡立てぬよう溶解す
る。Example m The precipitate prepared in Example 1 was added to a solution (at 5°C) containing Alpmin: 5 ml/So Tween 80: 0.1%, Glycine: 0.18 M, Sodium chloride: 0.029 M, and 0.012 M chloride. Dissolve as much as possible without creating bubbles.
得られるpHは5.4〜5.5である。望む場合は0.
09MTHAMを注意深く加え、PHを6.4に調整す
る。1g0濃度を測定し、溶液100w‘当り.5夕の
1gGを含有するよう、稀釈または実施例1の沈澱を更
に添加して調整する。The resulting pH is 5.4-5.5. 0 if desired.
Carefully add 09MTHAM and adjust pH to 6.4. The concentration of 1g0 was measured and the concentration was 1g0 per 100w' of solution. The mixture is adjusted to contain 1 g of 500 g by further dilution or addition of the precipitate of Example 1.
Tw■n80の代りに他の種のTweenやプルロニツ
ク聡を使用してもよい。液状製剤とするためには溶液を
除菌炉遇し容器に充填する。Other types of Tween or Pluronic Satoshi may be used instead of Tw■n80. To make a liquid preparation, the solution is placed in a sterilized oven and filled into containers.
乾燥製剤とするには、液状製剤をヴァィアルに小分けし
、凍結乾燥する。To prepare a dry formulation, the liquid formulation is aliquoted into vials and lyophilized.
使用前本品は発熱性物質を含まない蒸留水で溶解する。
本発明による薬剤組成のもとで貯蔵した場合、本発明の
ガンマ・グロブリンは、現在販売されている他のガンマ
・グロブリン製剤よりも長い半減期を有する。Before use, dissolve the product in pyrogen-free distilled water.
When stored under the pharmaceutical composition according to the invention, the gamma globulin of the invention has a longer half-life than other gamma globulin preparations currently on the market.
ガンマ・グロブリンの静脈内投与に伴って通常発生する
好ましくない副作用ないこ線注が望まれているがあらゆ
る場合又はどんな条件下でも、本発明のガンマ・グロブ
リンは静脈内投与用として有用なものであることが証明
されている。The gamma globulin of the present invention is useful for intravenous administration in all cases or under any conditions in which administration of gamma globulin is desirable. It has been proven that there is.
Claims (1)
IIペイスト、分画IIペイストより選択した原料から本質
的に抗補体活性の全くない、静脈内投与に適したガンマ
・グロブリンの製造方法において、a 上記ペイストを
水に懸濁し、pH約4.8〜6.5において約300×
10^−^6cm^−^1ohm^−^1の電導度を有
する低イオン強度の溶液をつくり、沈澱と濾液を得、b
分子量約4,000〜6,000のポリエチレングラ
イコールを約4W/V%となるように加えることにより
操作aの濾液から不純物を分別沈澱させ、濾液を得、c
つづいて分子量約4,000〜6,000のポリエチ
レングライコールを約5W/V%となるように加えるこ
とにより、操作bの濾液から不純物を分別沈澱させ、濾
液を得、d さらにpH約8.0において分子量約4,
000〜6,000のポリエチレングライコールを約1
2W/V%となるように加えることにより、操作cの濾
液からガンマ・グロブリンを沈澱させることよりなり、
上記操作をいずれも約0〜20℃の温度で行なうことを
特徴とする上記ガンマ・グロブリンの製造方法。 2 ペイストが抽出されるpHを約5.7〜5.9とす
る特許請求の範囲1に記載の方法。 3 pH5.8において、分画II+IIIペイスト1kg
を発熱性物質を含まない蒸留水30lをもつて抽出する
特許請求の範囲2に記載の方法。 4 操作温度を約0〜5℃とする特許請求の範囲1に記
載の方法。 5 抗補体活性がmg当り0から約0.02単位、沈降
定数は7S、分子の凝集物および分解産物F(ab)_
1F(ab)_2、Fcを含まず、水に溶解するとき無
色澄明であり抗体スペクトルおよびサブクラスの分布は
、原料血漿のそれと変らない、静脈内投与に適したガン
マ・グロブリン。 6 特許請求の範囲1の方法によつて調製され、静脈内
投与に適する特許請求の範囲5のガンマ・グロブリン。 7 アルブミン、非イオン系界面活性剤、グリシン醋酸
−醋酸塩緩衝液(pH5.4〜6.7)を含む水溶液に
溶解したガンマ・グロブリンからなる特許請求の範囲6
の静注用ガンマ・グロブリンの溶液。8 非イオン系界
面活性剤をTween80またはプルロニツク68とす
る特許請求の範囲7のガンマ・グロブリンの溶液。[Claims] 1. Plasma protein fraction II+I with a protein content of about 25-30%
In a method for producing gamma globulin essentially free of anti-complement activity and suitable for intravenous administration from a raw material selected from Paste II and Fraction II Paste, a. Approximately 300× at 8-6.5
Make a low ionic strength solution with a conductivity of 10^-^6cm^-^1ohm^-^1, obtain a precipitate and a filtrate, b
Impurities are separated and precipitated from the filtrate in step a by adding polyethylene glycol having a molecular weight of about 4,000 to 6,000 to a concentration of about 4 W/V% to obtain a filtrate, and c
Subsequently, by adding polyethylene glycol having a molecular weight of approximately 4,000 to 6,000 to a concentration of approximately 5 W/V%, impurities are separated and precipitated from the filtrate in step b to obtain a filtrate, and d the pH is approximately 8. At 0, the molecular weight is about 4,
Approximately 1 000 to 6,000 polyethylene glycol
Precipitating gamma globulin from the filtrate of step c by adding 2 W/V%,
The method for producing gamma globulin as described above, characterized in that all of the above operations are carried out at a temperature of about 0 to 20°C. 2. The method according to claim 1, wherein the pH at which the paste is extracted is about 5.7 to 5.9. 3 At pH 5.8, 1 kg of fraction II+III paste
The method according to claim 2, wherein the extract is extracted with 30 liters of pyrogen-free distilled water. 4. The method of claim 1, wherein the operating temperature is about 0-5°C. 5 Anti-complement activity from 0 to about 0.02 units per mg, sedimentation constant 7S, molecular aggregates and degradation products F(ab)_
1F(ab)_2, a gamma globulin that does not contain Fc, is colorless and clear when dissolved in water, and has an antibody spectrum and subclass distribution that is not different from that of the raw plasma, and is suitable for intravenous administration. 6. The gamma globulin of claim 5 prepared by the method of claim 1 and suitable for intravenous administration. 7 Claim 6 consisting of gamma globulin dissolved in an aqueous solution containing albumin, a nonionic surfactant, and a glycine acetic acid-acetate buffer (pH 5.4 to 6.7).
intravenous gamma globulin solution. 8. The gamma globulin solution according to claim 7, wherein the nonionic surfactant is Tween 80 or Pluronic 68.
Priority Applications (1)
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JP51093935A JPS6016406B2 (en) | 1976-08-06 | 1976-08-06 | Method for producing intravenously administrable gamma globulin and gamma globulin prepared thereby |
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Publication Number | Publication Date |
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JPS5320415A JPS5320415A (en) | 1978-02-24 |
JPS6016406B2 true JPS6016406B2 (en) | 1985-04-25 |
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