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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren von Human-Albuminlösungen zur
therapeutischen Verwendung im Hinblick auf ihre Wärmebehandlung
in einem Behälter,
insbesondere im Endbehälter.
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Die
Erfindung betrifft ebenfalls die durch das erfindungsgemäße Verfahren
erhaltene Human-Albuminlösung.
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Bei
der Herstellung von Human-Albuminlösungen ist das End-Pasteurisieren des
Produkts bei 60°C über 10 Stunden
ein obligatorischer Schritt. Dieser Schritt des Erwärmens ist
Anfang der Jahre 1950 in den USA eingeführt worden, um den Hepatitis
B-Virus zu inaktivieren, welcher möglicherweise trotz der verschiedenen
Reinigungsschritte aufgrund der möglichen Kontamination des ersten
biologischen Materials, im vorliegenden Fall zu dieser Zeit des
menschlichen Bluts, im Endprodukt anwesend ist. Die Wirksamkeit
dieses Pasteurisierens zum Ausschalten oder Vermindern des Risikos
der Übertragung
von Hepatitis B durch Albuminlösungen
wurde zu Beginn bei gesunden Freiwilligen gezeigt. Studien, die
beim Schimpansen durchgeführt
wurden, haben anschließend
gezeigt, daß das
Hepatitis-Virus nicht-A nicht-B ebenfalls durch eine Behandlung von
10 Stunden bei 60°C
inaktiviert wird. Diese Gegebenheiten waren der Gegenstand eines Übersichtartikels von
GERETY und ARONSON (1). Seither haben verschiedene Studien in vitro
mit Hilfe von Virus-Modellen gezeigt, daß das Pasteurisieren von Proteinlösungen über 10 Stunden
bei 60°C
als hinlänglich
allgemeines Verfahren angesehen werden kann, um das Risiko einer
Virus-Übertragung
beim Empfänger
zu vermindern, obwohl bestimmte Viren, wie das Parvovirus, gegen
die thermische Inaktivierung resistenter als andere sind (2–3).
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Das
Patent EP-A-0 050 061 sieht eine andere Lösung vor, welche bei Präparaten
von Plasmaproteinen, z. B. Albumin, darin besteht, das Pasteurisieren
durch Temperaturerhöhung
zu vermeiden und im Gegensatz dazu durch die Wirkung von oberflächenaktiven
Mitteln bei erhöhter
Konzentration das Hepatitis-Virus zu inaktivieren und gegebenenfalls
die Endotoxine auszuschalten. Diese Lösung bietet indessen nicht
die Vorteile der Inaktivierung von Albuminpräparaten durch Wärme und
erfordert, da das Präparat
zur körperlichen
Verabreichung bestimmt ist, darüber
hinaus, daß die
starken zur Inaktivierung verwendeten Konzentrationen an oberflächenaktivem
Mittel entfernt werden.
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Das
Patent EP-A-0 124 044 beschreibt ein Verfahren zum Pasteurisieren
eines Proteins, wie z. B. des Fibronectins, in Gegenwart eines an
das Fibronectin angepaßten
stabilisierenden Mittels, wie z. B. Polyolen und insbesondere eines
Disaccharids, zu dem es, mit dem Ziel, eine Beschädigung aufgrund
der mechanischen Bewegung bei der industriellen Herstellung von
Fibronectin während
der thermischen Behandlung zu verhindern, ein oberflächenaktives
Mittel und ein Chelat-bildendes oder Anti-Oxidations-Mittel hinzufügt. Die Gesamtheit
des Verfahrens ist für
Fibronectin und die Pasteurisierungsbehandlung in großem Volumen
in industriellem Maßstab
mit mechanischem Bewegen spezifisch.
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Heute
schreiben sämtliche
nationalen und internationalen Pharmakopöen das Pasteurisieren von Albuminlösungen bei
60°C über 10 Stunden
vor, wobei dieses Pasteurisieren im allerletzten Stadium der Herstellung,
nämlich
im Endbehälter,
im allgemeinen einem Fläschchen
aus neutralem Glas, vorgenommen werden muß; siehe z. B. die Europäische Pharmakopöe, II. Auflage
von 1984, die Pharmakopöe
der USA, XXI. Auflage, und die japanische Pharmakopöe von 1986.
Trotz der relativen Stabilität
des Albumins gegen Wärme muß dieses
mit Hilfe von geeigneten Stabilisatoren geschützt werden, um jegliche Gelbildung
während
des Pasteurisierens zu vermeiden. Die heute gleichsam generell verwendeten
Stabilisatoren sind Natriumcaprylat und Natriumacetyltryptophanat,
allein oder in Kombination. Speziell schreiben die Pharmakopöen der USA, XXI.
Auflage, und von Japan 1986 Natriumacetyltryptophanat allein in
einer Dosis von 0,16 Millimol pro Gramm Albumin oder auch die Mischung
Natriumacetyltryptophanat/Natriumcaprylat jeweils in einer Dosis
von 0,08 Millimol pro Gramm Albumin vor. Natriummandelat kann ebenfalls
allein oder zusammen mit Natriumcaprylat verwendet werden (siehe
die französische
Pharmakopöe,
VIII. Ausgabe von 1965).
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Die
Stabilisatoren werden nach den Pharmakopöen der USA und von Japan in
großem Überschuß bezüglich Albumin,
nämlich
10 Moleküle
Stabilisator auf 1 Molekül
Albumin, hinzugefügt,
und aufgrund ihrer besonderen Affinität zu Albumin sind sie in der
Lage, es wirksam gegen eine direkte Denaturierung durch die Wärme zu schützen. In
Abwesenheit dieser Stabilisatoren ist die Denaturierung des Albumins
unvermeidlich und führt
zu einer fortschreitenden Aggregation der Albuminmoleküle, was
sich im Erscheinen einer Opaleszenz und dann in einer vollständigen Gelbildung
der Lösung äußert.
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Wenn
auch diese Opaleszenz und diese Gelbildung durch die Verwendung
der vorstehend beschriebenen Stabilisatoren vermieden werden, ist
es bekannt, daß nach
dem Pasteurisieren eine gewisse Anzahl von Fläschchen mit Albumin bei einer
visuellen Überprüfung feine
flockige Teilchen oder Fädchen
oder Häute in
mehr oder weniger großer
Anzahl aufweisen. Dieses Phänomen
ist bei den Albuminpräparaten,
die verdünnter
sind, d. h. mit 4% oder 5% Proteinen, ausgeprägter als bei den Präparaten,
die konzentrierter sind, d. h. mit 20% Proteinen.
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Abgesehen
davon, daß das
Feststellen dieser unlöslichen
Teilchen die Verwerfung der betroffenen Fläschchen während der Endüberprüfung im
Rahmen der Qualitätskontrolle
verlangt, was sich in einem ökonomischen
Verlust äußert, verrät das Erscheinen
dieser Teilchen während
des Pasteurisierens eine gewisse Denaturierung des Produkts, was
Zweifel an seiner guten Verträglichkeit
bei der eventuellen Verabreichung an den Menschen hinterlassen kann.
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Die
Erfindung hat zum Ziel, diesen Nachteil abzustellen, indem sie ein
Verfahren zur Stabilisierung von Human-Albuminlösungen im Hinblick auf ihre
Wärmebehandlung
in einem Behälter,
insbesondere dem Endbehälter,
vorschlägt,
welches eine vollkommene Stabilisierung gestattet und zu einer mit
dem normalen Gebrauch dieser Lösungen
kompatiblen Human-Albuminlösung führt.
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Gegenstand
der Erfindung ist ein Pasteurisations-Wärmebehandlungsverfahren
einer Humanalbumin-Lösung
mit einer Reinheit gemäß dem in
Pharmacopée
Européenne
(2. Ausgabe von 1984 unter der Bezeichnung "Albumini humani solutio") oder dem Code of
Federal Regulations (Ausgabe vom 1. April 1986 unter der Bezeichnung "Albumin (human)" und "Plasma protein fraction
(human)") definierten
Zustand, wobei diese in die endgültigen
Fläschchen
für die
therapeutische Verwendung verteilt werden kann, in Gegenwart eines Stabilisierungsmittels,
das an die Stabilisierung des Albumins während dessen Wärmebehandlung
angepasst ist, dadurch gekennzeichnet, dass man die Wärmebehandlung
in einem Behälter
in Gegenwart eines oberflächenaktiven
Mittels, ausgewählt
aus Tween 80, Tween 20, Pluronic F68 und Laurat von Polyethylenglycol
600, und weiterhin des Stabilisierungsmittels, durchführt.
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Das
im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendete oberflächenaktive
Mittel spielt nicht die gleiche Rolle wie die gewöhnliche
stabilisierende Formulierung und kann sich deshalb nicht an dessen
Stelle setzen. Tatsächlich
resultiert das Auftreten von Teilchen als Folge des Pasteurisierens
nicht aus den gleichen Gründen, die
ursprünglich
in der Verwendung der gewöhnlichen
Stabilisatoren liegen, wie es weiter unten erläutert wird, sondern aus Wechselwirkungen
der Lösung
mit der Wand des Behälters
bei der thermischen Behandlung.
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Dieses
Phänomen
beobachtet man in Fläschchen
aus klassischem neutralem Glas, z. B. Borsilikatglas vom Typ I,
oder aus durch Behandlung mit Schwefeldioxid oder Ammoniumsulfat
an der Oberfläche
neutralisiertem Glas vom Typ II, wie sie in den Pharmakopöen Europas
und der USA beschrieben sind (Société SAINT-GOBAIN DESJONQUERES),
aber auch in Fläschchen
aus Kunststoffmaterial, z. B. aus Polystyrol (Société CORNING).
Dieses Phänomen
läßt demnach
wahrscheinlich denaturierende hydrophobe Wechselwirkungen zwischen
dem Produkt und der Wand des Fläschchens
mitspielen.
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Unter
gewöhnlicher
stabilisierender Mischung versteht man insbesondere Natriumcaprylat,
Natriumacetyltryptophanat, Natriummandelat oder eine Mischung von
zwei oder drei derselben.
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Erfindungsgemäß liegen
die Konzentrationen vorteilhafterweise im Bereich zwischen 5 und
50 mg/l zu stabilisierende Lösung.
Es genügt
ungefähr
0,25 bis 1 Molekül
eines geeigneten oberflächenaktiven
Mittels auf 100 Moleküle
Albumin jeweils in einer Lösung
von 200 bis 50 g/l, um die Denaturierung und das Auftreten von unlöslichen
Teilchen nach dem Pasteurisieren in Gegenwart der gewöhnlichen
stabilisierenden Formulierung zu verhindern.
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Das
bevorzugte oberflächenaktive
Mittel ist Tween 80 mit einem mittleren Molekulargewicht von 1320 Dalton.
Es muß bei
einer Konzentration oberhalb von 5 mg/l und vorzugsweise zwischen
10 und 20 mg/l verwendet werden. Eine Konzentration von Tween 80 von
10 mg/l zu stabilisierende Lösung
für eine
Albuminlösung
von 50 g/l entspricht 1 Molekül
dieses Stabilisators auf 100 Moleküle Albumin.
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In
einer speziellen Ausführungsform
der Erfindung wird das oberflächenaktive
Mittel in einem frühen Stadium
der Herstellung des Albumins zugesetzt. In einem solchen Fall muß die anfängliche
Konzentration des oberflächenaktiven
Mittels so sein, daß der
verbleibende Anteil des letzteren zum Zeitpunkt des Pasteurisierens
ausreichend ist, um die gewünschte
Schutzwirkung sicherzustellen.
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Bei
den Lösungen
von Human-Albumin, welche die Erfindung betrifft, handelt es sich
insbesondere um alle Proteinlösungen,
bei denen Albumin der Haupt-Proteinbestandteil ist, d. h. mehr als
80% der Gesamtheit der Proteine darstellt, und die zur klinischen
Verwendung beim Menschen bestimmt sind. Sie sind insbesondere in
der Europäischen
Pharmakopöe,
II. Auflage von 1984, unter der Bezeichnung "Albumini humani solutio" und im Code of Federal
Regulations der USA, Ausgabe vom 1. April 1986, unter der Bezeichnung "Albumin (human)" und "Plasma protein fraction
(human)" definiert.
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Das
durch die Erfindung betroffene Human-Albumin wird insbesondere durch
Extraktion und Reinigung gemäß jedem
geeigneten Verfahren, ausgehend von einer menschlichen Albumin-Quelle oder auch
von Kulturen tierischer, pflanzlicher Zellen, von Bakterien oder
Hefen, die mit Hilfe gentechnischer Verfahren zum Produzieren von
Human-Albumin transformiert worden sind, gewonnen. Unter den geeigneten
Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Human-Albumin kann man
speziell die Fraktionierung von Plasma mit Hilfe von Alkohol, von
COHN et al. (4) beschrieben, oder die Fraktionierung von Plazenta-Blut mit Hilfe von
Alkohol und Zink, von TAYLOR et al. (5) beschrieben, oder die Fraktionierung
von Plazenta-Blut mit Hilfe von Alkohol, Natriumcaprylat und Aluminiumgel,
von LIAUTAUD et al. (6) beschrieben, oder die Fraktionierung von Plazenta-Blut
mit Hilfe von Alkohol und durch Chromatographie, wie von TAYOT et
al. (7) beschrieben, oder die Fraktionierung von Plasma durch Chromatographie,
wie im US-Patent Nr. 4,675,384 beschrieben, aufführen.
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Die
Erfindung wird nun mit Hilfe von nicht beschränkenden Beispielen beschrieben.
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BEISPIEL 1
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Man
versuchte, die Stabilität
einer Lösung
von Albumin zu 50 g/l, erhalten durch Fraktionierung von Plazenta-Blut
mit Hilfe von Alkohol und durch Chromatographie, wie von TAYOT et
al. (4) beschrieben, zu verbessern. Das erhaltene Albumin weist
eine Protein-Reinheit von 100% in der Analyse durch Elektrophorese auf
Celluloseacetat und in der Zweidimensionalen Immunelektrophorese
(Gegenwart eines einzigen Peaks) auf.
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Der
Versuch bestand darin, die Mengen klassischer Stabilisatoren, Natriumcaprylat
und Natriumacetyltryptophanat, im Verhältnis zu den durch die Pharmakopöe der USA
vorgeschriebenen Mengen zu vergrößern, während man
einen Natriumanteil von 145 mÄq/l
und eine pH von 7,0 aufrechterhielt. Das Albumin wurde filtriert,
dann in 100 ml-Fläschchen
aus Glas vom Typ I verteilt und 10 Stunden bei 60°C im Wasserbad
pasteurisiert. Die Fläschchen
wurden vor und nach Pasteurisieren und spontanem Abkühlen an
Luft überprüft. Kein
Fläschchen
wies vor dem Pasteurisieren sichtbare Teilchen auf.
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Man
stellt fest (siehe Tabelle I), daß die klassischen Stabilisatoren
trotz der stark vergrößerten Dosen es
nicht zulassen, die Gegenwart von Teilchen in den pasteurisierten
Fläschchen
zu vermeiden. Diese Feststellung bestätigt die Tatsache, daß die durch
die klassischen Stabilisatoren verhinderte Gelbildung und die Bildung
von Teilchen zwei unabhängige
physikalische Phänomene
sind.
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BEISPIEL 2
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Ausgehend
von einem Plazenta-Albumin, hergestellt wie in Beispiel 1, stellte
man Lösungen
von Proteinen zu 200 g/l, 50 g/l und 10 g/l her, die mit einer Standard-Stabilisierungsformulierung,
z. B., 0,08 mMol Natriumcaprylat/g Protein und 0,08 mMol Natriumacetyltryptophanat/g
Protein, stabilisiert waren. Natrium wurde mit Natriumchlorid auf
145 mÄq/l
eingestellt, und der pH wurde auf 7,0 eingestellt. Zu den Lösungen wurden anschließend 0 oder
5 oder 10 mg/l Tween 80 gegeben, dann wurden sie filtriert und in
100 ml-Fläschchen
aus Glas vom Typ I verteilt, dann 10 Stunden bei 60°C im Wasserbad
pasteurisiert. Kein Fläschchen
wies vor dem Pasteurisieren sichtbare Teilchen auf.
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Man
stellt fest (siehe Tabelle II), daß Tween 80 in der Dosis von
10 mg/l, wie groß auch
die Albumin-Konzentration in der Lösung ist, vollständig die
Bildung von sichtbaren Teilchen verhindert.
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BEISPIEL 3
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Man
versuchte, die Stabilität
einer Lösung
von Albumin zu 50 g/l, erhalten durch Fraktionieren von Plasma nach
dem Verfahren von LOHN, zu verbessern. Das Albumin wurde in lyophilisierter
Form von der Gesellschaft HYLAND geliefert. Das Pulver wurde wieder
in Lösung
gegeben und auf 50 g/l Proteine eingestellt und mit einer Standard-Stabilisierungsformulierung,
z. B. 0,08 mMol Natriumcaprylat/g Protein und 0,08 mMol Natriumacetyltryptophanat/g
Protein, stabilisiert. Natrium wurde mit Natriumchlorid auf 145
mÄq/l eingestellt, und
der pH wurde auf 7,0 eingestellt. Zu einem Teil dieser Lösung wurden
10 mg/l Tween 80 gegeben. Die beiden erhaltenen Lösungen wurden
filtriert und in 100 ml-Fläschchen
aus Glas vom Typ I verteilt, dann 10 Stunden bei 60°C im Wasserbad
pasteurisiert. Kein Fläschchen
wies vor dem Pasteurisieren sichtbare Teilchen auf.
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Man
stellt fest, (siehe Tabelle III), daß Tween 80 in der Dosis von
10 mg/l vollständig
die Bildung von sichtbaren Teilchen im Albumin von COHN zu 50 g/l,
das 10 Stunden bei 60°C
einem Pasteurisieren unterzogen wurde, verhindert.
