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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren von
Human-Albuminlösungen zur therapeutischen Verwendung im
Hinblick auf ihre Wärmebehandlung in einem Behälter,
insbesondere im Endbehälter.
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Die Erfindung betrifft ebenfalls die durch das erfindungsgemäße
Verfahren erhaltene Human-Albuminlösung.
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Bei der Herstellung von Human-Albuminlösungen ist das End-
Pasteurisieren des Produkts bei 60ºC über 10 Stunden ein
obligatorischer Schritt. Dieser Schritt des Erwärmens ist
Anfang der Jahre 1950 in den USA eingeführt worden, um den
Hepatitis B-Virus zu inaktivieren, welcher möglicherweise trotz
der verschiedenen Reinigungsschritte aufgrund der möglichen
Kontamination des ersten biologischen Materials, im
vorliegenden Fall zu dieser Zeit des menschlichen Bluts, im
Endprodukt anwesend ist. Die Wirksamkeit dieses Pasteurisierens
zum Ausschalten oder Vermindern des Risikos der Übertragung von
Hepatitis B durch Albuminlösungen wurde zu Beginn bei gesunden
Freiwilligen gezeigt. Studien, die beim Schimpansen
durchgeführt wurden, haben anschließend gezeigt, daß das
Hepatitis-Virus nicht-A nicht-B ebenfalls durch eine Behandlung
von 10 Stunden bei 60ºC inaktiviert wird. Diese Gegebenheiten
waren der Gegenstand eines Übersichtartikels von GERETY und
ARONSON (1). Seither haben verschiedene Studien in vitro mit
Hilfe von Virus-Modellen gezeigt, daß das Pasteurisieren von
Proteinlösungen über 10 Stunden bei 60ºC als hinlänglich
allgemeines Verfahren angesehen werden kann, um das Risiko
einer Virus-Übertragung beim Empfänger zu vermindern, obwohl
bestimmte Viren, wie das Parvovirus, gegen die thermische
Inaktivierung resistenter als andere sind (2-3).
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Das Patent EP-A-0 050 061 sieht eine andere Lösung vor, welche
bei Präparaten von Plasmaproteinen, z. B. Albumin, darin
besteht, das Pasteurisieren durch Temperaturerhöhung zu
vermeiden und im Gegensatz dazu durch die Wirkung von
oberflächenaktiven Mitteln bei erhöhter Konzentration das
Hepatitis-Virus zu inaktivieren und gegebenenfalls die
Endotoxine auszuschalten. Diese Lösung bietet indessen nicht
die Vorteile der Inaktivierung von Albuminpräparaten durch
Wärme und erfordert, da das Präparat zur körperlichen
Verabreichung bestimmt ist, darüber hinaus, daß die starken zur
Inaktivierung verwendeten Konzentrationen an oberflächenaktivem
Mittel entfernt werden.
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Das Patent EP-A-0 124 044 beschreibt ein Verfahren zum
Pasteurisieren eines Proteins, wie z. B. des Fibronectins, in
Gegenwart eines an das Fibronectin angepaßten stabilisierenden
Mittels, wie z.B. Polyolen und insbesondere eines Disaccharids,
zu dem es, mit dem Ziel, eine Beschädigung aufgrund der
mechanischen Bewegung bei der industriellen Herstellung von
Fibronectin während der thermischen Behandlung zu verhindern,
ein oberflächenaktives Mittel und ein Chelat-bildendes oder
Anti-Oxidations-Mittel hinzufügt. Die Gesamtheit des Verfahrens
ist für Fibronectin und die Pasteurisierungsbehandlung in
großem Volumen in industriellem Maßstab mit mechanischem
Bewegen spezifisch.
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Heute schreiben sämtliche nationalen und internationalen
Pharmakopöen das Pasteurisieren von Albuminlösungen bei 60ºC
über 10 Stunden vor, wobei dieses Pasteurisieren im
allerletzten Stadium der Herstellung, nämlich im Endbehälter,
im allgemeinen einem Fläschchen aus neutralem Glas, vorgenommen
werden muß; siehe z.B. die Europäische Pharmakopöe, II. Auflage
von 1984, die Pharmakopöe der USA, XXI. Auflage, und die
japanische Pharmakopöe von 1986. Trotz der relativen Stabilität
des Albumins gegen Wärme muß dieses mit Hilfe von geeigneten
Stabilisatoren geschützt werden, um jegliche Gelbildung während
des Pasteurisierens zu vermeiden. Die heute gleichsam generell
verwendeten Stabilisatoren sind Natriumcaprylat und
Natriumacetyltryptophanat, allein oder in Kombination. Speziell
schreiben die Pharmakopöen der USA, XXI. Auflage, und von Japan
1986 Natriumacetyltryptophanat allein in einer Dosis von 0,16
Millimol pro Gramm Albumin oder auch die Mischung
Natriumacetyltryptophanat/Natriumcaprylat jeweils in einer
Dosis von 0,08 Millimol pro Gramm Albumin vor. Natriummandelat
kann ebenfalls allein oder zusammen mit Natriumcaprylat
verwendet werden (siehe die französische Pharmakopöe, VIII.
Ausgabe von 1965).
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Die Stabilisatoren werden nach den Pharmakopöen der USA und von
Japan in großem Überschuß bezüglich Albumin, nämlich 10
Moleküle Stabilisator auf 1 Molekül Albumin, hinzugefügt, und
aufgrund ihrer besonderen Affinität zu Albumin sind sie in der
Lage, es wirksam gegen eine direkte Denaturierung durch die
Wärme zu schützen. In Abwesenheit dieser Stabilisatoren ist die
Denaturierung des Albumins unvermeidlich und führt zu einer
fortschreitenden Aggregation der Albuminmoleküle, was sich im
Erscheinen einer Opaleszenz und dann in einer vollständigen
Gelbildung der Lösung äußert.
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Wenn auch diese Opaleszenz und diese Gelbildung durch die
Verwendung der vorstehend beschriebenen Stabilisatoren
vermieden werden, ist es bekannt, daß nach dem Pasteurisieren
eine gewisse Anzahl von Fläschchen mit Albumin bei einer
visuellen Überprüfung feine flockige Teilchen oder Fädchen oder
Häute in mehr oder weniger großer Anzahl aufweisen. Dieses
Phänomen ist bei den Albuminpräparaten, die verdünnter sind,
d.h. mit 4% oder 5% Proteinen, ausgeprägter als bei den
Präparaten, die konzentrierter sind, d.h. mit 20% Proteinen.
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Abgesehen davon, daß das Feststellen dieser unlöslichen
Teilchen die Verwerfung der betroffenen Fläschchen während der
Endüberprüfung im Rahmen der Qualitätskontolle verlangt, was
sich in einem ökonomischen Verlust äußert, verrät das
Erscheinen dieser Teilchen während des Pasteurisierens eine
gewisse Denaturierung des Produkts, was Zweifel an seiner guten
Verträglichkeit bei der eventuellen Verabreichung an den
Menschen hinterlassen kann.
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Die Erfindung hat zum Ziel, diesen Nachteil abzustellen, indem
sie ein Verfahren zur Stabilisierung von Human-Albuminlösungen
im Hinblick auf ihre Wärmebehandlung in einem Behälter,
insbesondere dem Endbehälter, vorschlägt, welches eine
vollkommene Stabilisierung gestattet und zu einer mit dem
normalen Gebrauch dieser Lösungen kompatiblen Human-
Albuminlösung führt.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Stabilisieren
von Human-Albuminlösungen zur therapeutischen Verwendung im
Hinblick auf ihre Wärmebehandlung in einem Behälter,
insbesondere im Endbehälter, mit Hilfe eines
Stabilisierungsmittels, das an die Stabilisierung des Albumins
während dessen Wärmebehandlung angepaßt ist, dadurch
gekennzeichnet, daß man vor der Wärmebehandlung zusätzlich zu
dem Stabilisierungsmittel ein oberflächenaktives Mittel,
ausgewählt aus Tween 80 (Polysorbat 80 Société Atlas
- Polyoxyethylensorbitanoleat), Tween 20 (Société Atlas
- Polyoxyethylensorbitanlaurat), Pluronic F68 (Societe Ugine
Kuhlmann - Copolymer von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen)
und Laurat von Polyethylenglykol 600 (Société Gattefossé),
zusetzt.
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Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete oberflächenaktive
Mittel spielt nicht die gleiche Rolle wie die gewöhnliche
stabilisierende Formulierung und kann sich deshalb nicht an
dessen Stelle setzen. Tatsächlich resultiert das Auftreten von
Teilchen als Folge des Pasteurisierens nicht aus den gleichen
Gründen, die ursprünglich in der Verwendung der gewöhnlichen
Stabilisatoren liegen, wie es weiter unten erläutert wird,
sondern aus Wechselwirkungen der Lösung mit der Wand des
Behälters bei der thermischen Behandlung.
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Dieses Phänomen beobachtet man in Fläschchen aus klassischem
neutralem Glas, z.B. Borsilikatglas vom Typ I, oder aus durch
Behandlung mit Schwefeldioxid oder Ammoniumsulfat an der
Oberfläche neutralisiertem Glas vom Typ II, wie sie in den
Pharmakopöen Europas und der USA beschrieben sind (Société
SAINT-GOBAIN DESJONQUERES), aber auch in Fläschchen aus
Kunststoffmaterial, z.B. aus Polystyrol (Société CORNING).
Dieses Phänomen läßt demnach wahrscheinlich denaturierende
hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Produkt und der Wand
des Fläschchens mitspielen.
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Unter gewöhnlicher stabilisierender Mischung versteht man
insbesondere Natriumcaprylat, Natriumacetyltryptophanat,
Natriummandelat oder eine Mischung von zwei oder drei
derselben.
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Unter äquivalenten Mitteln versteht man alle nicht-ionischen
oberflächenaktiven Mittel, die vorzugsweise bei schwacher
Konzentration die Denaturierung des Albumins auf der Wand des
Behälters und somit die Bildung von unlöslichen Teilchen beim
Pasteurisieren der Albuminlösungen verhindern und deren
Gegenwart in der endgültigen Lösung nicht mit der normalen
Verwendung der Lösung inkompatibel ist.
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Die oberflächenaktiven Mittel, insbesondere die
nichtionischen, und Äquivalente gemäß der Erfindung müssen
vorzugsweise bei schwachen Konzentrationen wirksam sein.
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Erfindungsgemäß liegen die Konzentrationen vorteilhafterweise
im Bereich zwischen 5 und 50 mg/l zu stabilisierende Lösung.
Es genügt ungefähr 0,25 bis 1 Molekül eines geeigneten
oberflächenaktiven Mittels auf 100 Moleküle Albumin jeweils in
einer Lösung von 200 bis 50 g/l, um die Denaturierung und das
Auftreten von unlöslichen Teilchen nach dem Pasteurisieren in
Gegenwart der gewöhnlichen stabilisierenden Formulierung zu
verhindern.
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Das bevorzugte oberflächenaktive Mittel ist Tween 80 mit einem
mittleren Molekulargewicht von 1320 Dalton. Es muß bei einer
Konzentration oberhalb von 5 mg/l und vorzugsweise zwischen 10
und 20 mg/l verwendet werden. Eine Konzentration von Tween 80
von 10 mg/l zu stabilisierende Lösung für eine Albuminlösung
von 50 g/l entspricht 1 Molekül dieses Stabilisators auf 100
Moleküle Albumin.
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In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wird das
oberflächenaktive Mittel in einem frühen Stadium der
Herstellung des Albumins zugesetzt. In einem solchen Fall muß
die anfängliche Konzentration des oberflächenaktiven Mittels
so sein, daß der verbleibende Anteil des letzteren zum
Zeitpunkt des Pasteurisierens ausreichend ist, um die
gewünschte Schutzwirkung sicherzustellen.
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Bei den Lösungen von Human-Albumin, welche die Erfindung
betrifft, handelt es sich insbesondere um alle Proteinlösungen,
bei denen Albumin der Haupt-Proteinbestandteil ist, d.h. mehr
als 80% der Gesamtheit der Proteine darstellt, und die zur
klinischen Verwendung beim Menschen bestimmt sind. Sie sind
insbesondere in der Europäischen Pharmakopöe, II. Auflage von
1984, unter der Bezeichnung "Albumini humani solutio" und im
Code of Federal Regulations der USA, Ausgabe vom 1. April 1986,
unter der Bezeichnung "Albumin (human)" und "Plasma protein
fraction (human)" definiert.
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Das durch die Erfindung betroffene Human-Albumin wird
insbesondere durch Extraktion und Reinigung gemäß jedem
geeigneten Verfahren, ausgehend von einer menschlichen Albumin-
Quelle oder auch von Kulturen tierischer, pflanzlicher Zellen,
von Bakterien oder Hefen, die mit Hilfe gentechnischer
Verfahren zum Produzieren von Human-Albumin transformiert
worden sind, gewonnen. Unter den geeigneten Verfahren zur
Extraktion und Reinigung von Human-Albumin kann man speziell
die Fraktionierung von Plasma mit Hilfe von Alkohol, von COHN
et al. (4) beschrieben, oder die Fraktionierung von Plazenta-
Blut mit Hilfe von Alkohol und Zink, von TAYLOR et al. (5)
beschrieben, oder die Fraktionierung von Plazenta-Blut mit
Hilfe von Alkohol, Natriumcaprylat und Aluminiumgel, von
LIAUTAUD et al. (6) beschrieben, oder die Fraktionierung von
Plazenta-Blut mit Hilfe von Alkohol und durch Chromatographie,
wie von TAYOT et al. (7) beschrieben, oder die Fraktionierung
von Plasma durch Chromatographie, wie im US-Patent Nr.
41675,384 beschrieben, aufführen.
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Die Erfindung wird nun mit Hilfe von nicht beschränkenden
Beispielen beschrieben.
BEISPIEL 1
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Man versuchte, die Stabilität einer Lösung von Albumin zu 50
g/l, erhalten durch Fraktionierung von Plazenta-Blut mit Hilfe
von Alkohol und durch Chromatographie, wie von TAYOT et al. (4)
beschrieben, zu verbessern. Das erhaltene Albumin weist eine
Protein-Reinheit von 100% in der Analyse durch Elektrophorese
auf Celluloseacetat und in der zweidimensionalen
Immunelektrophorese (Gegenwart eines einzigen Peaks) auf.
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Der Versuch bestand darin, die Mengen klassischer
Stabilisatoren, Natriumcaprylat und Natriumacetyltryptophanat,
im Verhältnis zu den durch die Pharmakopöe der USA
vorgeschriebenen Mengen zu vergrößern, während man einen
Natriumanteil von 145 mÄq/l und eine pH von 7,0
aufrechterhielt. Das Albumin wurde filtriert, dann in 100 ml-
Fläschchen aus Glas vom Typ I verteilt und 10 Stunden bei 60ºC
im Wasserbad pasteurisiert. Die Fläschchen wurden vor und nach
Pasteurisieren und spontanem Abkühlen an Luft überprüft. Kein
Fläschchen wies vor dem Pasteurisieren sichtbare Teilchen auf.
TABELLE I:
Natriumcaprylat mMol/g Prot.
Natriumacetyltryptophanat mMol/g Prot.
Anwesenheit von sichtbaren Teilchen nach Pasteurisieren
Standardformulierung (Pharmakopöe USA)
Formulierung
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Man stellt fest (siehe Tabelle I), daß die klassischen
Stabilisatoren trotz der stark vergrößerten Dosen es nicht
zulassen, die Gegenwart von Teilchen in den pateurisierten
Fläschchen zu vermeiden. Diese Feststellung bestätigt die
Tatsache, daß die durch die klassischen Stabilisatoren
verhinderte Gelbildung und die Bildung von Teilchen zwei
unabhängige physikalische Phänomene sind.
BEISPIEL 2
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Ausgehend von einem Plazenta-Albumin, hergestellt wie in
Beispiel 1, stellte man Lösungen von Proteinen zu 200 g/l, 50
g/l und 10 g/l her, die mit einer Standard-
Stabilisierungsformulierung, z.B. 0,08 mMol Natriumcaprylat/g
Protein und 0,08 mMol Natriumacetyltryptophanat/g Protein,
stabilisiert waren. Natrium wurde mit Natriumchlorid auf 145
mÄq/l eingestellt, und der pH wurde auf 7,0 eingestellt. Zu den
Lösungen wurden anschließend 0 oder 5 oder 10 mg/l Tween 80
gegeben, dann wurden sie filtriert und in 100 ml-Fläschchen aus
Glas vom Typ I verteilt, dann 10 Stunden bei 60ºC im Wasserbad
pasteurisiert. Kein Fläschchen wies vor dem Pasteurisieren
sichtbare Teilchen auf.
TABELLE II:
Albumin-Konzentration (g/l)
Anteil an Tween 80 (mg/l)
Anwesenheit von Teilchen nach Pasteurisieren
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Man stellt fest (siehe Tabelle II), daß Tween 80 in der Dosis
von 10 mg/l, wie groß auch die Albumin-Konzentration in der
Lösung ist, vollständig die Bildung von sichtbaren Teilchen
verhindert.
BEISPIEL 3
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Man versuchte, die Stabilität einer Lösung von Albumin zu 50
g/l, erhalten durch Fraktionieren von Plasma nach dem Verfahren
von COHN, zu verbessern. Das Albumin wurde in lyophilisierter
Form von der Gesellschaft HYLAND geliefert. Das Pulver wurde
wieder in Lösung gegeben und auf 50 g/l Proteine eingestellt
und mit einer Standard-Stabilisierungsformulierung, z.B. 0,08
mMol Natriumcaprylat/g Protein und 0,08 mMol
Natriumacetyltryptophanat/g Protein, stabilisiert. Natrium
wurde mit Natriumchlorid auf 145 mÄq/l eingestellt, und der pH
wurde auf 7,0 eingestellt. Zu einem Teil dieser Lösung wurden
10 mg/l Tween 80 gegeben. Die beiden erhaltenen Lösungen wurden
filtriert und in 100 ml-Fläschchen aus Glas vom Typ I verteilt,
dann 10 Stunden bei 60ºC im Wasserbad pasteurisiert. Kein
Fläschchen wies vor dem Pasteurisieren sichtbare Teilchen auf.
TABELLE III:
Anteil an Tween 80 (mg/l)
Anwesenheit von sichtbaren Teilchen nach Pasteurisieren
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Man stellt fest, (siehe Tabelle III), daß Tween 80 in der Dosis
von 10 mg/l vollständig die Bildung von sichtbaren Teilchen im
Albumin von COHN zu 50 g/l, das 10 Stunden bei 60ºC einem
Pasteurisieren unterzogen wurde, verhindert.