DE68907124T2

DE68907124T2 - Verfahren zum stabilisieren von menschlichen albuminloesungen und so erhaltene loesung.

Info

Publication number: DE68907124T2
Application number: DE89400947T
Authority: DE
Inventors: Pierre Fournier; Michel Grandgeorge
Original assignee: Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1988-04-14
Filing date: 1989-04-06
Publication date: 1993-11-04
Anticipated expiration: 2009-04-07
Also published as: FR2630115A1; EP0341103A1; FR2630115B1; ES2055120T5; JPH01311027A; DE68907124T3; US5118794A; ATE90573T1; DE68907124D1; AU617451B2; CA1339440C; EP0341103B1; JP2970911B2; ES2055120T3; AU3275689A; EP0341103B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren von Human-Albuminlösungen zur therapeutischen Verwendung im Hinblick auf ihre Wärmebehandlung in einem Behälter, insbesondere im Endbehälter.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Human-Albuminlösung.
Bei der Herstellung von Human-Albuminlösungen ist das End- Pasteurisieren des Produkts bei 60ºC über 10 Stunden ein obligatorischer Schritt. Dieser Schritt des Erwärmens ist Anfang der Jahre 1950 in den USA eingeführt worden, um den Hepatitis B-Virus zu inaktivieren, welcher möglicherweise trotz der verschiedenen Reinigungsschritte aufgrund der möglichen Kontamination des ersten biologischen Materials, im vorliegenden Fall zu dieser Zeit des menschlichen Bluts, im Endprodukt anwesend ist. Die Wirksamkeit dieses Pasteurisierens zum Ausschalten oder Vermindern des Risikos der Übertragung von Hepatitis B durch Albuminlösungen wurde zu Beginn bei gesunden Freiwilligen gezeigt. Studien, die beim Schimpansen durchgeführt wurden, haben anschließend gezeigt, daß das Hepatitis-Virus nicht-A nicht-B ebenfalls durch eine Behandlung von 10 Stunden bei 60ºC inaktiviert wird. Diese Gegebenheiten waren der Gegenstand eines Übersichtartikels von GERETY und ARONSON (1). Seither haben verschiedene Studien in vitro mit Hilfe von Virus-Modellen gezeigt, daß das Pasteurisieren von Proteinlösungen über 10 Stunden bei 60ºC als hinlänglich allgemeines Verfahren angesehen werden kann, um das Risiko einer Virus-Übertragung beim Empfänger zu vermindern, obwohl bestimmte Viren, wie das Parvovirus, gegen die thermische Inaktivierung resistenter als andere sind (2-3).
Das Patent EP-A-0 050 061 sieht eine andere Lösung vor, welche bei Präparaten von Plasmaproteinen, z. B. Albumin, darin besteht, das Pasteurisieren durch Temperaturerhöhung zu vermeiden und im Gegensatz dazu durch die Wirkung von oberflächenaktiven Mitteln bei erhöhter Konzentration das Hepatitis-Virus zu inaktivieren und gegebenenfalls die Endotoxine auszuschalten. Diese Lösung bietet indessen nicht die Vorteile der Inaktivierung von Albuminpräparaten durch Wärme und erfordert, da das Präparat zur körperlichen Verabreichung bestimmt ist, darüber hinaus, daß die starken zur Inaktivierung verwendeten Konzentrationen an oberflächenaktivem Mittel entfernt werden.
Das Patent EP-A-0 124 044 beschreibt ein Verfahren zum Pasteurisieren eines Proteins, wie z. B. des Fibronectins, in Gegenwart eines an das Fibronectin angepaßten stabilisierenden Mittels, wie z.B. Polyolen und insbesondere eines Disaccharids, zu dem es, mit dem Ziel, eine Beschädigung aufgrund der mechanischen Bewegung bei der industriellen Herstellung von Fibronectin während der thermischen Behandlung zu verhindern, ein oberflächenaktives Mittel und ein Chelat-bildendes oder Anti-Oxidations-Mittel hinzufügt. Die Gesamtheit des Verfahrens ist für Fibronectin und die Pasteurisierungsbehandlung in großem Volumen in industriellem Maßstab mit mechanischem Bewegen spezifisch.
Heute schreiben sämtliche nationalen und internationalen Pharmakopöen das Pasteurisieren von Albuminlösungen bei 60ºC über 10 Stunden vor, wobei dieses Pasteurisieren im allerletzten Stadium der Herstellung, nämlich im Endbehälter, im allgemeinen einem Fläschchen aus neutralem Glas, vorgenommen werden muß; siehe z.B. die Europäische Pharmakopöe, II. Auflage von 1984, die Pharmakopöe der USA, XXI. Auflage, und die japanische Pharmakopöe von 1986. Trotz der relativen Stabilität des Albumins gegen Wärme muß dieses mit Hilfe von geeigneten Stabilisatoren geschützt werden, um jegliche Gelbildung während des Pasteurisierens zu vermeiden. Die heute gleichsam generell verwendeten Stabilisatoren sind Natriumcaprylat und Natriumacetyltryptophanat, allein oder in Kombination. Speziell schreiben die Pharmakopöen der USA, XXI. Auflage, und von Japan 1986 Natriumacetyltryptophanat allein in einer Dosis von 0,16 Millimol pro Gramm Albumin oder auch die Mischung Natriumacetyltryptophanat/Natriumcaprylat jeweils in einer Dosis von 0,08 Millimol pro Gramm Albumin vor. Natriummandelat kann ebenfalls allein oder zusammen mit Natriumcaprylat verwendet werden (siehe die französische Pharmakopöe, VIII. Ausgabe von 1965).
Die Stabilisatoren werden nach den Pharmakopöen der USA und von Japan in großem Überschuß bezüglich Albumin, nämlich 10 Moleküle Stabilisator auf 1 Molekül Albumin, hinzugefügt, und aufgrund ihrer besonderen Affinität zu Albumin sind sie in der Lage, es wirksam gegen eine direkte Denaturierung durch die Wärme zu schützen. In Abwesenheit dieser Stabilisatoren ist die Denaturierung des Albumins unvermeidlich und führt zu einer fortschreitenden Aggregation der Albuminmoleküle, was sich im Erscheinen einer Opaleszenz und dann in einer vollständigen Gelbildung der Lösung äußert.
Wenn auch diese Opaleszenz und diese Gelbildung durch die Verwendung der vorstehend beschriebenen Stabilisatoren vermieden werden, ist es bekannt, daß nach dem Pasteurisieren eine gewisse Anzahl von Fläschchen mit Albumin bei einer visuellen Überprüfung feine flockige Teilchen oder Fädchen oder Häute in mehr oder weniger großer Anzahl aufweisen. Dieses Phänomen ist bei den Albuminpräparaten, die verdünnter sind, d.h. mit 4% oder 5% Proteinen, ausgeprägter als bei den Präparaten, die konzentrierter sind, d.h. mit 20% Proteinen.
Abgesehen davon, daß das Feststellen dieser unlöslichen Teilchen die Verwerfung der betroffenen Fläschchen während der Endüberprüfung im Rahmen der Qualitätskontolle verlangt, was sich in einem ökonomischen Verlust äußert, verrät das Erscheinen dieser Teilchen während des Pasteurisierens eine gewisse Denaturierung des Produkts, was Zweifel an seiner guten Verträglichkeit bei der eventuellen Verabreichung an den Menschen hinterlassen kann.
Die Erfindung hat zum Ziel, diesen Nachteil abzustellen, indem sie ein Verfahren zur Stabilisierung von Human-Albuminlösungen im Hinblick auf ihre Wärmebehandlung in einem Behälter, insbesondere dem Endbehälter, vorschlägt, welches eine vollkommene Stabilisierung gestattet und zu einer mit dem normalen Gebrauch dieser Lösungen kompatiblen Human- Albuminlösung führt.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Stabilisieren von Human-Albuminlösungen zur therapeutischen Verwendung im Hinblick auf ihre Wärmebehandlung in einem Behälter, insbesondere im Endbehälter, mit Hilfe eines Stabilisierungsmittels, das an die Stabilisierung des Albumins während dessen Wärmebehandlung angepaßt ist, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Wärmebehandlung zusätzlich zu dem Stabilisierungsmittel ein oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus Tween 80 (Polysorbat 80 Société Atlas - Polyoxyethylensorbitanoleat), Tween 20 (Société Atlas - Polyoxyethylensorbitanlaurat), Pluronic F68 (Societe Ugine Kuhlmann - Copolymer von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen) und Laurat von Polyethylenglykol 600 (Société Gattefossé), zusetzt.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete oberflächenaktive Mittel spielt nicht die gleiche Rolle wie die gewöhnliche stabilisierende Formulierung und kann sich deshalb nicht an dessen Stelle setzen. Tatsächlich resultiert das Auftreten von Teilchen als Folge des Pasteurisierens nicht aus den gleichen Gründen, die ursprünglich in der Verwendung der gewöhnlichen Stabilisatoren liegen, wie es weiter unten erläutert wird, sondern aus Wechselwirkungen der Lösung mit der Wand des Behälters bei der thermischen Behandlung.
Dieses Phänomen beobachtet man in Fläschchen aus klassischem neutralem Glas, z.B. Borsilikatglas vom Typ I, oder aus durch Behandlung mit Schwefeldioxid oder Ammoniumsulfat an der Oberfläche neutralisiertem Glas vom Typ II, wie sie in den Pharmakopöen Europas und der USA beschrieben sind (Société SAINT-GOBAIN DESJONQUERES), aber auch in Fläschchen aus Kunststoffmaterial, z.B. aus Polystyrol (Société CORNING). Dieses Phänomen läßt demnach wahrscheinlich denaturierende hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Produkt und der Wand des Fläschchens mitspielen.
Unter gewöhnlicher stabilisierender Mischung versteht man insbesondere Natriumcaprylat, Natriumacetyltryptophanat, Natriummandelat oder eine Mischung von zwei oder drei derselben.
Unter äquivalenten Mitteln versteht man alle nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, die vorzugsweise bei schwacher Konzentration die Denaturierung des Albumins auf der Wand des Behälters und somit die Bildung von unlöslichen Teilchen beim Pasteurisieren der Albuminlösungen verhindern und deren Gegenwart in der endgültigen Lösung nicht mit der normalen Verwendung der Lösung inkompatibel ist.
Die oberflächenaktiven Mittel, insbesondere die nichtionischen, und Äquivalente gemäß der Erfindung müssen vorzugsweise bei schwachen Konzentrationen wirksam sein.
Erfindungsgemäß liegen die Konzentrationen vorteilhafterweise im Bereich zwischen 5 und 50 mg/l zu stabilisierende Lösung. Es genügt ungefähr 0,25 bis 1 Molekül eines geeigneten oberflächenaktiven Mittels auf 100 Moleküle Albumin jeweils in einer Lösung von 200 bis 50 g/l, um die Denaturierung und das Auftreten von unlöslichen Teilchen nach dem Pasteurisieren in Gegenwart der gewöhnlichen stabilisierenden Formulierung zu verhindern.
Das bevorzugte oberflächenaktive Mittel ist Tween 80 mit einem mittleren Molekulargewicht von 1320 Dalton. Es muß bei einer Konzentration oberhalb von 5 mg/l und vorzugsweise zwischen 10 und 20 mg/l verwendet werden. Eine Konzentration von Tween 80 von 10 mg/l zu stabilisierende Lösung für eine Albuminlösung von 50 g/l entspricht 1 Molekül dieses Stabilisators auf 100 Moleküle Albumin.
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wird das oberflächenaktive Mittel in einem frühen Stadium der Herstellung des Albumins zugesetzt. In einem solchen Fall muß die anfängliche Konzentration des oberflächenaktiven Mittels so sein, daß der verbleibende Anteil des letzteren zum Zeitpunkt des Pasteurisierens ausreichend ist, um die gewünschte Schutzwirkung sicherzustellen.
Bei den Lösungen von Human-Albumin, welche die Erfindung betrifft, handelt es sich insbesondere um alle Proteinlösungen, bei denen Albumin der Haupt-Proteinbestandteil ist, d.h. mehr als 80% der Gesamtheit der Proteine darstellt, und die zur klinischen Verwendung beim Menschen bestimmt sind. Sie sind insbesondere in der Europäischen Pharmakopöe, II. Auflage von 1984, unter der Bezeichnung "Albumini humani solutio" und im Code of Federal Regulations der USA, Ausgabe vom 1. April 1986, unter der Bezeichnung "Albumin (human)" und "Plasma protein fraction (human)" definiert.
Das durch die Erfindung betroffene Human-Albumin wird insbesondere durch Extraktion und Reinigung gemäß jedem geeigneten Verfahren, ausgehend von einer menschlichen Albumin- Quelle oder auch von Kulturen tierischer, pflanzlicher Zellen, von Bakterien oder Hefen, die mit Hilfe gentechnischer Verfahren zum Produzieren von Human-Albumin transformiert worden sind, gewonnen. Unter den geeigneten Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Human-Albumin kann man speziell die Fraktionierung von Plasma mit Hilfe von Alkohol, von COHN et al. (4) beschrieben, oder die Fraktionierung von Plazenta- Blut mit Hilfe von Alkohol und Zink, von TAYLOR et al. (5) beschrieben, oder die Fraktionierung von Plazenta-Blut mit Hilfe von Alkohol, Natriumcaprylat und Aluminiumgel, von LIAUTAUD et al. (6) beschrieben, oder die Fraktionierung von Plazenta-Blut mit Hilfe von Alkohol und durch Chromatographie, wie von TAYOT et al. (7) beschrieben, oder die Fraktionierung von Plasma durch Chromatographie, wie im US-Patent Nr. 41675,384 beschrieben, aufführen.
Die Erfindung wird nun mit Hilfe von nicht beschränkenden Beispielen beschrieben.

BEISPIEL 1

Man versuchte, die Stabilität einer Lösung von Albumin zu 50 g/l, erhalten durch Fraktionierung von Plazenta-Blut mit Hilfe von Alkohol und durch Chromatographie, wie von TAYOT et al. (4) beschrieben, zu verbessern. Das erhaltene Albumin weist eine Protein-Reinheit von 100% in der Analyse durch Elektrophorese auf Celluloseacetat und in der zweidimensionalen Immunelektrophorese (Gegenwart eines einzigen Peaks) auf.
Der Versuch bestand darin, die Mengen klassischer Stabilisatoren, Natriumcaprylat und Natriumacetyltryptophanat, im Verhältnis zu den durch die Pharmakopöe der USA vorgeschriebenen Mengen zu vergrößern, während man einen Natriumanteil von 145 mÄq/l und eine pH von 7,0 aufrechterhielt. Das Albumin wurde filtriert, dann in 100 ml- Fläschchen aus Glas vom Typ I verteilt und 10 Stunden bei 60ºC im Wasserbad pasteurisiert. Die Fläschchen wurden vor und nach Pasteurisieren und spontanem Abkühlen an Luft überprüft. Kein Fläschchen wies vor dem Pasteurisieren sichtbare Teilchen auf. TABELLE I: Natriumcaprylat mMol/g Prot. Natriumacetyltryptophanat mMol/g Prot. Anwesenheit von sichtbaren Teilchen nach Pasteurisieren Standardformulierung (Pharmakopöe USA) Formulierung
Man stellt fest (siehe Tabelle I), daß die klassischen Stabilisatoren trotz der stark vergrößerten Dosen es nicht zulassen, die Gegenwart von Teilchen in den pateurisierten Fläschchen zu vermeiden. Diese Feststellung bestätigt die Tatsache, daß die durch die klassischen Stabilisatoren verhinderte Gelbildung und die Bildung von Teilchen zwei unabhängige physikalische Phänomene sind.

BEISPIEL 2

Ausgehend von einem Plazenta-Albumin, hergestellt wie in Beispiel 1, stellte man Lösungen von Proteinen zu 200 g/l, 50 g/l und 10 g/l her, die mit einer Standard- Stabilisierungsformulierung, z.B. 0,08 mMol Natriumcaprylat/g Protein und 0,08 mMol Natriumacetyltryptophanat/g Protein, stabilisiert waren. Natrium wurde mit Natriumchlorid auf 145 mÄq/l eingestellt, und der pH wurde auf 7,0 eingestellt. Zu den Lösungen wurden anschließend 0 oder 5 oder 10 mg/l Tween 80 gegeben, dann wurden sie filtriert und in 100 ml-Fläschchen aus Glas vom Typ I verteilt, dann 10 Stunden bei 60ºC im Wasserbad pasteurisiert. Kein Fläschchen wies vor dem Pasteurisieren sichtbare Teilchen auf. TABELLE II: Albumin-Konzentration (g/l) Anteil an Tween 80 (mg/l) Anwesenheit von Teilchen nach Pasteurisieren
Man stellt fest (siehe Tabelle II), daß Tween 80 in der Dosis von 10 mg/l, wie groß auch die Albumin-Konzentration in der Lösung ist, vollständig die Bildung von sichtbaren Teilchen verhindert.

BEISPIEL 3

Man versuchte, die Stabilität einer Lösung von Albumin zu 50 g/l, erhalten durch Fraktionieren von Plasma nach dem Verfahren von COHN, zu verbessern. Das Albumin wurde in lyophilisierter Form von der Gesellschaft HYLAND geliefert. Das Pulver wurde wieder in Lösung gegeben und auf 50 g/l Proteine eingestellt und mit einer Standard-Stabilisierungsformulierung, z.B. 0,08 mMol Natriumcaprylat/g Protein und 0,08 mMol Natriumacetyltryptophanat/g Protein, stabilisiert. Natrium wurde mit Natriumchlorid auf 145 mÄq/l eingestellt, und der pH wurde auf 7,0 eingestellt. Zu einem Teil dieser Lösung wurden 10 mg/l Tween 80 gegeben. Die beiden erhaltenen Lösungen wurden filtriert und in 100 ml-Fläschchen aus Glas vom Typ I verteilt, dann 10 Stunden bei 60ºC im Wasserbad pasteurisiert. Kein Fläschchen wies vor dem Pasteurisieren sichtbare Teilchen auf. TABELLE III: Anteil an Tween 80 (mg/l) Anwesenheit von sichtbaren Teilchen nach Pasteurisieren
Man stellt fest, (siehe Tabelle III), daß Tween 80 in der Dosis von 10 mg/l vollständig die Bildung von sichtbaren Teilchen im Albumin von COHN zu 50 g/l, das 10 Stunden bei 60ºC einem Pasteurisieren unterzogen wurde, verhindert.

Claims

1. Verfahren zum Stabilisieren von Human-Albuminlösungen zur therapeutischen Verwendung im Hinblick auf ihre Wärmebehandlung in einem Behälter, insbesondere im Endbehälter, mit Hilfe eines Stabilisierungsmittels, das an die Stabilisierung des Albumins während dessen Wärmebehandlung angepaßt ist, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Wärmebehandlung zusätzlich zu dem Stabilisierungsmittel ein oberflächenaktives Mittel, ausgewählt aus Tween 80, Tween 20, Pluronic F68 und Laurat von Polyethylenglykol 600, zusetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das oberflächenaktive Mittel in einer Konzentration von 5 bis 50 mg/l eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tween 80 in einer Konzentration über 5 mg/l und insbesondere im Bereich von 10 bis 20 mg/l eingesetzt wird.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der zu stabilisierenden Human-Albuminlösung die übliche stabilisierende Formulierung gibt, das Natrium mit Natriumchlorid auf 145 mÄq/l und den pH auf 7,0 einstellt, das oberflächenaktive Mittel hinzufügt, filtriert, dann die Lösung in Fläschchen verteilt und 10 Stunden bei 60ºC pasteurisiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich die übliche stabilisierende Formulierung aus 0,08 mMol Natriumcaprylat und 0,08 mMol Natriumacetyltryptophanat pro Gramm Albumin zusammensetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das oberflächenaktive Mittel in einem frühen Stadium der Herstellung des Albumins zusetzt.

7. Human-Albuminlösung, erhalten durch das in einem der vorangehenden Ansprüche beschriebene Verfahren.