DE69729786T2

DE69729786T2 - Hochkonzentrierte, lyophilisierte und flüssige faktor-ix formulierungen

Info

Publication number: DE69729786T2
Application number: DE69729786T
Authority: DE
Inventors: Chandra Webb; Lawrence Bush; G. Robert SCHAUB
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1996-01-25
Filing date: 1997-01-09
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2017-01-10
Also published as: EP0876155B1; JP2006257099A; CA2241319A1; AU1750097A; JP2010189433A; WO1997026909A1; JP2007262090A; JP2000504327A; EP0876155A1; AU726498B2; ATE270557T1; JP4879104B2; DE69729786D1; US5770700A

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein neuartige Formulierungen, welche Faktor IX umfassen, einschließlich sowohl hochgradig konzentrierte, als auch lyophilisierte und flüssige Faktor IX umfassende Formulierungen, welche zur Verabreichung auf verschiedenen Wegen, einschließlich zum Beispiel Wegen wie intravenös, subkutan, intramuskulär und intradermal geeignet sind.
Hintergrund der Erfindung
Eine Vielfalt an Faktoren, welche im Blutgerinnungsprozess einbezogen sind, sind identifiziert worden, einschließlich Faktor IX, einem Plasma-Glycoprotein. Ein Mangel an Faktor IX kennzeichnet einen Hämophilie-Typ (Typ B). Behandlung dieser Krankheit hat traditionell intravenöse Infusion von Proteinkonzentraten von Faktor IX einbezogen, welche von menschlichem Plasma abgeleitet wurden. Infusion von Blutkonzentraten bezieht das Risiko der Übertragung verschiedener infektiöser Wirkstoffe ein, wie virale Hepatitis und HIV, oder thromboembolische Faktoren. Ein alternatives Verfahren zum Herstellen von Faktor IX durch rekombinante DNA-Techniken ist in USPN 4770999, Kaufman et al., 13. September 1988 beschrieben worden. Die cDNA, welche für den humanen Faktor IX codiert, ist isoliert, gekennzeichnet und in Expressionsvektoren kloniert worden. Siehe zum Beispiel Choo et al., Nature 299: 178–180 (1982); Fair et al., Blood 64: 194–204 (1984) und Kurachi et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA 79: 6461–6464 (1982). So ist es durch Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technologie möglich geworden, Faktor IX Protein herzustellen.
Es ist wünschenswert, sowohl Masse- als auch Fertigformen von Faktor IX zu haben, welche sowohl zur Lagerung, als auch zur Abgabe geeignet sind. Typischerweise ergibt ein Reinigungsverfahren für ein Protein Konzentrieren des Proteins. Dieses konzentrierte Protein, auch als Masseprotein bekannt, kann sich in einem Formulierungspuffer befinden. Masseprotein kann dann typischerweise bei einer Konzentration von etwa 2 bis mindestens 20 mg/ml gefroren zu einer Füll/Fertig-Anlage transportiert werden, wo es an eine passende Dosierungskonzentration angepasst und in Dosierungsvialen oder eine Vorrichtung platziert wird, welche zur Verabreichung geeignet ist, z. B. eine vorgefüllte Spritze. Idealerweise wird das Arzneiprodukt in flüssigem Zustand belassen und als Flüssigkeit gelagert und verabreicht. Alternativ wird das Arzneiprodukt lyophilisiert, also gefriergetrocknet. Idealerweise hat das lyophilisierte Arzneiprodukt eine ausreichende Stabilität, um in Langzeitlagerung, also mehr als sechs Monate, gehalten zu werden: lyophilisiertes Arzneiprodukt wird zu einem späteren Zeitpunkt durch Zugeben eines geeigneten Verabreichungsverdünnungsmittels gerade kurz vor der Patientenverwendung rekonstituiert.
Die Entscheidung, das fertige Arzneiprodukt entweder als Flüssigkeit zu halten oder zu gefriertrocknen, basiert üblicherweise auf der Stabilität der Proteinarznei in jenen Formen. Die Proteinstabilität kann unter anderem durch solche Faktoren wie Ionenstärke, pH, Temperatur, wiederholte Frost/Tau-Wechsel und Aussetzung unter Scherkräfte beeinflusst werden. Wirksames Protein kann als Folge physikalischer Instabilitäten einschließlich Denaturierung und Aggregation (sowohl lösliche, als auch nicht lösliche Aggregatbildung), als auch chemischer Instabilitäten, einschließlich zum Beispiel Hydrolyse, Entamidierung und Oxidation, um nur ein paar zu nennen, verloren werden. Für eine allgemeine Übersicht über Stabilität von Protein-Pharmazeutika siehe zum Beispiel Manning et al., Pharmaceutical Research 6: 903–918 (1989).
Während das mögliche Auftreten von Protein-Instabilitäten weit anerkannt ist, ist es unmöglich, bestimmte Instabilitätsprobleme eines bestimmten Proteins vorherzusehen. Jede dieser Instabilitäten kann die Bildung eines Proteins, Protein-Nebenprodukts oder Derivats mit verringerter Wirksamkeit, erhöhter Toxizität und/oder erhöhter Immunogenizität zur Folge haben. Tatsächlich kann Proteinausfällung zu Thrombose, Nicht-Homogenität von Dosierungsform und Menge, als auch verklumpten Spritzen führen. Auch gibt es Faktor IX spezifisch mehrere post-translationale Modifikationen (zum Beispiel die Gamma-Carboxylierung von bestimmten Glutaminsäureresten im N-Terminus und die Addition von Kohlenhydrat) welche alle potentielle Stellen vorsehen, die anfällig für Modifikation bei Lagerung sein können. Somit steht die Sicherheit und Wirksamkeit jeder pharmazeutischen Formulierung aus einem Protein in direkter Beziehung zu ihrer Stabilität. Beibehalten dieser Stabilität in einer flüssigen Do sierungsform unterscheidet sich im Allgemeinen von einer lyophilisierten Dosierungsform aufgrund stark erhöhtem Potential für molekulare Bewegung und daher erhöhter Wahrscheinlichkeit molekularer Interaktionen. Beibehalten der Stabilität in einer hochgradig konzentrierten Form ist aufgrund der Neigung zur Aggragatbildung bei hohen Proteinkonzentrationen ebenfalls unterschiedlich.
Bei der Entwicklung einer flüssigen Formulierung werden viele Faktoren in Betracht gezogen. Kurzfristige, also weniger als sechs Monate, Flüssigkeitstabilität hängt im Allgemeinen vom Vermeiden von groben strukturellen Veränderungen ab wie Denaturierung und Aggregation. Diese Verfahren werden in der Literatur für eine Anzahl an Proteinen beschrieben und es gibt viele Beispiele für Stabilisatoren („Strategies to Suppress Aggregation of Recombinant Keratinocyte Growth Factor during Liquid Formulation Development", B. L. Chen et al., J. Pharm. Sci. 83(12): 1657–1661, (1994); „Formulation Design of Acidic Fibroblast Growth Factor", P. K. Tsai et al., Pharm. Res. 10(5): 649–659 (1993); „The Stabilization of Beta-Lactoglobulin by Glycine and NaCl", Tsutomu Arakawa, Biopolymers 28: 1397–1401 (1989); „Structural stability of lipase from wheat germ", A. N. Rajeshwara und V. Prakash, Internat. J. of Peptide & Prot. Res. 44: 435–440 (1994); „Thermal Stability of Human Immunoglobulins with Sorbitol", M. Gonzalez et al., Vox Sang 68: 1–4 (1995)). Es ist gut bekannt, dass ein Wirkstoff, welcher beim Stabilisieren eines Proteins wirksam ist, tatsächlich so wirkt, dass er ein anderes destabilisiert. Sobald das Protein vor groben Strukturveränderungen stabilisiert worden ist, hängt Entwickeln einer flüssigen Formulierung für Langzeitstabilität (zum Beispiel mehr als sechs Monate) vom weiteren Stabilisieren des Proteins vor Abbauarten ab, die für das Protein spezifisch sind. Spezifischere Abbauarten können zum Beispiel Disulfid-Bindungsverwürfelung, Oxidation von Oligosacchariden und/oder bestimmten Resten, Entamidierung, Cyclisierung und Ähnliches einschließen. Obwohl es nicht immer möglich ist, die einzelnen Abbauarten genau aufzuzeigen, werden Tests entwickelt, um feine Veränderungen zu überwachen, um so die Fähigkeit spezifischer Exzipienten zu überwachen, das Protein von Interesse einzigartig zu stabilisieren.
Zusätzlich zu Stabilitätsüberlegungen wählt man im Allgemeinen Exzipienten aus, welche der Billigung verschiedener, weltweiter, medizinischer Aufsichtsbehörden entsprechen werden. Es ist hochgradig wünschenswert, dass die Formulierung annähernd isotonisch ist, und dass sich der pH der Formulierung in einer physiologisch geeigneten Bandbreite bei Injektion/Infusion befindet, weil ansonsten Schmerz und Unbehagen für den Patienten die Folge sein kann. Die Wahl und Menge des verwendeten Puffers ist wichtig, um die gewünschte pH-Bandbreite zu erreichen. Die Wahl und Menge von Wirkstoffen, welche verwendet werden, um die Tonizität zu modifizieren, ist wichtig, um Leichtigkeit der Verabreichung sicherzustellen.
Traditionell werden große, labile Proteine wie Faktor IX intravenös, entweder prophylaktisch oder als Antwort auf Blutungsepisoden verabreicht. Wenn es intravenös gegeben wird, ist das Protein direkt im Blutstrom verfügbar. Unglücklicherweise kann es Nebenwirkungen in Verbindung mit wiederholten Injektionen geben, einschließlich Okklusion und/oder Fibrinbildung, insbesondere bei Älteren. Darüber hinaus kann es, wo die Venen des Patienten besonders klein sind, z. B. bei kleinen Kindern, schwierig sein, die erforderliche therapeutische Dosis zu erreichen.
EP-0317376 offenbart ein chromatographisches Verfahren zum Trennen einer Fraktion aus humanem Plasma, welche Faktor IX enthält, bei einer Konzentration von 25 U/ml. Die Zugabe von Arginin zum Elutionspuffer, um den Faktor IX zu stabilisieren, wird beschrieben.
Gegenwärtig gibt es keine hochgradig konzentrierten Faktor IX Formulierungen, welche im Handel erhältlich sind. Die einzigen beiden im Handel erhältlichen (in den US), Träger-Protein-freien, Plasma-abgeleiteten Faktor IX Formulierungen sind gefriergetrocknete Produkte, welche zur Verwendung rekonstituiert werden und auf niedrige Faktor IX Konzentrationen beschränkt sind, z. B. etwa 100 U/ml oder weniger als 1 mg/ml. Solche niedrigen Konzentrationen sind primär für intravenöse Verabreichung angezeigt und nicht für subkutane, intramuskuläre oder intradermale Verwendung beabsichtigt. Alpha Therapeutic Corporation sieht lyophilisiertes AlphaNine^® SD vor, welches Heparin, Dextrose, Polysorbat 80 und Tri(n-butyl)phosphat umfasst.
Von diesem Präparat ist beabsichtigt, dass es bei Temperaturen zwischen 2° und 8°C gelagert wird. Heparin ist zu vermeiden, da es ein Anti-Koagulans ist, und Tri(n-butyl)phosphat reizt Schleimhäute; somit ist diese Formulierung weniger als ideal. Armour Pharmaceutical Company sieht lyophilisiertes Mononine^® vor, welches Histidin, Natriumchlorid und Mannitol umfasst, welches ähnlicherweise bei 2° bis 8°C gelagert werden muss. Die Packungsbeilage empfiehlt kein Lagern dieser Formulierung für mehr als einen Monat bei Raumtemperatur. Es gibt weder flüssige, noch hochgradig konzentrierte Faktor IX Produkte, welche gegenwärtig im Handel erhältlich sind. Schwinn, PCT/EP90/02238 offenbart Faktor IX, 0,9 M Saccharose, 0,5 M Lysin und 0,003 M Calciumchlorid, gelagert bei 4–8°C, stabil nur für einen Zeitraum von Wochen und daher zur kommerziellen Herstellung ungeeignet; diese Formulierung ist unglücklicherweise hypertonisch und der pH ist außerhalb der Bandbreite für angenehme Verabreichung und daher zur Injektion ungeeignet.
Für den Patienten leichter zu handhaben sind Verabreichungsformen wie subkutan, intramuskulär oder intradermal. Subkutane Verabreichung von Faktor IX wird in Berrettini, Am. J. Hematol. 47: 61 (1994) und in WO-93/07890, BTG, Brownlee (veröffentlicht am 29. April 1993) beschrieben. In Berrettini wurde ein Immuno-Produkt verwendet: Immunine^TM, Faktor IX, Heparin, Natriumcitrat, Natriumchlorid und Antithrombin III bei einer Konzentration von 118 U/mg. Von dem Produkt wurde berichtet, dass es schlecht und langsam in die Zirkulation transportiert wurde und die Autoren schlossen, dass subkutane Verabreichung nicht verlässlich zum Behandeln oder Verhindern von Blutung bei Hämophilie B Patienten war und dass noch konzentriertere Formen bezüglich klinischer Wirksamkeit unannehmbar sein würden. Brownlee, supra, offenbart eine Mononine^TM Faktor IX Formulierung bei einer Konzentration von 10–500 U/ml. Es wurden nur niedrige zirkulierende Gehalte erhalten und auf Seite 9 wird vermerkt, dass sich nach vier Stunden große Gerinsel unter der Haut an jeder Stelle gebildet hatten, wo der Faktor IX injiziert worden war, was schwere Prellungen ergab. So etwas kann beobachtet werden, wenn ein Produkt verwendet wird, das unrein ist.
Bei Hämophilie B Hunden (Brinkhous et al., FASEB 7. 117 (1993)) und bei einem Hämophilie B Patienten (Liles et al., Thromb. Haemost. 73: 1986a (1995)) wurde Plasma-abgeleiteter Faktor IX (pFIX) subkutan (bei Dosen von 15–47 U/kg bei Hunden und bei einer Dosis von 30 U/kg beim Patienten) verabreicht. Dies ergab Plasma Faktor IX bei Hunden, welches Dosis abhängig war und von 0,8 bis 7,6% reicht, wobei intramuskulär höhere Gehalte ergab. Beim Hämophilie-Patienten erreicht Plasma Faktor IX Wirksamkeit nur 1% innerhalb von sechs Stunden; dieser Wirksamkeitsgrad hielt 36 Stunden an; die niedrige Konzentration an Plasma-abgeleitetem Faktor IX erforderte Injektionen mit hohem Volumen an multiplen (10) Stellen.
Eines der Hauptprobleme in Verbindung mit Formulieren einer geeigneten subkutanen Formulierung ist das Erreichen einer ausreichend hohen Konzentration des Proteins, ohne Aggragatbildung des Proteins zu verursachen und ohne gleichzeitigem Konzentrieren von Verunreinigungen in dem Präparat. Sowohl die Aggregatbildung, als auch Verunreinigungen führen zu erhöhter Immunogenizität. Bei gegenwärtig erhältlichen Produkten erfordert das Geben einer angemessenen Dosis an Faktor IX subkutan die Verwendung von multiplen Injektionsstellen. Dieses verursacht großes Unbehagen und Unbequemlichkeit beim Patienten. Um Faktor IX subkutan praktisch abzugeben ist es notwendig, Faktor IX auf mindestens 1000 U/ml oder höher zu konzentrieren und es in einer stabilen, nicht-aggregierenden Dosierungsform vorzusehen. Solch eine konzentrierte Form ist gegenwärtig nicht erhältlich.
Idealerweise sollten Formulierungen eine Faktor IX Stabilität für mehr als ein Jahr und eine Kompatibilität über eine große Bandbreite an Proteinkonzentrationen (0,1 mg/ml bis mehr als 160 mg/ml, also 20 U/ml bis mehr als 56000 U/ml beispielsweise) vorsehen. Dies ermöglicht Flexibilität bei Verabreichungsverfahren, welche höhere Proteinkonzentrationen erfordern können, z. B. subkutane, intradermale oder intramuskuläre Verabreichung, oder jene, welche niedrige Proteinkonzentration nutzen, z. B. intravenöse Verabreichung. Im Allgemeinen ermöglichen höher konzentrierte Formen die Verabreichung von kleineren Volumina, was aus Sicht des Patienten hochgradig wünschenswert ist. Flüssige Formulierungen können gegenüber gefriergetrockneten Produkten bezüglich Einfachheit der Verabreichung und Verwendung viele Vorteile haben. Entsprechend bleibt weiterhin ein Bedarf nach Stand der Technik für Verfahren zum Verbessern der Faktor IX Proteinstabilität, Erhöhen der Konzentration, Beibehalten von wirksamkeitsgraden und Vorsehen stabiler flüssiger Formulierungen, welche zur verlängerten Lagerung für mehr als ein Jahr bei 2 bis 8°C geeignet sind.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und hochgradig konzentrierte, lyophilisierte und flüssige Präparate von Faktor IX, welche als Masseprotein brauchbar sind oder zur Verabreichung brauchbar sind. Die Erfindung sieht eine Zusammensetzung vor, welche hochgradig konzentrierten Faktor IX und Arginin, einen Puffer und Sucrose oder Mannitol umfasst, wobei die Faktor IX Konzentration etwa 2 bis etwa 160 mg/ml beträgt. Diese Zusammensetzungen sind entweder gefroren oder flüssig für mindestens sechs Monate und vorzugsweise bis zu 36 und 60 Monate stabil und können bei Temperaturen im Bereich von –100°C bis 40°C von –80°C bis 0°C und von –20°C bis 10°C gelagert werden. Die Zusammensetzungen umfassen Faktor IX, Tonizitätsmodifikatoren, Kryoschutzmittel und Puffer und/oder weitere Exzipienten, welche Faktor IX weiter stabilisieren. Die Faktor IX Konzentration reicht von etwa 2 bis etwa 160 mg/ml (wobei 160 mg/ml mit mindestens 56000 U/ml äquivalent sind), wobei 2 bis 10 mg/ml (2500 U/ml) bevorzugt werden, wobei die am meisten bevorzugte Bandbreite vom Verabreichungsweg abhängt. Tonizitätmodifikatoren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Salze, Zucker, Polyole und Aminosäuren. Geeignete Aminosäuren schließen Arginin, Glycin und Histidin bei einer Konzentration von etwa 10 bis 500 mM ein, wobei etwa 10 bis 300 mM und etwa 10 bis 200 mM bevorzugt werden. Die Argininkonzentration beträgt vorzugsweise etwa 130 bis 160 mM, etwa 130 bis 235 mM oder etwa 60 bis 70 mM. Insbesondere bevorzugt beträgt die Argininkonzentration etwa 160 mM. Kroyschutzmittel Polyole, Mannitol und Sucrose haben eine Konzentrationsbandbreite von etwa 1 bis 400 mM, wobei etwa 5 bis 200 mM und 20 bis 100 mM bevorzugt werden. Sucrosekonzentration beträgt vorzugsweise etwa 3 bis 60 mM. Gegebenenfalls können die Zusammensetzungen auch einen Surfactanten oder Detergens enthalten, wie Polysorbat (z. B. Tween) oder Polyethylenglycol (PEG), welcher auch als Kryoschutzmittel während des Gefrierens dienen kann. Der Surfactant reicht von etwa 0,005 bis 1%, wobei etwa 0,005 bis 0,1% und etwa 0,005 bis 0,02% bevorzugt werden. Die Zusammensetzungen enthalten einen passenden Puffer, um einen physiologisch geeigneten pH zu halten, z. B. im Bereich von etwa 5,8 bis 8,0, wobei etwa 6,2 bis 7,2 und etwa 6,5 bis 7,0 bevorzugt werden. Puffer schließen vorzugsweise Histidin, Natriumcitrat, Kaliumcitrat, Maleinsäure, Ammoniumacetat, Tris, Natriumphosphat, Kaliumphosphat und Diethanolamin ein, wobei Natrium-/Kaliumcitrat bevorzugt werden, mit einem bevorzugten pH von etwa 6,5 bis 7,5 und einer Konzentrationsbandbreite von etwa 1–100 mM, wobei 5 bis 50 mM und 10 bis 25 mM bevorzugt werden. Die bevorzugte Citratkonzentration beträgt etwa 1 bis 40 mM, insbesondere bevorzugt etwa 15 mM. Gegebenenfalls werden kleine Mengen eines Chelatbildners wie EDTA bei Konzentrationen von 0,05 bis 50 mM oder 0,05 bis 10 mM oder 0,1 bis 5 mM eingeschlossen, wobei etwa 1 bis 5 mM bevorzugt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht Formulierungen von Faktor IX vor, welche zur Verabreichung in einer Enddosierungsform geeignet sind, zum Beispiel durch intravenöse, subkutane, intradermale oder intramuskuläre Verabreichungswege. Typischerweise werden große Mengen an Massearznei gefroren und können, falls notwendig, zu einem Herstellungsort transportiert werden, wo die Massearznei in kleine Vialen gefüllt wird; falls gewünscht, ist die Enddosierungsform eine verdünnte, pH-angepasste Form; die Massearznei umfasst typischerweise eine höhere Proteinkonzentration als Fertigarznei und muss nicht isotonisch sein. Die Fertigarzneizusammensetzungen umfassen Faktor IX, Tonizitätsmodifikatoren, Kryoschutzmittel und einen Puffer und/oder weitere Exzipienten, welche Faktor IX weiter stabilisieren, wie supra beschrieben. Die Fertigarzneiformulierungen sind für mindestens sechs Monate und vorzugsweise bis zu 36 und 60 Monate stabil und können bei Temperaturen im Bereich von –100°C bis 40°C, von –20°C und 37°C und von 2°C bis 8°C gelagert werden. Die Konzentrationen der Exzipienten sehen eine kombinierte Osmolalität von etwa 250 bis 420 milliosmolal vor. Bevorzugte Formulierungen schließen Faktor IX Konzentrationen im Bereich von etwa 2 bis größer als 160 mg/ml (bis größer als 56000 U/ml) ein, mit Natriumcitrat als Puffer; einer Kombination aus Mannitol, Sucrose, Arginin und Glycin als Kryoschutzmittel und Tonizitätsmodifikatoren und gegebenenfalls kleinen Mengen eines Chelatbildners wie EDTA (ca. 1 bis 5 mM) und/oder kleinen Mengen Polysorbat (0,005% bis 0,02%.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eine Argininkonzentration von etwa 130 bis 160 mM, eine Sucrosekonzentration von etwa 0 bis 60 mM und eine Surfactantkonzentration von etwa 0 bis 0,005% umfassen; alternativ beträgt besagte Argininkonzentration etwa 60 bis 70 mM, besagter Puffer ist etwa 0 bis 20 mM Sucrose und 165 mM Mannitol und besagte Surfactantkonzentration beträgt 0 bis 0,005%. In einer weiteren Zusammensetzung beträgt die Argininkonzentration etwa 160 mM, besagte Sucrosekonzentration beträgt etwa 0 mM, besagte Citratkonzentration beträgt etwa 15 mM und besagte Surfactantkonzentration beträgt etwa 0%; ober besagte Argininkonzentration beträgt etwa 70 mM, besagte Mannitolkonzentration beträgt etwa 165 mM, besagte Citratkonzentration beträgt etwa 15 mM und besagter Surfactant oder Chelatbildner beträgt etwa 0%.
Weitere Zusammensetzungen umfassen hochgradig konzentrierten Faktor IX und Arginin, einen Puffer und Sucrose oder Mannitol in Formulierungen, welche umfassen:
etwa: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX,
130 bis 235 mM Arginin und
7,5 bis 40 mM Citrat.
etwa: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX,
66 bis 90 mM Arginin,
110 bis 165 mM Mannitol und
7,5 bis 40 mM Citrat.
etwa: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX,
70 mM Arginin,
165 mM Mannitol und
15 mM Citrat.
etwa: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX,
160 mM Arginin und
15 mM Citrat.
Wo der Surfactant Polysorbat ist, umfasst eine alternative Zusammensetzung etwa:
2 bis 160 mg/ml Faktor IX,
130 bis 235 mM Arginin,
0 bis 60 mM Sucrose
0 bis 0,005% Polysorbat und
7,5 bis 40 mM Citrat.
Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung einer Zusammensetzung wie oben beschrieben für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Erhöhen der Faktor IX Konzentration vor, wobei vorzugsweise die besagte pharmazeutische Zusammensetzung so entworfen ist, dass sie sowohl intravenös, als auch subkutan verabreicht werden kann.
Auch werden Verfahren zur Verabreichung von hochgradig konzentriertem Faktor IX unter Verwendung von sowohl intravenösen, als auch subkutanen Wegen vorgesehen, z. B. eine intravenöse Dosis, gefolgt von einer subkutanen Dosis.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet, schließt Faktor IX sowohl von Plasma hergeleitetes, als auch rekombinant oder synthetisch hergestelltes ein. Die Faktor IX Konzentration wird bequem als mg/ml oder als U/ml ausgedrückt, wobei 1 mg üblicherweise > 150 U ± 100 U oder mehr repräsentiert. Eine Wirksamkeitseinheit wird definiert als Menge von Faktor IX Gerinnungswirksamkeit in einem Milliliter von normalem menschlichen Plasma. Die spezifische Wirksamkeit ist das Verhältnis von Gerinnungswirksamkeitskonzentration zu Proteinkonzentration, ausgedrückt als U/mg Protein. Patienten mit Hämophilie haben im Allgemeinen von < 1 bis 25% des Faktor IX Gerinnungsfaktors, wie er in normalem menschlichen Plasma gefunden wird.
Wie hierin verwendet verstehen sich die spezifizierten Mengen als ± etwa 10%, z. B. etwa 50 mM schließt 50 mM ± 5 mM ein; z. B. 4% schließt 4% ± 0,4% ein usw.
Wie hierin verwendet schließt der Begriff „Tonizitätsmodifikator" Wirkstoffe ein, welche zur Osmolalität der Lösung beitragen. Beispiele für Tonizitätsmodifikatoren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Aminosäuren wie Arginin, Histidin und Glycin, Salze wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Natriumcitrat und Saccharide wie Sucrose, Glucose und Mannitol und Ähnliches.
Der Begriff „Kryoschutzmittel" schließt allgemein Wirkstoffe ein, welche dem Protein Stabilität vor durch Gefrieren herbeigeführte Spannung verleiht; jedoch können Kroyschutzmittel auch allgemeine Stabilität vorsehen, zum Beispiel für Massearznei-Formulierungen während der Lagerung vor nicht durch Gefrieren herbeigeführte Spannungen. Bespielhafte Kryoschutzmittel schließen Polyole und Saccharide wie Mannitol und Sucrose ein, als auch Surfactanten wie Polysorbat oder Polyethylenglycol und Ähnliches. Während bevorzugte Konzentrationen an Kroyschutzmitteln von etwa 0,2 bis 4% (Gewicht/Volumen) reichen, sind relativ hohe Konzentrationen, zum Beispiel größer als 5% ebenfalls geeignet; die verwendeten Grade werden nur durch jene begrenzt, welche üblicherweise in der klinischen Praxis verwendet werden. Die oberen Konzentrationsgrenzen für Massearznei können höher sein, als für Fertigdosierungen, z. B. größer als 5%. „Surfactanten" schließt allgemein jene Wirkstoffe ein, welche das Protein vor durch Luft/Lösung-Grenzfläche herbeigeführte Spannungen und durch Lösung/Oberfläche herbeigeführte Spannungen schützt (was z. B. Proteinaggregation ergibt) und kann Detergenzien wie Polysorbat-80 (Tween), zum Beispiel etwa 0,005 bis 1% (Volumen/Volumen) oder Polyethylenglycol (PEG) wie zum Beispiel PEG8000 einschließen. Gegebenenfalls sind relativ hohe Konzentrationen, z. B. bis zu 0,5% zum Beibehalten von Proteinstabilität geeignet, jedoch werden die in der tatsächlichen Praxis verwendeten Grade üblicherweise durch die klinische Praxis eingeschränkt.
Der Begriff „Puffer" umfasst jene Wirkstoffe, welche den pH der Lösung in einer annehmbaren Bandbreite halten, und kann Histidin, Phosphat (Natrium oder Kalium), Citrat (Natrium oder Kalium), Maleinsäure, Ammoniumacetat, Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), Diethanolamin und Ähnliches einschließen. Die oberen Konzentrationsgrenzen können für Massenprotein höher sein, als für Fertigdosierung-Proteinformen, wie leicht durch einen Fachmann erkannt wird. Zum Beispiel während Pufferkonzentrationen von mehreren millimolar bis zur oberen Grenze ihrer Löslichkeit reichen können, z. B. Citrat könnte so hoch wie 200 mM sein, würde es der Fachmann ebenfalls bedenken, eine physiologisch angemessene Konzentration sowohl zu erreichen, als auch zu halten. Die Prozentsätze sind Gewicht/Volumen, wenn sie sich auf Feststoffe beziehen, die in Lösung gelöst sind, und Volumen/Volumen, wenn sie sich auf Flüssigkeiten beziehen, die in Lösungen gemischt sind. Zum Beispiel ist es für Sucrose das Trockengewicht Sucrose/Lösungsvolumen und für Tween ist es das Volumen von 100 Ausgangsmatrial/Lösungsvolumen. Der Begriff „isotonisch mit Serum" 300 ± 50 milliosmolal bedeutet ein Maß der Osmolalität der Lösung vor Verabreichung. Beibehalten der physiologischen Osmolalität ist wichtig, damit die Dosierungsformulierungen ohne vorherige Verdünnung injizierbar sind. Jedoch können für Masseformulierungen viel höhere Osmolaliltäten wirksam genutzt werden, solange die Lösung vor der Verwendung isotonisch gemacht wird. Der Begriff „Exzipienten" schließt pharmazeutisch annehmbare Reagenzien ein, um angemessene Tonizität, Kryoschutz des Proteins, Beibehaltung des pH und richtige Konformation des Proteins während der Lagerung vorzusehen, so dass wesentliche Erhaltung von biologischer Wirksamkeit und Proteinstabilität beibehalten bleibt.
Wirkung von Calciumionen
Die Herstellung von rekombinantem Faktor IX ist in USPN 4770999, Kaufman et al., beschrieben worden. Ein geeignetes Reinigungsverfahren ist das, welches in Hrinda et al., Preclinical Studies of a Monoclonal Antibody-Purified factor IX, Mononine^TM Seminars in Hematology, 28(3): 6 (Juli 1991) beschrieben wurde. Weiter Herstellungsverfahren schließen die Verwendung von Konformations-spezifischen monoklonalen Antikörper ein, wie durch Tharakan et al., „Physical and biochemical properties of five commercial resins for immunoaffinity purification of factor IX", Journal of Chromatograpy 595. 103–111 (1992); und durch Liebman et al., „Immunoaffinity purification of factor IX (Christmas factor) by using conformation-specific antibodies directed against the factor IX-metal complex" Proc. Nat. Acad. Sci., USA 82: 3879–3883 (1985) beschrieben; als auch durch herkömmliche chromatographische Verfahren wie zum Beispiel durch Hashimoto et al., „A Method for Systematic Purification from Bovine Plasma of Six Vitamin K-Dependent Coagulation Factors: Prothrombin, Factor X, Factor IX, Protein C and Protein Z", J. Biochem. 97: 1347–1355 (1985) und Bajaj, P. et al., Prep. Biochem. 11: 397 (1981), „Large-scale preparation and biochemical characterization of a new high purity factor IX concentrate prepared by metal chelate affinity chromatography", P. A. Feldman et al., Blood Coagulation and Fibrinolysis 5: 939–948 (1994) beschrieben. Noch ein weiteres Reinigungsverfahren wird in USSN 08/472823, eingereicht 7. Juni 1995 beschrieben und hierin durch Verweis eingeschlossen.
Eine gut gekennzeichnete Eigenschaft von Faktor IX ist seine Fähigkeit, Ca²⁺ Ionen zu binden. Strukturstudien zeigen an, dass Ca²⁺-Bindung eine stabilere Struktur verleihen kann, wobei die Möglichkeit molekularer Bewegung verringert wird („Structure of the Metal-free γ-Carboxyglutamic Acid-rich Membrane Binding Region of Factor IX by Two-dimensional NMR Spectroscopy", S. J. Freedman, B. C. Furie, B. Furie und J. D. Baleja, J. Biol. Chem. 270(14): 7980–7989 (1995); „Structure of the Calcium Ion-Bound γ-Carboxyglutamic Acid-Rich Domain of Factor IX.", S. J. Freedman, B. C. Furie, B. Furie, und J. D. Baleja, Biochemistry 34: 12126–12137 (1994): „The Structure of a Ca²⁺-Binding Epidermal Growth Factor-like Domain: Its Role in Protein-Protein Interactions", S. Rao., P. Handford, M. Mayhew, V. Knott, G. Brownlee und D. Stuart, Cell 82: 131–141 (1995); „Structure of Ca²⁺ Prothrombin Fragment 1 Including the Conformation of the Gla Domain", M. Soriano-Garcia, C. H. Park, A. Tulinsky, K. G. Ravichandran und E. Skrzypczak-Jankun, Biochem. 28: 6805–6810 (1989)). Vermutlich entspricht weniger Mobilität einer niedrigeren Wahrscheinlichkeit von molekularer Interaktion, wodurch sich die Wahrscheinlichkeit von Abbauprozessen verringert. Überraschend stellt sich heraus, dass dies nicht der Fall ist.
Proben werden in den in Tabelle 1 unten dargestellten Formulierungen bei einer Konzentration von rekombinantem Faktor IX Protein von –0,5 mg/ml (100 U/ml) und eine Osmolalität von 300 ± 50 milliosmolal hergestellt. Alle Proben enthalten eine rekombinante Form von Faktor IX. Um den potentiellen Nutzen von Ca²⁺ als Stabilisator zu untersuchen, wurde ein Probensatz in den in Tabelle 1 aufgelisteten Formulierungen hergestellt. Die Formulierung von Probe A ist die Formulierung, welche für kommerziell erhältlichen, von Plasma abgeleiteten, lyophilisierten Faktor IX (Mononine^TM) verwendet wird. Alle Proben enthalten eine rekombinante Form von Faktor IX.
Tabelle 1 Probenformulierungen
Proben von Faktor IX in jeder Formulierung wurden bei 4°C für 2,5 Monate gelagert. Die Proben wurden bezüglich Proteinkonzentration und Gerinnungswirksamkeit getestet. Faktor IX Wirksamkeit wird gemäß dem Verfahren von Pittman, D. et al., Blood 79: 389–397 (1992) unter Nutzung von Faktor IX armem Blut bestimmt. Das Verhältnis von Gerinnungswirksamkeit zu Proteinkonzentration, die spezifische Wirksamkeit, welche in Einheiten/mg Protein ausgedrückt wird, wird in Tabelle 2 angegeben. Eine annehmbare spezifische Wirksamkeit ist eine, die im Allgemeinen nicht mehr als 20% höher ist, als die anfängliche spezifische Wirksamkeit, weil eine ungewöhnlich hohe spezifische Wirksamkeit ein Aktivierungs-ähnliches Ereignis anzeigen kann, was thrombotische Implikationen haben kann.
Tabelle 2 Faktor IX spezifische Wirksamkeit
Die Proben, welche Calcium enthalten, also Proben C, E und G, haben höhere spezifische Wirksamkeit nach 2,5 Monaten Lagerung. Dies ist Folge der Inklusion von Ca²⁺ und zeigt an, dass sich der Faktor IX einer Umwandlung zu einem aktivierten-ähnlichen Molekül unterzogen hat. Aktivierter Faktor IX ist Faktor IX, der bei Resten R¹⁴⁵-A¹⁴⁶ und R¹⁸⁰-V¹⁸¹ gespalten wurde und dann in der Lage ist, Gerinnung zu katalysieren. Normalerweise zirkuliert Faktor IX als intaktes Protein und wird nicht in seine aktivierte Form umgewandelt, sofern es keine Initiation der Gerinnungskaskade gibt. Wenn man jemandem aktiviertes rhFIX injiziert, könnte dies thrombotische Implikationen haben. Daher ist Inklusion von Ca²⁺ bei einer Konzentration von 5 mM destabilisierend und muss vermieden werden.
Wirkungen der Pufferwahl auf BMW-Bildung
Die durchschnittliche spezifische Wirksamkeit nach acht Monaten Lagerung bei 40°C von Proben, formuliert in Puffer/Exzipient Kombinationen ähnlich und einschließlich jenen in Tabelle 1, aber ohne Calcium, bei pH 7,0 bis 112,5 ± 10,5 U/mg aber bei pH 7,5 ist nur 84,0 ± 22,1 U/mg, was anzeigt, dass feine Verschiebungen beim pH für das Beibehalten der Langzeit Faktor IX Stabilität signifikant sind.
Faktor IX wird in einem Satz isotonischer experimenteller Formulierungen wie in Tabelle 3 zusammengefasst hergestellt, einschließlich mehrerer unterschiedlicher Exzipient-Kombina tionen für jeden Puffer und einigen, welche weniger als 5 mM EDTA einschließen. Die Faktor IX Konzentrationen betragen etwa 1 mg/ml (Durchschnitt 161 U/ml). Die Proben werden bezüglich der Menge an vorhandenem Material mit hohem Molekulargewicht (HMW) und bezüglich Gerinnungswirksamkeit getestet. Die Bildung von signifikanten (> 3%) Mengen an HMW ist unerwünscht und weist auf physikalischen Abbau von Faktor IX mit möglichem Einfluss auf Produktsicherheit und Wirksamkeit hin. HMW ist insbesondere für subkutane Verabreichung unerwünscht, da aggregierte Proteine immunogener sind, wenn sie subkutan gegeben werden. Morein, B. und K. Simons, Vaccine 3: 83. Subunit vaccines against enveloped viruses: virosomes, micelles, and other protein complexes (1985); und Antibodies: A laboratory manual, (Seite 100), E. Harlow und D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Tabelle 3 Probenformulierung
Tabelle 4 zeigt die Wirkungen der unterschiedlichen Puffer auf HMW Erzeugung, wie durch Größen-Exklusionschromatographie (SEC-HPLC) gemessen. Die Proben wurden bei 3 sechs Wochen gelagert. Tabelle 4 gibt den durchschnittlichen Anstieg an, ausgedrückt als (HMW/Gesamtprotein × 100%) bei sechs Wochen minus dem bei Zeit Null.
Tabelle 4 Prozentualer Anstieg der HMW-Erzeugung
Die mit Citrat gepufferten Proben hatten im Durchschnitt die kleinste Menge an erzeugtem HMW, ungeachtet der weiteren eingeschlossenen Exzipienten. Ein angemessener Puffer erlaubt keinen Anstieg größer als 2%.
Aggregate sind gewöhnlich als immunogener, als monomere Proteine bekannt und sind allgemein für eine intravenöse Formulierung nicht annehmbar. Jedoch sind Aggregate für subkutane, intradermale oder intramuskuläre Formulierung noch unerwünschter, weil diese Verabreichungswege noch wahrscheinlicher eine Immunresponse erzeugen.
Alle Proben werden für sechs Monate bei 4°C weiter gelagert und bezüglich Gerinnungswirksamkeit getestet. Die durchschnittliche Menge an Wirksamkeit, welche für Proben verblieb, welche die verschiedenen Saccharide enthielten, variierte stark; Sucrose-enthaltende Proben behielten durchschnittlich 71% der Anfangswirksamkeit, Mannitol 53%, Glucose 52% und Mannose nur 27%. Überraschend sind nicht alle Saccharide gleich wirksam beim Erhalten der Faktor IX Wirksamkeit, trotz Zugabe weiterer Exzipienten.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Praxis der Erfindung. Diese Beispiele dienen nur veranschaulichenden Zwecken und sind nicht beabsichtigt, den Umfang der beanspruchten Erfindung in irgend einer Weise einzuschränken. Beispiel 1 veranschaulicht die Verwendung der Erfindung für höhere Konzentrationen von Faktor IX. Beispiel 2 veranschaulicht die Komplexität von Exzipient-Interaktionen beim Stabilisieren von Faktor IX. Beispiel 3 beschreibt Faktor IX in verschiedenen Formulierungen bezogen auf Frost/Tau-Stabilität. Beispiel 4 beschreibt die Wirkungen von Langzeitlagerung und Beispiele 5 und 6 veranschaulichen hochgradig konzentrierte Formen und ihre Verwendung.
Beispiel 1: Stabilität bei hoher Konzentration
Ein weiterer Satz Formulierungen wird hergestellt, welcher hohe Konzentrationen an Faktor IX umfasst; die Proben werden in den in Tabelle 5 aufgelisteten Formulierungen bei einer Konzentration von 8 mg/ml (2000 U/ml) hergestellt. Alle enthalten 15 mM Natriumcitrat und sind bei pH 6,8 gepuffert, ohne Surfactant. BG4 ist leicht hypertonisch, der Rest ist isotonisch.
Tabelle 5 Probenformulierungen
Die Proben werden in sowohl Glasvialen, als auch vorgefüllten Glasspritzen für acht, zehn und dreizehn Monate bei 4°C gelagert, um zu bestimmen, ob die Menge an Luft/Lösung Grenzfläche oder siliconisierte Stopper/Lösung Grenzfläche die Stabilität des Produkts beeinträchtigen würde. Zu allen drei Zeitpunkten werden keine signifikanten Unterschiede durch irgend einen Stabilitätstest zwischen den Vialen und Spritzen gesehen. Die Ergebnisse von mehreren analytischen Verfahren werden in Tabelle 6 gezeigt. „Rückgewinn an Wirksamkeit" betrifft die Menge an Gerinnungswirksamkeit, welche in der Probe verbleibt, ausgedrückt als Prozentsatz der Menge an Gerinnungswirksamkeit zur „Zeit Null", dem Beginn der Studie. „HMW" wird supra beschrieben. „SDS-PAGE" ist Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese; Gels werden gescannt und Bänder quantifiziert. Umkehrphasen-HPLC wird verwendet, um Produktheterogenität zu bewerten und Veränderungen in Peak-Verhältnissen können Veränderungen im Produkt anzeigen, zum Beispiel Oxidation von Oligosacchariden.
Tabelle 6
Selbst bei dieser hohen Konzentration von Faktor IX (8 mg/ml; 2000 U/ml) sind diese Formulierungen wirksam. Der Anstieg in beobachteter Wirksamkeit für bestimmte Proben bei 13 Monaten bezogen auf die Kontrolle ist innerhalb der Variabilität des Tests.
Beispiel 2: Exzipienten-Interaktionen
Ein weiterer Satz an Faktor IX Formulierungen, welche alle Citrat enthalten, wird wie in Tabelle 7 zusammengefasst hergestellt. Alle Formulierungen sind isotonisch, enthalten Faktor IX bei Konzentrationen von 1 bis 2 mg/ml (durchschnittlich 208 bis 481 U/ml), verwenden 10 mM bis 15 mM Natriumcitrat als pH Puffer und sind auf pH 6,8 eingestellt.
Tabelle 7 Probenformulierung
Die Proben werden bei 4°C gelagert und zu mehreren Zeitpunkten getestet. Nach acht Monaten bei 4°C Lagerung behielten neun Proben 100% der Gerinnungswirksamkeit des Ausgangsmaterials. Die Formulierungen dieser Neun werden in Tabelle 8 gezeigt (alle schließen 15 mM Natriumcitrat ein, haben einen pH von 6,8 und sind isotonisch).
Tabelle 8
Mehrere Formulierungen, welche ähnliche Exzipienten in ähnlichen Verhältnissen enthalten, behalten dennoch überraschenderweise ihr Gerinnungswirksamkeit nicht annähernd so gut. Zum Beispiel ergab 2,3% Glycin allein nur 86%; und 4% Sucrose, 2% Arginin, beide mit und ohne Tween und mit und ohne EDTA ergaben 87–89% Gerinnungswirksamkeit.
Für die neun Formulierungen von Tabelle 8 werden die Ergebnisse von weiteren Stabilität-anzeigenden Tests gezeigt. Spezifische Wirksamkeit wird als U/mg ausgedrückt und ein annehmbarer Bereich ist 200 bis 350 U/mg. SEC-HMW ist ein Maß für Aggregate mit hohem Molekulargewicht, wie durch Größen-Exklusionschromatographie bestimmt; weniger als 1% wird für eine subkutane, intradermale oder intramuskuläre Formulierung bevorzugt. „C-Terminal-Clips" ist ein Maß für Abbauarten wie durch Umkehrphasenchromatographie bestimmt; weniger als 1% wird bevorzugt.
Tabelle 9
Basierend auf den in Tabellen 8 und 9 dargestellte bevorzugten Formulierungen schließen zwei bevorzugtere Formulierungen Folgendes ein: (beide sind bei pH 6,8 mit 15 mM Citrat gepuffert und sind isotonisch), 3% Mannitol, 1,5% Arginin-HCl und 3,3% Arginin-HCl.
Beispiel 3: Wirkungen von Frost/Tau-Wechsel
Idealerweise wird eine ähnliche Formulierung für Masseprotein genutzt, wie sie für die Fertigdosierungsform verwendet wird. Dies erfordert, dass die gleiche Formulierung, die Faktor IX vor Langzeitlagerungsspannungen stabilisiert, auch zum Stabilisieren von Faktor IX gegenüber den Spannungen angemessen ist, welche normalerweise durch Masseprotein angetroffen werden, wie Gefrieren und Tauen.
Die Proben werden in den Formulierungen hergestellt, welche in Tabelle 10 unten dargestellt werden, bei einer Proteinkonzentration von ~2 mg/ml (500 U/ml) und Osmolalität von 300 ± 50 milliosmolal. Alle schließen 10 mM Natriumcitrat, pH 6,8 ein und alle werden sowohl mit, als auch ohne 0,005% Tween-80 (Polysorbat) hergestellt.
Tabelle 10 Probenformulierungen
Proben von Faktor IX in jeder Formulierung wurden fünf Frost/Tau-Wechseln unterworfen, um Anfälligkeit gegenüber durch Forst herbeigeführte Denaturierung zu bestimmen, welche Bildung von Proteinaggregaten ergeben kann. Eine Folge von Frost/Tau-Wechseln ist ein brauchbarer Indikator für die Anfälligkeit eines Proteins, Aggragatbildung zu erhöhen, wie es während Gefrieren und Langzeitlagerung beobachtet werden kann. Die Proben werden hinsichtlich der Menge an vorhandenem HMW getestet. Proben mit und ohne Tween-80 (0,005%) haben eine minimale Aggregation (weniger als 0,15% HMW Anstieg).
Basierend auf den Daten hierin werden die folgenden beiden Formulierungen (ausgedrückt als Bandbreiten an Bestandteilen) ebenfalls bevorzugt.
Beispiel 4: Wirkung von Langzeitlagerung bei 4°C
Faktor IX wird bei 2 mg/ml (500 U/ml) in 15 mM Natriumcitrat (0,38%), 0,16 M Arginin (3,3%), pH 6,8 formuliert und für ein Jahr bei 4°C gelagert. Die Rückgewinnung der Wirksamkeit beträgt 95% und das %-HMW ist 0,32%. Faktor IX wird bei 2 mg/ml in 15 ml Natriumcitrat, 3% Mannitol, 1,5% Arginin, pH 6,8 formuliert und für ein Jahr bei 4°C gelagert. Die Rückgewinnung der Wirksamkeit beträgt 76% und das %-HMW war 0,36%. Der Wirksamkeitsverlust wird Entamidierung zugeschrieben.
Faktor IX wird bei 2 mg/ml in 15 mM Natriumcitrat, 1% = 29 mM Sucrose, 3% = 0,14 M Arginin HCl formuliert und für ein Jahr bei 4°C gelagert. Die Rückgewinnung der Wirksamkeit beträgt 86% und das %-HMW ist 0,27.
Beispiel 5: Wirkungen von hoher Proteinkonzentration und von Frost-Tau
Faktor IX wird bei 4000 U/ml, 8000 U/ml, 16000 U/ml und mehr als 30000 U/ml (also 16 bis mehr als 120 mg/ml) in 10 mM Histidin, 260 mM Glycin, 1% Sucrose, 0,005% Tween-80, pH 7,0 formuliert. Faktor IX wird durch Zentrifugalkonzentration in einem Centricon-10 und durch Rühr-Zellkonzentration in einer Amicon Rührzelle unter Verwendung einer YM-10 Membran konzentriert. Weitere Verfahren, welche zum Konzentrieren von Proteinen verwendet werden, insbesondere jene, welche Membranen verwenden, welche Arten zurückhalten und ausschließen, basierend auf Molekulargewicht, wie Filtration mit Tangentialströmung, können ebenfalls verwendet werden. Zusätzlich kann Sprühtrocknen ohne ungünstige Wirkungen verwendet werden.
Überraschenderweise wird kein nachweisbares aggregiertes Protein (HMW wie durch SEC-HPLC bestimmt) erzeugt, selbst bei diesen außergewöhnlich hohen Proteinkonzentrationen.
Die Proben werden nachfolgend wiederholt gefroren und getaut und behalten überraschenderweise noch annehmbare Grade von HMW (≤ 1%). Dies ist in Anbetracht der kommerziell erhältlichen, von Plasma abgeleiteten Faktor IX Produkte wie Mononine^TM und Alphanine^TM (supra auf Seite 3, Zeilen 20–29) überraschend, welche häufig 10% oder mehr HMW enthalten, obwohl die Faktor IX Konzentration ziemlich niedrig ist. Solche ein hoher % HMW ist für subkutane, intradermale oder intramuskuläre Verabreichung aufgrund des Potentials für Immunogenizität unannehmbar.
Ferner werden, wenn Faktor IX in der gleichen Formulierung wie Mononine^TM formuliert wird und wiederholten Frost/Tau-Wechseln unterworfen wird, signifikante Mengen (~15%) HMW erzeugt. Diese Daten zeigen zusammen mit den in Beispiel 3 gezeigten Daten die überraschenden und unvorhergesehenen Wirkungen von Formulierung auf die Stabilität von Faktor IX.
Beispiel 6: Verwendung von hochgradig konzentriertem Faktor IX
Hochgradig konzentrierter Faktor IX ist wirksam, wenn er subkutan, intradermal oder intramuskulär verabreicht wird. Unter Nutzung einer hochgradig konzentrierten Formulierung von Faktor IX, also 4000 U/ml bis mehr als 56000 U/ml ist eine subkutane Injektion an einer einzelnen Stelle mit niedrigem Volumen möglich, wie unten beschrieben.
Drei experimentelle Gruppen wurden unter Verwendung von Faktor IX bei einer Konzentration von 4000 IU/ml in 260 mM Glycin, 10 mM Histidin, 29 mM (1%) Sucrose und 0,005% Polysorbat bewertet. In Gruppe I wurde Hunden 200 U/kg (0,05 ml/kg) Faktor IX intravenös gegeben. In Gruppe II wurde Hunden 200 U/kg (0,05 ml/kg) Faktor IX subkutan gegeben. In Gruppe III wurde Hunden eine Faktor IX intravenöse Initialdosis von 50 U/kg (0,0125 ml/kg) gegeben, gefolgt von einer 200 U/kg (0,05 ml/kg) subkutanen Dosis 24 Stunden später. Intravenöser Faktor IX erzeugte eine 240 Faktor IX Wirksamkeit (wo 100% = Standard von gepooltem menschlichen Plasma) innerhalb von fünf Minuten nach der Injektion, welche auf 6,4% bis Tag 5 sank. Subkutane Faktor IX Wirksamkeit betrug 0,9% bei 5 Minuten, 10% bei drei Stunden und 5,8% an Tag 5. Die Kombination einer intravenösen Ladungsdosis, gefolgt von einer subkutanen Dosis 24 Stunden später, ergab eine Plasma Faktor IX Wirksamkeit von 25% drei Stunden nach der subkutanen Dosis und eine Faktor IX Wirksamkeit von 9,1% an Tag 5 nach der subkutanen Injektion. Die biologische Verfügbarkeit der subkutanen Dosis wurde als 43% errechnet. Subkutanes Faktor IX erzeugt therapeutische Grade von Faktor IX Wirksamkeit in weniger als drei Stunden nach Verabreichung. Die Kombinationsdosis aus einer intravenösen mit einer subkutanen Dosis sieht sofortigen Koagulanzschutz vor und verbessert die Wirksamkeit der subkutanen Dosis. Auch können hochgradig konzentrierte Formen von Faktor IX in den supra beschriebenen Formulierungen in Beispielen 1–3 formuliert und wirksam für Verabreichung verwendet werden.
Während die vorliegende Erfindung bezüglich spezifischer Verfahren, Formulierungen und Zusammensetzungen beschrieben worden ist, versteht es sich, dass den Fachleuten bei Betrachtung der vorliegenden Erfindung Variationen und Modifikationen einfallen werden.
Es wird erwartet, dass den Fachleuten zahlreiche Modifikationen und Variationen der Erfindung wie in den obigen veranschaulichenden Beispielen beschrieben, einfallen werden, und demzufolge sollten darauf nur solche Einschränkungen auferlegt werden, wie sie in den angehängten Ansprüchen erscheinen. Entsprechend ist es in den angehängten Ansprüchen beabsichtigt, alle solchen äquivalenten Variationen abzudecken, welche innerhalb des Umfangs der Erfindung wie beansprucht fallen.

Claims

Zusammensetzung, welche hochgradig konzentrierten Faktor IX und Arginin, eine Puffersubstanz und Saccharose oder Mannitol umfasst, worin die Faktor IX Konzentration etwa 2 bis etwa 160 mg/ml beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin besagte Puffersubstanz Citrat, Maleinsäure, Ammoniumacetat, Phosphat, Histidin, Tris- oder Diethanolamin ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, welche ferner einen Surfactanten oder einen Chelatbildner umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin besagte Argininkonzentration etwa 130 bis 160 mM, etwa 130 bis 235 mM oder etwa 60 bis 70 mM beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin besagte Argininkonzentration etwa 160 mM beträgt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin besagte Saccharosekonzentration etwa 3 bis 60 mM beträgt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, worin besagte Citratkonzentration etwa 1 bis 40 mM beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin besagte Citratkonzentration etwa 15 mM beträgt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, worin besagter Surfactant Polysorbat ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, worin besagte Polysorbatkonzentration etwa 0,005 bis 1% beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin besagte Argininkonzentration etwa 130 mM bis 160 mM beträgt, besagte Saccharosekonzentration etwa 0 bis 60 mM beträgt und besagte Surfactantkonzentration etwa 0 bis 0,005 beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin besagte Argininkonzentration etwa 60 bis 70 mM beträgt, die Saccharosekonzentration etwa 0 bis 20 mM beträgt, die Mannitolkonzentration 165 mM beträgt und besagter Surfactant 0 bis 0,005% beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin besagte Argininkonzentration etwa 160 mM beträgt, besagte Saccharosekonzentration etwa 0 mM beträgt, besagte Citratkonzentration etwa 15 mM beträgt und besagte Surfactantkonzentration etwa 0% beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin besagte Argininkon zentration etwa 70 mM beträgt, besagte Mannitolkonzentration etwa 165 mM beträgt, besagte Citratkonzentration etwa 15 mM beträgt und besagter Surfactant oder Chelatbildner 0% beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, welche etwa umfasst: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX, 130 bis 235 mM Arginin und 7,5 bis 40 mM Citrat.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, welche etwa umfasst: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX, 130 bis 235 mM Arginin, 0 bis 60 mM Saccharose 0 bis 0,005 Polysorbat und 7,5 bis 40 mM Citrat.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, welche etwa umfasst: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX, 66 bis 90 mM Arginin, 110 bis 165 mM Mannitol und 7,5 bis 40 mM Citrat.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche etwa umfasst: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX, 70 mM Arginin, 165 mM Mannitol und 15 mM Citrat.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, welche etwa umfasst: 2 bis 160 mg/ml Faktor IX, 160 mM Arginin und 15 mM Citrat.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Erhöhen von Faktor IX Konzentration.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei besagte pharmazeutische Zusammensetzung konstruiert wird, um sowohl intravenös, als auch subkutan verabreicht zu werden.