JP2577744B2

JP2577744B2 - 安定な顆粒球コロニ−刺激因子含有製剤

Info

Publication number: JP2577744B2
Application number: JP62178035A
Authority: JP
Inventors: 実町田
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-07-18
Filing date: 1987-07-16
Publication date: 1997-02-05
Anticipated expiration: 2012-02-05
Also published as: JPS63146829A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、顆粒球コロニー刺激因子含有製剤に関し、
特に保存中の活性成分の損失、不活性化あるいは分解等
を有利に防止し、有効成分を安定化した顆粒球コロニー
刺激因子含有製剤に関するものである。

従来の技術最近、各種感染症の化学療法においては、耐性菌発
生、原因菌の交代現象、あるいは高い副作用などが臨床
的に重大な問題となっており、そのため、抗生物質、抗
菌剤等による上記の如き化学的療法とは別に感染菌宿主
の防禦機能を活性化するような物質を用いることによ
り、上記化学療法の根本的な問題の解決を図ろうとする
動きがある。即ち、例えば細菌感染の初期には宿主のも
つ防禦機能のうちで白血球の貧食殺菌作用が最も強く影
響すると考えられており、そこで好中球の増殖、分化成
熟を促進することにより宿主の感染防禦機能の亢進を図
ることが重要と考えられる。このような作用を示す極め
て有用な物質の一つとして顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ
−CSF）があり、既にこれを用いた感染防禦剤が本出願
人によって別途特許出願されている（特願昭60−23777
号）。

発明が解決しようとする問題点上記の如く、各種化学療法においては、各種の回避し
得ない問題があり、そのために被感染体即ち宿主の防禦
機能を賦活化し得るように物質を薬剤として用いる試み
がなされている。

Ｇ−CSFは勿論、それ自身に宿主の防禦機能を賦活化
する活性を有し、臨床上の治療効果をさらに十分に発揮
すべく、上述した薬剤との併用の場合に於ても、その目
的を遂行する上で、極めて有用であることが判明した。

このＧ−CSFは極めて微量で使用され、通常成人一人
当たり、0.1〜500μｇ（好ましくは５〜50μｇ）のＧ−
CSFを含有する製剤を１〜７回／週の割合で投与する。
しかしながら、Ｇ−CSFは不安定で、例えば温度、湿
度、酸素、紫外線等の外的因子の影響を受けやすく、そ
の結果として会合、重合あるいは酸化分解などの物理
的、化学的変化を生じ、大きな活性の低下を招く。この
ことは極めて微量の投与量のＧ−CSFを、しかも極めて
正確に投与しようとする治療行為の完全に遂行できなく
するばかりか、有効成分の損失を予め見積もって余分に
医薬中に添加しておかなければならないことを意味す
る。

そこで、このような問題点に解決し、有効成分の活性
の低下を十分に防止できる製品を開発する必要がある。
本発明の目的はこのような点にある。即ち、安定なＧ−
CSF含有製剤を提供することである。

問題点を解決するための手段本発明は上記目的とするＧ−CSF含有製剤の安定性を
改善すべく種々検討・研究した結果、製薬上許容される
アミノ酸、含硫還元剤、酸化防止剤もしくはこれらの混
合物を添加することが有効であることを見出し、本発明
を完成した。

即ち、本発明の安定なＧ−CSF含有製剤は、有効成分
としてＧ−CSFを含有し、製薬上許容されるアミノ酸、
含硫還元剤および酸化防止剤から成る群から選ばれる少
なくとも１種を含むことを特徴とする。

また、本発明で使用するＧ−CSFは、例えば既に出願
されている特願昭59−153273号、同60−269455号、同60
−269456号、同60−270838号、同60−270839号明細書に
記載の各種方法に従って得ることができ、例えばヒトＧ
−CSFは口腔底癌患者の腫瘍細胞から採取した細胞株（C
NCM受託番号「Ｉ−315」、同「Ｉ−483」）の培養によ
り、あるいは更にヒトＧ−CSFをコードする遺伝子を用
いて組換体DNAを作製し、これを適当な宿主細胞（例え
ば大腸菌、Ｃ−127細胞、チャイニーズハムスターの卵
巣細胞等）で発現させるなどによって得ることができ
る。

本発明におけるＧ−CSFとしては高純度に精製された
ヒトＧ−CSFであれば全て使用できるが、ヒトＧ−CSF産
生細胞を培養して得られる培養上清から単離して得られ
るもの及びヒトＧ−CSF活性を有するポリペプチドをコ
ードする遺伝子を組み込んだ組換えベクターで宿主を形
質転換して得られる形質転換体が産生する、ヒトＧ−CS
F活性を有するポリペプチドまたは糖蛋白質が好まし
い。

具体的には、次の（ｉ）及び（ii）で示すＧ−CSFが
特に好ましく用いられる。

（ｉ）次の理化学的性質を有するヒトＧ−CSF。

分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法による測定で約19,000±1,000。

等電点:pI＝5.5±0.1、pI＝5.8±0.1、pI＝6.1±0.1
の三つの等電点のうち少なくとも１つを有する。

紫外部吸収:280nmに極大吸収を有し、250nmに極小値
をもつ。

Ｎ末端から21残基目迄のアミノ酸配列が次の如くであ
る。

H₂N−Thr−Pro−Leu−Gly−Pro−Ala−Ser−Ser−Leu−Pro− Gln−Ser−Phe−Leu−Leu−Lys−Cys−Leu−Glu−Gln−Val− （ii）下記のアミノ酸配列またはその一部で表わされる
ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチド
又はこれと糖鎖部を有する糖蛋白質を含有するヒトＧ−
CSF。

（Met）_n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu （Val Ser Glu）_m Gys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala AsP Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gun Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro（但しｍは０又は１を表わし、ｎは０
又は１を表わす）。

なおこれらのＧ−CSFの詳細な製造方法については、
本出願人が先に出願した特願昭59−153273号、特願昭60
−269455号、特願昭60−269456号、特願昭60−270838
号、特願昭60−270839号明細書を参照されたい。

又、その他の方法としてＧ−CSF産生細胞と自己増殖
能を有する悪性腫瘍細胞とを細胞融合して得られるハイ
ブリドーマをマイトジェンの存在下または不在下で培養
することによって得ることもできる。

これ等の方法で得られたヒトＧ−CSF含有液は必要に
より公知の手段でさらに精製、濃縮した後凍結保存する
かまたは凍結乾燥などの手段により水分を除去して保存
することができる。

このようにして得たヒトＧ−CSFは全て本発明によっ
て安定なＧ−CSF含有製剤とすることができる。

本発明の安定なＧ−CSF含有製剤をえるために使用す
る安定化剤としてのアミノ酸は、グリシン、トレオニ
ン、トリプトファン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒス
チジン、アルギニン、システイン、シスチン、メチオニ
ンなどであり、また含硫還元剤としてはＮ−アセチルシ
ステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、
チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセ
ロール、チオソルビトール、チオグリコール酸およびそ
の塩、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、ピ
ロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、チオ乳酸、ジ
チオスレイトール、グルタチオン並びに炭素原子数１〜
７のチオアルカン酸などのスルフヒドリル基を有する温
和な含硫還元剤などを例示できる。更に酸化防止剤とし
ては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、
ブチルヒドロキシアニソール、dl−α−トコフェロー
ル、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸およびそ
の塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコル
ビン酸ステアレート、没食子酸トリアミル、没食子酸プ
ロピルなどあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム（EDTA）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリ
ウムの如きキレート剤を例示できる。

安定な本発明のＧ−CSF含有製剤は、これらの群から
選ばれた少なくとも１種を含むものである。

このアミノ酸、含硫還元剤、酸化防止剤もしくはその
混合物は、顆粒球コロニー刺激因子１重量部に対し、１
重量部〜10,000重量部の範囲内の量で使用することが好
ましい。

更に本発明の安定なＧ−CSF含有製剤は、その製剤化
の目的のために、希釈剤、溶解補助剤、等張化剤、賦形
剤、pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤および吸着防止剤等を
含有することができる。

本発明の安定化されたＧ−CSF含有製剤は、経口、各
種の注射等の非経口投与形式として使用でき、該投与形
式に応じた様々な剤形で実現できる。例えば、錠剤、丸
剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁剤等の経口投与剤、ある
いは静注、筋注、皮下注、皮内注等の溶液、懸濁注射
剤、凍結乾燥製剤、あるいは坐剤、経鼻剤、膣剤等の経
粘膜投与剤形をその典型的なものとして例示できる。

作用上記の如く、感染症等の化学療法においては、抗生物
質、抗菌剤等の薬剤の他、患者の抵抗力、活性などとい
った免疫応答力にもずいた防禦機能自体をも同時に改善
するために、この目的で有効な成分を添加併用すること
が、臨床上極めて有用な手段であることが判明してき
た。

この種の成分の一つであるＧ−CSFは極めて微量で使
用される。従って、このＧ−CSFを極低濃度の水溶液等
として取扱う場合には、例えば注射器等に入れたり、ア
ンプル等の容器に収容して使用することが多い。このよ
うな場合、Ｇ−CSFは各種外的因子、例えば、温度、湿
度、酸素、紫外線等の因子により影響をうけ、会合、重
合あるいは酸化等を受ける。このような物理的、化学的
変化はＧ−CSFの大きな活性の低下を招く。

このことにより容器内の薬液中の有効濃度、あるいは
所定単位用量中の成分の目的とする活性を維持すること
が困難であるといった問題がみられた。従って、治療上
必要とされる以上の量を、不安定のために損失する量を
考慮し、予め添加しておく必要があった。

そこで、本発明ではＧ−CSF含有製剤にアミノ酸、含
硫還元剤および酸化防止剤からなる群から選ばれた少な
くとも１種を添加することにより上記問題点を解決し
た。これらの添加剤は、例えば温度、湿度で促進される
自動酸化の速度を抑制し、もしくはこれらにもとずく会
合あるいは重合を防止し得るものと考える。

これらの結果から推測される現象は、Ｇ−CSFが高分
子蛋白質ゆえに詳細な反応機構は明らかではないがＧ−
CSFの安定化のために効果的に働いている。このような
問題は注射用溶液、懸濁剤などにおいて顕著なものであ
るが、その他の錠剤等の製剤過程においても同様にみら
れる問題であり、アミノ酸あるいは含硫還元剤あるいは
酸化防止剤の使用は、このような場合にも有効である。

これらのアミノ酸、含硫還元剤および酸化防止剤から
選ばれる少なくとも１種を添加することによってＧ−CS
Fは大巾に安定化され、以下の実施例で実証するように
長期に亘りＧ−CSFの活性を有効に維持することができ
る。これらは、上記の添加剤の使用により、Ｇ−CSF分
子が外的因子から保護され、これらの間の例えば会合、
重合の確率が大巾に減じられたためと推測する。

このような理由から、アミノ酸、含硫還元剤および酸
化防止剤からなる群から選ばれる少なくとも１種もしく
はその混合物としての添加剤の使用量は、特にその下限
は臨界的であり、上記の如くＧ−CSF含有製剤中のＧ−C
SF1重量部に対し１重量部〜10,000重量部の範囲内であ
ることが好ましい。

上記の如く、本発明によれば効果的にＧ−CSFの安定
性を維持し得ることから、極微量成分としてのＧ−CSF
の極めて特異性の高い有効性と活性を治療上利用するこ
とが可能となり、更に高価な成分の浪費を防止し得るこ
とから、製品コストの低下という面でも目的を達成する
ことが可能となる。

実施例以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明す
る。しかしながら、本発明は以下の例によって何等制限
されるものではない。

尚、以下の実施例においてＧ−CSFの残存活性の測定
は以下の如く実施した。

（ａ）マウス骨髄細胞を用いる軟寒天法ウマ血清0.4ml、被検体0.1ml、C3H/HeN（メス）マウ
スの骨髄細胞浮遊液0.1ml（0.5〜１×10⁵有核細胞）、
寒天を0.75％含む改変マッコイ5A培養液0.4mlを混合
し、直径35mmの組織培養用プラスチックディッシュに入
れて固まらせた後、37℃、５％炭酸ガス/95％空気、100
％湿度の条件にて５日間培養し、形成されたコロニー数
（50個以上の細胞からなる集落を１コロニーとする）を
数え、１個のコロニーを形成する活性を１単位（Unit）
とした。

尚、上記（ａ）の方法において用いた「改変マッコイ
5A培養液」は次の如くして作製した。

改変マッコイ5A培養液（２倍濃度）マッコイ5A培養液〔ギブコ（GIBCO）社製〕12g、MEM
アミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）2.55g、重炭酸
ナトリウム2.18g、ペニシリンＧカリウム50,000単位を
２回蒸溜水500mlに溶解後、0.22μｍのミリポアフィル
ターにて濾過滅菌を行った後使用した。

実施例１Ｇ−CSF50μｇに第１表に示す添加剤を添加したＧ−C
SF50μg/ml含有製剤（20mMリン酸緩衝液、100mM塩化ナ
トリウム含有、pH7.4）を無菌的に調製し、次いで凍結
乾製剤を製造した。Ｇ−CSF活性の経時変化は上記
（ａ）マウス骨髄細胞を用いる軟寒天法で測定した。結
果は第１表に示す。尚、表中活性（％）とは、初期単位
に対する相対割合であり、以下の式で定義される。

凍結乾燥条件は以下の通りである：安定化剤を添加したＧ−CSF溶液を無菌サルファ処理
ガラスバイアルに入れ、−40℃以下で４時間凍結し、−
40℃から０℃、真空度0.03から0.1Torrで、48時間一次
乾燥した。次いで０℃から20℃、真空度0.03から0.08To
rrで12時間二次乾燥し、バイアル内部を無菌乾燥窒素ガ
スで大気圧になるまで置換する。次いで凍結乾燥用ゴス
栓で打栓し、アルミニウムキャップで密封する。

実施例２Ｇ−CSF50μｇに第２表に示す添加剤を添加したＧ−C
SF10μg/ml含有製剤（20mMリン酸緩衝液、100mM塩化ナ
トリウム含有、pH7.4）を無菌的に調製し、サルファ処
理ガラスバイアル内に無菌的に充填、密封してＧ−CSF
溶液製剤を製造した。これらの溶液製剤について、Ｇ−
CSF活性の経過時変化を実施例１と同様の方法で測定
し、その結果を第２表に示した。

発明の効果以上詳しく述べたように、本発明によれば、アミノ
酸、含硫還元剤、酸化防止剤の少なくとも１種を所定量
で用いたことにより、製剤中に極微量で存在するＧ−CS
Fの温度、湿度、酸素、紫外線等の外的因子にもとずく
会合、重合あるいは酸化の結果として生ずる有効成分の
損失、活性の低下等に関する諸問題点を効果的に解決す
ることが可能となった。

従って、患者に対するＧ−CSFの投与量を極めて正確
に投与、管理することが可能となり、しかも高価なＧ−
CSFを有効利用できるのでＧ−CSF含有製剤のコスト低減
を図ることも可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 47/22 Ａ６１Ｋ 47/22 ＪＫ (56)参考文献特開昭54−140707（ＪＰ，Ａ) 特開昭55−22603（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−36326（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−230729（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−44826（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−215631（ＪＰ，Ａ) 特開昭59−181224（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−146504（ＪＰ，Ａ) 特開昭51−91320（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】有効成分としてヒト組み換え体顆粒球コロ
ニー刺激因子を含有し、各々製薬上許容される、（ａ）トレオニン、トリプトファン、リジン、ヒドロキ
シリジン、ヒスチジン、アルギニン、システイン、シス
チン、メチオニンから選ばれる少なくとも１種のアミノ
酸；（ｂ）チオグリコール酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウ
ムから選ばれる少なくとも１種の含硫還元剤；または（ｃ）ジブチルヒドロキシトルエン、dl−α−トコフェ
ロール、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムから選ばれる少
なくとも１種の酸化防止剤；から成る群から選ばれる少なくとも１種を含むことを特
徴とする、安定な顆粒球コロニー刺激因子含有製剤。
【請求項２】アミノ酸としてヒスチジンを含むことを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の安定な顆粒コロニ
ー刺激因子含有製剤。