KR101100059B1 - 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체 - Google Patents

중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체 Download PDF

Info

Publication number
KR101100059B1
KR101100059B1 KR1020077002327A KR20077002327A KR101100059B1 KR 101100059 B1 KR101100059 B1 KR 101100059B1 KR 1020077002327 A KR1020077002327 A KR 1020077002327A KR 20077002327 A KR20077002327 A KR 20077002327A KR 101100059 B1 KR101100059 B1 KR 101100059B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
factor
delete delete
moiety
conjugate
water soluble
Prior art date
Application number
KR1020077002327A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070030308A (ko
Inventor
메리 제이 보사드
게일 스티븐슨
Original Assignee
넥타르 테라퓨틱스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35429498&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101100059(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 넥타르 테라퓨틱스 filed Critical 넥타르 테라퓨틱스
Publication of KR20070030308A publication Critical patent/KR20070030308A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101100059B1 publication Critical patent/KR101100059B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Abstract

본 발명은 인자 IX 부분과 하나 이상의 수용성 중합체의 접합체를 제공한다. 전형적으로, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 그의 유도체이다. 다른 것들 중에서도, 상기 접합체를 포함하는 조성물, 상기 접합체의 제조 방법, 및 상기 접합체를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 방법 또한 제공된다.
중합체, 인자 IX 부분, 접합체, 혈우병

Description

중합체­인자 ＩＸ 부분의 접합체 {POLYMER-FACTOR IX MOIETY CONJUGATES}
본 발명은 전체적으로 인자 IX 부분 (즉, 인자 IX 활성을 갖는 부분) 및 중합체를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 접합체를 포함하는 조성물, 상기 접합체를 합성하는 방법, 상기 접합체를 전달하는 방법, 및 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다.
지혈은 손상된 혈관으로부터 출혈을 저지하는 과정이다. 여러 다른 유기체뿐 아니라 포유류의 경우, 계속된 생존을 위해서는 지혈 과정이 매우 중요하다. 지혈 과정의 결점은 예를 들어 혈관 손상후 혈액의 손실을 정지시키는 기능을 하는 혈병을 효과적으로 형성하는 기능이 결여될 수 있다는 것이다. 인간의 경우, 혈병을 형성할 수 없는 것으로 고통받는 개체를 혈우병 환자라고 부른다. 특히, 혈우병 환자는 일단 출혈이 시작되면 절대 멈추지 않는 생명을 위협하는 위험을 안고 있다.
일반적으로, 혈우병 환자는 궁극적으로 가용성 피브리노겐을 불용성 피브린으로 전환시키기 위해 필요한 하나 이상의 물질을 효과적인 양으로 생성하는 능력이 결여되어 있다. 예를 들어, 혈우병 B ("선천성 인자 IX 결핍증" 및 "크리스마스 질환"이라고도 부름)를 앓고 있는 혈우병 환자는 인자 IX를 효과적인 수준으로 생성하는 능력이 결여되어 있다. 인자 IX는 혈병의 형성을 위한 여러 "다단계" 반응 중 하나에서 핵심적인 성분이다. "내성 경로"라고 불리는 다단계 반응의 중요한 단계에서, 인자 IX는 궁극적으로 피브리노겐이 혈병의 중요한 성분인 피브린으로 전환되는데 영향을 미친다.
혈병이 형성되는 과정이 비교적 복잡하지만, 내성 경로에서 인자 IX의 역할에 대해 간단히 기재할 수 있다. 혈액이 (예를 들어, 열상과 관련된 조직 손상의 결과로서) 음으로 하전된 표면 및/또는 내피하의 결합 조직과 접촉하게 되는 경우, 다른 물질의 존재하에 인자 XII (또는 하게만(Hageman) 인자)는 인자 XIIa로 전환된다. 인자 XIIa는 (다른 물질과 함께) 인자 XI를 인자 XIa로 전환시킨다. 또한, 인자 XIa는 (다른 물질과 함께) 인자 IX를 인자 IXa로 전환시킨다. 인자 VIII, 인자 IXa, 칼슘 이온 및 인지질 미셀은 인자 X와 함께 지단백질 복합체를 형성하고, 이를 활성화시켜 인자 Xa를 형성한다. 그 후, 인자 Xa는 (다른 물질과 함께) 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시키고, 그 결과, 시간이 지남에 따라 비교적 다량의 트롬빈이 생성된다. 비교적 다량의 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환시킨다. 또한, 피브린은 혈병의 형성을 담당하는 매트릭스 또는 격자를 형성한다.
혈병 형성의 내성 경로에서 인자 IX의 역할을 하기에 개략적으로 도시한다.
Figure 112007009010618-pct00001
34,500명의 남성 중 한 명이 앓고 있는 혈우병 B는 X-염색체상에 위치한 인자 IX 유전자의 다양한 돌연변이 중 어느 하나로부터 기인할 수 있다. 특정 돌연변이에 따라 혈우병 B는 중증, 중등도 또는 경증으로 나타날 수 있다. 중증의 혈우병 B를 앓고 있는 개체는 전반적으로 인자 IX의 활성 형태를 발현하는 능력이 결여되어 있다. 임상적으로, 혈우병 B를 앓고 있는 개체는 코피, 잦은 타박상, 관절내 출혈, 및 상처부터의 지속적인 출혈로 고통받고 있다. 혈우병 B의 현행 치료법은 인간 혈장으로부터 수집되거나 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 외생 인자 IX 농축물을 주입하는 것을 포함한다. 이들 치료법이 효과적인 수준의 인자 IX의 부족분을 보충하는 기능만 하기 때문에, 중증의 혈우병 B를 앓고 있는 개체는 살아있는 동안 인자 IX 농축물을 정기적으로 (주 3회 정도) 주사맞아야 한다. 보다 나은 중등도의 혈우병 B를 앓고 있는 환자는 대개 수술 및 치과 시술 전후에 인자 IX 농축물을 주사맞을 필요가 있다.
시판되는 여러 인자 IX 농축물이 혈우병 B를 앓고 있는 환자의 대체요법에 유용하다. 예를 들어, 혈액으로부터 유도된 인자 IX 복합체 제품 (다른 인자를 함 유함)은 베불린 브이에이치(BEBULIN VH®; 오스트리아 비엔나 소재의 박스터 헬쓰케어(Baxter Healthcare)), 코닌 80(KONYNE 80®; 인디애나주 에이크하트 소재의 바이엘 코포레이션(Bayer Corporation)), 프로필닌 에스디(PROFILNINE SDTM; 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재의 알파 테라퓨틱 코포레이션(Alpha Therapeutic Corporation)), 및 프로플렉스 티(PROPLEX T®; 캘리포니아주 그렌데일 소재의 박스터 헬쓰케어) 상표로 시판된다. 다소 정제된 형태의 인자 IX 제품은 알팜 에스디(ALPHANME SD®; 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재의 알파 테라퓨틱 코포레이션) 및 모노닌(MONONINE®; 일리노이주 칸카키 소재의 아벤티스 베링(Aventis Behring) 상표로 시판된다. 재조합에 의해 재조된 인자 IX 농축물과 관련해서는 베네픽스(BENEFIX®; 메릴랜드주 캠브리지 소재의 웨이쓰/제네틱스 인스티튜트(Wyeth/Genetics Institute)) 상표로 한 제품이 시판된다.
일반적으로, 인자 IX 농축물의 재조합 공급원이 혈액으로부터 유도된 공급원보다 더 유리한데, 그 이유는 후자의 경우에는 바이러스 및/또는 다른 질환의 감염의 위험이 있기 때문이다. 또한, 대개 재조합 공급원의 순도가 더 높으며, 따라서 혈액으로부터 유도된 공급원에 일반적으로 존재하는 원치않는 혈액 인자 및 다른 단백질의 투여에 의해 발생하는 문제점을 피할 수 있다.
재조합-기재의 제제를 투여하는 것이 유리함에도 불구하고, 재조합-기재 제 품의 가공에는 대개 환자에게 투여되는 최종 생성물에 존재할 수 있는 알부민과 같은 특정 단백질이 필요하다. 그 결과, 이러한 제제를 투여받는 환자는 이들 외래 단백질에 대해 알러지 반응을 나타낸다. 어떠한 경우이건, 혈액으로부터 유도된 제품 및 재조합-기재의 제품 모두 반복된 투여로 인한 단점을 안고 있다.
PEG화, 또는 단백질에 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체의 부착은 면역원성을 감소시키는 수단으로서 뿐만 아니라, 단백질의 생체내 반감기를 연장시키는 수단으로서 기재되어 왔다. 그러나, 인자 IX와 관련하여서는, 단백질-중합체 접합체를 형성하기 위한 기존의 접근법이 여러 결점을 안고 있었다.
예를 들어, 미국 특허 제5,969,040호는 인자 IX의 활성화 영역에 있는 탄수화물 잔기의 인접 디올을 산화시켜 알데히드를 형성하는 단계를 포함하는 방법을 기재한다. 상기 기재된 방법은 산화 단계 이후에, 하나 이상의 비-항원성 중합체 [예컨대, 히드라진-보유 폴리(에틸렌 글리콜) 유도체]를 상기 산화된 탄수화물 잔기에 공유 부착시키는 단계를 포함한다. 그러나, 이 접근법의 문제점은 인자 IX의 산화된 형태를 수득하기 위해 필요한 추가의 단계 때문에 더욱 복잡해진다는 것이다. 또한, 산화 단계 이후에 남아 있을 수 있는 임의의 산화제가 접합체와 회합된 중합체를 분해시킬 수 있다. 마지막으로, 이 접근법은 특정 중합체 (즉, 히드라지드-함유 중합체) 및 인자 IX상의 특정 영역 (즉, 인자 IX의 활성화 영역에 있는 탄수화물 잔기의 인접 디올)을 사용하는 접합에만 제한된다.
산화제의 존재 (미국 특허 제5,969,040호에 기재된 방법의 결과로서, 또는 다른 원인으로부터 존재함)는 인자 IX에 접합된 중합체의 제약상 허용되는 생성물 을 제조하기 위해 추가의 시도를 필요로 한다. 구체적으로, 메티오닌 및 다른 히드록실-함유 아미노산은 산화제의 존재하에서 원치않게 산화될 수 있기 때문에, 이에 따라 알데히드기가 도입된다. 중합체성 시약과 반응하지 않은 임의의 잔류 알데히드는 반응성이어서, 잠재적으로 단백질을 손상시킬 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 미반응 알데히드를 글리신 또는 다른 소분자로 캡핑하여 단백질을 안정화시켜야 한다. 그러나, 조절을 위해 생성물이 즉시 정의되어야 한다는 점에서 (그렇지 않으면 추가 성분의 도입이 정확한 생성물 정의를 방해할 수 있음), 이러한 시도는 분석적인 문제를 발생시킨다. 특히, 캡핑제의 사용은 특히 어려운 시도를 필요로 할 것이다.
미국 특허 제6,037,452호는 인자 IX에 폴리(알킬렌 옥시드)를 부착시키며, 인자 IX로의 부착이 트리아진, 아세틸, 히드라진, 디아조늄, 아미노, 및 숙신이미딜 에스테르와 같은 반응성 기 중 하나를 보유하는 폴리(알킬렌 옥시드)를 통해 이루어지는 것을 기재한다. 그러나, 상기 문헌은 트리아진, 아세틸, 히드라진, 디아조늄, 아미노, 또는 숙신이미딜 에스테르 이외의 반응성 기를 보유하는 중합체를 통해 부착시키는 것은 개시하지 않는다.
따라서, 당 분야에서는 수용성 중합체와 인자 IX 활성을 갖는 부분 사이의 추가의 접합체를 제공하는 것이 여전히 요구된다. 특히, 인자 IX 활성을 갖는 부분에 중합체를 접합시키는 더욱 간단한 방법을 제공하는 것이 요구된다. 따라서, 본 발명은 이러한 접합체뿐만 아니라, 상기 접합체를 포함하는 조성물, 및 본원에 기재된 관련 방법에 대한 것이며, 이들은 신규하고 당업계에서 전혀 제안된 적이 없는 것으로 믿어진다.
<발명의 요약>
따라서, 본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 분자량이 5,000 달톤 초과 내지 약 150,000 달톤 미만의 범위인 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 아미노산 잔기에서 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하며, 상기 아미노산 잔기는 직접적으로 또는 상기 스페이서 부분을 통해 -CH2-C(O)-O-, -N(H)-C(O)CH2-O-, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-CH2-O-, -C(O)-CH2-O-, -C(O)-CH2-CH2-C(O)-O-, 디아조 또는 트리아진 연결부에 의해 부착되지 않은 것인 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 비선형 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하는 접합체가 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 조성물 중 모든 접합체의 약 80％ 이상은 각각 1, 2, 3 또는 4개의 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하고, 상기 접합체 중 각각의 수용성 중합체는 인자 IX 부분에 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 부착된, 다수개의 접합체를 포함하 는 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 모든 유형의 제형, 특히 재현탁가능한 분말, 액체 (예컨대, 현탁액 및 용액)와 같이 주사에 적합한 제형을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하는 접합체를 생성하기에 충분한 조건하에, 중합체성 시약 조성물을 인자 IX 조성물에 첨가하는 것을 포함하는, 접합체의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 본원에 기재된 접합체를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 접합체를 전달하는 방법이 제공된다. 접합체의 투여는 주사 (예컨대, 근육내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사 등) 또는 다른 접근법에 의해 이루어질 수 있다.
도 1 및 도 2는 실시예 1 내지 4에 기술된 샘플의 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 분석의 겔 사진이다.
도 3은 실시예 5, 6, 10 및 11에 기술된 샘플의 SDS-PAGE 분석의 겔 사진이다.
도 4는 실시예 2, 9, 및 12 내지 16에 기술된 샘플의 SDS-PAGE 분석의 겔 사진이다.
도 5는 실시예 1의 생성된 접합체 용액에 해당하는 플롯이다.
도 6은 실시예 2의 생성된 접합체 용액에 해당하는 플롯이다.
도 7은 실시예 3의 생성된 접합체 용액에 해당하는 플롯이다.
도 8은 실시예 4의 생성된 접합체 용액에 해당하는 플롯이다.
도 9는 실시예 12의 생성된 접합체 용액에 해당하는 플롯이다.
도 10은 실시예 13의 생성된 접합체 용액에 해당하는 플롯이다.
도 11은 실시예 14의 생성된 접합체 용액에 해당하는 플롯이다.
도 12는 실시예 15의 생성된 접합체 용액에 해당하는 플롯이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태를 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 특정한 중합체, 합성 기술, 인자 IX 부분 등으로 한정되지 않으며, 다양할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 단수형 관사 ("a," "an" 및 "the")에는, 문맥이 분명하게 달리 명시하지 않는 한 복수 대상이 포함된다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "중합체(a polymer)"라고 언급하는 것은 단일 중합체 및 2개 이상의 동일하거나 상이한 중합체를 포함하고, "임의의 부형제(an optional excipient)"라고 언급하는 것은 단일의 임의의 부형제 및 2개 이상의 동일하거나 상이한 임의의 부형제를 지칭한다.
본 발명을 기술하고 청구함에 있어서, 하기 용어가 후술된 정의에 따라 사용될 것이다.
본원에서 사용되는 "PEG," "폴리에틸렌 글리콜" 및 "폴리(에틸렌 글리콜)"은 서로 교체가능하게 사용된다. 전형적으로, 본 발명에 따라 사용되는 PEG에는 구조 "-(OCH2CH2)n-" (식 중, (n)은 2 내지 4000임)가 포함된다. 본원에 사용되는 PEG에는 또한 종결 산소가 치환되었는지 또는 그렇지 않은지에 따라 구조 "-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" 및 "-(OCH2CH2)nO-"가 포함된다. 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐서, 용어 "PEG"에는 다양한 종결 또는 "말단 캡핑" 기를 갖는 구조 등이 포함된다는 것을 상기하여야 한다. 용어 "PEG"는 또한 다수의, 즉 50％ 초과의 -OCH2CH2- 반복 하위단위를 함유하는 중합체를 의미한다. 특정한 형태에 관하여, PEG는 임의의 다양한 분자량 값, 및 "분지형," "선형," "포크형(forked)," "다관능성," 등과 같은 구조 또는 기하학적 배열을 취할 수 있으며, 이는 하기에 보다 상세히 기술될 것이다.
용어 "말단-캡핑된" 및 "종결 캡핑된"은 본원에서 말단-캡핑 부분을 갖는 중합체의 종결점 또는 종점을 나타내기 위해 서로 교체가능하게 사용된다. 전형적으로, 말단-캡핑 부분은 히드록시기 또는 C1 -20 알콕시기, 더욱 바람직하게는 C1 -10 알콕시기, 보다 더욱 바람직하게는 C1 -5 알콕시기를 포함하지만, 반드시 그렇지는 않다. 따라서, 말단-캡핑 부분의 예로는 알콕시 (예컨대, 메톡시, 에톡시 및 벤질옥시), 및 아릴, 헤테로아릴, 시클로, 헤테로시클로 등이 있다. 말단-캡핑 부분은 중합체에서 1개 이상의 원자의 종결 단량체를 포함하거나 [예컨대, CH3O(CH2CH2O)n- 중 말단-캡핑 부분 "메톡시"], 포함하지 않을 수 있다 [예컨대, CH3(OCH2CH2)n- 중 "CH3"]는 것을 상기하여야 한다. 또한, 상기 각각의 포화된, 불포화된, 치환된 및 비치환된 형태가 고려된다. 게다가, 말단-캡핑기는 또한 실란일 수 있다. 말단-캡핑기는 또한 유리하게는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 중합체가 검출가능한 표지를 포함하는 말단-캡핑기를 갖는 경우, 중합체 및/또는 중합체가 커플링되는 부분 (예컨대, 활성제)의 양 또는 위치는 적합한 검출기를 사용함으로써 측정될 수 있다. 이러한 표지에는 형광물질, 화학발광물질, 효소 표지화에 사용되는 물질, 색채학적 물질 (예컨대, 염료), 금속 이온, 방사성 물질 등이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 적합한 검출기에는 광도계, 필름, 분광계 등이 포함된다. 말단-캡핑기는 또한 유리하게는 인지질을 포함할 수 있다. 중합체가 인지질을 포함하는 말단-캡핑기를 갖는 경우에는 특이한 성질이 중합체 및 임의의 생성된 접합체에 부여된다. 예시적인 인지질에는 포스파티딜콜린이라고 불리는 인지질 부류로부터 선택된 것이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 특히 인지질에는 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테로일포스파티딜콜린, 베헤노일포스파티딜콜린, 아라키도일포스파티딜콜린, 및 레시틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
중합체와 관련하여 본원에서 기술된 "비-자연 발생"이란 그대로는 자연계에서 발견되지 않는 중합체를 의미한다. 그러나, 비-자연 발생 중합체는, 전체 중합체 구조가 자연계에서 발견되지 않는 한, 자연 발생하는 하나 이상의 단량체 또는 단량체의 세그먼트를 함유할 수 있다.
"수용성 중합체"와 같이 용어 "수용성"은 실온의 수중에서 가용성인 임의의 중합체이다. 전형적으로, 수용성 중합체는 여과 후에 동일한 용액에 의해 투과되는 빛의 약 75％, 더욱 바람직하게는 약 95％ 이상을 투과할 것이다. 중량 기준으로, 수용성 중합체는 바람직하게는 약 35 중량％ 이상이 수중에서 가용성이고, 더욱 바람직하게는 약 50 중량％ 이상이 수중에서 가용성이고, 보다 더욱 바람직하게는 약 70 중량％가 수중에서 가용성이고, 보다 더욱더 바람직하게는 약 85 중량％가 수중에서 가용성일 것이다. 그러나, 수용성 중합체는 약 95 중량％가 수중에서 가용성이거나 수중에서 완전히 가용성인 것이 가장 바람직하다.
PEG와 같은 수용성 중합체와 관련하여 분자량은 수-평균 분자량 또는 중량-평균 분자량으로 표시될 수 있다. 달리 언급하지 않는 한, 본원에서 모든 분자량은 중량-평균 분자량을 지칭한다. 수-평균 분자량이든 중량-평균 분자량이든 분자량 측정은 겔 투과 크로마토그래피 또는 다른 액체 크로마토그래피 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 분자량 값을 측정하는 다른 방법, 예컨대 말단기 분석의 사용 또는 총괄 특성 (예컨대, 어는점 내림, 끓는점 오름, 또는 삼투압)의 측정을 사용하여 수-평균 분자량을 측정하거나, 광산란 기술, 초원심분리 또는 점도법을 사용하여 중량-평균 분자량을 측정할 수 있다. 본 발명의 중합체는 전형적으로 다분산성 (즉, 중합체의 수-평균 분자량 및 중량-평균 분자량이 동일하지 않음)이며, 바람직하게는 약 1.2 미만, 더욱 바람직하게는 약 1.15 미만, 보다 더욱 바람직하게는 약 1.10 미만, 보다 더욱더 바람직하게는 약 1.05 미만, 가장 바람직하게는 약 1.03 미만의 낮은 다분산도 값을 갖는다. 본원에서, 때로는 중량-평균 분자량 또는 수-평균 분자량을 갖는 단일 수용성 중합체가 언급되는데, 이러한 언급은 단일-수용성 중합체가 명시된 분자량을 갖는 수용성 중합체의 조성물로부터 수득된다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
용어 "활성" 또는 "활성화"는, 특정 관능기와 함께 사용될 경우 또다른 분자의 친전자체 또는 친핵체와 용이하게 반응하는 반응성 관능기를 지칭한다. 이는 반응하기 위해서는 강력한 촉매 또는 매우 비실용적인 반응 조건을 요하는 기 (즉, "비-반응성" 또는 "불활성" 기)와는 대조를 이룬다.
본원에서 사용되는 용어 "관능기" 또는 그의 임의 유의어는 그의 보호된 형태 및 비보호된 형태를 포괄하는 것을 의미한다.
용어 "스페이서 부분," "연결부" 및 "링커"는 본원에서 수용성 중합체 및 인자 IX 부분의 종결부, 또는 인자 IX 부분의 친전자체 또는 친핵체와 같은 서로 연결되는 부분을 연결하기 위해 임의로 사용되는 원자 또는 원자의 집합체를 나타내기 위해 사용된다. 스페이서 부분은 가수분해에 안정적일 수 있거나, 또는 생리학적으로 가수분해가능하거나 효소적으로 분해가능한 연결부를 포함할 수 있다.
"알킬"은 탄화수소 쇄, 전형적으로 약 1 내지 15개 원자 길이의 쇄를 지칭한다. 이러한 탄화수소 쇄는 포화된 것이 바람직하지만 반드시 그렇지는 않으며, 분지형 또는 선형 쇄일 수 있지만, 전형적으로는 선형 쇄가 바람직하다. 예시적인 알킬기에는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, 3-메틸펜틸 등이 포함된다. 본원에서 사용되는 "알킬"에는 시클로알킬 및 시클로알킬렌-함유 알킬이 포함된다.
"저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬기를 지칭하며, 선형 쇄 또는 분지형일 수 있고, 그 예로는 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸 및 t-부틸이 있다.
"시클로알킬"은 바람직하게는 3 내지 약 12개, 더욱 바람직하게는 3 내지 약 8개의 탄소 원자로 구성된, 포화 또는 불포화된 시클릭 탄화수소 쇄, 예컨대 가교, 융합, 또는 스피로 시클릭 화합물을 지칭한다. "시클로알킬렌"은 시클릭 고리 시스템에서 임의의 두 개의 탄소에서 쇄의 결합에 의해 알킬 쇄에 삽입된 시클로알킬기를 지칭한다.
"알콕시"는 -O-R기를 지칭하고, 여기서 R은 알킬 또는 치환된 알킬, 바람직하게는 C1 -6 알킬 (예컨대, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 등)이다.
예를 들어, "치환된 알킬"과 같이 용어 "치환된"은 하나 이상의 비-간섭 치환기, 예컨대 비제한적으로 알킬, C3 -8 시클로알킬, 예를 들면, 시클로프로필, 시클로부틸 등; 할로, 예를 들면, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도; 시아노; 알콕시, 저급 페닐; 치환된 페닐 등으로 치환된 부분 (예컨대, 알킬기)을 지칭한다. "치환된 아릴"은 치환기로서 하나 이상의 비-간섭 기를 갖는 아릴이다. 페닐 고리에서의 치환기에 있어서, 치환기는 임의의 배향 (즉, 오르토, 메타 또는 파라)을 가질 수 있다.
"비-간섭 치환기"는 분자 내에 존재할 때, 전형적으로 분자 내에 함유된 다른 관능기와 비-반응성인 기이다.
"아릴"은 각각 5개 또는 6개의 코어 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 방향족 고리를 의미한다. 아릴은 나프틸과 같이 융합되거나, 비페닐과 같이 융합되지 않을 수 있는 복수 개의 아릴 고리를 포함한다. 아릴 고리는 또한 융합되지 않거나 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로아릴, 또는 헤테로시클릭 고리와 융합될 수 있다. 본원에서 사용되는 "아릴"에는 헤테로아릴이 포함된다.
"헤테로아릴"은 1 내지 4개의 헤테로원자, 바람직하게는 황, 산소 또는 질소, 또는 이들의 조합을 함유하는 아릴기이다. 헤테로아릴 고리는 또한 하나 이상의 시클릭 탄화수소, 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리와 융합될 수 있다.
"헤테로사이클" 또는 "헤테로시클릭"은 불포화성 또는 방향성이 있거나 없고, 탄소가 아닌 하나 이상의 고리 원자를 갖는, 5 내지 12개의 원자, 바람직하게는 5 내지 7개의 원자를 갖는 하나 이상의 고리를 의미한다. 바람직한 헤테로원자에는 황, 산소 및 질소가 포함된다.
"치환된 헤테로아릴"은 치환기로서 하나 이상의 비-간섭 기를 갖는 헤테로아릴이다.
"치환된 헤테로사이클"은 비-간섭 치환기로부터 형성된 하나 이상의 측쇄를 갖는 헤테로사이클이다.
본원에서 사용되는 "유기 라디칼"에는 알킬, 치환된 알킬, 아릴 및 치환된 아릴이 포함된다.
"친전자체" 및 "친전자기"는 친핵체와 반응할 수 있는 친전자성 중심, 즉 전자를 당기는 중심을 갖는 이온, 또는 이온성일 수 있는 원자 또는 원자의 집합체를 지칭한다.
"친핵체" 및 "친핵기"는 친핵성 중심, 즉 친전자성 중심 또는 친전자체를 당기는 중심을 갖는 이온, 또는 이온성일 수 있는 원자 또는 원자의 집합체를 지칭한다.
"생리학적으로 절단가능한" 또는 "가수분해가능한" 결합은 생리학적 조건하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 결합이다. 수중에서 결합이 가수분해되는 경향은 두 중심 원자를 연결하는 연결부의 일반적인 유형 뿐만 아니라, 이들 중심 원자에 부착된 치환기에 좌우될 것이다. 적합한, 가수분해에 안정적이지 않거나 또는 약한 연결부에는 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드가 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
"효소적으로 분해가능한 연결부"는 하나 이상의 효소에 의해 분해되는 연결부를 의미한다.
"가수분해에 안정적인" 연결부 또는 결합은 수중에서 실질적으로 안정한, 즉 생리학적 조건하에서 장시간에 걸쳐 감지될 정도로는 가수분해되지 않는 화학 결합, 전형적으로는 공유 결합을 지칭한다. 가수분해에 안정적인 연결부의 예로는 탄소-탄소 결합 (예컨대, 지방족 쇄), 에테르, 아미드, 우레탄 등이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 일반적으로, 가수분해에 안정적인 연결부는 생리학적 조건하에서 하루에 약 1 내지 2％ 미만의 가수분해율을 나타내는 것이다. 대표적인 화학 결합의 가수분해율은 대부분의 표준 화학 문헌에서 찾아볼 수 있다.
"제약상 허용되는 부형제"는 본 발명의 조성물에 임의로 포함될 수 있고 환자에게 유의한 불리한 독성 효과를 초래하지 않는 부형제를 지칭한다.
"치료적 유효량"은 본원에서, 혈류 또는 표적 조직에서 목적하는 수준의 접합체 (또는 상응하는 접합되지 않은 인자 IX 부분)를 제공하기 위해 필요한 중합체-인자 IX 부분의 접합체의 양을 나타내기 위해 사용된다. 정확한 양은 수많은 인자, 예를 들면 특정 인자 IX 부분, 치료 조성물의 성분 및 물리적 성질, 지정된 환자군, 전달 방식, 개별 환자의 고려할 사항 등에 좌우될 것이고, 본원에서 제공된 정보를 기초로 하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
"다관능성"은 동일하거나 상이할 수 있는, 3개 이상의 관능기가 함유된 중합체를 의미한다. 다관능성 중합체성 시약은 전형적으로 약 3 내지 100개의 관능기, 또는 3 내지 50개의 관능기, 또는 3 내지 25개의 관능기, 또는 3 내지 15개의 관능기, 또는 3 내지 10개의 관능기를 함유하거나, 또는 중합체 주쇄 내에 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 관능기를 함유할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "인자 IX 부분"은 인자 IX 활성을 갖는 부분을 지칭한다. 인자 IX 부분은 또한 중합체성 시약과 반응하기에 적합한 하나 이상의 친전차기 또는 친핵기를 가질 것이다. 전형적으로, 인자 IX 부분은 단백질이지만, 반드시 그렇지는 않다. 또한, 용어 "인자 IX 부분"은 접합 전의 인자 IX 부분과 접합 후의 인자 IX 부분의 잔기를 둘 다 포괄한다. 하기에 더욱 상세히 설명된 것처럼, 당업자라면 임의의 주어진 부분이 인자 IX 활성을 갖는지 여부를 결정할 수 있다. 서열 1에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 인자 IX 부분이고, 그와 실질적으로 상동성인 임의의 단백질 또는 폴리펩티드의 생물학적 성질은 인자 IX의 활성을 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "인자 IX 부분"은 의도적으로 예를 들면, 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 또는 돌연변이 동안 우연히 변형된 단백질을 포함한다. 용어 "인자 IX 부분"은 또한 1 내지 6개의 추가의 글리코실화 부위를 갖는 유도체, 단백질의 카르복시 종결 말단에서 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 하나 이상의 추가의 아미노산을 갖는 유도체, 및 하나 이상의 글리코실화 부위를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 유도체를 포함한다.
용어 "실질적으로 상동성"은 특정 해당 서열, 예를 들면 돌연변이 서열이 하나 이상의 치환, 결실, 또는 부가에 의해 대조 서열과 상이하지만, 그의 실제 효과가 대조 서열과 해당 서열 사이의 불리한 기능적 차이점을 초래하지는 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 95％ 초과의 상동성, 동등한 생물학적 성질 (그러나 잠재적으로는 서로 상이한 활성 정도), 및 동등한 발현 성질을 갖는 서열은 실질적으로 상동성인 것으로 간주된다. 상동성을 측정하기 위해서는, 성숙한 서열의 말단절단(truncation)은 무시해야 한다. 보다 낮은 상동성, 필적하는 생활성, 및 동등한 발현 성질을 갖는 서열은 실질적으로 동등한 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 인자 IX 부분의 예로는 서열 1과 실질적으로 상동성인 서열을 갖는 단백질이 포함된다.
용어 "단편"은 어느 정도의 인자 IX 활성을 보유하는 인자 IX 부분의 일부의 아미노산 서열을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 인자 IX 단백질의 단백질 가수분해에 의해 생산되거나 또는 당업계에서 일상적인 방법으로 화학 합성에 의해 생산된 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 단편이 인자 IX의 생물학적 활성을 갖는지 여부의 판단은 1종 이상의 포유동물에서 그러한 목적으로 이용되는, 통상적이고 널리 공지된 시험법에 의해 실시될 수 있다. 이러한 생물학적 활성을 입증하기 위해 이용될 수 있는 적합한 시험법은 본원에 기술되어 있다.
인자 IX 부분의 "결실 변이체"는 인자 IX 부분의 한 아미노산 잔기가 결실되고 결실된 아미노산 잔기의 앞 및 뒤의 아미노산 잔기가 아미드 결합을 통해 연결된 (결실된 아미노산 잔기가 펩티드 또는 단백질의 종결부에 위치하는 경우는 제외함) 펩티드 또는 단백질이다. 결실 변이체는 단일 아미노산 잔기가 결실된 경우, 및 2개의 아미노산, 3개의 아미노산, 4개의 아미노산이 결실된 경우 등을 포함한다. 그러나, 결실 변이체 각각은 어느 정도의 인자 IX 활성을 보유해야 한다.
인자 IX 부분의 "치환 변이체"는 인자 IX 부분의 한 아미노산 잔기가 결실되고 상이한 아미노산 잔기가 그 자리에 삽입된 펩티드 또는 단백질이다. 치환 변이체는 단일 아미노산 잔기가 치환된 경우, 및 2개의 아미노산, 3개의 아미노산, 4개의 아미노산이 치환된 경우 등을 포함한다. 그러나, 치환 변이체 각각은 어느 정도의 인자 IX 활성을 가져야 한다.
인자 IX 부분의 "부가 변이체"는 인자 IX 부분의 한 아미노산 잔기가 아미노산 서열에 부가되고, 인접한 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 잔기에 아미드 결합에 의해 부착된 (부가된 아미노산 잔기가 펩티드 또는 단백질의 종결부에 위치하는 경우는 제외함; 이 경우에는 단일 아미드 결합이 부가된 아미노산 잔기와 부착됨) 펩티드 또는 단백질이다. 부가 변이체는 단일 아미노산 잔기가 부가된 경우, 및 2개의 아미노산, 3개의 아미노산, 4개의 아미노산이 부가된 경우 등을 포함한다. 그러나, 부가 변이체 각각은 어느 정도의 인자 IX 활성을 가져야 한다.
용어 "환자"는 활성제 (예컨대, 접합체)를 투여함으로써 예방 또는 치료될 수 있는 증상을 앓고 있거나 앓기 쉬운 생물체를 지칭하고, 인간과 동물 둘 다를 포함한다.
"임의의" 또는 "임의로"는 이어서 기술된 상황이 일어나거나 일어나지 않을 수 있어, 상기 기재가 상황이 일어난 경우 및 그렇지 않은 경우를 포함한다는 것을 의미한다.
"실질적으로" (특정한 문맥에 대해 분명히 달리 명시하지 않거나 문맥이 명확하게 달리 명시하지 않는다면)는 거의 전체 또는 완전히, 예를 들면 50％ 초과, 51％ 이상, 75％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 및 95％ 이상 중 하나 이상의 조건을 만족시키는 것을 의미한다.
문맥이 명확하게 달리 명시하지 않는 한, 용어 "약"이 수치 앞에 있으면, 상기 수치는 명시된 수치의 ± 10％를 의미하는 것으로 이해된다.
펩티드의 아미노산 잔기는 하기와 같이 줄여 쓴다.
페닐알라닌은 Phe 또는 F이고; 루신은 Leu 또는 L이고; 이소루신은 Ile 또는 I이고; 메티오닌은 Met 또는 M이고; 발린은 Val 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S이고; 프롤린은 Pro 또는 P이고; 트레오닌은 Thr 또는 T이고; 알라닌은 Ala 또는 A이고; 티로신은 Tyr 또는 Y이고; 히스티딘은 His 또는 H이고; 글루타민은 Gln 또는 Q이고; 아스파라긴은 Asn 또는 N이고; 리신은 Lys 또는 K이고; 아스파르트산은 Asp 또는 D이고; 글루탐산은 Glu 또는 E이고; 시스테인은 Cys 또는 C이고; 트립토판은Trp 또는 W이고; 아르기닌은 Arg 또는 R이고; 글리신은 Gly 또는 G이다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하는 접합체가 제공된다. 본 발명의 접합체는 하기 특징 중 하나 이상의 특징을 가질 것이다.
인자 IX 부분
앞서 설명한 바와 같이, 용어 "인자 IX 부분"은 접합 전의 인자 IX 부분 및 수용성 중합체에 부착 후의 인자 IX 부분을 포함할 것이다. 그러나, 인자 IX 부분이 비펩티드 수용성 중합체에 부착될 경우에는, 인자 IX 부분이 중합체와의 연결부 (또는 중합체에 부착된 스페이서 부분)와 회합된 하나 이상의 공유 결합의 존재로 인해 약간 변형된다는 것을 이해하여야 한다. 종종, 또다른 분자에 부착된 인자 IX 부분의 이렇게 약간 변형된 형태를 인자 IX 부분의 "잔기"라고 한다.
인자 IX 부분은 비-재조합 방법 또는 재조합 방법으로부터 유도될 수 있고 본 발명은 이와 관련하여 제한되지 않는다. 또한, 인자 IX 부분은 인간 공급원 또는 동물 공급원으로부터 유도될 수 있다.
인자 IX 부분은 비-재조합에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 인자 IX 부분은 혈액으로부터 유도된 공급원으로부터 수득될 수 있다. 특히, 인자 IX는 인간 혈장으로부터 당업자에게 공지된 침전 및 원심분리 기술을 사용하여 분리될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Wickerhauser (1976) Transfusion 16(4):345-350] 및 문헌 [Slichter et al. (1976) Transfusion 16(6):616-626] 참조). 인자 IX는 또한 인간 과립구로부터 단리될 수 있다 (문헌 [Szmitkoski et al. (1977) Haematologia (Budap.) 11(1-2):177-187] 참조).
인자 IX 부분은 재조합에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, 인자 IX 부분인, 천연 인자 IX를 코딩하는 cDNA를 단리하고, 특성 분석하고, 발현 벡터로 클로닝한다 (예를 들어, 문헌 [Choo et al. (1982) "Molecular Cloning of the Gene for Human Anti-hemophilic Factor IX," Nature, Vol. 299: 178-180] 및 문헌 [Kurachi et al. (1982) "Isolation and Characterization of a cDNA Coding for Human Factor IX," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 79: 6461-65] 참조).
발현되면, 천연 인자 IX는 약 55,000 달톤의 단일 쇄 당단백질이다. 구조적으로 Gla 또는 감마 카르복시글루타메이트-풍부 도메인, EGF-유사 영역, 활성화 펩티드, 및 활성 부위의 4개의 도메인을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 발현된 아미노산 서열이 서열 1로서 제공된다. 구체적으로 명시하지 않는 한, 본원에서 제공되는 아미노산 잔기의 모든 위치 지정은 서열 1을 기초로 한다.
인자 IX 부분 (천연 인자 IX이건, 인자 IX 활성을 갖는 상이한 단백질이건 간에)을 제조하는 데 사용되는 예시적인 재조합 방법을 간략하게 기술할 수 있다. 이러한 방법은 목적하는 폴리펩티드 또는 단편을 코딩하는 핵산을 구축하고, 핵산을 발현 벡터로 클로닝하고, 숙주 세포 (예컨대, 식물, 이. 콜라이와 같은 박테리아, 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포 또는 베이비 햄스터 신장 세포와 같은 포유류 세포)를 형질전환시키고, 핵산을 발현시켜 목적하는 폴리펩티드 또는 단편을 생산하는 것을 포함한다. 발현은 외생성 발현 (숙주 세포가 자연히 목적하는 유전자 코드를 함유할 경우) 또는 내생성 발현을 통해 일어날 수 있다. 시험관내, 및 원핵 및 진핵 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드를 생산하고 발현하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,868,122호 참조).
재조합 폴리펩티드의 확인 및 정제를 용이하게 하기 위해, 에피토프 태그 또는 다른 친화성 결합 서열을 코딩하는 핵산 서열을 코딩 서열에 삽입하거나 프레임내(in-frame) 첨가하여, 목적하는 폴리펩티드 및 결합에 적합한 폴리펩티드로 이루어진 융합 단백질을 생산할 수 있다. 융합 단백질은 우선 융합 단백질 내 에피토프 태그 또는 다른 결합 서열에 대한 결합 부분 (예컨대, 항체)을 보유하는 친화성 컬럼을 통해 융합 단백질을 함유하는 혼합물을 전개하여, 컬럼내에서 융합 단백질을 결합시킴으로써 확인하고 정제할 수 있다. 그 후에, 컬럼을 적합한 용액 (예컨대, 산)으로 세척하여 결합된 융합 단백질을 방출시킴으로써 융합 단백질을 회수할 수 있다. 재조합 폴리펩티드는 또한 숙주 세포를 용혈시키고, 폴리펩티드를, 예를 들면 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분리하고, 폴리펩티드를 수집합으로써 확인하고 정제할 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 확인하고 정제하는 상기 방법 및 기타 방법은 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 인자 IX 부분이 융합 단백질 형태가 아닌 것이 바람직하다.
인자 IX 활성을 갖는 단백질을 발현시키는 데 사용된 시스템에 따라, 인자 IX 부분은 글리코실화되지 않거나 글리코실화될 수 있고, 그 중 하나가 사용될 수 있다. 즉, 인자 IX 부분은 글리코실화되지 않거나, 또는 인자 IX 부분은 글리코실화될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 인자 IX 부분이 글리코실화된 것이 바람직하다.
인자 IX 활성을 갖는 부분은 중합체가 아미노산 내 원자에 부착되는 것을 용이하게 하기 위해, 유리하게는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예를 들어 리신, 시스테인 및/또는 아르기닌을 포함하도록 개질될 수 있다. 또한, 인자 IX 부분은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함하도록 개질될 수 있다. 아미노산 잔기 및 비-자연 발생 아미노산 잔기를 첨가하는 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다 (문헌 [J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)] 참조).
또한, 인자 IX 부분은 유리하게는 관능기의 부착점을 포함하도록 개질될 수 있다 (관능기-함유 아미노산 잔기를 첨가하는 것 제외). 예를 들어, 인자 IX 부분은 티올기를 포함하도록 개질될 수 있다. 또한, 인자 IX 부분은 N-종결 알파 탄소를 포함하도록 개질될 수 있다. 또한, 인자 IX 부분은 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하도록 개질될 수 있다. 아미녹시, 알데히드 또는 다른 관능기를 함유하도록 개질된 인자 IX 부분 또한 사용될 수 있다.
인자 IX 부분의 비제한적 예에는 인자 IX; 인자 IXa; 인자 IX의 말단절단형; 하이브리드 단백질, 및 인자 IX 활성을 갖는 펩티드 유사체가 포함된다. 적어도 어느 정도의 인자 IX 활성을 유지하는 상기의 생물학적 활성 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 부가 변이체 또한 인자 IX 부분으로서 작용할 수 있다.
임의의 주어진 부분에 대하여, 상기 부분이 인자 IX 활성을 갖는지 여부를 판단할 수 있다. 예를 들어, 다수의 동물 라인에 혈우병에 대한 유전자 돌연변이를 의도적으로 일으켜 그러한 라인으로부터 생산된 동물이 매우 낮고 불충분한 수준의 인자 IX를 갖도록 한다. 이러한 라인은 비제한적으로 미국 뉴욕주 알바니에 소재하는 공중보건부 뉴욕 지부의 연구소 (Division of Laboratories and Research, New York Department of Public Health) 및 미국 노쓰 캐롤라이나주 챠펠 힐에 소재하는 노쓰 캐롤라이나 대학 병리학과와 같은 다양한 공급원으로부터 입수가능하다. 이들 공급원은 둘 다 예를 들면, 개 혈우병 B를 앓고 있는 개를 제공한다. 임의의 주어진 해당 부분의 인자 IX 활성을 시험하기 위해, 상기 부분을 질환을 앓고 있는 동물에 주입하고, 작게 절개하여, 출혈 시간을 건강한 대조군과 비교한다. 인자 IX 활성을 측정하는 또다른 유용한 방법은 공동인자 및 전구응고 활성을 측정하는 것이다 (예를 들어, 문헌 [Mertens et al. (1993) Brit. J. Haematol. 85:133-42] 참조). 당업계에 공지된 다른 방법 또한 주어진 부분이 인자 IX 활성을 갖는지 여부를 판단하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 제시된 인자 IX 부분 및 상응하는 중합체-인자 IX 부분 접합체 둘 다의 인자 IX 활성을 측정하는 데 유용하다.
수용성 중합체
상기 논의된 바와 같이, 접합체 각각은 수용성 중합체에 부착된 인자 IX 부분을 포함한다. 수용성 중합체와 관련하여, 수용성 중합체는 비펩티드성, 비독성, 비-자연 발생성 및 생체적합성이다. 생체적합성과 관련하여, 생 조직에서 (예를 들면, 환자에게 투여함) 물질을 단독으로 또는 또다른 물질 (예를 들면, 인자 IX 부분과 같은 활성제)과 함께 사용하는 것으로 인한 이로운 효과가 임상의, 예를 들면 의사가 평가하였을 때 해로운 효과를 능가한다면 상기 물질은 생체적합한 것으로 간주된다. 비-면역원성과 관련하여, 물질의 생체내 의도된 사용이 바람직하지 않은 면역 반응 (예를 들면, 항체의 형성)을 초래하지 않거나, 면역 반응이 초래된다면, 그러한 반응이 임상의가 평가하였을 때 임상학적으로 유의하거나 중요한 것으로 생각되지 않는다면 상기 물질은 비-면역원성인 것으로 간주된다. 수용성 중합체가 생체적합성이고 비-면역원성인 것이 특히 바람직하다.
또한 중합체는 전형적으로 2 내지 약 300개의 종결부를 갖는 것으로 특성 분석된다. 이러한 중합체의 예로는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체 등, 폴리(옥시에틸화된 폴리올), 폴리(올레핀계 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 다(당류), 폴리(α-히드록시산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 이들의 조합이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다.
중합체는 특정 구조로 제한되지 않고, 선형 (예컨대, 알콕시 PEG 또는 이관능성 PEG), 또는 비선형, 예컨대 분지형, 포크형, 복수 개의 암형(multi-armed) (예컨대, 폴리올 코어에 부착된 PEG), 및 수지상일 수 있다. 게다가, 중합체의 내부 구조는 수많은 상이한 패턴으로 조직화될 수 있고 단독중합체, 교대 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교대 삼중합체, 랜덤 삼중합체, 및 블록 삼중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
전형적으로, 활성화된 PEG 및 다른 활성화된 수용성 중합체 (즉, 중합체성 시약)는 인자 IX 부분의 목적하는 부위에 커플링시키기에 적절한, 적합한 활성화기로 활성화된다. 따라서, 중합체성 시약은 인자 IX 부분과 반응하기 위한 반응기를 보유할 것이다. 대표적인 중합체성 시약 및 이들 중합체를 활성 부분에 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 또한 문헌 [Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry], 문헌 [Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992)], 및 문헌 [Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182]에 개시되어 있다.
전형적으로, 접합체 중 수용성 중합체의 중량-평균 분자량은 약 100 달톤 내지 약 150,000 달톤이다. 그러나, 중량-평균 분자량 범위의 예로는, 5,000 달톤 초과 내지 약 100,000 달톤의 범위, 약 6,000 달톤 내지 약 90,000 달톤의 범위, 약 10,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 10,000 달톤 초과 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 20,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 53,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 25,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 약 29,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 약 35,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 및 약 40,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위 등이 있다. 임의의 주어진 수용성 중합체는 이들 범위 중 하나 이상의 분자량을 갖는 PEG인 것이 바람직하다.
수용성 중합체의 중량-평균 분자량의 예로는 약 100 달톤, 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤, 및 약 75,000 달톤 등이 있다. 전체 분자량이 상술한 어느 하나인, 수용성 중합체의 분지형 형태 (예컨대, 2개의 20,000 달톤 중합체들로 이루어진 분지형 40,000 달톤 수용성 중합체)가 사용될 수도 있다. 하나 이상의 실시양태에서, 상기 접합체는 약 6,000 달톤 미만의 중량-평균 분자량을 갖는 PEG와 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 임의의 PEG 부분을 갖지 않는다.
중합체로서 사용될 때, PEG는 전형적으로 수많은 (OCH2CH2) 단량체 [또는 PEG의 정의에 따라서는 (CH2CH2O) 단량체]를 포함하게 된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 반복 단위의 수는 "(OCH2CH2)n"에서의 하첨자 "n"으로 표시된다. 따라서, (n)의 값은 전형적으로 하기 범위 중 하나 이상에 속한다: 2 내지 약 3400, 약 100 내지 약 2300, 약 100 내지 약 2270, 약 136 내지 약 2050, 약 225 내지 약 1930, 약 450 내지 약 1930, 약 1200 내지 약 1930, 약 568 내지 약 2727, 약 660 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 909 내지 약 2730, 및 약 1,200 내지 약 1,900. 분자량이 알려진 임의의 주어진 중합체의 경우에는, 중합체의 전체 중량-평균 분자량을 반복 단량체의 분자량으로 나누어서 반복 단위의 수 (즉, "n")를 결정할 수 있다.
수용성 중합체의 분자량과 관련하여, 본 발명의 하나 이상의 실시양태에서는 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 분자량이 5,000 달톤 초과 내지 약 150,000 달톤 미만의 범위인 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하는 접합체가 제공된다.
본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 중합체 중 하나는 말단-캡핑 중합체, 즉, 저급 C1 -6 알콕시기와 같은 비교적 불활성인 기로 캡핑된 1개 이상의 종결부를 갖는 중합체이지만, 히드록실기가 사용될 수도 있다. 예를 들어 중합체가 PEG인 경우에는 메톡시-PEG (통상적으로 mPEG라고 지칭됨)를 사용하는 것이 바람직한데, 이것은 선형 형태의 PEG로서 이 중합체의 한쪽 종결부는 메톡시 (-OCH3)기를 갖는 반면에 다른쪽 종결부는 임의로 화학적으로 개질될 수 있는 히드록실기 또는 다른 관능기를 갖는다.
본 발명에 유용한 한 형태에서, 유리 또는 미결합 PEG는 각 말단이 히드록실기로 종결하는 선형 중합체이다:
Figure 112007009010618-pct00002
여기서, (n)은 전형적으로 0 내지 약 4,000의 범위이다.
상기 중합체인 알파-,오메가-디히드록실폴리(에틸렌 글리콜)은 간단하게 HO-PEG-OH라고 표현될 수 있으며, 여기서 상기 -PEG- 표시는 하기 구조 단위를 나타낼 수 있음이 이해되어야 한다:
Figure 112007009010618-pct00003
여기서, (n)은 상기 정의한 바와 같다.
본 발명에 유용한 PEG의 또다른 유형은, 한쪽 종결부는 비교적 불활성인 메톡시기인 반면에 다른쪽 종결부는 히드록실기인 메톡시-PEG-OH 또는 간단하게 mPEG이다. mPEG의 구조는 다음과 같다:
Figure 112007009010618-pct00004
여기서, (n)은 상기한 바와 같다.
다중-분지형 또는 분지형 PEG 분자, 예를 들어 미국 특허 제5,932,462호에 기재된 분자가 PEG 중합체로 사용될 수도 있다. 예를 들어, PEG는 하기하는 구조를 가질 수 있다:
Figure 112007009010618-pct00005
여기서,
폴리a 및 폴리b는 PEG 주쇄 (동일하거나 상이함), 예를 들어 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)이고,
R"는 비-반응성 부분, 예를 들어 H, 메틸 또는 PEG 주쇄이며,
P 및 Q는 비-반응성 연결부이다.
하나 이상의 실시양태에서, 분지형 PEG 중합체는 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) 2치환된 리신이다. 사용되는 구체적인 인자 IX 부분에 따라, 2치환된 리신의 반응성 에스테르 관능기가 추가로 개질되어, 인자 IX 부분 내에서 표적기와의 반응에 적합한 관능기를 형성할 수 있다.
또한, PEG는 포크형 PEG를 포함할 수 있다. 포크형 PEG의 예는 하기 구조로 표현된다:
Figure 112007009010618-pct00006
여기서,
X는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분이고,
각각의 Z는 규정된 길이의 원자 쇄에 의해 CH에 연결된 활성화된 종결기이다.
국제 출원 제PCT/US99/05333호는 본 발명의 하나 이상의 실시양태에 이용될 수 있는 여러가지 포크형 PEG 구조를 개시하고 있다. Z 관능기를 분지 탄소 원자에 연결하는 원자 쇄는 테터기(tethering group)로 기능하며, 예를 들어 알킬 쇄, 에테르 쇄, 에스테르 쇄, 아미드 쇄 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
PEG 중합체는 PEG 쇄의 말단이 아니라 PEG의 길이를 따라 공유 부착된 반응성 기, 예를 들어 카르복실기를 갖는 펜던트(pendant) PEG 분자를 포함할 수 있다. 펜던트 반응성 기는 PEG에 직접적으로 부착되거나 또는 알킬렌기와 같은 스페이서 부분을 통해 부착될 수 있다.
상기한 형태의 PEG 뿐만이 아니라, 중합체는 상기한 중합체 중 임의의 하나를 포함하는 중합체 내에 1개 이상의 약하거나 분해가능한 연결부 (예컨대, 가수분해에 의해 분해가능한 연결부)를 갖도록 제조될 수도 있다. 예를 들어, PEG는 중합체 내에 가수분해 대상인 에스테르 연결부를 갖도록 제조될 수 있다. 하기에 나타낸 바와 같이, 이러한 가수분해로 인해 중합체가 더 낮은 분자량의 단편들로 절단된다:
Figure 112007009010618-pct00007
중합체 주쇄 내의 분해가능한 연결부로서 유용한, 가수분해에 의해 분해가능한 다른 연결부로는, 카르보네이트 연결부; 예를 들어 아민과 알데히드의 반응으로 생성되는 이민 연결부 (예를 들어 문헌 [Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3] 참조); 예를 들어 알콜을 포스페이트기와 반응시켜 형성되는 포스페이트 에스테르 연결부; 전형적으로 히드라지드와 알데히드의 반응으로 형성되는 히드라존 연결부; 전형적으로 알데히드와 알콜 사이의 반응으로 형성되는 아세탈 연결부; 예를 들어 포르메이트와 알콜 사이의 반응으로 형성되는 오르토에스테르 연결부; 예를 들어 PEG와 같은 중합체 말단의 아민기와 또다른 PEG 쇄의 카르복실기에 의해 형성되는 아미드 연결부; 예를 들어 종결 이소시아네이트기를 갖는 PEG와 PEG 알콜의 반응으로 형성되는 우레탄 연결부; 예를 들어 PEG와 같은 중합체 말단의 아민기와 펩티드의 카르복실기에 의해 형성되는 펩티드 연결부; 및 예를 들어 중합체 말단의 포스포르아미디트기와 올리고뉴클레오티드의 5' 히드록실기의 반응 등에 의해 형성되는 올리고뉴클레오티드 연결부 등이 있다.
중합체 접합체에 있어서의 이러한 임의의 특징, 즉, 1개 이상의 분해가능한 연결부가 중합체 쇄로 도입되는 것은, 투여시에 접합체에 대하여 최종적으로 원하는 약리학적 성질을 부가적으로 제어하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 크고 비교적 불활성인 접합체 (예컨대, 인자 IX 부분에 부착된 1개 이상의 고분자량 PEG 쇄, 예를 들어, 분자량이 약 10,000 초과인 1개 이상의 PEG 쇄를 갖는, 본질적으로 생활성을 보유하지 않는 접합체)가 투여되면, 이것이 가수분해되어 원래 PEG 쇄의 일부를 보유하는 생활성 접합체가 생성될 수 있다. 이러한 방법으로, 접합체의 성질이 더욱 효과적으로 조정되어 접합체의 생활성이 시간 경과에 따라 균형을 이루도록 할 수 있다.
당업자는 실질적으로 수용성인 중합체 세그먼트와 관련하여 전술한 논의가 한정적인 것이 아니라 단지 예시하는 것에 불과하며, 앞서 기재한 성질을 갖는 모든 중합체성 물질이 고려된다는 것을 인지할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중합체성 시약"은 일반적으로 수용성 중합체 세그먼트 및 관능기를 포함할 수 있는 전체 분자를 지칭한다.
접합체
상기한 바와 같이, 본 발명의 접합체는 인자 IX 부분에 (직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해) 공유 부착된 수용성 중합체를 포함한다. 전형적으로, 임의의 주어진 접합체에는 인자 IX 부분에 공유 부착된 1개 내지 4개의 수용성 중합체가 존재한다 (여기서, 각 수용성 중합체에서 상기 수용성 중합체는 인자 IX 부분에 직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해 부착될 수 있음). 그러나, 몇몇 예에서는 접합체가 인자 IX 부분에 개별적으로 부착된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 이상의 수용성 중합체를 가질 수 있다. 또한, 접합체는 인자 IX 부분에 개별적으로 부착된 8개 이하의 수용성 중합체, 인자 IX 부분에 개별적으로 부착된 7개 이하의 수용성 중합체, 인자 IX 부분에 개별적으로 부착된 6개 이하의 수용성 중합체, 인자 IX 부분에 개별적으로 부착된 5개 이하의 수용성 중합체, 인자 IX 부분에 개별적으로 부착된 4개 이하의 수용성 중합체, 인자 IX 부분에 개별적으로 부착된 3개 이하의 수용성 중합체, 및 인자 IX 부분에 개별적으로 부착된 2개 이하의 수용성 중합체를 포함할 수 있다.
인자 IX 부분과 중합체 (또는 중합체에 부착된 스페이서 부분) 사이의 특정 연결부는 수많은 요인에 따라 달라진다. 이러한 요인의 예로는, 특정 연결부의 화학적 성질, 특정 인자 IX 부분, 인자 IX 부분 내의 이용가능한 관능기 (중합체로의 부착 또는 적합한 부착 부위로의 전환에 이용), 인자 IX 부분 내 부가적인 반응성 관능기의 존재 가능성 등이 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 인자 IX 부분과 중합체 (또는 중합체에 부착된 스페이서 부분) 사이의 연결부는 가수분해에 안정적인 연결부, 예를 들어 아미드, 우레탄 (또한 카르바메이트라고도 알려져 있음), 아민, 티오에테르 (또한 술파이드라고도 알려져 있음), 또는 우레아 (또한 카르바미드라고도 알려져 있음)이다. 하나 이상의 실시양태에서, 상기 연결부는 트리아진, 아세틸, 히드라진, 디아조늄, 아미노, 또는 숙신이미딜 에스테르 관능기를 보유하는 중합체성 시약과 인자 IX 부분과의 반응으로 인한 것이 아니다. 몇몇 경우에는 상기 연결부가 카르바메이트 연결부도 아니고 카르바미드 연결부도 아닌 것이 바람직하며, 추가로 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트 종을 보유하는 중합체 유도체와 인자 IX 부분과의 반응을 기초로 하여 형성되는 연결부는 없는 것이 바람직하다. 다시, 가수분해에 안정적인 바람직한 연결부는 아미드이다. 아미드는 인자 IX 부분 내에 함유된 카르복실기 (예컨대, 인자 IX 활성을 갖는 펩티드 부분의 종결 카르복실기)와 아미노-종결된 중합체와의 반응으로 쉽게 제조될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 인자 IX 부분과 중합체 (또는 중합체에 부착된 스페이서 부분) 사이의 연결부는 분해가능한 연결부이다. 이러한 방법으로, 수용성 중합체 (및 임의의 스페이서 부분)의 연결부는 "절단가능"하다. 즉, 수용성 중합체 (및 임의의 스페이서 부분)가 (가수분해 또는 효소 반응 등을 통해) 절단되어, 천연 또는 접합되지 않은 인자 IX 부분을 생성한다. 바람직하게는, 절단가능한 연결부로 인해, 수용성 중합체 (및 임의의 스페이서 부분)의 임의의 단편을 남기지 않고 상기 중합체 (및 임의의 스페이서 부분)가 인자 IX 부분으로부터 생체내 분리된다. 분해가능한 연결부의 예로는 카르보네이트, 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 티오에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 및 오르토에스테르 등이 있다. 이러한 연결부는, 인자 IX 부분 (예컨대, 단백질의 카르복실기 C 종결부 또는 단백질 내에 함유된 세린 또는 트레오닌과 같은 아미노산의 측쇄 히드록실기) 및/또는 중합체성 시약을 당 분야에서 통상적으로 이용되는 커플링 방법으로 적절히 개질시켜 쉽게 제조될 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 것은 적합하게 활성화된 중합체를 인자 IX 활성을 갖는 부분 내에 함유된 비-개질된 관능기와 반응시켜 쉽게 형성되는 가수분해가능한 연결부이다.
연결부와 관련한 본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 아미노산 잔기에서 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하며, 상기 아미노산 잔기는 직접적으로 또는 상기 스페이서 부분을 통해 -CH2-C(O)-O-, -N(H)-C(O)CH2-O-, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-CH2-O-, -C(O)-CH2-O-, -C(O)-CH2-CH2-C(O)-O-, 디아조 또는 트리아진 연결부에 의해 부착되지는 않은 접합체가 제공된다.
접합체 (접합되지 않은 인자 IX 부분과는 달리)는 측정가능한 정도의 인자 IX 활성을 보유할 수도 있고 보유하지 않을 수도 있다. 즉, 본 발명에 따른 접합체는 어디에서든 비-개질된 모(母) 인자 IX 부분의 생활성의 약 0％ 내지 약 100％ 또는 그 이상을 보유할 것이다. 바람직하게는, 인자 IX 활성을 거의 보유하지 않거나 전혀 보유하지 않는 화합물은 전형적으로 중합체를 인자 IX 부분에 연결시키는 가수분해가능한 연결부를 함유하여, 접합체가 활성을 갖지 않는 것과는 관계없이, 수성 환경으로 인한 연결부 절단시에 활성 모 분자 (또는 인자 IX 활성을 갖는 그의 유도체)를 방출한다. 이러한 활성은, 사용된 인자 IX 활성을 갖는 특정 부분의 공지된 활성에 따라 적합한 생체내 또는 시험관내 모델을 이용하여 결정될 수 있다.
임의로는, 각 수용성 중합체 부분의 절단은 생리적으로 절단가능하고/하거나 효소적으로 분해가능한 연결부, 예를 들어 우레탄, 아미드, 카르보네이트 또는 에스테르-함유 연결부의 사용에 의해 용이해진다. 이러한 방법으로, 접합체의 [개별적인 수용성 중합체(들)의 절단을 통한] 제거율을 중합체 분자 크기 및 원하는 제거율 특성을 제공할 관능기 유형을 선택하여 조정할 수 있다. 당업자는 중합체의 적당한 분자 크기 및 절단가능한 관능기를 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 일상적인 실험을 이용하여 우선 중합체 중량과 절단가능한 관능기가 상이한 다양한 중합체-인자 IX 접합체를 제조한 후에 이 접합체를 환자에게 투여하고 주기적으로 혈액 및/또는 뇨의 샘플을 채취해서 각 접합체의 제거율 프로파일을 구함으로써 적당한 분자 크기 및 절단가능한 관능기를 결정할 수 있다. 각각의 시험된 접합체에 대한 일련의 제거율 프로파일이 일단 구해지면, 원하는 제거율을 갖는 접합체를 확인할 수 있다.
전형적으로, 인자 IX 부분을 중합체에 커플링하고 가수분해에 안정적인 연결부를 보유하는 접합체는 측정가능한 정도의 인자 IX 활성을 보유할 것이다. 예를 들어, 이러한 접합체는 접합되지 않은 인자 IX 부분에 대하여 하기하는 비율(％) 중 하나 이상을 충족시키는 생활성을 갖는 것을 특징으로 하는 것이 전형적이다: 약 2％ 이상, 약 5％ 이상, 약 10％ 이상, 약 15％ 이상, 약 25％ 이상, 약 30％ 이상, 약 40％ 이상 이상, 약 50％ 이상, 약 60％ 이상, 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 97％ 이상, 약 100％ 이상, 및 105％ 초과 (적합한 모델에서의 측정시, 예를 들어 본원에 기재된 것 및/또는 당 분야에서 공지된 것). 가수분해에 안정적인 연결부 (예컨대, 아미드 연결부)를 갖는 접합체는 비-개질된 모 인자 IX 부분의 생활성을 적어도 어느 정도는 보유하는 것이 바람직하다.
이하에서는 접합체의 예를 기재한다. 인자 IX 부분은 천연 인자 IX와 유사하거나 이와 관련이 있는 아미노산 서열을 (적어도 일부) 공유한다고 예측된다. 따라서, 천연 인자 IX 단백질 내의 특정 위치 또는 원자를 언급할 것이지만, 이러한 언급은 단지 편의를 위한 것에 불과하며, 당업자라면 인자 IX 활성을 갖는 다른 부분에서 그에 상응하는 위치 또는 원자를 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 특히, 천연 인자 IX에 관한 본원의 기재는 전술한 것의 임의의 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 부가 변이체 뿐만이 아니라 종종 인자 IXa에도 적용될 수 있다.
인자 IX 부분상의 아미노기가 인자 IX 부분과 수용성 중합체 사이의 부착 지점을 제공할 수 있다. 천연 인자 IX는 27개의 리신 잔기를 포함하며, 이들 각각은 아미노 종결부 뿐만이 아니라 접합에 이용될 수 있는 ε-아미노기를 갖는다. 따라서, 이러한 인자 IX 부분의 부착 지점의 예는 (리신의 아민-함유 측쇄를 통해) 위치 39, 45, 51, 68, 89, 109, 127, 137, 146, 168, 189, 234, 247, 260, 274, 293, 311, 339, 347, 362, 387, 438, 440, 446, 455, 457 및 459 중 임의의 하나 이상의 아미노산에서의 부착을 포함한다. 추가로, 인자 IX 활성을 갖는 임의의 단백질의 N-종결 아민이 부착 지점으로 기능할 수도 있다.
인자 IX 부분의 이용가능한 아민과 공유 연결부를 형성하는데 유용한 적합한 수용성 중합체성 시약에는 수많은 예가 있다. 구체적인 예를 상응하는 접합체와 함께 하기 표 1에 기재하였다. 표 1에서, 변수 (n)은 반복 단량체 단위의 수를 나타내고, "-NH-F9"는 수용성 중합체에 접합된 인자 IX 부분을 나타낸다. 표 1에 제시한 각 중합체 부분 [예를 들어 (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]은 "CH3"기로 종결하지만, 다른 기 (예컨대 H 및 벤질)가 이것을 대신할 수도 있다.
Figure 112007009010618-pct00008
Figure 112007009010618-pct00009
Figure 112007009010618-pct00010
Figure 112007009010618-pct00011
Figure 112007009010618-pct00012
Figure 112007009010618-pct00013
Figure 112007009010618-pct00014
중합체성 시약을 인자 IX 부분의 아민기에 접합시키는 것은 다양한 기술로 수행될 수 있다. 한 접근법에서, 인자 IX 부분은 숙신이미딜 유도체 (또는 다른 활성화된 에스테르기 - 여기서, 숙신이미딜 유도체에 대하여 기재한 것과 유사한 접근법이 다른 활성화된 에스테르기-함유 중합체성 시약에 대해 사용될 수 있음)로 관능화된 중합체성 시약에 접합될 수 있다. 이 접근법에서, 숙신이미딜기를 보유하는 중합체성 시약은 pH 7.0 내지 9.0의 수성 매질 중에서 인자 IX 부분에 부착될 수 있으며, 다른 반응 조건 (예컨대, pH 6 내지 7과 같은 더 낮은 pH, 또는 다른 온도 및/또는 15℃ 미만)을 이용하면 중합체가 인자 IX 부분상의 다른 위치에 부착될 수 있다. 또한, 아미드 연결부는 아민-종결된 비-펩티드 수용성 중합체와 알데히드기 또는 활성화된 카르복실산기를 보유하는 인자 IX 부분과의 반응으로 형성될 수 있다.
접합체의 예는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112007009010618-pct00015
여기서,
(n)은 2 내지 3400의 값을 갖는 정수이고,
X는 스페이서 부분, 바람직하게는 메틸렌 ("-CH2-"), 에틸렌 ("-CH2CH2-") 및 프로필렌 ("-CH2CH2CH2-") 중 하나이고,
R1은 유기 라디칼, 바람직하게는 H 또는 메틸 ("-CH3")이며,
F9는 인자 IX 부분이다.
인자 IX 부분을 중합체성 시약에 접합시키는데 유용한 또다른 전형적인 접근법은, 인자 IX 부분의 1급 아민을 케톤, 알데히드 또는 그의 수화된 형태 (예컨대, 케톤 수화물 및 알데히드 수화물)로 관능화된 중합체와 접합시키는 환원적 아미노화 반응을 이용하는 것이다. 이 접근법에서, 인자 IX 부분으로부터의 1급 아민은 알데히드 또는 케톤의 카르보닐기 (또는 수화된 알데히드 또는 케톤의 상응하는 히드록시-함유 기)와 반응하여 쉬프(Schiff) 염기를 형성한다. 이어서, 쉬프 염기는 이후에 붕수소화나트륨과 같은 환원제의 사용을 통해 안정적인 접합체로 환원적으로 전환될 수 있다. 특히 케톤 또는 알파-메틸 분지형 알데히드로 관능화된 중합체의 경우 및/또는 특정 반응 조건 (예컨대, 감소된 pH)하에서는 선택적인 반응이 가능하다 (예컨대, N-종결부에서의 선택적인 반응이 가능함).
카르복실기는 인자 IX 부분상의 부착 지점으로 기능할 수 있는 또다른 관능기를 대표한다. 구조적으로, 접합체는 하기 구조를 포함한다:
Figure 112007009010618-pct00016
여기서,
F9 및 인접한 카르보닐기는 카르복실-함유 인자 IX 부분에 상응하고,
X는 스페이서 부분, 바람직하게는 O, N(H), 및 S로부터 선택된 헤테로원자이며,
POLY는 수용성 중합체, 예를 들어 임의로 말단-캡핑 부분으로 종결하는 PEG이다.
C(O)-X 연결부는 종결 관능기를 보유하는 중합체성 유도체와 카르복실-함유 인자 IX 부분 사이의 반응으로 생성된 것이다. 앞서 논의한 바와 같이, 구체적인 연결부는 이용되는 관능기의 유형에 따라 달라질 것이다. 중합체가 히드록실기로 말단-관능화되거나 "활성화"된다면, 생성되는 연결부는 카르복실산 에스테르일 것이고 X는 O일 것이다. 중합체 주쇄가 티올기로 관능화된다면, 생성되는 연결부는 티오에스테르일 것이고 X는 S일 것이다. 특정 다중-분지형, 분지형 또는 포크형 중합체가 사용되는 경우, C(O)X 부분, 특히 X 부분은 비교적 더 복잡할 수 있고 더 긴 연결부 구조를 포함할 수 있다.
히드라지드 부분을 함유하는 중합체성 시약도 카르보닐에서의 접합에 유용하다. 인자 IX 부분이 카르보닐 부분을 함유하지 않는다면, 임의의 카르복실산 (예컨대, C-종결 카르복실산)을 환원시키고/시키거나 인자 IX 부분이 글리코실화되거나 당화된 (첨가된 당이 카르보닐 부분을 가짐) 형태를 제공함으로써 카르보닐 부분을 도입할 수 있다. 히드라지드 부분을 포함하는 중합체성 시약의 구체적인 예를 상응하는 접합체와 함께 하기 표 2에 기재하였다. 또한, 활성화된 에스테르 (예컨대, 숙신이미딜기)를 포함하는 임의의 중합체성 시약은, 활성화된 에스테르를 포함하는 중합체성 시약을 히드라진 (NH2-NH2) 또는 tert-부틸 카르바제이트 [NH2NHCO2C(CH3)3]와 반응시킴으로써 히드라지드 부분을 함유하도록 전환시킬 수 있다. 표 2에서, 변수 (n)은 반복 단량체 단위의 수를 나타내고, "=C-F9"는 중합체성 시약에 접합된 인자 IX 부분을 나타낸다. 임의로는 적합한 환원제를 사용하여 히드라존 연결부를 환원시킬 수 있다. 표 2에 제시한 각 중합체 부분 [예를 들어 (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]은 "CH3"기로 종결하지만, 다른 기 (예컨대 H 및 벤질)가 이것을 대신할 수도 있다.
Figure 112007009010618-pct00017
Figure 112007009010618-pct00018
인자 IX 부분 내에 함유된 티올기는 수용성 중합체와의 부착에 효과적인 부위로서 기능할 수 있다. 특히, 인자 IX 부분이 단백질인 경우에는 시스테인 잔기가 티올기를 제공한다. 이러한 시스테인 잔기 내의 티올기는 티올기와의 반응에 특이적인 활성화된 PEG와 반응할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,739,208호 및 국제 특허 공개 제WO 01/62827호에 기재된 바와 같은 N-말레이미딜 중합체 또는 다른 유도체).
이론에 얽매이려는 것은 아니지만, 인자 IX 내의 모든 시스테인 잔기가 디술파이드 결합에 관여하는 것으로 여겨진다. 결과적으로, 디술파이드 결합에 관여하는 시스테인 잔기와의 접합은 인자 IX의 3차 구조를 파괴할 수 있고, 잠재적으로는 전체 활성을 유의하게 감소시킬 수 있다. 따라서, 임의의 특정 인자 IX 부분에 티올기가 없거나 디술파이드 결합의 파괴를 방지하기 위해서는 통상의 합성 기술을 이용하여 시스테인 잔기를 인자 IX 부분에 첨가하는 것이 가능하다 (예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 90/12874호에 기재된 시스테인 잔기 첨가 절차 참조; 이 절차는 인자 IX 부분을 위해 채택될 수 있음). 또한, 통상의 유전자 조작 방법이 시스테인 잔기를 인자 IX 부분에 도입하는데 사용될 수도 있다.
구체적인 예를 상응하는 접합체와 함께 하기 표 3에 기재하였다. 표 3에서, 변수 (n)은 반복 단량체 단위의 수를 나타내고, "-S-F9"는 수용성 중합체에 접합된 인자 IX 부분을 나타낸다. 표 3에 제시한 각 중합체 부분 [예를 들어 (OCH2CH2)n 또는 (CH2CH2O)n]은 "CH3"기로 종결하지만, 다른 기 (예컨대 H 및 벤질)가 이것을 대신할 수도 있다.
Figure 112007009010618-pct00019
Figure 112007009010618-pct00020
Figure 112007009010618-pct00021
1개 이상의 말레이미드 관능기를 보유하는 수용성 중합체로부터 형성된 중합체와 관련하여 (상기 말레이미드가 인자 IX 부분상의 아민 또는 티올기와 반응하는지 여부와는 관계없음), 수용성 중합체의 상응하는 말레아믹산 형태(들)이 인자 IX 부분과 반응할 수도 있다. 특정 조건 (예컨대, pH 약 7 내지 9 및 물의 존재)하에서는 말레이미드 고리가 "개환"되어 상응하는 말레아믹산을 형성할 것이다. 말레아믹산은 이후에 인자 IX 부분의 아민 또는 티올기와 반응할 수 있다. 말레아믹산-기재 반응의 예를 하기에 개략적으로 나타내었다. POLY는 수용성 중합체를 나타내고, F9는 인자 IX 부분을 나타낸다.
Figure 112007009010618-pct00022
본 발명에 따른 대표적인 접합체는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure 112007009010618-pct00023
여기서,
POLY는 수용성 중합체이고,
L은 임의의 링커이고,
Z는 O, NH, 및 S로 이루어진 군에서 선택된 헤테로원자이고,
Y는 C2 -10 알킬, C2 -10 치환된 알킬, 아릴, 및 치환된 아릴로 이루어진 군에서 선택되며,
F9는 인자 IX 부분이다.
인자 IX 부분과 반응하여 이러한 유형의 접합체를 생성할 수 있는 중합체성 시약은 미국 특허 출원 공개 제2005/0014903호에 기재되어 있다.
본원 등에 기재된 중합체성 시약은 시판하는 공급처 (예컨대, 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics), 미국 알라바마주 헌츠빌 소재)로부터 구입할 수 있다. 또한, 상기 중합체성 시약의 제조 방법도 문헌에 기재되어 있다.
인자 IX 부분 및 수용성 중합체 사이의 부착은 직접적 (인자 IX 부분 및 중합체 사이에 개재 원자가 위치하지 않음) 또는 간접적 (인자 IX 부분 및 중합체 사이에 1개 이상의 원자가 위치함)일 수 있다. 간접 부착과 관련하여, "스페이서 부분"은 인자 IX 부분 및 수용성 중합체 사이의 연결부로서 작용한다. 스페이서 부분을 구성하는 1개 이상의 원자는 1개 이상의 탄소 원자, 질소 원자, 황 원자, 산소 원자, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 스페이서 부분은 아미드, 2급 아민, 카르바메이트, 티오에테르 및/또는 디술파이드기를 포함할 수 있다. 구체적인 스페이서 부분의 예는 제한되지 않지만, -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -0-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -0-CH2-, -CH2-O-, -0-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-O-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -0-C(O)-NH-CH2-, -0-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j-, 2가 시클로알킬기, -0-, -S-, 아미노산, -N(R6)-, 및 상기 중 어느 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함한다 (여기서, R6은 H, 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴 및 치환된 아릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기 라디칼이고, (h)는 0 내지 6이고, (j)는 0 내지 20임). 다른 구체적인 스페이서 부분은 하기 구조를 갖는다: -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)- 및 -0-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)- (여기서, 각각의 메틸렌에 대한 하첨자 값은 구조체 중 함유된 메틸렌의 개수를 나타내며, 예를 들어 (CH2)1-6은 상기 구조가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 메틸렌을 함유할 수 있음을 의미함). 추가로, 임의의 상기 스페이서 부분은 1 내지 20개의 에틸렌 옥시드 단량체 단위를 포함한 에틸렌 옥시드 올리고머 쇄 [즉, -(CH2CH2O)1-20]를 더 포함할 수 있다. 즉, 에틸렌 옥시드 올리고머 쇄는 스페이서 부분 앞 또는 뒤에 존재할 수 있으며, 임의로는 2개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분 중의 임의의 2개의 원자 사이에 존재할 수 있다. 또한, 올리고머가 중합체 세그먼트에 인접하고 단지 중합체 세그먼트의 연장을 나타내는 경우, 올리고머 쇄는 스페이서 부분의 일부로 인정되지 않을 것이다. 스페이서 부분은 당 또는 탄수화물을 포함하지 않고, 접합체는 직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해 당 또는 탄수화물에 부착되어 인자 IX 부분에 부착된 임의의 수용성 중합체를 갖지 않는 것이 바람직하다.
일부 예에서, 접합체는 단일 인자 IX 부분과 결합된 단일 수용성 중합체만을 가질 수 있다. 결론적으로, 비선형 수용성 중합체인 수용성 중합체를 갖는 것 (그리고 비선형 중합체성 시약을 사용하여 접합체를 제조하는 것)이 바람직할 수 있다. 바람직한 비선형 수용성 중합체는 분지형 수용성 중합체이지만, 다중-분지형 수용성 중합체도 포함한다. 분지형 수용성 중합체를 혼입함으로써, 예를 들어, 단일 중합체와 비교하여 각각의 부착 부위에 대해 유효한 분자량을 두배로 하는 것이 가능하다.
수용성 중합체가 분지형 형태인 본 발명의 예시적인 접합체는 리신-기재의 분지형 중합체를 포함하는 분지형 형태 및 하기 구조를 포함하는 분지형 형태를 포함한다.
Figure 112007009010618-pct00024
여기서, 각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 3400의 정수이다.
본 발명의 예시적인 접합체는 하기 구조를 포함한다.
Figure 112007009010618-pct00025
여기서,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 3400의 정수이고;
X는 스페이서 부분이고;
(b)는 2 내지 6의 정수이고;
(c)는 2 내지 6의 정수이고;
R2는 각각의 경우 독립적으로 H 또는 저급 알킬이고;
F9는 인자 IX 부분이다.
본 발명의 예시적인 접합체 하기 구조를 포함한다.
Figure 112007009010618-pct00026
여기서,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 3400의 정수이고;
F9는 인자 IX 부분이다.
본 발명의 또다른 예시적인 접합체는 하기 구조를 포함한다.
Figure 112007009010618-pct00027
여기서,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 3400의 정수이고;
(a)는 0 또는 1이고;
X는, 존재하는 경우, 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분이고;
(b')는 0 또는 1 내지 10의 정수이고;
(c)는 1 내지 10의 정수이고;
R2는, 각각의 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
R3은, 각각의 경우, 독립적으로 H 또는 유기 라디칼이고;
F9는 인자 IX 부분이다.
본 발명의 예시적인 접합체는 하기 구조를 포함한다.
Figure 112007009010618-pct00028
여기서,
각각의 (n)은 독립적으로 2 내지 3400의 정수이고;
F9는 인자 IX 부분이다.
조성물
접합체는 전형적으로 조성물의 한 부분이다. 일반적으로, 조성물은 다수개의 접합체, 필수적이지는 않지만 바람직하게는, 1개의 인자 IX 부분에 (직접적으로 또는 스페이서 부분을 통해) 별도로 공유 부착된 1, 2, 3 또는 4개의 수용성 중합체를 갖는 다수개의 접합체를 포함한다. 그러나, 조성물은 또한 인자 IX 활성을 갖는 임의의 주어진 부분에 부착된 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 중합체를 갖는 다른 접합체를 포함할 수도 있다. 추가로, 본 발명은 조성물이 다수개의 접합체를 포함하는 예를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 1개의 인자 IX 부분에 공유 부착된 1개의 수용성 중합체를 포함하고, 또는 조성물은 1개의 인자 IX 부분에 공유 부착된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 수용성 중합체를 포함한다 .
본 발명의 하나 이상의 실시양태에서, 다수개의 접합체를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 조성물 중 모든 접합체의 약 80％ 이상은 각각 1, 2, 3 또는 4개의 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분로 이루어지고, 추가로 접합체의 각각의 수용성 중합체에 대하여, 인자 IX 부분은 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 수용성 중합체에 부착된다.
조성물 중의 접합체와 관련하여, 조성물은 전형적으로 하나 이상의 하기 특징을 만족할 것이다: 조성물 중 약 85％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 5개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 85％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 4개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 85％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 3개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 85％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 또는 2개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 85％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1개의 중합체를 가질 것이고 (즉, 모노PEG화됨); 조성물 중 약 95％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 5개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 95％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 4개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 95％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 3개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 95％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 또는 2개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 95％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1개의 중합체를 가질 것이고 (즉, 모노PEG화됨); 조성물 중 약 99％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 5개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 99％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 4개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 99％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 내지 3개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 99％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1 또는 2개의 중합체를 가질 것이고; 조성물 중 약 99％ 이상의 접합체가 인자 IX 부분에 부착된 1개의 중합체를 가질 것이다 (즉, 모노PEG화됨).
하나 이상의 실시양태에서, 접합체-함유 조성물이 알부민을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 조성물이 인자 IX 활성을 갖지 않는 단백질을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 조성물은 알부민 85％ 무함유, 더욱 바람직하게는 95％ 무함유, 가장 바람직하게는 99％ 무함유인 것이 바람직하다. 또한, 조성물은 인자 IX 활성을 갖지 않는 단백질 85％ 무함유, 더욱 바람직하게는 95％ 무함유, 가장 바람직하게는 99％ 무함유인 것이 바람직하다. 알부민이 조성물 중에 존재하는 정도까지, 본 발명의 예시적인 조성물은 인자 IX 부분의 잔기를 알부민에 연결하는 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 포함하는 접합체를 실질적으로 함유하지 않는다.
임의의 소정 부분에 대한 바람직한 중합체의 개수는 적절한 중합체성 시약, 중합체성 시약 대 인자 IX 부분의 비율, 온도, pH 조건, 및 접합 반응의 다른 측면을 선택함으로써 조절될 수 있다. 추가로, 원하지 않는 접합체 (예컨대, 4개 이상의 부착된 중합체를 갖는 접합체)는 정제 수단을 통해 감소 또는 제거될 수 있다.
예를 들어, 중합체-인자 IX 부분의 접합체는 상이한 접합 종을 수득/단리하기 위해 정제될 수 있다. 특히, 생성물 혼합물은 인자 IX 부분 당 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 PEG, 전형적으로 인자 IX 부분 당 1, 2 또는 3개의 PEG로부터 어디에서든지 평균을 얻기 위해 정제될 수 있다. 최종 접합체 반응 혼합물의 정제를 위한 방법은 다수의 인자, 예를 들어 사용된 중합체성 시약의 분자량, 특정 인자 IX 부분, 목적하는 투여량 섭생, 및 개별 접합체(들)의 잔류 활성 및 생체내 성질을 비롯한 다수의 인자에 따라 좌우될 것이다.
목적한다면, 상이한 분자량을 갖는 접합체는 겔 여과 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 단리될 수 있다. 다시 말하면, 겔 여과 크로마토그래피는 이들의 상이한 분자량 (이러한 차이는 수용성 중합체 부분의 평균 분자량에 반드시 상응해야 함)을 기준으로 하여, 상이하게 넘버링된 중합체-대-인자 IX 부분 비율 (예컨대, 단량체, 이합체, 삼합체, 등, 여기서 "단량체"는 인자 IX 부분에 부착된 1개의 중합체를 나타내고, "이합체"는 인자 IX 부분에 부착된 2개의 중합체를 나타냄)을 분획화하는 데 이용된다. 예를 들어, 55,000 달톤 단백질이 분자량 약 20,000 달톤의 중합체성 시약에 랜덤하게 접합되는 예시적인 반응에서, 생성된 반응 혼합물은 비-개질된 단백질 (분자량이 약 55,000 달톤임), 모노PEG화 단백질 (또는 "단량체") (분자량이 약 75,000 달톤임), 디PEG화 단백질 (또는 이합체" (분자량이 약 95,000 달톤임) 등을 함유할 수 있다.
이러한 접근법을 이용하여 PEG 및 상이한 분자량을 갖는 다른 중합체-인자 IX 부분의 접합체를 분리할 수 있으나, 이러한 접근법은 일반적으로 인자 IX 부분 내에 상이한 중합체 부착 부위를 갖는 위치 이성질체를 분리하는 것에는 비효과적이다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 단량체, 이합체, 삼합체 등으로 이루어진 각각의 다른 혼합물을 분리할 수 있지만, 각각의 회수된 PEG-합체 조성물은 인자 IX 부분 내에 상이한 반응성 아미노기 (예컨대, 리신 잔기)에 부착된 PEG를 함유할 수 있다.
이러한 분리 유형을 수행하기에 적합한 겔 여과 컬럼은 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences) (뉴저지주 피스카타웨이 소재)로부터 구입할 수 있는 수퍼덱스(SuperdexTM) 및 세파덱스(SephadexTM) 컬럼을 포함한다. 특정 컬럼은 목적하는 분획 범위에 따라 선택될 것이다. 용출은 일반적으로 적합한 완충액, 예컨대 포스페이트, 아세테이트 등을 사용하여 수행된다. 수집된 분획은 여러가지 상이한 방법, 예를 들어, (i) 단백질 함량에 대한 280 nm에서의 흡광도, (ii) 표준으로서 소 혈청 알부민을 사용하는, 염색에 의한 단백질 분석, (iii) PEG 함량에 대한 요오드 검사 (문헌 [Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63]), (iv) 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS PAGE)에 이은 요오드화바륨으로의 염색, 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석될 수 있다.
위치 이성질체의 분리는 역상-고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 방법, 예를 들어 C18 컬럼 또는 C3 컬럼 (아머샴 바이오사이언시즈 또는 바이닥(Vydac))을 사용하는 역상 크로마토그래피, 또는 이온 교환 컬럼, 예를 들어 아머샴 바이오사이언시즈로부터 구입할 수 있는 세파로스(SepharoseTM) 이온 교환 컬럼을 사용하는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 둘 중 하나의 접근법은 동일한 분자량을 갖는 중합체-활성제 이성질체 (위치 이성질체)를 분리하는 데 이용될 수 있다.
조성물은 인자 IX 활성을 갖지 않는 단백질을 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 또한, 조성물은 모든 다른 공유 부착되지 않은 수용성 중합체를 실질적으로 함유하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 일부 환경에서, 조성물은 중합체-인자 IX 부분의 접합체 및 접합되지 않은 인자 IX의 혼합물을 함유할 수 있다.
임의로, 본 발명의 조성물은 또한 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 바람직하다면, 제약상 허용되는 부형제가 접합체에 첨가되어 조성물을 형성할 수 있다.
예시적인 부형제로는 탄수화물, 무기 염, 항균제, 항산화제, 계면활성제, 완충액, 산, 염기, 및 이의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것들이 포함되지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
탄수화물, 예컨대 당, 유도당, 예컨대 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당, 및/또는 당 중합체는 부형제로서 존재할 수 있다. 구체적인 탄수화물 부형제로는, 예를 들어, 단당류, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예컨대 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨류, 예컨대 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨, 소르비톨 (글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등이 포함된다.
부형제로는 또한 무기 염 또는 완충액, 예컨대 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 1염기가 인산나트륨, 2염기가 인산나트륨, 및 이의 조합물이 포함될 수 있다.
조성물은 또한 미생물 성장을 방지하거나 또는 못하게 하는 항균제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항균제의 비제한적인 예로는, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메르솔, 및 이의 조합물이 포함된다.
항산화제 또한 조성물 중에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화를 방지하는 데 사용되어, 접합체 또는 제제 중 다른 성분의 열화를 방지한다. 본 발명에 사용되는 적합한 항산화제로는, 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 하이포아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 비술파이트, 나트륨 포름알데히드 술폭실레이트, 나트륨 메타비술파이트, 및 이의 조합물이 포함된다.
계면활성제가 부형제로서 존재할 수 있다. 예시적인 계면활성제로는, 폴리소르베이트, 예컨대 "트윈(Tween) 20" 및 "트윈 80," 및 플루로닉, 예컨대 F68 및 F88 (둘다 뉴저지주 마운트 올리브 소재의 바스프(BASF)로부터 구입할 수 있음); 소르비탄 에스테르; 지질, 예컨대 인지질, 예컨대 레시틴 및 다른 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (바람직하게는 리포좀 형태는 아님), 지방산 및 지방 에스테르; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤; 및 킬레이트제, 예컨대 EDTA, 아연 및 다른 이러한 적합한 양이온이 포함된다.
산 또는 염기가 조성물 중 부형제로서 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 비제한적인 예로는, 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산, 및 이의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 산이 포함된다. 적합한 염기의 예로는, 이에 제한되지 않지만, 수산화나트륨, 아세트산나트륨, 히드록시암모늄, 히드록시칼륨, 아세트산암모늄, 아세트산칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨, 포름산나트륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 푸마르산칼륨, 및 이의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기가 포함된다.
조성물 중 접합체 (즉, 활성제 및 중합체성 시약 사이에 형성된 접합체)의 양은 다수의 인자에 따라 달라질 것이지만, 조성물이 단위 투여 용기 (예컨대, 바이알) 중 저장되었을 때 최적 치료적 유효량일 수 있을 것이다. 또한, 제약 제제는 시린지에 하우징될 수 있다. 치료적 유효량은 접합체의 양을 증가시키면서 반복 투여함으로써 실험적으로 측정되어, 임상적으로 바람직한 목적을 달성하는 양을 결정할 수 있다.
조성물 중 임의의 개별 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특정 요구에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임의의 개별 부형제의 최적량은 통상의 실험을 통해, 즉 다양한 양의 부형제 (적은 양 내지 많은 양의 범위)를 함유한 조성물을 제조하고, 안정성 및 다른 파라미터를 검사하고, 이어서 유의한 부작용 없이 최적의 성능이 얻어지는 범위를 측정함으로써 결정된다.
그러나, 일반적으로, 부형제는 조성물 중에 약 1 내지 약 99 중량％, 바람직하게는 약 5 내지 약 98 중량％, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 95 중량％의 양으로 존재하며, 30 중량％ 미만의 농도가 가장 바람직하다.
이러한 상기 제약 부형제는 다른 부형제와 함께 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995)]; [the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998)]; 및 [Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000]에 기재되어 있다.
조성물은 모든 유형의 제형, 특히 재현탁가능한 분말 또는 동결건조물 뿐만 아니라 액체와 같이 주사에 적합한 제형을 포함한다. 주사 전에 고체 조성물을 재현탁하기에 적합한 희석제의 예로는, 주사용 정균수, 물 중 5％ 덱스트로스, 포스페이트-완충된 염수, 링거액, 염수, 멸균수, 탈염수, 및 이의 조합물이 포함된다. 액체 제약 조성물과 관련하여, 용액 및 현탁액도 예상된다.
본 발명의 조성물은 필수적이지는 않지만 전형적으로 주사를 통해 투여되고, 따라서 일반적으로 투여 직전에는 액체 용액 또는 현탁액이다. 제약 제형은 또한 다른 형태, 예를 들어, 시럽, 크림, 연고, 정제, 산제 등의 형태를 취할 수 있다. 다른 투여 방식, 예를 들어 폐, 직장, 피내, 점막내, 경구, 경막내, 피하, 동맥내 투여 등도 또한 포함된다.
본 발명은 또한 접합체를 사용하는 치료에 반응하는 상태를 앓는 환자에게 본원에서 제공되는 바와 같은 접합체를 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의 접합체 (바람직하게는 제약 조성물의 일부로서 제공됨)를 일반적으로 주사를 통해 전달하는 것을 포함한다. 접합체 (전형적으로 제약 조성물의 일부로서)는, 예를 들어, 정맥내 주사, 근육내 주사, 피하 주사 등에 의해 전달될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제형으로는 즉시-주사 용액, 사용전에 용매와 합쳐지는 건조 분말, 사용전에 비히클과 합쳐지는 건조 불용성 조성물, 및 투여전에 희석되는 에멀젼 및 액체 농축물 등이 있다.
전달 방법은 접합체의 투여에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 증상을 가진 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 당업자들은 특정 접합체가 효과적으로 치료할 수 있는 증상을 인지할 것이다. 예를 들어, 접합체를 대체요법으로서 또는 예방 성분으로 사용하여 혈우병 B를 앓고 있는 개체를 치료할 수 있다. 예방을 위한 접합체의 투여는 혈우병 B를 앓고 있는 환자가 곧 수술을 해야하는 상황을 포함하며, 수술하기 1 내지 4시간 전에 접합체를 투여한다. 또한, 접합체는 조절되지 않는 출혈에 대한, 임의로는 혈우병을 앓고 있지 않은 환자에서 예방제로서 사용하기에 적합하다. 따라서, 예를 들어, 접합체는 조절되지 않는 출혈에 대한 위험이 있는 환자에게 수술 전에 투여될 수 있다.
투여하고자 하는 실제 용량은 대상체의 연령, 체중 및 일반적인 상태, 및 치료하고자 하는 상태의 중증도, 건강 전문인의 판단, 및 투여되는 접합체에 따라 달라질 것이다. 치료적 유효량은 당업자들에게 공지되어 있고/있거나 관련 자료 및 문헌에 기재되어 있다. 일반적으로, 중량 기준으로, 치료적 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg의 범위, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일의 용량, 및 더욱 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량일 것이다. 활성을 기준으로, 활성의 국제 단위를 기준으로 하는 상응하는 용량은 당업자에 의해 산출될 수 있다.
임의의 소정 접합체 (다시, 바람직하게는 제약 조성물의 일부로서 제공됨)의 단위 투여량은 임상학자의 판단, 환자의 요구 등에 따라 다양한 투여 스케쥴로 투여될 수 있다. 구체적인 투여 스케쥴은 당업자들에게 공지되어 있을 것이거나 또는 통상의 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. 예시적인 투여 스케쥴은 1일 5회, 1일 4회, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 주 3회, 주 2회, 주 1회, 월 2회, 월 1회 투여, 및 이들의 임의의 조합 투여를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 임상학적 목적이 달성되면, 조성물의 투여를 중단한다.
본 발명은 그의 바람직한 특정 실시양태와 함께 기재되지만, 상기 기재 및 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이고 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아님을 이해한다. 본 발명의 범주 내 다른 측면, 이점 및 변형은 본 발명이 관련된 업계의 기술자들에게 명백할 것이다.
본 발명의 수행은, 달리 나타내지 않는 한, 당업자들이 알고 있는 유기 합성 등의 종래 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명된다. 시약 및 재료는 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 시판 구입가능하다. 예를 들어, 상기 언급된 문헌 [J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms 및 Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992)]를 참조한다.
하기 실시예에서, 사용된 수치 (예컨대, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 확실하게 하기 위해 노력하지만, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 해발 고도에서 대기압 또는 대기압 부근이다.
당업자들에게 공지된 다른 약어를 참조하고, 다른 시약 및 재료를 사용하고, 당업자에 의해 공지된 방법이 이용될 것이지만, 하기 리스트 및 방법 기재가 편의를 위해 제공된다.
NaCNBH3 시아노붕수소화나트륨, 95％ (알드리치(Aldrich))
HCl 염산, 빙원 (피셔(Fisher))
K 또는 kDa 킬로달톤
아세토니트릴 (피셔 옵티마(Fisher Optima))
TFA 트리플루오로아세트산, HPLC 등급 (제이티 베이커(JT Baker))
PBS 포스페이트 완충된 염수 (시그마(Sigma))
SEC 크기 배제 크로마토그래피
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
SDS-PAGE 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동
HEPES [4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산] 생명공학 성능 보증됨, 99.5+％ (시그마)
에틸 알콜, USP, 앱솔루트-200 프루프(Absolute-200 Proof) (AAPER)
NuPAGE® MES [2-(N-모르폴리노)에탄 술폰산] SDS 전개 완충액 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation))
NuPAGE® 4x LDS (리튬 도데실 술페이트) 샘플 완충액 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)
시그마마커, 저분자량 범위 (M.W. 6,500-66,000) (시그마)
시그마마커, 고분자량 범위 (M.W. 36,000-205,000) (시그마)
NuPAGE® 노벡스(Novex) 비스-트리스 [비스(2-히드록시에틸)이미노-트리스(히드록시메틸)메탄-HCl] 겔 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)
SEC- HPLC 분석
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 아길렌트(Agilent) 1100 HPLC 시스템 (아길렌트)에서 수행하였다. SEC-HPLC를 이용하여 분석되는 샘플에 대하여, 각각의 샘플을 pH 7.2에서 소덱스(SHODEX) 단백질 KW-804 컬럼 (일본 도꾜 소재의 쇼와 덴코 가부시키가이샤(Showa Denko KK))을 사용하여 분석하였다. 컬럼에 대한 유속을 0.5 mL/분으로 설정하였다. 용출된 단백질 및 PEG-단백질 접합체를 파장이 280 nm로 설정된 UV-기재 접근법을 이용하여 검출하였다.
SDS-PAGE 분석
나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 엑셀 수렐록(XCELL SURELOCK) 미니-셀(Mini-Cell) 전기영동 시스템 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)을 이용하여 수행하였다. SDS-PAGE를 이용하여 분석되는 샘플에 대하여, 각각의 샘플을 4x LDS 샘플 완충액 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)과 혼합하였다. 이어서 준비된 샘플을 NuPAGE 노벡스 4 내지 12％ 비스-트리스 겔에 로딩하고, NuPAGE® MES 전개 완충액 (캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐 코포레이션)을 사용하여 200 V에서 대략 30분 동안 전개하였다.
RP- HPLC 분석
역상-고성능 액체 크로마토그래피를 C3 역상 컬럼 (해밀턴(Hamilton), 조르박스(Zorbax))를 사용하여 수행하였다. 30 내지 80％ 구배의 아세토니트릴을 0.5 mL/분으로 30분에 걸쳐 승온으로 사용하였다.
서열 1의 아미노산 서열에 상응하는 재조합 인자 IX를 실시예 1 내지 16에서 사용하였다. 인자 IX를 L-히스티딘 및 글리신 둘다를 함유한 완충액 중에서 수득하였다. 완충액 중 L-히스티딘 및 글리신과 결합된 아민기는 인자 IX와 결합된 아민기와 경쟁하기 때문에, 아민-함유 완충액을 아민-무함유 완충액으로 교환하여, 아민-지시된 중합체성 시약을 사용하여 접합시키는 경우 인자 IX 접합 수율을 개선할 필요가 있었다.
간단하게, 교환하고자 하는 완충액의 용적에 따라 2가지 접근법 중 한가지를 이용하여 아민-함유 완충액을 아민-무함유 완충액으로 교환하였다. 비교적 소량 용적의 완충액에 대하여, 500 ㎕ 제바 디솔트(Zeba Desalt) 원심분리 컬럼 (일리노이주 록포드 소재의 피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology))을 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 이용하였다. 비교적 대량 용적의 완충액에 대하여, 컷오프(cutoff)가 분자량 10,000 또는 30,000 달톤인 2 mL 센트리콘(CENTRICON®) 원심분리 필터 장치 (메릴랜드주 빌레르시아 소재의 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation))를 제조자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 이용하였다. 실시예에 사용된 모든 에탄올 무함유 샘플을 1x PBS 완충액(pH 7.5)으로 교환하면서, 실시예에 사용된 모든 에탄올 함유 샘플을 10％ 에탄올-함유 인자 IX 반응 혼합물을 형성하기 위해 첨가된 에탄올 함유 1x PBS 완충액(pH 7.5)으로 교환하였다.
서열 1의 아미노산 서열에 상응하는 재조합 인자 IX를 함유한 아민-무함유 완충액 ("인자 IX 원액")을 실시예 1 내지 16에서 사용하였다. 인자 IX 원액은 약 0.2 mg/mL 내지 0.55 mg/mL의 인자 IX를 함유하였다.
실시예 1
mPEG-SMB, 30kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 1:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00029
아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SMB, 30kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SMB (4.1 mg)를 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 mPEG-SMB 용액을 형성하였 다. mPEG-SMB 대 인자 IX의 1:1 몰비에 이를 때까지 mPEG-SMB 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. mPEG-SMB의 첨가 후, 반응의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SMB의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, SDS PAGE를 샘플에 대해 수행하여 모노-접합된 물질 ("단량체")의 존재를 확인하였다. 도 1에 제공된 겔에서 "1:1 30K SMB"로 표지된 레인을 참조한다. 이후에, 4℃에서 15시간 동안 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
RP-HPLC (C3) 및 제2 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. 제2 SDS PAGE 결과로부터, 접합을 확인하였다. 도 2에 제공된 겔에서 "1:1 30K SMB"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)를 사용하여 생성된 접합체 용액의 성분을 분리하였으며, 생성된 크로마토그램은 0.54％의 수율 (100％ 모노PEG화 또는 "단량체" 종을 나타냄)을 나타내었다. 도 5에 제공된 크로마토그램을 참조한다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SMB를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 2
mPEG-SMB, 30kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 10:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00030
아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SMB, 30kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SMB (4.1 mg)를 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 mPEG-SMB 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 mPEG-SMB가 10몰 초과가 될 때까지 mPEG-SMB 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. mPEG-SMB의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SMB의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, SDS PAGE를 샘플에 대해 수행하여 모노-접합된 물질 ("단량체")의 존재를 확인하였다. 도 1에 제공된 겔에서 "10:1 30K SMB"로 표지된 레인을 참조한다. 이후에, 4℃에서 15시간 동안 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
RP-HPLC (C3) 및 제2 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. 제2 SDS PAGE 결과로부터, 접합을 확인하였다. 도 2에 제공된 겔에서 "10:1 30K SMB"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)를 사용하여 생성된 접합체 용액의 성분을 분리하였으며, 생성된 크로마토그램은 6.4％의 수율 (100％ 모노PEG화 또는 "단량체" 종을 나타냄)을 나타내었다. 도 6에 제공된 크로마토그램을 참조한다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 이 실험을 실온에서 연장된 시간 동안 반복한 후, 반응을 4℃에서 밤새 진행시킬 경우, SDS PAGE 겔에서 보여지는 어두운 밴드에 의해 증명되는 바와 같이 접합체의 수율이 증가되었다. 도 4에서 "10:1 30K SMB"로 표지된 레인을 참조한다. 여기에 기재된 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SMB를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 3
분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 1:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00031
아르곤하에 -20℃에서 저장된 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 (2.0 mg)를 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 용액을 형성하였다. 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 대 인자 IX의 1:1 몰비에 이를 때까지 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드의 첨가 후, 반응 혼합 물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, SDS PAGE를 샘플에 대해 수행하였지만, 검출가능한 접합이 나타나지 않았다. 도 1에 제공된 겔에서 "1:1 40K NHS"로 표지된 레인을 참조한다. 이후에, 반응 용액을 4℃에서 15시간 동안 교반함으로써 접합을 위한 첨가 시간이 제공되어 접합체 용액이 생성되었다.
RP-HPLC (C3) 및 제2 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. 제2 SDS PAGE 결과로부터, 접합을 확인하였다. 도 2에서 제공된 겔에서 "1:1 40K NHS"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)를 사용하여 생성된 접합체 용액의 성분을 분리하였으며, 생성된 크로마토그램은 0.1％의 수율 (100％ 모노PEG화 또는 "단량체" 종을 나타냄)을 나타내었다. 도 7에 제공된 크로마토그램을 참조한다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 4
분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 10:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00032
아르곤하에 -20℃에서 저장된 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 (2.0 mg)를 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드가 10몰 초과가 될 때까지 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, SDS PAGE를 샘플에 대해 수행하였지만, 검출가능한 접합이 나타나지 않았다. 도 1에 제공된 겔에서 "10:1 40K NHS"로 표지된 레인을 참조한다. 이후에, 반응 용액을 4℃에서 15시간 동안 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
RP-HPLC (C3) 및 제2 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. 제2 SDS PAGE 결과로부터, 여전히 접합이 검출되지 않았다. 도 2에서 제공된 겔에서 "10:1 40K NHS"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)를 사용하여 생성된 접합체 용액의 성분을 분리하였으며, 생성된 크로마토그램은 검출가능한 접합체 수율을 나타내지 않았다. 도 8에 제공된 크로마토그램을 참조한다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 5
mPEG-SMB, 30kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 10:1; 에탄올 함유)
Figure 112007009010618-pct00033
에탄올이 특정 단백질의 구조적 가요성을 증가시키는 것으로 생각되어서, 완충액 및 반응계에 에탄올을 도입하였다. 아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SMB, 30kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SMB (10.0 mg)를 첨가된 에탄올과 함께 2 mM HCl 0.5 mL에 용해시켜 10％ 에탄올-함유 mPEG-SMB 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 mPEG-SMB가 10몰 초과가 될 때까지 10％ 에탄올-함유 mPEG-SMB 용액을 10％ 에탄올-함유 인자 IX 반응 혼합물에 첨가하였다. mPEG-SMB의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SMB의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온 에서 3시간 동안 교반하였다. 4℃에서 밤새도록 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합이 검출되지 않았다. 도 3에서 제공된 겔에서 "10:1 30K SMB + EtOH"로 표지된 레인을 참조한다. 이제, 에탄올의 도입이 인자 IX의 구조적 가요성을 증가시켜 mPEG-SMB, 30kDa의 접합을 증가시키는 것이 아니라고 생각된다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SMB를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 6
mPEG-SMB, 30kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 20:1; 에탄올 함유)
Figure 112007009010618-pct00034
에탄올이 특정 단백질의 구조적 가요성을 증가시키는 것으로 생각되어서, 완충액 및 반응계에 에탄올을 도입하였다. 아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SMB, 30kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SMB (10.0 mg)를 첨가된 에탄올과 함께 2 mM HCl 0.5 mL에 용해시켜 10％ 에탄올-함유 mPEG-SMB 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 mPEG-SMB가 20몰 초과가 될 때까지 10％ 에탄올-함유 mPEG-SMB 용 액을 10％ 에탄올-함유 인자 IX 반응 혼합물에 첨가하였다. mPEG-SMB의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SMB의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 4℃에서 밤새도록 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합이 검출되지 않았다. 도 3에서 제공된 겔에서 "20:1 30K SMB + EtOH"로 표지된 레인을 참조한다. 이제, 에탄올의 도입이 인자 IX의 구조적 가요성을 증가시켜 mPEG-SMB, 30kDa의 접합을 증가시키는 것이 아니라고 생각된다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SMB를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 7
분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 10:1; 에탄올 함유)
Figure 112007009010618-pct00035
에탄올이 특정 단백질의 구조적 가요성을 증가시키는 것으로 생각되어서, 완충액 및 반응계에 에탄올을 도입하였다. 아르곤하에 -20℃에서 저장된 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 (2.0 mg)를 첨가된 에탄올과 함께 2 mM HCl 1.0 mL에 용해시켜 10％ 에탄올-함유 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드가 10몰 초과가 될 때까지 10％ 에탄올-함유 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 용액을 10％ 에탄올-함유 인자 IX 반응 혼합물에 첨가하였다. 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 4℃에서 밤새도록 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합이 검출되지 않았다 (결과는 도시되지 않음). 이제, 에탄올의 도입이 인자 IX의 구조적 가요성을 증가시켜 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa의 접합을 증가시키는 것이 아니라고 생각된다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 8
분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 20:1; 에탄올 함유)
Figure 112007009010618-pct00036
에탄올이 특정 단백질의 구조적 가요성을 증가시키는 것으로 생각되어서, 완충액 및 반응계에 에탄올을 도입하였다. 아르곤하에 -20℃에서 저장된 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 (2.0 mg)를 첨가된 에탄올과 함께 2 mM HCl 1.0 mL에 용해시켜 10％ 에탄올-함유 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드가 20몰 초과가 될 때까지 10％ 에탄올-함유 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드 용액을 10％ 에탄올-함유 인자 IX 반응 혼합물에 첨가하였다. 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 4℃에서 밤새도록 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합이 검출되지 않았다 (결과는 도시되지 않음). 이제, 에탄올의 도입이 인자 IX의 구조적 가요성을 증가시켜 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드, 40kDa의 접합을 증가시키는 것이 아니라고 생각된다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 분지형 mPEG2-N-히드록시숙신이미드를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 9
mPEG-SMB, 30kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 20:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00037
아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SMB, 30kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SMB (8.6 mg)를 2 mM HCl 1.0 mL에 용해시켜 mPEG-SMB 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 mPEG-SMB가 20몰 초과가 될 때까지 mPEG-SMB 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. mPEG-SMB의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SMB의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 4℃에서 밤새도록 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다. 이후에, 4℃에서 밤새도록 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
SDS PAGE를 특성 분석을 위해 사용하였다. 제2 SDS PAGE 결과로부터, 접합 을 확인하였다. 도 4에 제공된 겔에서 "20:1 30K SMB"로 표지된 레인을 참조한다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SMB를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 10
mPEG-SPA, 20kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체 대 인자 IX의 비 20:1; 에탄올 함유)
Figure 112007009010618-pct00038
에탄올이 특정 단백질의 구조적 가요성을 증가시키는 것으로 생각되어서, 완충액 및 반응계에 에탄올을 도입하였다. 아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SPA, 20kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SPA (10.0 mg)를 첨가된 에탄올과 함께 2 mM HCl 0.5 mL에 용해시켜 10％ 에탄올-함유 mPEG-SPA 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 mPEG-SPA가 20몰 초과가 될 때까지 10％ 에탄올-함유 mPEG-SPA 용액을 10％ 에탄올-함유 인자 IX 반응 혼합물에 첨가하였다. mPEG-SPA의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SPA의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켰다.
SDS PAGE 결과로부터, 접합이 검출되지 않았다. 도 3에서 제공된 겔에서 "20:1 20K SPA + EtOH"로 표지된 레인을 참조한다. 이제, 에탄올의 도입이 인자 IX의 구조적 가요성을 증가시켜 mPEG-SPA, 20kDa의 접합을 증가시키는 것이 아니라고 생각된다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SPA를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 11
mPEG-SPA, 20kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 40:1; 에탄올 함유)
Figure 112007009010618-pct00039
에탄올이 특정 단백질의 구조적 가요성을 증가시키는 것으로 생각되어서, 완충액 및 반응계에 에탄올을 도입하였다. 아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SPA, 20kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SPA (10.0 mg)를 첨가된 에탄올과 함께 2 mM HCl 0.5 mL에 용해시켜 10％ 에탄올-함유 mPEG-SPA 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 mPEG-SPA가 40몰 초과가 될 때까지 10％ 에탄올-함유 mPEG-SPA 용액을 10％ 에탄올-함유 인자 IX 반응 혼합물에 첨가하였다. mPEG-SPA의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하고, 잘 혼합하였다. 아 미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SPA의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 교반함으로써 계속 커플링시켰다.
SDS PAGE 결과로부터, 접합이 검출되지 않았다. 도 3에서 제공된 겔에서 "40:1 20K SPA + EtOH"로 표지된 레인을 참조한다. 이제, 에탄올의 도입이 인자 IX의 구조적 가요성을 증가시켜 mPEG-SPA, 20kDa의 접합을 증가시키는 것이 아니라고 생각된다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SPA를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 12
분지형 mPEG-부티르알데히드, 20kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 10:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00040
아르곤하에 -20℃에서 저장된 분지형 mPEG2-부티르알데히드, 20kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 분지형 mPEG2-부티르알데히드 (10.9 mg)를 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 분지형 mPEG2-부티르알데히드 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 분지형 mPEG2-부티르알데히드가 10몰 초과가 될 때까지 분지형 mPEG2-부티르알데히드 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. 30 분 동안 혼합한 후, 환원제, NaCNBH3 (1x PBS에 용해됨)를 분지형 mPEG2-부티르알데히드에 대해 과량으로 첨가하였다 (pH를 시험하고, 필요할 경우 조정하여 2급 아민으로의 환원을 보장함). 그 후, 용액을 4℃에서 밤새도록 교반하여 아민 연결부를 통한 커플링을 보장하였다.
RP-HPLC (C3) 및 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합은 검출되지 않았다. 도 4에 제공된 겔에서 "10:1 20K BYA"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)를 사용하여 생성된 접합체 용액의 성분을 분리하였으며, 생성된 크로마토그램으로는 접합된 물질의 존재가 확인되지 않았다. 도 9에 제공된 크로마토그램을 참조한다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 분지형 mPEG2-부티르알데히드를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 13
분지형 mPEG-부티르알데히드, 20kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 20:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00041
아르곤하에 -20℃에서 저장된 분지형 mPEG2-부티르알데히드, 20kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 분지형 mPEG2-부티르알데히드 (10.9 mg)를 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 분지형 mPEG2-부티르알데히드 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 분지형 mPEG2-부티르알데히드가 20몰 초과가 될 때까지 분지형 mPEG2-부티르알데히드 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. 30분 동안 혼합한 후, 환원제, NaCNBH3 (1x PBS에 용해됨)를 분지형 mPEG2-부티르알데히드에 대해 과량으로 첨가하였다 (pH를 시험하고, 필요할 경우 조정하여 2급 아민으로의 환원을 보장함). 그 후, 용액을 4℃에서 밤새도록 교반하여 아민 연결부를 통한 커플링을 보장하였다.
RP-HPLC (C3) 및 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합은 검출되지 않았다. 도 4에 제공된 겔에서 "20:1 20K BYA"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)를 사용하여 생성된 접합체 용액의 성분을 분리하였으며, 생성된 크로마토그램으로는 접합된 물질의 존재가 확인되지 않았다. 도 10에 제공된 크로마토그램을 참조한다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 분지형 mPEG2-부티르알데히드를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 14
mPEG-SPA, 20kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 53:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00042
아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SPA, 20kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SPA (5.4 mg)를 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 mPEG-SPA 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 mPEG-SPA가 53몰 초과가 될 때까지 mPEG-SPA 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. mPEG-SPA의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SPA의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 4℃에서 밤새도록 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
RP-HPLC (C3) 및 제2 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합이 확인되었다. 도 4에 제공된 겔에서 "53:1 20K SPA"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)를 사용하여 생성된 접합체 용액의 성분을 분리하였으며, 생성된 크로마토그램은 약 60％ 접합 수율 (51.9％ 모노PEG화 또는 "단량체" 종 및 8％ 디PEG화 또는 "이합체" 종을 포함함)을 나타내었다. 도 11에 제공된 크로마토그램을 참조한다. 그러나, 비교적 많은 과량의 중합체성 시약으로 인하여 실제 수율은 다소 낮아질 수 있는 것으로 생각된다.
이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SPA를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 15
mPEG-SPA, 20kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 110:1; 에탄올 무함유)
Figure 112007009010618-pct00043
아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-SPA, 20kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-SPA (5.4 mg)를 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 mPEG-SPA 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 mPEG-SPA가 110몰 초과가 될 때까지 mPEG-SPA 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. mPEG-SPA의 첨가 후, 반응 혼합물의 pH를 시험하여 7.2 내지 7.5의 pH를 보장하였다. 아미드 연결부를 통한 인자 IX에 대한 mPEG-SPA의 커플링을 위해, 반응 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 용액을 4℃에서 밤새도록 교반함으로써 계속 커플링시켜 접합체 용액을 생성하였다.
RP-HPLC (C3) 및 제2 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합이 확인되었다. 도 4에 제공된 겔에서 "110:1 20K SPA"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)를 사용하여 생성된 접합체 용액의 성분을 분리하였으며, 생성된 크로마토그램은 약 44％ 접합 수율 (약 100％ 모 노PEG화 또는 "단량체" 종을 나타냄)을 나타내었다. 도 12에 제공된 크로마토그램을 참조한다. 그러나, 비교적 많은 과량의 중합체성 시약으로 인하여 실제 수율은 다소 낮아질 수 있는 것으로 생각된다.
이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 mPEG-SPA를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 16
분지형 mPEG-부티르알데히드, 20kDa를 이용한 인자 IX의 PEG화
(중합체:인자 IX의 비 20:1; 에탄올 함유)
Figure 112007009010618-pct00044
Figure 112007009010618-pct00045
에탄올이 특정 단백질의 구조적 가요성을 증가시키는 것으로 생각되어서, 완충액 및 반응계에 에탄올을 도입하였다. 아르곤하에 -20℃에서 저장된 분지형 mPEG2-부티르알데히드, 20kDa를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 분지형 mPEG2-부티르알데히드 (10.9 mg)를 첨가된 에탄올과 함께 2 mM HCl 1 mL에 용해시켜 10％ 에탄올-함유 분지형 mPEG2-부티르알데히드 용액을 형성하였다. 인자 IX에 대해 분지형 mPEG2-부티르알데히드가 20몰 초과가 될 때까지 10％ 에탄올-함유 분지형 mPEG2-부티르알데히드 용액을 인자 IX 0.07 mg을 함유하는 인자 IX 원액의 분취액에 첨가하였다. 30분 동안 혼합한 후, 환원제, NaCNBH3 (1x PBS에 용해됨)를 분지 형 mPEG2-부티르알데히드에 대해 과량으로 첨가하였다 (pH를 시험하고, 필요할 경우 조정하여 2급 아민으로의 환원을 보장함). 그 후, 용액을 4℃에서 밤새도록 교반하여 아민 연결부를 통한 커플링을 보장하였다.
RP-HPLC (C3) 및 SDS PAGE를 사용하여 생성된 접합체 용액을 특성 분석하였다. SDS PAGE 결과로부터, 접합이 검출되지 않았다. 도 4에 제공된 겔에서 "20:1 20K BYA + EtOH"로 표지된 레인을 참조한다. RP-HPLC (C3)로 검출가능한 접합된 물질의 부재를 확인하였다 (결과는 도시되지 않음). 이제, 에탄올의 도입이 인자 IX의 구조적 가요성을 증가시켜 분지형 mPEG2-부티르알데히드의 접합을 증가시키는 것이 아니라고 생각된다.
반응 시간의 증가, 온도 증가 및/또는 중합체성 시약의 다중 첨가는 수율을 증가시킬 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 동일한 접근법에 의해, 다른 중량-평균 분자량을 갖는 분지형 mPEG2-부티르알데히드를 이용하여 다른 접합체를 제조할 수 있다.
실시예 17
mPEG-SBA를 이용한 인자 IXa의 PEG화
10,000 달톤의 분자량을 갖는 mPEG-숙신이미딜 부타노에이트를 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics; 미국 알라바마주 헌츠빌 소재)로부터 입수하였다. 중합체 시약의 기본 구조는 이하에 제공된다:
Figure 112007009010618-pct00046
인자 IXa는 동결건조될 경우, 아민-무함유 완충액, 예컨대 포스페이트에 용해시켜 7.2 내지 9의 최종 pH를 생성하였다. 그 후, 이 용액에 1.5 내지 10배 몰 초과의 mPEG-SBA를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 수시간 동안 교반하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE에 의해 분석하여 단백질의 PEG화 정도를 측정하였다.
실시예 18
mPEG-PIP, 5K를 이용한 인자 IX의 PEG화
Figure 112007009010618-pct00047
상기 중합체성 시약 (둘다 케톤 및 상응하는 케탈로서 도시됨)은 미국 특허 출원 공개 제2005/0031576호에 기재된 바와 같이 제조하였다.
상기 중합체성 시약을 제조하기 위하여, 메틸렌 클로라이드 (20 ml) 중 5,000 달톤 (1.0 g, 0.002 몰)의 중량-평균 분자량을 갖는 메톡시-폴리에틸렌 글리콜-숙신이미딜 프로피오네이트의 용액에 트리에틸 아민 (0.084 ml, 0.006몰) 및 4-피페리돈 모노히드레이트 히드로클로라이드 (0.077 g, 0.005몰)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 대기하에 실온에서 밤새도록 교반한 후, 정제하고, 그 후 접합시 켰다. 별법으로, 중합체 시약을 넥타 테라퓨틱스로부터 구입할 수 있다.
접합을 수행하기 위하여, 수성 완충액 중 인자 IX의 용액에 20배-몰 초과의 mPEG-PIP, 5K를 첨가하였다. 생성된 용액을 저속으로 설정된 로토 믹스 (Roto Mix; 상표명) 궤도 진탕기 (미국 아이오와주 두부크 소재 써몰린 코포레이션 (Thermolyne Corp.) 제품)에 배치하여 실온에서 반응을 용이하게 하였다. 15분 후에, 수성 NaCNBH3를 인자 IX에 대해 50배-몰 초과와 동일한 양으로 첨가하였다. 반응 혼합물로부터 일정한 간격으로 분취액을 취출하고, SDS-PAGE (미국 캘리포니아주 허큘레스 소재 바이오-래드 래버러터리즈 (Bio-Rad Laboratories)로부터 입수가능한 겔을 사용함)에 의해 분석하였다.
SDS-PAGE 분석은 1, 2, 및 3 PEG 부분이 부착된 인자 IX의 PEG 유도체의 존재를 지시하였다.
실시예 19
mPEG-MAL, 20K를 이용한 시스테인-삽입된 인자 IX의 접합
WO 90/12874호에 기재된 방법에 따라 인자 IX에 1개 이상의 시스테인 잔기를 삽입하였다.
접합 전에, 인자 IX에 대한 완충액 교환을 수행하여 히스티딘을 HEPES로 대체하였다.
아르곤하에 -20℃에서 저장된 mPEG-MAL, 20K를 주위 온도로 가온시켰다. 가온된 mPEG-MAL 시약 (4.4 mg)을 HEPES 완충액 [50 mM HEPES (또는 다른 적합한 완 충액) pH 7.0] 0.044 ml에 용해시켜 10％ mPEG-MAL 용액을 제조하였다. mPEG-MAL 용액을 인자 IX 용액 [50 mM HEPES (또는 다른 적합한 제제) pH 7.0 중 0.4324 mg/ml] 4 ml에 신속하게 첨가하고, 잘 혼합하였다. 실온에서 30분의 반응 후에, 반응 바이알을 냉각실 (4℃)로 옮기고, mPEG-MAL 용액의 또다른 0.044 ml를 반응 혼합물에 첨가한 후, 2시간에 걸쳐 mPEG-MAL 용액 0.044 ml의 3 이상의 분취액을 첨가하였다. pH를 결정하였다 (pH 7.0±0.2). mPEG-MAL 대 단백질의 몰비는 50:1이었다. 최종 mPEG-MAL 농도는 5.213 mg/ml이고, 최종 인자 IX 농도는 0.410 mg/ml이었다. 로토믹스 (Rotomix) (저속, 써몰린 제품) 상에서 4℃에서 반응을 밤새 진행되게 하였다.
접합체 혼합물을 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 크기 배제 크로마토그래피 방법은 반응 혼합물 및 최종 생성물을 분석하기 위해 개발된 것이었다. 또한, SDS-PAGE 분석은 샘플의 특성 분석을 위해 사용되었다.
실시예 20
예시적인 인자 IX-PEG 접합체의 시험관내 활성
실시예 1, 2, 3, 9, 14 및 15에 기재된 인자 IX-PEG 접합체 각각의 생물학적 활성을 측정하였다. 시험된 모든 인자 IX-PEG 접합체는 어느 정도의 인자 IX 활성을 갖는 것으로 측정되었다.
Figure 112007009010618-pct00048
<110> BOSSARD, MARY STEPHENSON, GAYLE <120> POLYMER-FACTOR IX MOIETY CONJUGATES <130> SHE0097.00 <140> 11/172,459 <141> 2005-06-30 <150> 60/584,505 <151> 2004-06-30 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu 20 25 30 Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn 35 40 45 Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys 50 55 60 Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn 65 70 75 80 Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln 85 90 95 Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile 100 105 110 Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys 115 120 125 Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe 130 135 140 Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe 165 170 175 Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala 180 185 190 Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu 195 200 205 Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe 210 215 220 Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp 225 230 235 240 Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile 245 250 255 Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly 260 265 270 Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu 275 280 285 His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn 290 295 300 Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu 305 310 315 320 Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile 325 330 335 Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr 340 345 350 Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val 355 360 365 Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg 370 375 380 Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 405 410 415 Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly 420 425 430 Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser 435 440 445 Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 450 455 460

Claims (67)

  1. 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 하나 이상의 비펩티드 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하는 접합체로서, (i) 하나 이상의 비펩티드 수용성 중합체의 전체 중량-평균 분자량이 10,000 달톤 초과 내지 약 85,000 달톤의 범위이고, (ii) 인자 IX 부분이 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 하나 이상의 비펩티드 수용성 중합체에 공유 부착될 때, 스페이서 부분은 당 또는 탄수화물을 포함하지 않고, (iii) 3개 이하의 비펩티드 수용성 중합체가 인자 IX 부분에 결합되는 접합체.
  2. 직접적으로 또는 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 비선형, 비펩티드 수용성 중합체에 공유 부착된 인자 IX 부분을 포함하는 접합체로서, (i) 인자 IX 부분이 1개 이상의 원자를 포함한 스페이서 부분을 통해 비선형, 비펩티드 수용성 중합체에 공유 부착될 때, 스페이서 부분은 당 또는 탄수화물을 포함하지 않고, (ii) 3개 이하의 비펩티드 수용성 중합체가 인자 IX 부분에 결합되는 접합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 접합체 중의 각 수용성 중합체가 폴리(알킬렌 옥시드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리옥사졸린 및 폴리(아크릴로일모르폴린)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  4. 제3항에 있어서, 각각의 수용성 중합체가 폴리(알킬렌 옥시드)인 접합체.
  5. 제4항에 있어서, 각각의 폴리(알킬렌 옥시드)가 폴리(에틸렌 글리콜)인 접합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)이 히드록시, 알콕시, 치환된 알콕시, 알케녹시, 치환된 알케녹시, 알키녹시, 치환된 알키녹시, 아릴옥시 및 치환된 아릴옥시로 이루어진 군으로부터 선택된 말단-캡핑 부분으로 종결 캡핑된 것인 접합체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)이 메톡시로 종결 캡핑된 것인 접합체.
  8. 제2항에 있어서, 상기 수용성 중합체의 전체 중량-평균 분자량이 5,000 달톤 초과 내지 약 150,000 달톤의 범위인 접합체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)의 전체 중량-평균 분자량이 약 6,000 달톤 내지 약 100,000 달톤의 범위인 접합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)의 전체 중량-평균 분자량이 약 10,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위인 접합체.
  11. 제5항에 있어서, 상기 폴리(에틸렌 글리콜)의 전체 중량-평균 분자량이 약 20,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위인 접합체.
  12. 제1항에 있어서, 각각의 수용성 중합체가 선형인 접합체.
  13. 제1항에 있어서, 각각의 수용성 중합체가 분지형인 접합체.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인자 IX 부분이 인자 IX, 인자 IXa, 및 이들 중 어느 하나의 생물학적 활성 단편, 결실 변이체, 치환 변이체 또는 부가 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 접합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 인자 IX 부분이 인자 IX인 접합체.
  16. 제15항에 있어서, 상기 인자 IX 부분이 인자 IXa인 접합체.
  17. 제5항에 있어서, 상기 인자 IX 부분이 재조합에 의해 유도된 것인 접합체.
  18. 제5항에 있어서, 상기 인자 IX 부분이 혈액으로부터 유도된 것인 접합체.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
KR1020077002327A 2004-06-30 2005-06-30 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체 KR101100059B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58450504P 2004-06-30 2004-06-30
US60/584,505 2004-06-30
PCT/US2005/023745 WO2006005058A2 (en) 2004-06-30 2005-06-30 Polymer-factor ix moiety conjugates

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117005370A Division KR101146160B1 (ko) 2004-06-30 2005-06-30 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070030308A KR20070030308A (ko) 2007-03-15
KR101100059B1 true KR101100059B1 (ko) 2011-12-29

Family

ID=35429498

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077002327A KR101100059B1 (ko) 2004-06-30 2005-06-30 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
KR1020117005370A KR101146160B1 (ko) 2004-06-30 2005-06-30 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117005370A KR101146160B1 (ko) 2004-06-30 2005-06-30 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체

Country Status (11)

Country Link
US (10) US7579444B2 (ko)
EP (1) EP1765411B2 (ko)
JP (3) JP2008505119A (ko)
KR (2) KR101100059B1 (ko)
AU (1) AU2005260763B2 (ko)
CA (1) CA2571292C (ko)
ES (1) ES2390082T5 (ko)
IL (1) IL180115A (ko)
MX (1) MXPA06015234A (ko)
NO (1) NO342927B1 (ko)
WO (1) WO2006005058A2 (ko)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002225681A1 (en) * 2000-11-15 2002-05-27 Globe Immune, Inc. Yeast-dentritic cell vaccines and uses thereof
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
CA2522345A1 (en) 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
AU2005260763B2 (en) 2004-06-30 2011-12-22 Nektar Therapeutics Polymer-factor IX moiety conjugates
AU2014280936B2 (en) * 2004-06-30 2016-12-15 Nektar Therapeutics Polymer-factor ix moiety conjugates
US20080300173A1 (en) 2004-07-13 2008-12-04 Defrees Shawn Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1]
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2006074467A2 (en) 2005-01-10 2006-07-13 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20070154992A1 (en) 2005-04-08 2007-07-05 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
EP2029738A2 (en) * 2006-05-24 2009-03-04 Novo Nordisk Health Care AG Factor ix analogues having prolonged in vivo half life
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
PL2054074T3 (pl) 2006-08-04 2015-03-31 Prolong Pharmaceuticals Llc Zmodyfikowana erytropoetyna
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
EP2114458B1 (en) * 2006-12-27 2014-02-26 Nektar Therapeutics Von willebrand factor- and factor viii-polymer conjugates having a releasable linkage
JP5606738B2 (ja) * 2006-12-27 2014-10-15 ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション 解離可能な連結を有する第ｉｘ因子部分−ポリマー共役体
WO2008119815A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Novo Nordisk A/S Subcutaneous administration of coagulation factor ix
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
EP2170919B8 (en) 2007-06-12 2016-01-20 ratiopharm GmbH Improved process for the production of nucleotide sugars
CN102026653B (zh) * 2007-10-15 2014-06-18 北卡罗来纳-查佩尔山大学 半衰期延长的人因子ⅸ变体
AU2009219232B2 (en) 2008-02-27 2014-02-27 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII molecules
EP2282767A4 (en) * 2008-04-16 2012-07-11 Bayer Healthcare Llc MODIFICATION OF FACTOR IX ORIENTED SITE
CN102046205A (zh) * 2008-04-24 2011-05-04 凯尔特药物Peg有限公司 具有延长的半衰期的因子ix缀合物
JP5785872B2 (ja) * 2008-10-17 2015-09-30 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 低度の水溶性ポリマーを含む改変血液因子
GB201007356D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
EP2857499A1 (en) 2010-10-01 2015-04-08 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012167076A2 (en) * 2011-06-01 2012-12-06 The Regents Of The University Of Michigan Nanochannel-guided patterning for polymeric substrates
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SG10201602654SA (en) 2011-10-03 2016-05-30 Moderna Therapeutics Inc Modified nucleosides,nucleotides,and nucleic acids,and uses thereof
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
AU2013243950A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
SG11201406492YA (en) * 2012-04-16 2014-11-27 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Optimised subcutaneous therapeutic agents
PT2922554T (pt) 2012-11-26 2022-06-28 Modernatx Inc Arn modificado nas porções terminais
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2017049245A2 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
LT3386484T (lt) 2015-12-10 2022-06-10 Modernatx, Inc. Gydomųjų medžiagų sudėtis ir pristatymo metodai
RS63051B1 (sr) 2015-12-22 2022-04-29 Modernatx Inc Jedinjenja i kompozicije za intracelularnu isporuku agenasa
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
IL298380A (en) 2017-03-15 2023-01-01 Modernatx Inc Compounds and preparations for intracellular administration of medical agents
DK3596042T3 (da) 2017-03-15 2022-04-11 Modernatx Inc Krystalformer af aminolipider
WO2019126543A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Plasmonic lithography for patterning high aspect-ratio nanostructures
CA3154618A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003040211A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4361510A (en) * 1980-05-27 1982-11-30 Cutter Laboratories, Inc. Blood coagulation promoting product
US4470968A (en) * 1983-01-13 1984-09-11 Miles Laboratories, Inc. Pasteurized therapeutically active blood coagulation factor concentrates
US5614500A (en) * 1983-03-04 1997-03-25 The Scripps Research Institute Compositions containing highly purified factor IX proteins prepared by immunoaffinity chromatography
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US5171569A (en) * 1985-03-15 1992-12-15 National Research Development Corporation Factor IX preparations uncontaminated by plasma components or pox virus
JP2584443B2 (ja) * 1985-04-22 1997-02-26 ジエネテイツクス・インスチチユ−ト・インコ−ポレ−テツド 活性化▲ｉ▼▲ｘ▼因子の高収率産生
US4786726A (en) * 1986-01-06 1988-11-22 Blood Systems, Inc. Factor IX therapeutic blood product, means and methods of preparing same
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
WO1992009698A1 (en) * 1990-11-26 1992-06-11 Genetics Institute, Inc. Expression of pace in host cells and methods of use thereof
AT402261B (de) * 1991-01-25 1997-03-25 Immuno Ag Komplex enthaltend den gerinnungsfaktor ix
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
WO1994004193A1 (en) 1992-08-21 1994-03-03 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5298643A (en) * 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) * 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5621039A (en) * 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6372716B1 (en) * 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
US5629384A (en) * 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5714583A (en) * 1995-06-07 1998-02-03 Genetics Institute, Inc. Factor IX purification methods
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
IL124442A0 (en) * 1995-11-22 1998-12-06 Amgen Inc Methods of increasing lean tissue mass using ob protein compositions
US5925738A (en) * 1995-12-01 1999-07-20 The American National Red Cross Methods of production and use of liquid formulations of plasma proteins
US6320029B1 (en) * 1996-11-29 2001-11-20 The American National Red Cross Methods of production and use of liquid formulations of plasma proteins
US5770700A (en) * 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US6159722A (en) * 1997-12-03 2000-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Chimeric serine proteases
EP1100542B1 (en) * 1998-08-06 2005-06-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
ME00238B (me) * 1998-10-23 2011-02-10 Kirin Amgen Inc Mimičko vezivanje dimernog trombopoitetinskog peptida za mp1 receptor sa trombopoietičkom aktivnošću
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6423626B1 (en) * 1998-11-02 2002-07-23 Micron Technology, Inc. Removal of metal cusp for improved contact fill
WO2001024831A2 (en) * 1999-10-04 2001-04-12 Shearwater Corporation Polymer stabilized neuropeptides
US7355019B2 (en) * 2000-06-06 2008-04-08 Sibtech, Inc. Cysteine-containing peptide tag for site-specific conjugation of proteins
US6423826B1 (en) * 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
CZ2003678A3 (cs) * 2000-09-08 2004-03-17 Gryphon Therapeutics, Inc. Syntetické proteiny stimulující erytropoézu
JP2002112782A (ja) * 2000-10-04 2002-04-16 Ajinomoto Co Inc 抗血栓活性を有する蛋白質及びその製造法
DE10112825A1 (de) * 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
PT2279753E (pt) * 2001-10-10 2016-01-15 Novo Nordisk As Remodelação e glicoconjugação de péptidos
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
WO2003049760A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 Intermune, Inc. Compositions and method for treating hepatitis virus infection
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US20040106779A1 (en) * 2002-12-03 2004-06-03 Bigler Douglas E. Modified factor IX preparation
JP4490369B2 (ja) * 2002-12-31 2010-06-23 ネクター セラピューティクス アラバマ，コーポレイション マレアミド酸ポリマー誘導体及びこれらの生物学的複合体
US20040180054A1 (en) * 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
DK2644206T3 (da) * 2003-05-23 2019-06-11 Nektar Therapeutics PEG-derivater indeholdende to PEG-kæder
US7141544B2 (en) * 2003-10-10 2006-11-28 Baxter International, Inc. Stabilization of pharmaceutical protein formulations with small peptides
MXPA06006023A (es) * 2003-12-03 2006-08-23 Neose Technologies Inc Factor ix glicopegilado.
US7329516B2 (en) * 2004-03-17 2008-02-12 Anticancer, Inc. Methods for increasing protein polyethylene glycol (PEG) conjugation
AU2005260763B2 (en) 2004-06-30 2011-12-22 Nektar Therapeutics Polymer-factor IX moiety conjugates
KR20120136413A (ko) * 2004-11-12 2012-12-18 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003040211A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
US20060052302A1 (en) 2006-03-09
IL180115A0 (en) 2007-06-03
US20090280550A1 (en) 2009-11-12
WO2006005058A2 (en) 2006-01-12
ES2390082T5 (es) 2018-01-19
IL180115A (en) 2013-06-27
US20100130428A1 (en) 2010-05-27
JP2012025768A (ja) 2012-02-09
US20100130684A1 (en) 2010-05-27
ES2390082T3 (es) 2012-11-06
JP2008505119A (ja) 2008-02-21
US20210023186A1 (en) 2021-01-28
CA2571292A1 (en) 2006-01-12
NO342927B1 (no) 2018-09-03
US8586711B2 (en) 2013-11-19
EP1765411A2 (en) 2007-03-28
KR20110030712A (ko) 2011-03-23
JP6162358B2 (ja) 2017-07-12
US20170035896A1 (en) 2017-02-09
CA2571292C (en) 2013-05-21
NO20070552L (no) 2007-02-14
US20100249033A1 (en) 2010-09-30
AU2005260763B2 (en) 2011-12-22
KR101146160B1 (ko) 2012-07-16
WO2006005058A3 (en) 2006-12-21
MXPA06015234A (es) 2007-11-22
EP1765411B2 (en) 2017-10-11
JP6585643B2 (ja) 2019-10-02
AU2005260763A1 (en) 2006-01-12
US9347054B2 (en) 2016-05-24
JP2017105820A (ja) 2017-06-15
US7579444B2 (en) 2009-08-25
US20140141483A1 (en) 2014-05-22
US20100137511A1 (en) 2010-06-03
US20100120982A1 (en) 2010-05-13
KR20070030308A (ko) 2007-03-15
EP1765411B1 (en) 2012-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101100059B1 (ko) 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
US20210401948A1 (en) Polymer-factor viii moiety conjugates
AU2014280936B2 (en) Polymer-factor ix moiety conjugates
WO2012088123A1 (en) Polymer-factor vii moiety conjugates
AU2012203323A1 (en) Polymer-factor IX moiety conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
A107 Divisional application of patent
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141209

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151207

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161125

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170929

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180928

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190924

Year of fee payment: 9