ES2390082T3 - Conjugados de resto de Factor IX y polímeros - Google Patents

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Abstract

Un conjugado que comprende un resto de Factor IX unido covalentemente a través de un enlace amida, biendirectamente o bien a través de un resto espaciador que comprende uno o más átomos, a un polímero soluble enagua, en el que el peso molecular promedio en peso del polímero soluble en agua está en el intervalo de 6000daltons a 100000 daltons, en el que el conjugado no incluye más de 6 polímeros solubles en agua unidoscovalentemente al resto de Factor IX y en el que el polímero soluble en agua que es polietilenglicol.

Description

Conjugados de resto de Factor IX y polimeros
5 Campo de la invenci6n La presente invencion se refiere generalmente a conjugados que comprenden un resto de Factor IX (es decir, un resto que tiene actividad de Factor IX) y a un polimero. Ademas, la presente invencion se refiere a las composiciones que comprenden los conjugados, los metodos para la sintesis de los conjugados, los metodos para el
10 suministro de los conjugados, y los metodos para el tratamiento de los pacientes.
Antecedentes de la invenci6n
La hemostasis es el proceso de detener el flujo de sangre desde un vaso sanguineo lesionado. Para los mamiferos,
15 asi como para otros muchos organismos, el proceso hemostatico es de importancia critica para la supervivencia continuada. Los defectos del proceso hemostatico pueden provocar, por ejemplo, la incapacidad de formar de manera eficaz coagulos sanguineos que sirven para detener la perdida de sangre despues de una lesion vascular. En los seres humanos, los individuos que padecen una incapacidad para formar coagulos sanguineos se denominan hemofilicos. Es de particular interes para los hemofilicos el riesgo que amenaza su vida, ya que una vez iniciado, el
20 sangrado nunca cesara.
Generalmente, los hemofilicos carecen de la capacidad de producir cantidades eficaces de una o mas sustancias que se requieren, en ultima instancia, para la transformacion del fibrinogeno soluble en fibrina. Por ejemplo, los hemofilicos que padecen la hemofilia B (tambien llamada "deficiencia congenita del factor IX" y "enfermedad de
25 Navidad") tienen la incapacidad de producir niveles eficaces de Factor IX. El factor IX es un componente clave de una de las varias "cascadas" de reacciones que dan como resultado la formacion de coagulos sanguineos. El factor IX, critico para la cascada de reacciones mencionadas como la "via intrinseca", influye en ultima instancia en la conversion del fibrinogeno en el componente principal de los coagulos sanguineos, la fibrina.
30 Aunque el proceso a traves del cual se forman los coagulos sanguineos es relativamente complejo, el papel del Factor IX en la via intrinseca se puede describir brevemente. Cuando la sangre entra en contacto con superficies con carga negativa y/o tejidos conectivos subendoteliales (como resultado de, por ejemplo, el dano tisular asociado con una laceracion), el Factor XII (o factor de Hageman) en presencia de otras sustancias se transforma en el Factor Xlla. El factor Xlla (junto con otras sustancias) transforma el Factor XI en el Factor XIa. A su vez, el Factor XIa (junto
35 con otras sustancias) transforma el Factor IX en el Factor IXa. El Factor VIII, el Factor IXa, los iones de calcio y las micelas fosfolipidicas forman un complejo de lipoproteina con el Factor X y lo activan para formar el Factor Xa. A partir de entonces, el Factor Xa (junto con otras sustancias) convierte la protrombina en trombina, dando como resultado la produccion en el tiempo de una cantidad relativamente grande de trombina. Cantidades relativamente grandes de trombina convierten el fibrinogeno en fibrina. La fibrina, a su vez, forma la matriz o la reticula
40 responsable de la formacion de los coagulos sanguineos. Se muestra esquematicamente a c ontinuacion el papel del Factor IX en la via intrinseca de la coagulacion sanguinea.
Afectando a uno de cada 34500 hombres, la hemofilia B puede provenir de una diversidad de mutaciones del gen del Factor IX, que se encuentra en el cromosoma X. Dependiendo de la mutacion en particular, la hemofilia B se puede
manifestar en si misma como grave, moderada o leve. Los individuos que padecen las formas mas gravesde hemofilia B carecentotalmente de la capacidad de expresar las formas activas del Factor IX. Clinicamente, los individuos afectados con hemofilia B padecen sangrados nasales, facil aparicion de hematomas, hemorragia en las articulaciones, y sangrado prolongado de lasheridas. El tratamiento actual de la hemofilia Bindica la infusion de concentrado de Factor IX exogeno recogido a partir de plasma humano o preparado a traves de tecnicas de ADN recombinante.Debido a que sus tratamientos solo sirven para complementar la carencia de los niveles eficaces de Factor IX, los individuos que padecen las formas graves de hem ofilia B necesitan inyecciones regulares (tana menudo comotres veces a la semana) deconcentrado de Factor IX alo largo de sus vidas. Los pacientes que padecen incluso las formas mas moderadas de hemofilia B a menudo necesitan la inyeccion de concentrado de Factor IX antes y/o a continuacion de la cirugia y del trabajo dental.
Estan d isponibles varias f ormas comerciales de c oncentrados de Factor I X para pr oporcionar la terapia d e sustitucion para los pacientes que padecen hemofilia B. Por ejemplo, los productos de complejo de Factor IX derivados de la sangre (que contienen otros factores) se comercializan con las marcas BEBULIN VH® (Baxter Healthcare, Viena, Austria), KONYNE 80® (Bayer Corporation, Elkhart IN), PROFILNINE SDT (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles CA), y PROPLEX T® (Baxter Healthcare, Glendale CA). Las formas algo mas purificadas de productos del Factor IX se comercializan como las marcas ALPHANINE SD® (Alpha Therapeutic Corporation, Los Angeles CA) e IVIONONINE® (Aventis Behring, Kankakee IL). Con respecto a los concentrados de Factor IX preparados de manera recombinante, actualmente esta disponible un producto con la marca BENEFIX® (Wyeth/Genetics Institute, Cambridge IVIA).
Generalmente, la fuente recombinante de concentrado de Factor IX se favorece sobre las fuentes derivadas de la sangre ya que las ultimas implican el riesgo de transmision de virus y/o otras enfermedades. Ademas, a menudo la pureza es mas alta con la fuente recombinante, evitando de ese modo los problemas potenciales que surgen de la administracion de factores de sangre no deseados y de otras proteinas generalmente presentes en fuentes derivadas de la sangre.
A pesar de los beneficios de la administracion de una formulacion basada en recombinante, el procesamiento de los productos basados en recombinantes a menudo necesita la presencia de determinadas proteinastales como la albumina, que puede estar presente en la formulacion final administrada al paciente. Como resultado, los pacientes que reciben tales formulaciones desarrollan reaccionesalergicas a estas proteinas extranas.En cualquier caso, tanto l os productos derivados de l a sa ngre co mo l os basados en r ecombinantes sufren l a d esventaja de l a administracion repetida.
La PEGilacion, o la union de un derivado de poli(etilenglicol) a una proteina, se ha descrito como un medio para reducir la inmunogenicidad asi como un medio para prolongar la vida media in vivo de una proteina. Con respecto al Factor IX, sin embargo, los enfoques previos para la formacion de conjugados proteina-polimero sufrieron diversas deficiencias.
Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de America N° 5.969.040 describe un proceso que comprende la etapa de oxidacion de los dioles vecinales de los restos de hidrato de carbono en la region de activacion del Factor IX para formar aldehidos. Despues de la etapa de oxidacion, el proceso que se ha descrito incluye la etapa de union covalente de uno o mas polimeros no antigenicos [tales como un derivado de poli(etilenglicol) que soporta hidrazina] a los restos oxidados de hidrato de carbono. Sin embargo, un problema con este enfoque, es la complejidad aumentadaatribuida a las etapas adicionales necesarias para obteneruna forma oxidada del Factor IX. Ademas, cualquier oxidante que pueda permanecer despues de la etapa de oxidacion puede degradar el polimero asociado con el conjugado. Finalmente, este enfoque se limita a la conjugacion usando polimeros especificos (es decir, polimeros que contienen hidrazida) yregiones especificas en el Factor IX (es decir, dioles vecinales de los restos hidrato de carbono en la region de activacion del Factor IX).
La presencia de oxidantes (presentes como resultado del proceso que se ha descrito en la Patente de los Estados Unidos de America N° 5.969.040, o por otras causas) presenta desafios adicionales con respecto a proporcionar un producto farmaceuticamente aceptable de un polimero conjugado con el Factor IX. Especificamente, la metionina y otros aminoacidos que co ntienen hi droxilo se pued en so meter a una oxidacion n o dese ada en presencia d e oxidantes, introduciendo de ese modo grupos aldehido. Cualquier aldehido residual que no reacciono con el reactivo polimerico sera reactivo y puede danar potencialmentela proteina. Para abordar este problema, los aldehidos sin reaccionar necesitan una proteccion con glicina u otra molecula pequena para estabilizar la proteina. Al hacerlo, sin embargo, surge un problema analitico en el que, a efectos de regulacion, un producto se deberia definir facilmente; la introduccion de componentes adicionales puede frustrar la definicion del producto de otra manera sencilla. En particular, el uso de agentes protectores presentaria un desafio particularmente dificil.
La Patente de los Estados Unidos de America N° 6.037.452 describe la union de un poli(oxido de alquileno) al Factor IX, en el que la union al Factor IX se efectua a traves de un poli(oxido de alquileno) que soporta uno de los siguientes grupos reactivos: triazina, acetilo, hidrazina, diazonio, amino, y ester de succinimidilo. Una vez mas, sin embargo, la referencia carece de la divulgacion de llevar a cabo una union a traves de polimeros que soportan grupos reactivos distintos de triazina, acetilo, hidrazina, diazonio, amino, o ester de succinimidilo.
El d ocumento US-A-6037452, el d ocumento WO94/18247, el docu mento WO03/040211 y el d ocumento WO 97/11957 describen, todos, la union teorica de polietilenglicol al Factor IX.
De est e m odo, sigue h abiendo u na necesidad en la tecnica para proporcionar conjugados adicionales entre polimeros solubles en agua y restos que tienen actividad de Factor IX. En particular, hay una n ecesidad para proporcionar procesos mas sencillos para la conjugacion de un polimero con un resto que tiene actividad de Factor
IX. La presente invencion se dirige por lo tanto a tales conjugados asi como a las composiciones que comprenden los conjugados y los metodos relacionados como se ha descrito en el presente documento, que se cree que son nuevos y no se sugieren totalmente en la tecnica.
Sumario de la invenci6n
Por consiguiente, en una o mas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un resto de Factor IX unido covalentemente, a traves de una union amida directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos, a un polimero soluble en agua, en el que el peso molecular promedio en peso del polimero soluble en agua es de 6000 daltons a 100000 daltons, en el que el conjugado no incluye mas de 6 polimeros solubles en agua y en el que el polimero fuente de agua es poli(etilenglicol).
En una o mas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un resto de F actor I X u nido c ovalentemente a t raves de una union am ida d irectamente o a t raves de un r esto espaciador compuesto de uno o mas atomos a un polimero soluble en agua no lineal que es poli(etilenglicol).
En una o mas realizaciones de la presente invencion, se proporciona una composicion, composicion que comprende una pluralidad de conjugados, en la que al menos aproximadamente el 80% de cada uno de todos los conjugados en la composicion esta compuesto de un resto de Factor IX unido covalentemente a uno, dos, tres o cuatro polimeros solubles en agua, cada polimero soluble en agua en el conjugado tiene un peso molecular promedio en peso de desde 6000 a 100000 daltons y en el que adicionalmente para cada polimero soluble en agua en el conjugado, el resto de F actor I X esta u nido a t raves de un enlace amida directamente o a traves de un r esto esp aciador compuesto de uno o mas atomos en el que el polimero soluble en agua valido se selecciona entre un poli(oxido de alquileno), p oli(vinilpirrolidona), pol i(alcohol vi nilico), p olioxazolina, po li(poliol oxietilado), alcohol poliolefinico, poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), polisacaridos, poli(a-hidroxiacido), polifosfazeno, polioxazolina, y poli(acriloilmorfolina). Las composiciones incluyen todos los tipos de formulaciones y en particular aquellas que son adecuadas para la inyeccion tales como los polvos que se pueden reconstituir, asi como los liquidos (por ejemplo, suspensiones y soluciones).
En una o mas realizaciones de la presente invencion, se proporciona un metodo para la preparacion de un conjugado como se ha descrito anteriormente, comprendiendo el metodo la adicion de una composicion de reactivo polimerico a una composicion de Factor IX en condiciones suficientes para dar como resultado un conjugado que comprende un resto de Factor IX unido covalentemente, directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos, a un polimero soluble en agua.
Tambien se describe en el presente d ocumento u n m etodo para pr oporcionar e l suministro de un co njugado, comprendiendo el metodo la administracion al paciente de una composicion que comprende un conjugado como se ha descrito en el presente documento. La etapa de administracion del conjugado se puede efectuar por inyeccion (por ejemplo, inyeccion intramuscular, inyeccion intravenosa, inyeccion subcutanea, etcetera) u otro enfoque.
Breve descripci6n de las figuras
La Figura 1 y la Figura 2 son copias de geles que resultan del analisis de muestras por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico (SDS-PAGE) descritas en los Ejemplos 1 a 4.
La Figura 3 es una copia de un gel que resulta del analisis SDS-PAGE de muestras descritas en los Ejemplos 5, 6, 10 y 11.
La Figura 4 es una copia de un gel que resulta del analisis SDS-PAGE de muestras descritas en los Ejemplos 2, 9 y 12 a 16.
La Figura 5 es una representacion grafica que corresponde a la solucion de conjugacion resultante del Ejemplo 1.
La Figura 6 es una representacion grafica que corresponde a la solucion de conjugacion resultante del Ejemplo 2.
La Figura 7 es una representacion grafica que corresponde a la solucion de conjugacion resultante del Ejemplo 3.
La Figura 8 es una representacion grafica que corresponde a la solucion de conjugacion resultante del Ejemplo 4.
La Figura 9 es una representacion grafica que corresponde a la solucion de conjugacion resultante del Ejemplo 12.
La Figura 10 es una representacion grafica que corresponde a la solucion de conjugacion resultante del Ejemplo 13.
La Figura 11 es una representacion grafica que corresponde a la solucion de conjugacion resultante del Ejemplo 14.
La Figura 12 es una representacion grafica que corresponde a la solucion de conjugacion resultante del Ejemplo 15.
Descripci6n detallada de la invenci6n
Se debe indicar que, como se usa en l a presente memoria descriptiva y en l as reivindicaciones, las formas en singular "un," "una," "uno," y "el" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polimero" incluye un polimero unico asi como dos o mas de los mismos o diferentes polimeros, la referencia a "un excipiente opcional" se refiere a un excipiente opcional unico asi como a dos o mas de los mismos o de diferentes excipientes opcionales.
Al describir y reivindicar la presente invencion, se usara la siguiente terminologia de acuerdo con las definiciones que se describen a continuacion.
"PEG," "polietilenglicol" y "poli(etilenglicol)", como se usa en el presente documento, son i ntercambiables. Tipicamente, P EG para su uso de ac uerdo co n l a presente invencion comprende l a si guiente est ructura "(OCH2CH2)n-" en la que (n) es de 2 a 4000. Como se usa en el presente documento, PEG tambien incluye "-CH2CH2-O(CH2CH2O)nCH2CH2-" y"-(OCH2CH2)nO-," dependiendo d e si se han de splazado o n o l os oxigenos terminales. A lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones, se deberia recordar que el termino "PEG" incluye las estructuras que tienen diversos grupos terminales o "protectores terminales" etcetera. El termino "PEG" tambien significa un polimero que contiene una mayoria, es decir, mas de un 50%, de subunidades de repeticion -OCH2CH2-. Con respecto a las formas especificas, el PEG puede adoptar cualquier numero de una diversidad de pesos moleculares, asi como las estructuras o las geometrias tales como "ramificada," "lineal," "bifurcada," "multifuncional," que se describiran con mayor detalle a continuacion.
Los terminos "terminacion protegida" y "protegido terminalmente" se usan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a una parte terminal o a un extremo de un polimero que tiene un resto con proteccion terminal. Tipicamente, aunque no necesariamente, el resto de proteccion terminal comprende un grupo hidroxi o alcoxi C1-20, mas preferentemente un grupo alcoxi C1-10, y aun mas preferentemente un grupo alcoxi C1-5. De este modo, los ejemplos de restos de proteccion terminal incluyen alcoxi (por ejemplo, metoxi, etoxi y benciloxi), asi como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo. Se deberecordar que el resto de proteccion terminal puede incluir uno o m as atomos del m onomero terminal en el pol imero [por ejemplo, el r esto de proteccion terminal "metoxi" en CH3O(CH2CH2O)n-] o no [ por ej emplo, " CH3" e n CH 3(OCH2CH2)n-]. Ademas, se p reven las formas saturada, insaturada, sustituida y no sustituida de cada uno de los anteriores. Ademas, el grupo de proteccion terminal tambien puede ser un silano.El grupo de proteccion terminal tambien puede comprender ventajosamente un marcador detectable. Cuando el polimero tiene grupo de proteccion terminal que comprende un marcador detectable, se puede determinar la cantidad o la posicion del polimero y/o del resto (por ejemplo,agente activo)al quese acopla el polimero usando un det ector adecu ado. Tales marcadores incluyen f luorescentes, quimioluminiscentes, restos usados en marcado enzimatico, restos colorimetricos (por ejemplo, colorantes), iones metalicos, restos radiactivos. Los detectores adecuados incluyen fotometros, peliculas, espectrometros. El grupo de proteccion terminal tambien puede comprender ventajosamente un fosfolipido. Cuandoel polimero tiene un grupo de proteccion terminalque comprende un fosfolipido, se confieren propiedades unicas al polimeroy a cualquier conjugado resultante. Los fosfolipidos ejemplares incluyen aquellos seleccionados entre la clase de fosfolipidos denominados fosfatidilcolinas. Los fosfolipidos especificos incluyen aquellos seleccionados del grupo que c onsiste en d ilauroilfosfatidilcolina, dioleilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, diesteroilfosfatidilcolina, behenoilfosfatidilcolina, araquidoilfosfatidilcolina, y lecitina.
"De origen no natural" con respecto a un polimero que se ha descrito en el presente documento, significaun polimero que no se encuentra en la naturaleza en su totalidad. Un polimero de origen no natural puede contener, sin embargo, uno o mas monomeros o segmentos de monomeros que son de origen natural, siempre que la estructura global del polimero no se encuentre en la naturaleza.
El termino "soluble en agua " como en un "polimero soluble en agua" es cualquier polimero que es soluble en agua a temperatura ambiente. Tipicamente, un polimero soluble en agua transmitira almenosaproximadamente el 75%, mas preferentemente al menos aproximadamente el 95%, de la luz transmitida a traves de la misma solucion despues de la filtracion. En base al peso, un polimero soluble en agua sera preferentemente soluble en agua en al menos aproximadamente un 35% (en peso), mas preferentemente soluble en agua en al menos aproximadamente un 50% (en peso), aun mas preferentemente soluble en agua en aproximadamente un 70% (en peso), y aun mas preferentemente soluble en agua en aproximadamente un 85% (en peso). Sin embargo, es mas preferente, que el polimero soluble en agua sea soluble en agua en aproximadamente un 95% (en peso) o totalmente soluble en agua.
Peso molecular en el contexto de un polimero soluble en agua, tal como PEG, se puede expresar como un peso molecular promedio en numero o un peso molecular promedio en peso. A menos que se indique lo contrario, en el presente documento todas las referencias al peso molecular se refieren al peso molecular promedio en peso. Tanto las determinaciones de peso molecular, promedio en numero como promedio en peso, se pueden medir usando la cromatografia de exclusion molecular u otras tecnicas de cromatografia liquida.Tambien se pueden usar otros metodos para la medida de los valores delpeso molecular, tales como el uso del analisis del grupo terminal o la medida de las propiedades coligativas (por ejemplo, disminucion del punto de congelacion, elevacion del punto de ebullicion, o presion osmotica) para determinar el peso molecular promedio en numero o el uso de tecnicas de dispersion de la luz, ultracentrifugacion o viscometria para determinar el peso molecular promedio en peso. Los polimeros de la presente invencion son tipicamente polidispersos (es decir, el peso molecular promedio en numero y el peso molecular promedio en peso de lospolimeros noes el mismo), teniendobajos valores de polidispersion preferentemente menores que aproximadamente 1,2, mas preferentemente menores que aproximadamente 1,15, aun mas preferentemente menores que aproximadamente 1,10, todavia aun m as preferentemente menores que aproximadamente 1,05, y mas preferentemente menores que aproximadamente 1,03. Como se usa en el presente documento, las referencias a veces se haran para un polimero soluble en agua unico que tiene un peso molecular promedio en peso o un peso molecular promedio en numero; se entendera que tales referencias significan que el polimero soluble en agua unico se obtuvo a partir de una composicion de polimeros solubles en agua que tienen el peso molecular indicado.
Los terminos "activo" o "activado" cuando se usan en conjunto con un grupo funcional en particular, se refieren a ungrupo funcional reactivo que reacciona rapidamente con un electrofilo o con un nucleofilo o con otra molecula. Esto sucede en contraste con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones de reaccion muy poco practicas para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").
Como se usa en el presente documento, el termino "grupo funcional" o cualquier sinonimo del mismo significa que incluye las formas protegidas del mismo asi como las formas no protegidas.
Los terminos "resto espaciador," "enlace" y "engarce" se usan en el presente documento para referirse a un atomo o a un conjunto de atomos usados opcionalmente para unir restos de interconexion tales como una parte terminal de un polimero soluble en agua y un resto del Factor IX o un resto electrofilo o nucleofilo de un Factor IX. El resto espaciador p uede se r hidroliticamente estable o puede incluir un en lace f isiologicamente hidrolizable o enzimaticamente degradable.
"Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburos, que oscila tipicamente de aproximadamente 1 a 15 atomos de longitud. Tales cadenas de hidrocarburos son preferentemente, pero no necesariamente, saturadas y pueden ser de cadena ramificada o lineal, aunque tipicamente se prefiere la cadena lineal. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo, y similares. Como se usa en el presente documento, "alquilo" incluye cicloalquilo asi como alquilo que contiene cicloalquileno.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 atomos de carbono, y puede ser de cadena lineal
o ramificado, como se ejemplifica a traves de metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, y t-butilo.
"Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo ciclico saturado o insaturado, que incluye compuestos ciclicos con puente, condensados, o espiro, compuestos preferentemente de 3 a aproximadamente 12 atomos de carbono, mas preferentemente de 3 a aproximadamente 8 atomos de carbono. "Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquiloque se inserta en una cadena de alquiloa traves del enlace dela cadena a cualquiera de los dos carbonos en el sistema de anillo ciclico.
"Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, en el que R es alquilo o alquilo sustituido, preferentemente alquilo C1-6 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, etcetera).
El termino "sustituido" como en, por ejemplo, "alquilo sustituido," se refiere a un resto (por ejemplo, un grupo alquilo) sustituido con uno o mas sustituyentes que no interfieren, tales como, pero no limitados a: alquilo, cicloalquilo C3-8, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo; halo, por ejemplo, fluor, cloro, bromo, y yodo; ciano; alcoxi, fenilo inferior; fenilo sustituido; "Arilo sustituido" es un arilo que tiene uno o mas grupos que no interfieren como un sustituyente. Para las sustituciones de un anillo de fenilo, los sustituyentes pueden estar en cualquier orientacion (es decir, orto, meta, o para).
"Sustituyentes que no i nterfieren" son aquellos grupos que, cuando estan pr esentes en un a m olecula, son tipicamente no reactivos con otros grupos funcionales contenidos en la molecula.
"Arilo" significa uno o mas anillos aromaticos, cada uno con 5 o 6 atomos de carbono en el nucleo. Arilo incluye multiples anillos arilo que pueden estar condensados, como en naftilo o sin condensar, como en bifenilo. Los anillos arilo tambien pueden estar condensados o sin condensar con uno o mas anillos de hidrocarburo ciclico, heteroarilo,
o heterociclico. Como se usa en el presente documento, "arilo" incluye heteroarilo.
"Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroatomos, preferentemente azufre, oxigeno, o nitrogeno, o una combinacion de los mismos. Los anillos de heteroarilo tambien pueden estar condensados con uno
o mas anillos de hidrocarburo ciclico, heterociclico, arilo, o heteroarilo.
"Heterociclo" o "heterociclico" significa uno o mas anillos de 5-12 atomos, preferentemente de 5-7 atomos, con o sin insaturacion o caracter aromatico y que tienen al menos un atomo en el anillo que no es carbono. Los heteroatomos preferentes incluyen azufre, oxigeno, y nitrogeno.
"Heteroarilo sustituido" es un heteroarilo que tiene uno o mas grupos que no interfieren como sustituyentes.
"Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o mas cadenas laterales formadas a partir de sustituyentes que no interfieren.
Un "radical organico" como se usa en el presente documento incluira alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido.
"Electrofilo" y "grupo electrofilico" se refierena un ion o atomo oconjunto de atomos, que pueden ser ionicos, que tienen un centro electrofilico, es decir, un centro que busca electrones, capaz de reaccionar con un nucleofilo.
"Nucleofilo" y "grupo nucleofilico" se refieren a un ion o atomo o conjunto de atomos, que pueden ser ionicos, que tienen un centro nucleofilico, es decir, un centro que busca un centro electrofilico o capaz de reaccionar con un electrofilo.
Un enlace "fisiologicamente escindible" o "hidrolizable" es un enlace que reacciona con agua (es decir, se hidroliza) en condiciones fisiologicas. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua dependera no solo del tipo general de enlace que une los dos atomos principales sino tambien de los sustituyentes unidos a estos atomos principales. Los enlaces hidroliticamente inestables o debiles apropiados incluyen ester de carboxilato, ester de fosfato, anhidridos, acetales, cetales, aciloxialquil eter, iminas, ortoesteres, peptidos y oligonucleotidos.
Un "enlace enzimaticamente degradable" significa un enlace que es objeto de degradacion mediante una o mas enzimas.
Un enlace o union "hidroliticamente estable" se refiere a un enlace quimico, tipicamente un enlace covalente, que es basicamente e stable en a gua, es decir, no e xperimenta hidrolisis en co ndiciones fisiologicas en n ingun gr ado apreciable durante un periodo prolongado de tiempo. Los ejemplos de enlaces hidroliticamente estables incluyen los siguientes:enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifaticas), eteres, amidas, uretano. Generalmente, un enlace hidroliticamente estable es el que presenta una tasa de hidrolisis de menos de aproximadamente el 1-2% por dia en condiciones fisiologicas. Las tasas de hidrolisis de los enlaces quimicos representativos se pueden encontrar en la mayoria de los libros de texto de quimica estandar.
"Excipiente farmaceuticamente activo" se refiere a un excipiente que puede estar opcionalmente incluido en las composiciones de l a pr esente i ntencion y que no produce ef ectos toxicologicos adversos significativos en e l paciente.
"Cantidad terapeuticamente eficaz" se usa en el presente documento para significar la cantidad de un conjugado polimero-resto de Factor IX que se necesita para proporcionar un nivel deseado del conjugado (o el correspondiente resto de Factor IX no conjugado) enla corriente sanguinea o en el tejido diana.La cantidad precisa dependera de numerosos factores, por ejemplo, el resto de Factor IX en particular, los componentes y las caracteristicas fisicas de la composicion terapeutica, poblacion de pacientes pretendida, del modo de suministro, consideraciones del paciente individual, yse pueden determinar rapidamente por unexperto en la materia, en base a la informacion que se ha proporcionado el presente documento.
"Multifuncional" significa un polimero que tiene tres o mas grupos funcionales contenidos en el mismo, en el que los grupos funcionales pueden se r i guales o di ferentes. Los reactivos pol imericos multifuncionales contendran tipicamente aproximadamente 3-100 grupos funcionales, o 3-50 grupos funcionales, o 3-25 grupos funcionales, o 315 grupos funcionales, o de 3 a 10 grupos funcionales, o contendran 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grupos funcionales en la estructura polimerica.
El termino "resto de Factor IX," como se usa en el presente documento, se refiere a un resto que tiene actividad de Factor IX. El resto de Factor IX tambien tendra al menos un grupo electrofilico o grupo nucleofilico adecuado para la reaccion con un reactivo polimerico. Tipicamente, aunque no necesariamente, el resto de Factor IX es una proteina. Ademas, el termino "resto de Factor IX" incluye tanto al resto de Factor IX anterior a la conjugacion como al residuo del resto de Factor IX que sigue a la conjugacion. Como se explicara con mas detalle posteriormente, un experto en la materia puede determinar si cualquier resto dado tiene actividad de Factor IX. Una proteina que comprende una secuencia de aminoacidos que corresponde a SEC ID N° 1 es un resto de Factor IX, asi como cualquier proteina o polipeptido basicamente homologo a esto, cuyas propiedades biologicas dan como resultado la actividad de Factor
IX. Como se usa en el presente documento, el termino "resto de Factor IX" incluye proteinas modificadas de forma
deliberada, como por ejemplo, a traves de mutagenesis dirigida al sitio o accidentalmente a traves de mutaciones. El termino "resto de Factor IX "tambien incluye derivados que tienen de 1 a 6 sitios de glicosilacion adicionales, derivados que tienen al menos un aminoacido adicional en la parte terminal carboxi de la proteina en la que el aminoacido o aminoacidos adicionales incluyen al menos un sitio de glicosilacion, y derivados que tienen una secuencia de aminoacidos que incluyen al menos un sitio de glicosilacion.
El termino "basicamente homologo" significa que una secuencia objeto en particular, por ejemplo, una secuencia mutante, varia a partir de una secuencia de referencia mediante una o mas sustituciones, eliminaciones, o adiciones, cuyo efecto neto no da como resultado una disimilitud funcional adversa entre las secuencias de referencia y objeto. Para los propositos de la presente invencion, las secuencias que tienen mas del 95 por ciento de homologia, propiedades biologicas equivalentes (aunque grados potencialmente diferentes de actividad), y caracteristicas de expresion e quivalentes se consideran basicamente h omologas. Para l os propositos de determinacion d e l a homologia, se deberia descartar el truncamiento de la secuencia madura. Las secuencias que tienen menores grados de h omologia, bioactividad comparable, y c aracteristicas de e xpresion equ ivalentes se co nsideran basicamenteequivalentes.Los restos de Factor IX ejemplares para su uso en el presente documento incluyen aquellas proteinas que tienen una secuencia que es basicamente homologa a SEC ID N° 1.
El termino "fragmento" significa cualquier proteina o polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos de una porcion de un resto de Factor IX que mantiene algun grado de actividad de Factor IX. Los fragmentos incluyen proteinas o polipeptidos producidos a traves de la degradacion proteolitica de la proteina del Factor IX o producidas a traves de sintesis quimicas a traves de metodos rutinarios en la tecnica. La determinacion de si un fragmento en particular tiene la actividad biologica de Factor IX se puede llevar a cabo a traves de ensayos convencionales, bien conocidos, utilizados para tales fines en una o mas especies de mamiferos.Se describe en el presente documento un ensayo apropiado que se puede utilizar para demostrar tal actividad biologica.
Una "variante de supresion" de un resto de Factor IX es el peptido o la proteina en los que se ha suprimido un resto de aminoacidos del resto de Factor IX y los restos de aminoacidos que preceden y que siguen al resto de aminoacidos estan conectados a traves de un enlace amida (excepto en los casos en los que el resto de aminoacido suprimido estaba situado en una parte terminal del peptido o de la proteina). Las variantes de supresion incluyen los casos en los que solamente un unico resto de aminoacido se ha suprimido, asi como en los casos en los que se suprimen dos aminoacidos, se suprimen tres aminoacidos, se suprimen cuatro aminoacidos, etcetera. Cada variante de supresion debe, sin embargo, mantener algun grado de actividad de Factor IX.
Una "variante de sustitucion" de un resto de Factor IX es el peptido o la proteina en los que se ha suprimido un resto de aminoacido del restode Factor IX y un resto de aminoacidodistinto ha ocupado su lugar. Las variantes de sustitucion incluyen los casos en los que solamente se ha sustituido un resto de aminoacido unico, asi como los casos en los que se sustituyen dos aminoacidos, se sustituyen tres aminoacidos, se sustituyen cuatro aminoacidos, etcetera. Cada variante de sustitucion debe tener, sin embargo, algun grado de actividad de Factor IX.
Una "variante de adicion" de un resto de Factor IX es el peptido o proteina en los que se ha anadido un resto de aminoacido al resto de Factor IX en una secuencia de aminoacidos ylosrestos de aminoacidos adyacentes estan unidos alrestode aminoacidoatraves de enlacesamida(excepto los casos enlos que el resto de aminoacido anadido esta situado en una parte terminal del peptido o de la proteina, en el que solo un enlace amida se une al resto de aminoacido anadido). Las variantes de adicion incluyen los casos en los que solo se ha anadido un resto de aminoacido unico, asi como los casos en los que se anaden dos aminoacidos, se anaden tres aminoacidos, se anaden cuatro aminoacidos, etcetera. Cada variacion de adicion debe tener, sin embargo, algun grado de actividad de Factor IX.
El termino "paciente," se refiere a un organismo vivo que padece o que es propenso a una afeccion que se puede prevenir o tratar a traves de la administracion de un agente activo (por ejemplo, un conjugado), e incluye tanto seres humanos como animales.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita posteriormente puede suceder o no suceder, de manera que la distincion incluye los casos en los que la circunstancia ocurre y los casos en los que no lo hace.
"Basicamente" (a menos que se defina especificamente para un contexto en particular en otro lugar o el contexto claramente indique lo contrario) significa casi totalmente o completamente, por ejemplo, satisfaciendo uno o mas de los siguientes casos: mayor que el 50%, 51% o superior, 75% o superior, 80% o superior, 90% o superior, y 95% o superior de la condicion.
A menos que el contexto indique claramente lo contrario, cuando el termino "aproximadamente" precede a un valor numerico, se entiende que valor numerico significa ± 10% del valor numerico indicado.
Los restos de aminoacidos en los peptidos se abrevian como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es Ile o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr
o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N;
Lisina es Lys o K; Acido Aspartico es Asp o D; Acido Glutamico es Glu o E; Cisteina es Cys o C; Triptofano es Trp o W; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G.
Volviendo a una o mas de las realizaciones de la presente invencion, se proporciona un conjugado, conjugado que comprende un resto de Factor IX unido covalentemente a traves de un enlace amida, bien directamente o bien a traves de un resto espaciador que comprende uno o mas atomos, aun polimero soluble en agua como se ha definido anteriormente. Los conjugados de la presente invencion tendran una o mas de las siguientes caracteristicas.
El Resto de Factor IX
Como se ha indicado previamente, el termino "resto de Factor IX" incluira el resto de Factor IX anterior a la conjugacion asi como el resto de Factor IX que sigue a la union con un polimero soluble en agua. Se entiende, sin embargo, que cuando un resto de Factor IX esta unido a un polimero soluble en agua no peptidico, el resto de Factor IX se altera ligeramente debido a la presencia de uno o mas enlaces covalentes asociados con el enlace al polimero (o al resto espaciador que esta unido al polimero). A menudo, esta forma ligeramente alterada del resto de Factor IX unido a otra molecula se denomina "residuo" del resto de Factor IX.
El resto de Factor IX se puede obtener a partir de metodos no recombinantes o a partir de metodos recombinantes. Ademas, el resto de Factor IX se puede obtener a partir de fuentes humanas o a partir de fuentes animales.
El resto de Factor IXse puede obtener de manera no recombinante. Por ejemplo,el resto de Factor IXse puede obtener a partir de fuentes derivadas de la sangre. En particular, el Factor IX se puede fraccionar a partir del plasma humano usando tecnicas de precipitacion y de centrifugacion conocidas por los expertos habituales en la materia. Vease, por ejemplo, Wickerhauser (1976) Transfusion 16(4):345-350 y Slichter et al. (1976) Transfusion 16(6):616
626. El Factor IX tambien se puede aislar a partir de los granulocitos humanos. Vease Szmitkoski et al. (1977) Haematologia (Budap.) 11(1-2):177-187.
El r esto de F actor I X se p uede obt ener a par tir de metodos recombinantes. P or ej emplo, se ha ai slado, caracterizado, y clonado en vectores de expresion el ADNc que codifican para el Factor IX nativo, que es un resto de Factor IX. Vease, por ejemplo, Choo et al. (1982) "Molecular Cloning of the Gene for Human Anti-hemophilic Factor IX," Nature, Vol. 299: 178-180, and Kurachi et al. (1982) "Isolation and Characterization of a cDNA Coding for Human Factor IX," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 79:6461-65.
Una vez expresado, el Factor IX nativo es una glicoproteina de cadena unica de aproximadamente 55000 daltons. Se puede considerar estructuralmente que tiene cuatro dominios: el dominio rico en Gla o gamma carboxiglutamato; las regiones de tipo EGF;el peptido de activacion; y el sitio activo. La secuencia de aminoacidos expresada se proporciona como SEC ID N ° 1. A menos que se indique de forma especifica, todas las asignaciones de una ubicacion numerica de un resto de aminoacido como se ha proporcionado el presente documento son en base a la SEC ID N° 1.
Los metodos recombinantes ejemplares usados para preparar un resto de Factor IX (ya sea Factor IX nativo o una proteina diferente que tiene la actividad de Factor IX) se pueden describir brevemente. Tales metodos implican la construccion del acido nucleico que codifica el polipeptido o fragmento deseado, la clonacion del acido nucleico en un vector de expresion, la transformacion en una celula huesped (por ejemplo, planta, bacterias tales como E. coli, levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, o celulas de mamifero tales como celulas ovaricas de hamster Chino o celulasde rinon de cria de hamster), yla expresion del acido nucleico para producir el polipeptido o fragmento des eado. La e xpresion p uede o currir a t raves de la expresion e xogena (cuando l a celula hu esped contiene de forma natural la codificacion genetica deseada) o a traves de la expresion endogena. Los metodos para la produccion y la expresion de los polipeptidos recombinantes in vitro en celulas huesped procariotas y eucariotas se conocen por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, el documento de Patente de los Estados Unidos de America N° 4.868.122.
Para facilitar la identificacion y la purificacion de un polipeptido recombinante, las secuencias de acidos nucleicos que codifican para una marcade epitopo u otra secuencia de afinidad de union se pueden insertar o anadir en el marco con secuencia de codificacion, produciendo de ese modo una proteina de fusion que co mprende e l polipeptido deseado y un polipeptido adecuado para la union. Las proteinas de fusion se pueden identificar y purificar mediante un primer procesado de una mezcla que contiene la proteina de fusion a traves deuna columna de afinidad que soporta restos de union (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra la marca del epitopo u otra secuencia de union en las proteinas de fusion, uniendo de ese modo la proteina de fusion a la columna. A partir de entonces, se puede recuperar la proteina de fusionlavando la columna con la solucion apropiada (por ejemplo, acido) para el liberar la proteina de fusion unida. Tambien se puede identificar el polipeptido recombinante y purificar lisando las celulas huesped, separando el polipeptido, por ejemplo, a traves de cromatografia de exclusion por tamano, y r ecogiendo el polipeptido. Estos y ot ros metodos de i dentificacion y t ipificacion de l os pol ipeptidos recombinantes se conocen por los expertos habituales en la materia. En una o mas realizaciones de la presente invencion, sin embargo, se prefiere que el resto de Factor IX no este formando por una proteina de fusion.
Dependiendo del sistema usado para expresar las proteinas que tienen actividad de Factor IX, el resto de Factor IX puede estar glicosilado o no glicosilado y se pueden usar cualquiera de los dos. Es decir, el resto de Factor IX puede estar no glicosilado o el resto de Factor IX puede estar glicosilado. En una o mas realizaciones de la presente invencion, se prefiere que el resto de Factor IX este glicosilado.
El resto que tiene actividad de Factor IX se puede modificar ventajosamente para incluiruno o mas restos de aminoacidos tales como, por ejemplo, lisina, cisteina y/o arginina, para facilitar la union de un polimero a un atomo dentro de un aminoacido. Ademas, el resto de Factor IX se puede modificar para incluir restos de aminoacidos de origen no natural. Las tecnicas para la direccion de restos de aminoacidos y de restos de aminoacidos de origen no natural son bien conocidas por los expertos habituales en la materia.Se hace referencia a J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4a Ed. (New York: Wiley-lnterscience, 1992).
Ademas, el resto de Factor IX se puede modificar ventajosamente para incluir la union de un gr upo funcional (diferente que mediante la adicion de un resto de aminoacido que contiene un grupo funcional). Por ejemplo, el resto de Factor IX se puede modificar para incluir un grupo tiol. Ademas, el resto de Factor IX se puede modificar para incluir un carbono alfa N-terminal. Ademas, el resto de Factor IX se puede modificar la incluir uno o mas restos de hidrato de carbono. Tambien se pueden usar los restos de Factor IX modificados para contener un aminoxi, aldehido u otro grupo funcional.
Los Ejemplos de restos de Factor IX incluyen los siguientes: Factor IX; Factor IXa; versiones truncadas del Factor IX; proteinas hibridas, y peptidomimeticos que tengan actividad de Factor IX. Tambien pueden servir como resto de Factor IX los fragmentos biologicamente act ivos, las variantes de supresion, las variantes de sustitucion o las variantes de adicion de cualquiera de los anteriores que mantengan al menos algun grado de actividad de Factor IX.
Para cualquier resto dado, es posible determinar si el resto tiene actividad de Factor IX. Por ejemplo, se han criado intencionadamente varias lineas de animales con la mutacion genetica para la hemofilia de manera que unanimal criado a partir de tal linea tiene unos niveles muy bajos e insuficientes de Factor IX. Tales lineas estan disponibles a partir de una diversidad de fuentes tales como, sin limitacion, la Division de Laboratorios e Investigacion, Departmento de Salud Publica de Nueva York, Albany, NY y el Departamento de Patologia, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC. Ambas fuentes, por ejemplo, proporcionan perros que padecen la hemofilia B canina. Para ensayar la actividad de Factor IX de cualquier resto dado en cuestion, el resto se inyecta en el animal enfermo, se hace una pequena incision y se compara el tiempo de hemorragia con un control sano. Otro metodo util para determinar la actividad del Factor IX es determinar el cofactor y la actividad pro-coagulante. Vease, por ejemplo, Mertens etal. (1993) Brit. J. Haematol. 85:133-42.Tambien se pueden usar otrosmetodos conocidos por los expertos en la materia para determinar si un resto dado tiene una actividad de Factor IX. Tales metodos son utiles para determinar la actividad de Factor IX tanto de un resto de Factor IX propuesto como del conjugado de polimeroresto de Factor IX correspondiente.
El Polimero Soluble en Agua
Como se discutio anteriormente, cada conjugado comprende un resto de Factor IX unido a un polimero soluble en agua. Con respecto al polimero soluble en agua, el polimero soluble agua es no peptidico, no toxico, de origen no natural y biocompatible. Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia se considera biocompatible si los efectos beneficiosos asociados con el uso de la sustancia sola o con otra sustancia (por ejemplo, un agente activo tal como un resto de Factor IX) en contacto con los tejidos vivos (por ejemplo, administracion a un paciente) tienen mas peso que cualquier efecto perjudicial segun la evaluacion de un clinico, por ejemplo, un medico. Con respecto a la no inmunogenicidad, una sustancia se considera no inmunogenica si el uso no previsto de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmune no deseada (por ejemplo, la formacion de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmune, lo hace de modo que tal respuesta no se considera clinicamente significativa o importante segun la evaluacion de un clinico. Se prefiere particularmente que el polimero soluble en agua sea biocompatible y no inmunogenico.
Adicionalmente, el polimero se caracteriza tipicamente porque tiene de 2 a aproximadamente 300 extremos y en particular se selecciona entre poli(alquilenglicoles) tales como polietilenglicol (PEG), poli(propilenglicol) ("PPG"), copolimeros de etilenglicol y de propilenglicol, poli(poliol oxietilado), poli(alcohol olefinico), p oli(vinilpirrolidona), poli(hidroxialquilimetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), poli(sacaridos), pol i(a-hidroxiacido), pol i(alcohol vinilico), polifosfaceno, polioxazolina, poli(N-acriloilmorfolina), y las combinaciones de cualquiera de los anteriores.
El polimero no se limita a una estructura en particular y puede ser lineal (por ejemplo, alcoxi PEG o PEG funcional),
o no lineal tal como ramificado, bifurcado, de ramas multiples (por ejemplo, PEGunido a un nucleode poliol), y dendritico. Ademas, la estructura interna del polimero se puede organizar con cualquier num ero de pat rones diferentes yse puede seleccionar del grupo que consiste en homopolimero, copolimero alternante, copolimero aleatorio, copolimero en bloque, tripolimero alternante, tripolimero aleatorio, y tripolimero en bloque.
Tipicamente, el PEG activado y otros polimeros solubles en agua activados (es decir, reactivos polimericos) se activan con un grupo activador adecuado apropiado para el acoplamiento a un sitio deseado en el resto de Factor IX.
Por lo tanto, un reactivo polimerico poseera un gr upo reactivo para la reaccion con el resto de Factor IX. Los reactivos polimericos y los metodos representativos para la conjugacion de estos polimeros con un resto activo se conocen en la tecnica y se describen adicionalmente en �aiipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycols) f or Modification o f P olypeptides" en P olyethylene Glycol Chemistry: B iotechnical a nd B iomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), y en �aiipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157
182.
Tipicamente, el peso molecular promedio en peso del polimero soluble en agua en el conjugado esta en el intervalo de 6000 daltons a 90000 daltons, en el intervalo de 10000 daltons a 85000 daltons, en el intervalo de mayor que 10000 daltons a 85000 daltons, en el intervalo de 20000 daltons a 85000 daltons, en el intervalo de 53000 daltons a 85000 daltons, en el intervalo de 25000 daltons a 120000 daltons, en el intervalo de 29000 daltons a 120000 daltons, en el intervalo de 35000 daltons a 120000 daltons, y en el intervalo de 40000 daltons a 120000 daltons. Para cualquier polimero soluble en agua, se prefieren los PEG que tienen un peso molecular dentro de uno o mas de estos intervalos.
Los pesos moleculares promedio en peso ejemplares para el polimero soluble en agua incluyen aproximadamente 6000 daltons, aproximadamente 7000 daltons, aproximadamente 7500 daltons, aproximadamente 8000 daltons, aproximadamente 9000 daltons, aproximadamente 10000 daltons, aproximadamente 11000 daltons, aproximadamente 12000 daltons, aproximadamente 13000 daltons, aproximadamente 14000 daltons, aproximadamente 15000 daltons, aproximadamente 20000 daltons, aproximadamente 22500 daltons, aproximadamente 25000 daltons, aproximadamente 30000 daltons, aproximadamente 35000 daltons, aproximadamente 40000 daltons, aproximadamente 45000 daltons, aproximadamente 50000 daltons, aproximadamente 55000 daltons, aproximadamente 60000 daltons, aproximadamente 65000 daltons, aproximadamente 70000 daltons, y aproximadamente 75000 daltons. Tambien se pueden usar las versiones ramificadas del polimero soluble en agua (por ejemplo, un polimero ramificado soluble en agua de 40000 daltons compuesto de dos polimeros de 20000 daltons) que tiene un peso molecular total de cualquiera de los anteriores. En una o mas realizaciones, el conjugado no tendra ningun resto de PEG unido, directa o indirectamente, con un PEG que tenga un peso molecular promedio en peso inferior a aproximadamente 6000 daltons.
Cuando se usan como el polimero, los PEG comprenderan tipicamente un determinado numero de monomeros de (OCH2CH2) [o monomeros de (CH2CH2O), dependiendo de como se defina el PEG]. Como se ha usado a lo largo de la descripcion, el numero de unidades de repeticion se identifica a traves del subindice "n" en "(OCH2CH2)n-". De este modo, el valor de (n) entra tipicamente dentro de uno o mas de los siguientes intervalos: de 2 a aproximadamente 3400, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2300, de aproximadamente 100 a aproximadamente 2270, de aproximadamente 136 a apr oximadamente 2050, de aproximadamente 225 a aproximadamente 1 930, d e apr oximadamente 450 a aproximadamente 1 930, d e apr oximadamente 1200 a aproximadamente 1930, de aproximadamente 568 a aproximadamente 2727, de aproximadamente 660 a aproximadamente 2730, de aproximadamente 795 a aproximadamente 2730, de aproximadamente 795 a aproximadamente 2 730, de aproximadamente 9 09 a aproximadamente 2 730, y de apr oximadamente 1200 a aproximadamente 1900. Para cualquier polimero dado en el que se conoce el peso molecular, es posible determinar el numero de unidades de repeticion (es decir, "n") dividiendo el peso molecular promedio en peso del polimero entre el peso molecular del monomero que se repite.
Un polimero particularmente preferente para su uso en la presente invencion es un polimero con la parte terminal protegida, es decir, un polimero que tiene al menos un extremo protegido con grupo relativamente inerte, tal como un grupo alcoxi C1-6 inferior, aunque tambien se puede usar un grupo hidroxilo. Cuandoel polimero es PEG, por ejemplo, se prefiere usar un metoxi-PEG (denominado comunmente mPEG), que es una forma lineal de PEG en el que un extremo del polimero tiene un grupo metoxi (-OCH3), mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo u otro grupo funcional que opcionalmente puede estar quimicamente modificado.
En una forma util de la presente invencion, el PEG libre o no unido es un polimero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo:
HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH,
en los que (n) oscila tipicamente de cero a aproximadamente 4000.
El polimero que se ha mencionado anteriormente, alfa, omega-dihidroxipoli(etilenglicol), se puede representar de una forma breve como HO-PEG-OH en el que se entiende que el simbolo -PEG- puede representar la siguiente unidad estructural:
-
CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-,
en la que (n) es como se ha definido anteriormente.
Otro tipo de PEG util en la presente invencion es metoxi-PEG-OH, o abreviado mPEG, en el que un extremo es el
grupo metoxi relativamente inerte, mientras que el otro extremo es un grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se proporciona a continuacion.
CH3O-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
en la que (n) es como se ha descrito anteriormente.
Tambien se pueden usar como polimero las moleculas de PEG con ramas multiples o ramificadas, tales como las descritas en el documento de Patente de los Estados Unidos de America N° 5.932.462. Por ejemplo, PEG puede tener la estructura:
en la que:
polia y polib son cadenas principales de PEG (iguales o diferentes), tales como metoxi poli(etilenglicol);
R" es un resto no reactivo, tal como H, metilo o un esqueleto de PEG; y
P y Q son enlaces no reactivos. En una o mas realizaciones, el polimero de PEG ramificado es lisina disustituida con metoxi poli(etilenglicol). Dependiendo del resto de Factor IX especifico usado, se puede modificar de forma adicional el grupo funcional ester reactivo de la lisina disustituida para formar un grupo funcional adecuado para la reaccion con el grupo diana dentro del resto de Factor IX.
Ademas, el PEG puede comprender un PEG bifurcado. Un ejemplo de un PEG bifurcado se representa mediante la siguiente estructura:
en la que X es un resto espaciador de uno o mas atomos y cada � es un grupo terminal activado unido a CH a traves de una ca dena d e at omos de una l ongitud definida. El doc umento de S olicitud de P atente i nternacional N ° PCT/US99/05333, desvela diversas estructuras de PEG bifurcado que se pueden usar en una o mas realizaciones de la presente invencion. La cadena de atomos que une los grupos funcionales � con el atomo de carbono de la ramificacion sirven como un grupo de anclaje y puede comprender, por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de eter, cadenas de ester, cadenas de amida y las combinaciones de las mismas.
El pol imero de PEG puede co mprender una m olecula de PEG lateral que t iene grupos reactivos, tales como carboxilo, unidos covalentemente a lo largo de la cadena de PEG en vez de en el extremo de la cadena de PEG. Los grupos reactivos laterales se pueden unir al PEG directamente o a traves de un resto espaciador, tal como un grupo alquileno.
Ademas de las formas de PEG que se han descrito anteriormente, el polimero tambien se puede preparar con uno o mas enlaces degradables o debiles (tal como unenlace hidroliticamente degradable) en el polimero, incluyendo cualquiera de los polimeros que se han descrito anteriormente. Por ejemplo, se puede preparar el PEG con enlaces de ester en el polimero que se somete a hidrolisis. Como se muestra a continuacion, esta hidrolisis da como resultado la escision del polimero en fragmentos de menor peso molecular:
-PEG-CO2-PEG- � H2O � -PEG-CO2H � HO-PEG-
Otros enlaces hidroliticamente degradables, utiles como un enlace degradable dentro de una cadena principal de de polimero, incluyen: enlaces carbonato; enlaces imina que resultan, por ejemplo, a partir de la reaccion de una amina y un aldehido (vease, por ejemplo, Ouchi et al. (1997) Polymer Preprints 38(1):582-3); enlaces esterde fosfato formados, por ejemplo, por reaccion de un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona que se forman tipicamente por reaccion de una hidrazida y un aldehido; enlaces acetal que se forman tipicamente por reaccion entre un aldehido yun alcohol; enlaces ortoester quese forman, por ejemplo, por reaccion entre un formiato y un alcohol; enlaces amida formados por un grupo amina, por ejemplo, en el extremo de un polimero tal como PEG, y un grupo carboxilo de otra cadena de PEG; enlaces uretano formados por reaccion de, por ejemplo, un PEG con un
grupo terminal isocianato y un alcohol PEG; enlaces peptidicos formados por un grupo una amina, por ejemplo, en el extremo de un polimero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un peptido; y enlaces oligonucleotido formados por, por ejemplo, un grupo fosforamidito, por ejemplo, en el extremo de un polimero, yel grupo hidroxilo 5' de un oligonucleotido.
Tales caracteristicas opcionales del polimero conjugado, es decir, la introduccion de uno o mas enlaces degradables en la cadena del polimero, pueden proporcionar un control adicional sobre las propiedades farmacologicas finales deseadas del conjugado despues de la administracion. Por ejemplo, se puede administrar un conjugado grande y relativamente inerte (por ejemplo, que tiene una o mas cadenas de PEG de alto peso molecular unidas a un resto de Factor IX, por ejemplo, una o mas cadenas de PEG que tienen un peso molecular mayor de aproximadamente 10000, en el que el conjugado basicamente no posee bioactividad), quese hidrolizan para generar un conjugado bioactivo que posee una porcion de la cadena de PEG original. De esta manera, las propiedades del conjugado se pueden adaptar de una manera mas eficaz para equilibrar la bioactividad del conjugado con el tiempo.
Los expertos habituales en la materia reconoceran que la discusion anterior relativa basicamente a los segmentos de polimero solubles en agua no es de ninguna manera exhaustiva y es meramente ilustrativa, y que se contemplan todos los materiales polimericos que tienen las cualidades que se han descrito anteriormente. Como se usa en el presente documento, el termino "reactivo polimerico" se refiere generalmente a una molecula completa, que puede comprender un segmento de polimero soluble en agua y un grupo funcional.
Conjugados
Como se ha descrito anteriormente, un conjugado de la presente invencion comprende un polimero soluble en agua (como se ha descrito anteriormente) unido covalentemente a traves de un enlace amida directamente o a traves de un resto espaciador a un resto de Factor IX. Tipicamente, para cualquier conjugado dado, habra de uno a cuatro polimeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto de Factor IX (en el que para cada polimero soluble en agua, el p olimero s oluble e n ag ua s e puede unir directamente al r esto de Factor IX o a traves de un r esto espaciador). Ademas, el conjugado puede incluir no mas de 6 polimeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX, no mas de 5 polimeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX, no mas de 4 polimeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX, no mas de 3 polimeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX, y no mas de 2 polimeros solubles en agua unidos individualmente a un resto de Factor IX.
El enlace en particular entre el resto de Factor IX y el polimero (o el resto espaciador que esta unido al polimero) depende d e una di versidad de f actores. Tales factores incluyen, por e jemplo, el e nlace qui mico e n particular empleado, el resto de Factor IX en particular, los grupos funcionales disponibles dentro del resto de Factor IX (para la union a un pol imero o para la conversion en un sitio de union adecuado), y la posible presencia de grupos funcionales reactivos adicionales dentro del resto de Factor IX.
En una o mas realizaciones de la presente invencion, el enlace entre el resto de Factor IX y el polimero (o el resto espaciador que esta unido al polimero) es un enlace hidroliticamente estable, tal como una amida. En una o mas realizaciones, el enlace no resulta de la reaccion del reactivo polimerico que soporta un grupo funcional triazina, acetilo, hidrazina, diazonio, amino, o ester de succinimidilo con el resto de Factor IX.El enlace no es un enlace carbamato y no es un enlace carbamida, y ademas, no se forma ningun enlace basado en la reaccion de un derivado de polimero que soporta especies de isocianato o de isotiocianato con un resto de Factor IX. Una amida se puede preparar facilmente por reaccion de un grupo carboxilo contenido dentro del resto de Factor IX (por ejemplo, el grupo terminal carboxilo de un resto peptidico que tiene una actividad de Factor IX) con un polimero terminado en amino.
Tambien se describe en el presente documento un conjugado en el que el enlace entre el resto de Factor IX yel polimero (o el resto espaciador que esta unido al polimero) es un enlace degradable. De este modo, el enlace del polimero soluble en agua (y cualquier resto espaciador) es "escindible." Es decir, el polimero soluble en agua (y cualquier resto espaciador) se escinde (a traves de hidrolisis, procesos enzimaticos, o de otra manera), resultando de ese modo el resto de Factor IX nativo o no conjugado.Preferentemente, los enlaces de escision dan como resultado e l p olimero (y c ualquier r esto espaciador) separado d el r esto de F actor I X in v ivo sin de jar n ingun fragmento de polimero soluble en agua (ni cualquier resto espaciador). Los enlaces degradables ejemplares incluyen carbonato, ester de carboxilato, ester de fosfato, tioester, anhidridos, acetales, cetales, aciloxialquil eter, iminas, y ortoesteres. Tales enlaces se pueden preparar facilmente a traves de una modificacion apropiada del resto de Factor IX (por ejemplo, el extremo C delgrupocarboxilo de la proteinaoun grupo hidroxilode lacadenalateraldeun aminoacido tal como serina o treonina contenido dentro de la proteina) y/o el reactivo polimerico usando los metodos de acoplamiento empleados comunmente en la tecnica. Sin embargo, son mas preferentes los enlaces hidrolizables que s e f orman f acilmente por la reaccion d e un polimero act ivado adecuadamente co n un grupo funcional o modificado contenido dentro del resto que tiene actividad de Factor IX.
Los conjugados (en oposicion a un resto de Factor IX no conjugado) puede no poseer un grado medible de actividad de Factor IX. Es decir, un conjugado de acuerdo con la presente invencion poseera en cualquier lugar de aproximadamente un 0% a aproximadamente un 100% omas de labioactividad del resto de Factor IX original sin
modificar. Como se ha descrito en el presente documento en la que no es necesario de acuerdo con la presente invencion, los compuestos que poseen poca o ni nguna actividad de Factor IX contienen tipicamente un enlace hidrolizable que conecta el polimero con el resto, de manera que independientemente de la falta de actividaddel conjugado, la molecula original activa (o un derivado de la misma que tiene actividad de Factor IX) se libera despues de la escision del enlace inducida en medio acuoso. Tal actividad se puede determinar usando un modelo in vivo o in vitro, dependiendo de la actividad conocida del resto empleado en particular que tiene actividad de Factor IX.
De manera optima, la escision de cada porcion de polimero soluble en agua se facilita a traves del uso de enlaces fisiologicamente escindibles y/o enzimaticamente degradables tales como enlaces que contienen uretano, amida, carbonato o ester. De esta manera, la eliminacion del conjugado [a traves de la escision del polimero o polimeros solubles en agua individuales] se puede modular a traves de la seleccion del tamano molecular y del tipo de grupo funcional qu e proporcionaria l as propiedades de eliminacion deseadas. Los expertos hab ituales en l a materia pueden determinar el tamano molecular apropiado del polimero asi como el grupo funcional escindible. Por ejemplo, un experto habitual en la materia, usando experimentacion de rutina, puede determinar el tamano molecular apropiado y el grupo funcional escindible preparando primero una diversidad de conjugados de polimero-Factor IX con distintos pesos de po limero y de los grupos funcionales escindibles, y despues obteniendo el perfil de eliminacion para cada conjugado a traves de la administracion del conjugado a un paciente ytomando muestras periodicas de sangre y/o orina. Una vez que se ha obtenido una serie de perfiles de eliminacion para cada conjugado ensayado, se puede identificar un conjugado que tiene la eliminacion deseada.
Para los conjugados que poseen un enlace hidroliticamente estable que acopla el resto de Factor IX con el polimero, tal como un enlace amida de acuerdo con la presente invencion, el conjugado poseera tipicamente un grado medible de actividad de Factor IX. Por ejemplo, tales conjugado se caracterizan tipicamente porque tienen una bioactividad que satisface uno o mas de los siguientes porcentajes relativos a ladel resto de Factor IX no conjugado:al menos aproximadamente un 2%, al menos aproximadamente u n 5%, al m enos aproximadamente u n 10%, al m enos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 25%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente un 50%, al menos aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 80%, al menos aproximadamente un 85%, al menos aproximadamente un 90%, al menos aproximadamente un 95%, al menos aproximadamente un 97%, al menos aproximadamente un 100%, y mas de un 105% (cuando se mide en un modelo adecuado, tales como los presentados en el presente documento y/o los conocidos en la tecnica). Preferentemente, los conjugados que tienen un enlace hidroliticamente estable (por ejemplo, un enlace amida) poseeran al menos algun grado de la bioactividad del resto de Factor IX original no modificado.
Los conjugados ejemplares se describiran a continuacion. Se espera que el resto de Factor IX comparta (al menos en parte) una secuencia de aminoacidos similar o relacionada con el Factor IX nativo. Por lo tanto, mientras que se hara referencia a las posiciones o a los atomos especificos dentro de la proteina del Factor IX nativo, tal referencia solo es por conveniencia y un experto habitual en la materia sera capaz de determinar facilmente la posicion o el atomo correspondiente en otros restos que tengan actividad de Factor IX. En particular, la descripcion proporcionada en el presente documento para el Factor IX nativo a menudo es aplicable al Factor IXa, asi como a los fragmentos, variantes de supresion, variantes de sustitucion o variantes de adicion de cualquiera de los anteriores.
Los grupos amino en los restos de Factor IX pueden proporcionar un punto de union entre el resto de Factor IX y el polimero soluble en agua. El Factor IX nativo comprende 27 restos de lisina, cada uno con un grupo £-amino que puede ser adecuado para la conjugacion, asi como un extremo amino. Por lo tanto, los puntos de union ejemplares de tales restos de Factor IX incluyen la union a un aminoacido (a traves de una cadena lateral de lisina que contiene amina) con una o mas de las posiciones 39, 45, 51, 68, 89, 109, 127, 137, 146, 168, 189, 234, 247, 260, 274, 293, 311, 339, 347, 362, 387, 438, 440, 446, 455, 457, y 459. Adicionalmente, la amina N-terminal de cualquier proteina que tiene actividad de Factor IX tambien puede servir como punto de union.
Existen una diversidad de ejemplos de reactivos polimericos solubles en agua adecuados utiles para la formacion de enlaces covalentes con las aminas disponibles de un resto de Factor IX. Los ejemplos especificos, junto con los conjugados correspondientes, se proporcionan en la siguiente Tabla 1, que incluye los enlaces amida de acuerdo con la presente invencion. En la tabla, la variable (n) representa el numero de unidades monomericas de repeticion y "-NH-F9" representa el resto de Factor IX que sigue a la conjugacion con el polimero soluble en agua. Mientras que cada porcionpolimerica [por ejemplo, (OCH2CH2)no (CH2CH2O)n]presentada en la Tabla 1 termina en un grupo "CH3", los mismos se pueden sustituir por otros grupos (tal como H y bencilo).
Tabla 1
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG-Oxicarbonilimidazol
Enlace Carbamato
Derivado de mPEG Nitrofenilo
Enlace Carbamato
mPEG-Carbonato de Triclorofenilo
Enlace Carbamato
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace Amida
Derivado Homobifuncional de PEG-Succinimidilo
Enlaces Amida
(continua)
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado Homobifuncional de PEG-Succinimidilo
Enlace Amida
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace Amida
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace Amida
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace Amida
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace Amida
(continua)
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG-Carbonato de Benzotriazol
Enlace Carbamato
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace Carbamato
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace amida
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace amida
Derivado de mPEG2-N-Hidroxisuccinimida ramificado
Enlace amida
(continua)
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG2-Aldehido ramificado
Enlace amina secundaria
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace amida
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace amida
Derivado Homobifuncional de PEG-Succinimidilo
Enlaces amida
(continua)
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace amida
Derivado Homobifuncional de PEG-Propionato deSuccinimidilo
Enlaces amida
Derivado de mPEG-Succinimidilo
Enlace amida
Derivado de mPEG2-N-Hidroxisuccinimida ramificado
Enlace amida
Derivado de mPEG2-N-Hidroxisuccinimida ramificado
Enlace amida
(continua)
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG-Tioester
Enlace amida (tipicamente al resto de Factor IX que tiene una cisteina o histidina N-terminal)
Derivado Homobifuncional de PEG Propionaldehido
Enlaces amina secundaria
Derivado de mPEG Propionaldehido
Enlace amina secundaria
Derivado Homobifuncional de PEG Butiraldehido
Enlaces amina secundaria
Derivado de mPEG Butiraldehido
Enlace amina secundaria
Derivado de mPEG Butiraldehido
Enlace amina secundaria
(continua)
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado Homobifuncional mPEG Butiraldehido
Enlaces amina secundaria
Derivado de mPEG2 Butiraldehido ramificado
Enlace amina secundaria
Derivado de mPEG2 Butiraldehido ramificado
Enlace amina secundaria
Derivado de mPEG Acetal
Enlace amina secundaria
Derivado de mPEG Piperidona
Enlace amina secundaria (a un carbono secundario)
(continua)
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG Metilcetona
Enlace amina secundaria (a un carbono secundario)
mPEG tresilato
Enlace amina secundaria
Derivado de mPEG Maleimida (en determinadascondiciones de reaccion tales como pH � 8)
Enlace amina secundaria
Derivado de mPEG Maleimida (en determinadascondiciones de reaccion tales como pH � 8)
Enlace amina secundaria
Derivado de mPEG Maleimida (en determinadas condiciones de reaccion tales como pH � 8)
Enlace amina secundaria
(continua)
Reactivos polimericos especificos de aminas y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG Maleimida Bifurcado (en determinadas condiciones de reaccion tales como pH � 8)
Enlaces amina secundaria
Derivado de mPEG Maleimida Ramificado (en determinadas condiciones de reaccion tales como pH � 8)
Enlace amina secundaria
Posteriormente se describen de forma adicional en el presente documento los metodos para la preparacion de los conjugados y los conjugados asi producidos de factor IX con un polimero soluble en agua del tipo especialmente definido en el presente documento. Algunos de estos metodos son adecuados para la preparacion de un conjugado de acuerdo con la invencion reivindicada con un enlace amida.
La conjugacion de un reactivo polimerico con un grupo amina de un resto de Factor IX se puede conseguir a traves de una diversidad de tecnicas. En un enfoque, un resto de Factor IX se puede conjugar con un reactivo polimerico funcionalizado con un derivado de succinimidilo (u otro grupo ester activado, en el que se pueden usar enfoques similares a los que se han descrito para un derivado de succinimidilo para otros reactivos polimericos que contienen el grupo ester activado). En este enfoque, el resto polimerico que soporta un grupo succinimidilo se puede unir al resto de Factor IX en mediosacuosos a un pH de 7,0 a9,0, aunque encondiciones de reaccion diferentes (por ejemplo, un pH inferior tal como de 6 a 7, o diferentes temperaturas y/o inferiores a 15 °C) pueden dar como resultado la union de un polimero a una posicion diferente en el resto de Factor IX. Ademas, se puede formarun enlace amida a traves de la reaccion de un polimero soluble en agua, no peptidico terminado en amina con un resto de Factor IX que soporta un aldehido o un grupo acido carboxilico activado.
Un conjugado ejemplar comprende la siguiente estructura
en la que:
(n) es un numero entero que tiene un valor de desde 2 a 3400; X es un resto espaciador, preferentemente uno de metileno ("-CH2-"), etileno ("-CH2CH2-") y propileno ("- CH2CH2CH2-"); R1 es un radical organico, preferentemente H o metilo ("-CH3"); y F9 es un resto de Factor IX.
Es tipico de otro enfoque util para la conjugacion del resto de Factor IX con un reactivo polimerico el uso de una reaccion de aminacion reductora para conjugar una amina primaria de un resto de Factor IX con un polimero funcionalizado con una forma cetona, aldehido o un hidrato del mismo (por ejemplo, hidrato de cetona e hidrato de aldehido). En este enfoque, la amina primaria a partir del resto de Factor IX reacciona con el grupo carbonilo del aldehido o cetona (o con el correspondiente grupo que contiene hidroxi de un aldehido o cetona hidratados), formando ese modo una base de Schiff.La base deSchiff, a su vez,se puede convertir por reduccion en un conjugado estable a traves del uso de un agente reductor tal como borohidruro sodico. Las reacciones selectivas (por ejemplo, en el extremo N) son posibles, particularmente con un polimero funcionalizado con una cetona o con un aldehido ramificado con un metilo en alfa y/o en las condiciones especificas de reaccion (por ejemplo, pH reducido).
Los grupos carboxilo representan otro grupo funcional que puede servir como un punto de unionen el resto de Factor IX. Estructuralmente, el conjugado comprendera lo siguiente:
en el que F9 y el grupo carbonilo adyacente corresponde al resto de Factor IX que contiene carboxilo, X es un resto espaciador, preferentemente un heteroatomo seleccionado entre O, N(H), y S, y POLI es un polimero soluble en agua tal como PEG, opcionalmente terminado en un resto de proteccion terminal.
El enlace C(O)-X resulta de la reaccion entre un derivado polimerico que soporta un grupo funcional terminal y un resto de Factor IX que contiene carboxilo. Como se ha analizado anteriormente, el enlace especifico dependera del tipo de grupo funcional utilizado. Si el polimero esta funcionalizado en el extremo o "activado" con un grupo hidroxilo, el en lace r esultante se ra un est er de acido carboxilico y X sera O . Si l a ca dena pr incipal del polimero est a funcionalizada con un grupo tiol, el enlace resultante sera un tioester y X sera S. Cuando se emplean determinados polimeros con brazos multiples, ramificados o bifurcados, el resto C(O)X, y en particular el resto X, puede ser relativamente mas complejo y puede incluir una estructura de enlace mas larga.
Los reactivos polimericos que co ntienen un r esto de hidrazida tambien so n utiles para l a co njugacion c on un
carbonilo. En la medida en la que el resto de Factor IX no contenga un resto carbonilo, se puede introducir un resto carbonilo mediante la reduccion de cualquiera de los acidos carboxilicos (por ejemplo, el acido carboxilico Cterminal) y/o proporcionando las versiones glicosiladas o glicadas (en las que los azucares anadidos tienen un resto carbonilo) del resto de Factor IX.Los ejemplos especificos de reactivos polimericos que comprenden un resto de 5 hidrazida, junto con los conjugados correspondientes, se proporcionan en la Tabla 2, a continuacion. Ademas, cualquier reactivo polimerico que comprende un ester activado (por ejemplo, un grupo succinimidilo) se puede convertir para contener un resto de hidrazida mediante la reaccion del reactivo polimerico que comprende el ester activado con hidrazina (NH2-NH2) o ca rbazato de terc-butilo [NH2NHCO2C(CH3)3]. En la tabla, la variable (n) representa el numero de unidades monomericas de repeticion y "�C-F9" representa el resto de Factor IX que sigue a
10 la conjugacion con el reactivo polimerico. Opcionalmente, el enlace hidrazona se puede reducir usando un agente reductor adecuado. Aunque cada porcion polimerica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 1 termina en un grupo "CH3", otros grupos (tal como H y bencilo) se pueden sustituir por el mismo.
Tabla 2 15 Reactivos polimericos especificos de carboxilo y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG-Hidrazina
Enlace Hidrazona
Enlace Hidrazona
Derivado de mPEG-Hidrazina
Enlace Hidrazona
Derivado de mPEG-Hidrazina
Derivado de mPEG-Hidrazina Enlace Hidrazona
Enlace Hidrazona
Derivado de mPEG-Hidrazina
Derivado de mPEG-Hidrazina Enlace Hidrazona
Derivado de mPEG-Hidrazina Enlace Hidrazona
Enlace Hidrazona
Derivado de mPEG-Hidrazina
Los grupos tiol contenidos dentro del resto de Factor IX pueden servir como sitios efectivos de union para el polimero soluble en agua. En particular, los restos de cisteina proporcionan grupos tiol cuando el resto de Factor IX 20 es una proteina. Los grupos tiol en tales r estos de ci steina pu eden reaccionar co n un PEG activado q ue es
Especifico para la reaccion con grupos tiol, por ejemplo, un polimero de N-maleimidilo u otro derivado, como se ha descrito en la Patente de los Estados Unidos de America N° 5.739.208 y en la Publicacion de Patente Internacional N° WO 01/62827.
5 Aunque no se desea estar limitado por la teoria, se cree que todos los restos de cisteina dentro del Factor IX participan en el enlace disulfuro. Como consecuencia, la conjugacion con un resto de cisteina que participa en el enlace disulfuro puede alterar la estructura terciaria del Factor IX y potencialmente reducir de manera significativa su actividad global. Por lo tanto, suponiendo que cualquier resto de Factor IX en particular carezca de un grupo tiol o se deba evitar la alteracion de los enlaces disulfuro, es posible anadir un resto de cisteina al resto de Factor IX usando
10 tecnicas sinteticas convencionales. Vease, por ejemplo, el procedimiento descrito en la Publicacion de Patente internacional N° WO 90/12874 para la adicion de restos de cisteina, en la que se puede adaptar tal procedimiento para un resto de Factor IX. Ademas, tambien se pueden usar los procesos convencionales de ingenieria genetica para introducir un resto de cisteina en el resto de Factor IX.
15 Los ejemplos especificos, junto con los conjugados correspondientes, se proporcionan en la Tabla 3, a continuacion. En la tabla, la variable (n) representa el numero de unidades monomericas derepeticion y "-S-F9" representa el resto de Factor IX que sigue a la conjugacion con el polimero soluble en agua. Aunque cada porcion polimerica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH2O)n] presentada en la Tabla 3 termina en un grupo "CH3", otros grupos (tal como H y bencilo) se pueden sustituir por el mismo.
Tabla 3
Reactivos polimericos especificos de tioles y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG Maleimida
Enlace Tioeter
Derivado de mPEG Maleimida
Enlace Tioeter
Derivado de mPEG Maleimida
Enlace Tioeter
Derivado Homobifuncional de mPEG Maleimida
Enlaces Tioeter
(continua)
Reactivos polimericos especificos de tioles y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG Maleimida
Enlace Tioeter
Derivado de mPEG Maleimida
Enlace Tioeter
Derivado de mPEG Maleimida Bifurcado
Enlace Tioeter
(continua)
Reactivos polimericos especificos de tioles y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG2 Maleimida Ramificado
Enlace Tioeter
Derivado de mPEG2 Maleimida Ramificado
Enlace Tioeter
(continua)
Reactivos polimericos especificos de tioles y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG2 Maleimida Ramificado Bifurcado
Enlaces Tioeter
Derivado de mPEG2 Maleimida Ramificado Bifurcado
Enlaces Tioeter
(continua)
Reactivos polimericos especificos de tioles y conjugado de resto de Factor IX formado a partir de los mismos
Reactivo Polimerico
Conjugado Correspondiente
Derivado de mPEG Vinil Sulfona
Enlace Tioeter
Derivado de mPEG Tiol
Enlace Disulfuro
Derivado Homobifuncional de mPEG Tiol
Enlaces Disulfuro
Derivado de mPEG Disulfuro
Enlace Disulfuro
Con respecto a los conjugados formados a partir de polimeros solubles en agua que soportan uno o mas grupos funcionales maleimida (independientemente de si la maleimida reacciona con un grupo amina o tiol del resto de Factor IX), la correspondiente o correspondientes formas acidas maleamicas del polimero soluble en agua tambien pueden reaccionar con el resto de Factor IX. En ciertas condiciones (por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7-9 en presencia de agua), el anillo de maleimida se abre para formar el correspondiente acido maleamico. El acido maleamico, a su vez, puede reaccionar con un grupo amina o tiol del resto de Factor IX. Los ejemplos de las reacciones basadas en el acido maleamico se muestran de forma esquematica a continuacion. POLI representa el polimero soluble en agua, y F9 representa el resto de Factor IX.
Un conjugado representativo de acuerdo con la presente invencion pueden tener la siguiente estructura:
POLI-L0,1-C(O)�-Y-S-S-F9
en la que POLI es un polimero soluble en agua, L es un engarce opcional, � es un heteroatomo seleccionado entre el grupo que consiste en O, NH, y S, e Y se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo C2-10, alquilo C2-10 sustituido, arilo, y arilo sustituido, y F9 es un resto de Factor IX. Los reactivos polimericos que pueden reaccionar con el resto de Factor IX y dan como resultado este tipo de conjugado se describen en el documento de Publicacion de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de America N° 2005/0014903.
Con respecto a los reactivos polimericos, los descritos en el presente documento y en otra parte se pueden adquirir de fuentes comerciales (por ejemplo, Nektar Therapeutics, Huntsville AL). Ademas, los metodos para la preparacion de los reactivos polimericos se describen en la bibliografia.
De acuerdo con la presente invencion la union entre el resto de Factor IX y el polimero soluble en agua puede ser directa, en la que ninguno de los atomos intervinientes esta localizado entre el resto de Factor IX y el polimero, o indirecta, en la que uno o mas atomos estan localizados entre el resto de Factor IX y el polimero. Con respecto a la union indirecta, un "resto espaciador" sirve como union entre el resto de Factor IX y el polimero soluble en agua. El uno o mas atomos que conforman el resto espaciador pueden incluir uno o mas atomos de carbono, atomos de nitrogeno, atomos de azufre, atomos de oxigeno, y las combinaciones de los mismos. El resto espaciador puede comprender; un gr upo am ida, am ina se cundaria, ca rbamato, t ioeter, y/o di sulfuro. Los ejemplos de r estos espaciadores especificos incluyen los seleccionados entre el grupo que consiste en -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-NH-, -O-C(O)-NH-, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -O-CH2-, -CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-O-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-O-CH2-, -CH2-CH2-CH2
CH2-O-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-, -C(O)-O-CH2-, -CH2-C(O)-Q-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-O-CH2-, -C(O)-O-CH2-CH2-, -NH-C(O)-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -NH-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(O)-CHz-CH2, -CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -C(O)-NH-CH2-, -C(O)-NH-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-, -O-C(O)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(O)-CH2-CH2-, -CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C (O)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-, -O-C(O)-NH-[CH2]h-(OCH2CH2)j, un grupo cicloalquilo bivalente, -O-, -S-, un aminoacido, -N(R6), y las combinaciones de dos o mas de cualquiera de los anteriores, en los que R6 es H o un radical organico seleccionado entre el grupo qu e co nsiste en alquilo, a lquilo s ustituido, al quenilo, a lquenilo s ustituido, al quinilo, alquinilo sustituido, arilo yarilo sustituido, (h) es de cero a seis, y (j) es de cero a 20. Otros restos espaciadores especificos tienen las siguientes estructuras: -C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, -NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, y -O-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-, en los que los valores de los subindices que siguen a cada metileno indican el numero de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, (CH2)1-6 significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5
o 6 metilenos. Ademas, cualquiera de los restos espaciadores anteriores puede incluir de forma adicional una cadena de oligomero de oxido de etileno que comprende de 1 a 20 unidades monomericas de oxido de etileno [es decir, -(CH2CH2O)1-20]. Es decir, la cadena de oligomero de oxido de etileno puede aparecer antes o despues del resto espaciador, y opcionalmente entre dos atomos cualesquiera del resto espaciador que consta de dos o mas atomos. Ademas, la cadena de oligomero no se consideraria como parte del resto espaciador si el oligomero es adyacente al segmento polimerico y representa meramente una extension del segmento polimerico. El resto espaciador no incluye azucares o hidratos de carbono y es preferente que el conjugado carezca basicamente de cualquier polimero soluble en agua unido directamente, o a traves de un resto espaciador, a un azucar o hidrato de carbono que, a su vez, este unido a un resto de Factor IX.
En algunos ejemplos, el conjugado de acuerdo con la presente invencion puede tener solamente un polimero soluble en agua sencillo asociado a un resto de Factor IX sencillo. En consecuencia, puede ser deseable que el polimero soluble en agua sea un polimero no lineal soluble en agua (y preparar el conjugado utilizando un reactivo polimerico no lineal). Un polimero no lineal soluble en agua preferente es un polimero soluble en agua ramificado, aunque se incluyen los polimeros solubles en agua multi-ramificados. Mediante la incorporacion de un polimero soluble en agua ramificado, es posible, por ejemplo, duplicar el peso molecular eficaz para cada sitio de union en comparacion con los polimeros sencillos.
Los conjugados ejemplares de la presenteinvencion son en los que el polimero soluble en agua esta en forma ramificada, incluyen las formas ramificadas que comprenden un polimero ramificado basado en lisina y un enfoque ramificado que comprende la estructura:
en la que cada (n) es independientemente un numero entero que tiene un valor de 2 a 3400. Los conjugados ejemplares de la presente invencion comprenden la siguiente estructura:
en la que:
cada (n) es independientemente un numero entero que tiene un valor de 2 a 3400; X es un resto espaciador;
(b)es un numero entero que tiene un valor de 2 a 6;
(c)es un numero entero que tiene un valor de 2 a 6;
R2, en cada aparicion, es independientemente H o alquilo inferior; y
F9 es un resto de Factor IX.
Un conjugado ejemplar de la presente invencion comprende la siguiente estructura:
en la que: cada (n) es independientemente un numero entero que tiene un valor de 2 a 3400; y F9 es un resto de Factor IX. Otro conjugado ejemplar de la presente invencion comprende la siguiente estructura:
en la que: 20 cada (n) es independientemente un numero entero que tiene un valor de 2 a 3400;
(a) es cero o uno;
X, cuando esta presente, es un resto espaciador que comprende uno o mas atomos; 25 (b') es cero o un numero entero que tiene un valor de uno a diez;
(c) es un numero entero que tiene un valor de uno a diez;
R2, en cada aparicion, es independientemente H o un radical organico; 30 R3, en cada aparicion, es independientemente H o un radical organico; y F9 es un resto de Factor IX.
Un conjugado ejemplar de la presente invencion comprende la siguiente estructura:
en la que: cada (n) es independientemente un numero entero que tiene un valor de 2 a 3400; y
40 F9 es un resto de Factor IX.
Composiciones
Tipicamente, l os conjugados f orman par te de co mposiciones. G eneralmente, l a co mposicion co mprende un a
45 pluralidad de conjugados, teniendo cada uno de ellos uno, dos, tres o cuatro polimeros solubles en agua como se
han definido anteriormente unidos covalentemente de forma separada (bien directamente o bien a traves de un resto espaciador) a un resto del Factor IX. Ademas, la presente invencion incluye ejemplosen los que la composicion comprende una pluralidad de conjugados, comprendiendo cada conjugado un polimero soluble en agua como se ha definido anteriormente unido covalentemente a un resto de Factor IX; asi como composiciones comprenden dos, tres
o cuatro polimeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto del Factor IX.
En una o m as realizaciones de l a pr esente i nvencion se pr oporciona u na co mposicion, co mprendiendo l a composicion una pluralidad de conjugados, en la que al menos aproximadamente un 80% de todos los conjugados en la composicion comprenden cada uno un resto del Factor IX unido covalentemente a uno, dos, tres o cuatro polimeros solubles en agua como se han definido anteriormente y en la que de forma adicional para cada polimero soluble en agua en el conjugado, el resto de Factor IX esta unido al polimero soluble en agua a traves de un enlace amida, bien directamente o bien a traves de un resto espaciador que comprende uno o mas atomos.
Con respecto a los conjugados en la composicion, la composicion satisfara tipicamente una o mas de las siguientes caracteristicas: al menos aproximadamente un 85% de los conjugados en la composicion tendra de uno a tres polimeros unidos al restode Factor IX; al menos aproximadamente un 85% de losconjugados en la composicion tendra de uno a tres polimeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 85% de los conjugados en la composicion tendra de uno a dos polimeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 85% de los conjugados en la composicion tendra un polimero unido a resto del Factor IX (es decir, sera monoPEGilado); al menos aproximadamente un 95% de los conjugados en la composicion tendra de uno a cinco polimeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 95% de los conjugados en la composicion tendra de uno a cuatro polimeros unidos al restode Factor IX; al menos aproximadamente un 95% de losconjugados en la composicion tendra de uno a tres polimeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 95% de los conjugados en la composicion tendra de uno a dos polimeros unidos al resto de Factor IX; al menos un 95% de los conjugados en la composicion tendra un polimero unido al resto de Factor IX (es decir, sera monoPEGilado); al menos aproximadamente un 99% de los conjugados en la composicion tendra de uno a cuatro polimeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 99% de los conjugados en la composicion tendra de uno a tres polimeros unidos al resto de Factor IX; al menos aproximadamente un 99% de los conjugados en la composicion tendra de uno a dos polimeros unidos al resto de Factor IX; y al menos aproximadamente un 99% de los conjugados en la composicion tendra un polimero unido al resto de Factor IX (es decir, sera monoPEGilado).
En una o mas realizaciones, es preferente que la composicion que contiene el conjugado este libre o basicamente libre de albumina. Es tambien preferente que la composicion este libre o basicamente libre de proteinas que no tengan actividad de Factor IX. De esta manera, es preferentequela composicion este libre en un 85%, mas preferentemente en un 95%, y lo mas preferentemente en un 99%, de albumina. Ademas, es preferente que la composicion este libre en un 85%, mas preferentemente en un 95%, y lo mas preferentemente en un 99%, de cualquier pr oteina q ue no tenga actividad de F actor I X. S uponiendo qu e l a albumina est a pr esente en l a composicion, las composiciones ejemplares de la presente invencion estan basicamente libres de conjugados que comprenden un polimero de polietilenglicol que une un residuo de un resto de Factor IX a la albumina.
El control del numero deseado de polimeros para cualquier resto determinado se puede conseguir mediante la seleccion del reactivo polimerico apropiado, la proporcion de reactivo polimerico con respecto al resto de Factor IX, la temperatura, las condiciones de pH, y otros aspectos de la reaccion de conjugacion. Ademas, lareduccion o eliminacion de los conjugados no deseados (por ejemplo, los conjugados que tienen cuatro o mas polimeros unidos) se puede conseguir por medio de purificacion.
Por ejemplo, los conjugados polimero-resto de Factor IX se pueden purificar para obtener/aislar diferentes especies conjugadas. De forma especifica, la mezcla de productos se puede purificar para obtener un promedio cualquiera entre uno, dos, tres, cuatro, cinco o mas PEGs por resto de Factor IX, tipicamente uno, dos o tres PEGs por resto de Factor I X. La estrategia p ara l a p urificacion d e l a m ezcla d e r eaccion de l co njugado f inal d ependera de u na diversidad de factores, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimerico empleado, el resto de Factor IX en particular, el regimen de dosificacion deseado, y la actividad residual ylas propiedades in vivo del conjugado o conjugados individuales.
Si se desea, los conjugados que tienen diferentes pesos moleculares se pueden aislar utilizando cromatografia por filtracion en gel y/o cromatografia de intercambio ionico. Es decir, la cromatografia por filtracion en gel se usa para fraccionar diferentes valores del promedio de polimero con respecto al resto de Factor IX (por ejemplo, 1-mero, 2mero, 3-mero, y demas, en los que "1-mero" indica 1 polimero unido a un resto de Factor IX, "2-mero" 2 polimeros unidos a un resto de Factor IX, y asi sucesivamente) basandose en sus diferentes pesos moleculares (cuando la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promediode la parte de polimero soluble en agua). Por ejemplo, en una reaccion ejemplar en la que se conjuga aleatoriamente una proteina de 55000 daltons con un reactivo polimerico que t iene un p eso m olecular de a proximadamente 20 000 daltons, l a me zcla d e re accion resultante puede contener la proteina no modificada (que tiene un peso molecular de aproximadamente 55000 daltons), la proteina monoPEGilada (o "1-mero") (que tiene un peso molecular de aproximadamente 75000 daltons), la proteina diPEGilada (o "2-mero") (que tiene un peso molecular de aproximadamente 95000 daltons), y demas.
Mientras este enfoque se puede utilizar para separar conjugados de restos de Factor IX con PEGy con otros polimeros quetengan diferentes pesos moleculares, esta aproximacion no es generalmente eficaz para separar isomeros posicionales que presentan diferentes sitios de union del polimero en el resto de Factor IX. Por ejemplo, la cromatografia por filtracion en gel se pueden usar para separar unas de otras las mezclas de 1 -meros, 2-meros, 3meros, y demas, aunque cada una de las composiciones de PEG-mero recuperadas puede contener PEGs unidos a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, restos de lisina) en el resto de Factor IX.
Las columnas par a f iltracion en gel a decuadas par a l levar a c abo est e t ipo d e se paracion incluyen c olumnas SuperdexT y SephadexT disponibles en Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). La seleccion de una columna en particular dependera del rango de fraccionamiento deseado. Generalmente, la elucion se lleva a cabo utilizando un tampon adecuado, tal como fosfato o acetato. Las fracciones recogidas se pueden analizar mediante una diversidad de m etodos diferentes, p or ej emplo, ( i) absorbancia a 280 nm p ara el co ntenido de pr oteinas, ( ii) an alisis de proteinas basado en una tincion usando albumina en suero bovino como estandar, (iii) ensayo de yodo para el contenido de PEG (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107:60-63), (iv) electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico ( SDS P AGE), se guido de t incion co n cl oruro de bar io, y cr omatografia l iquida d e al to rendimiento.
La separacion de los isomeros posicionales se puede llevar a cabo mediante cromatografia de fase inversa utilizando metodos de cromatografia liquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) usando por ejemplo una columna C18 o una columna C3 (Amersham Biosciences o Vydac) o mediante cromatografia de intercambio ionico utilizando una columna de intercambio ionico, por ejemplo, una columna de intercambio ionico SepharoseT disponible en Amersham Biosciences. Cualquiera de los dos enfoques se puede utilizar para separar isomeros polimero-agente activo tienen el mismo peso molecular (isomeros posicionales).
Preferentemente, las composiciones estan basicamente libres de proteinas que no tienen actividad de Factor IX. Ademas, preferentemente las composiciones estan basicamente libres de todos los demas polimeros solubles en agua unidos de forma no covalente. En algunas circunstancias, sin embargo, la composicion puede contener una mezcla de conjugados polimero-resto de Factor IX y Factor IX no conjugado.
Opcionalmente, l a co mposicion de l a presente i nvencion co mprende de f orma ad icional u n e xcipiente farmaceuticamente ace ptable. S i se dese a, el e xcipiente f armaceuticamente ac eptable se pu ede ana dir a u n conjugado para formar una composicion.
Los ejemplos de excipientes incluyen los seleccionados entre el grupo que consiste en hidratos de carbono, sales inorganicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, acidos, bases, y las combinaciones de los mismos.
Un hidrato de carbono tal como un azucar, un azucar derivatizado tal como un alditol, acido aldonico, un azucar esterificado y/o un polimero de az ucar p uede estar pr esente co mo e xcipiente. Los ex cipientes de hi dratos de carbono especificos incluyen, por ejemplo: monosacaridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, Dmanosa, y sorbosa; disacaridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, y celobiosa; polisacaridos, tales como rafinosa, melecitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, y mioinositol.
El excipientetambien pueden incluir unasal inorganica o tampontal como acido citrico, cloruro sodico, cloruro potasico, sulfato sodico, nitrato potasico, fosfato sodico monobasico, fosfato sodico dibasico, y las combinaciones de los mismos.
La composicion tambien pueden incluir un agente antimicrobiano para la prevencion o disuasion del crecimiento microbiano. Los ejemplos de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invencion incluyen cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencilico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletilico, nitrato fenilmercurico, timersol, y las combinaciones de los mismos.
Tambien p uede est ar pr esente e n la c omposicion u n a ntioxidante. Lo s antioxidantes se usan p ara pr evenir l a oxidacion, previniendo de esta manera el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparacion. Los antioxidantes adecuados para su uso en l a pr esente i nvencion i ncluyen, por ej emplo, pa lmitato de asco rbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, acido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito sodico, formaldehido sodico sulfoxilado, metabisulfito sodico, y las combinaciones de los mismos.
Un tensioactivo puede estar presente como excipiente. Los ejemplos de tensioactivos incluyen: polisorbatos, tales como "Tween20" y "Tween 80," y pluronicos tales como F68 y F88 (ambos disponibles en BASF, Mount Olive, New Jersey); est eres de s orbitan; l ipidos, t ales como f osfolipidos tales co mo l ecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferentemente no en forma liposomal), acidos grasos y esteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA, cinc y otros cationes adecuados.
Los acidos o las bases pueden estar presentes en la composicion como excipientes. Los ejemplos de acidos que se
pueden utilizar incluyen los acidos seleccionados entre el grupo que consiste en acido clorhidrico, acido acetico, acido fosforico, acido citrico, acido malico, acido lactico, acido formico, acido tricloroacetico, acido nitrico, acido perclorico, acido fosforico, acido sulfurico, acido fumarico, y las combinaciones de los mismos. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen las bases seleccionadas entre el grupo que consiste en hidroxido sodico, acetato sodico, hidroxido amonico, hidroxido potasico, acetato amonico, acetato potasico, fosfato sodico, fosfato potasico, citrato sodico, formiato sodico, sulfato sodico, sulfato potasico, fumarato potasico, y las combinaciones de los mismos.
La cantidad de conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el reactivo polimerico) en la composicion p odra va riar d ependiendo d e una d iversidad d e f actores, per o se ra opt imamente una ca ntidad terapeuticamente eficaz cuando la composicion se almacena en un envase de dosificacion unitario (por ejemplo, un vial). A demas, l a pr eparacion f armaceutica se pue de a lojar e n un a j eringa. S e pu ede d eterminar l a ca ntidad terapeuticamente ef icaz experimentalmente m ediante la adm inistracion r epetida de ca ntidades en a umento d el conjugado para determinar que cantidad produce el criterio de valoracion clinico deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composicion podra variar dependiendo de la actividad del excipiente y de l as necesidades particulares de la c omposicion. T ipicamente, l a ca ntidad o ptima de cu alquier excipiente individual se determina a traves de una experimentacion de rutina, es decir, mediante la preparacion de composiciones que contienen cantidades variables del excipiente (que varian de valores bajos a elevados), examinando la estabilidad y otros parametros, y a continuacion determinando el intervalo en el que se obtiene un rendimiento optimo sin efectos adversos importantes.
Sin embargo, generalmente, el excipiente estara presente en la composicion en una cantidad de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 99% en peso, preferentemente de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 98% en peso, mas preferentemente de aproximadamente un 15 aproximadamente un 95% en peso del excipiente, siendo las concentraciones mas preferentes las menores del 30% en peso.
Estos excipientes farmaceuticos anteriores junto con otros excipientes se describen en "Remington: The Science & Practice of P harmacy", 19a ed. , W illiams & W illiams, ( 1995), " Physician's Desk Reference", 52a ed., M edical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.M., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a Edicion, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Las composiciones incluyen todos los tipos de formulaciones y en particular los que son adecuados para inyeccion, por ejemplo, polvos o liofilizados que se pueden reconstituir como liquidos. Los ejemplos de diluyentes adecuados para la reconstitucion de las composiciones solidas antes de la inyeccion incluyen agua bacteriostatica para inyeccion, dextrosa al 5% en agua, tamponfosfato salino, solucion de Ringer, solucion salina, agua esteril, agua desionizada, y las combinaciones de los mismos. Con respecto a l as composiciones farmaceuticas liquidas, se preven las soluciones y suspensiones.
Las composiciones de la presente invencion se administran tipicamente, aunque no necesariamente, mediante inyeccion y por lo tanto son generalmente soluciones o suspensiones liquidas inmediatamente antes de su administracion. La preparacion f armaceutica t ambien puede t omar otras formas tales como j arabes, cremas, pomadas, comprimidos, y polvos. Tambien se incluyen otros modos de administracion, tales como pulmonar, rectal, transdermico, transmucosal, oral, intratecal, subcutaneo, intraarterial, y demas.
Tambien se descr ibe en el presente docu mento un m etodo p ara el s uministro d e u n co njugado, co mo se h a proporcionado el presente documento, a un paciente que sufre de una afeccion que es responsable del tratamiento con el co njugado. E l m etodo c omprende el su ministro, gen eralmente m ediante inyeccion, d e u na c antidad terapeuticamente eficaz del conjugado (preferentemente proporcionado como parte de una composicion farmaceutica). Los conjugados(tipicamente como parte de una composicion farmaceutica) se pueden suministrar mediante, por ejemplo, inyeccion intravenosa, inyeccion intramuscular, inyeccion subcutanea, y demas. Los tipos de formulacion adecuados para la administracion parenteral incluyen soluciones listas para la inyeccion, polvos secos para la combinacion con un disolvente antes de su uso, suspensiones listas para inyeccion, composiciones secas insolubles para la combinacion con un vehiculo antes de su uso, y emulsiones y liquidos concentrados para diluirse antes de la administracion, entre otras.
El metodo de suministro se puede usar para tratar a un paci ente que tiene una afeccion que se puede remediar o prevenir mediante la administracion del conjugado. Los expertos habituales en la materia conocen las afecciones que puede tratar de forma eficaz un conjugado especifico. Por ejemplo, los conjugados se pueden utilizar para tratar a individuos que padecen hemofilia B, bien como terapia de reemplazo o bien como profilaxis. La administracion del conjugado para la profilaxis incluye las situaciones en las que el paciente padece hemofilia B y va a someterse a una intervencion quirurgica y el conjugado se administra entre una y cuatro horas antes de la intervencion quirurgica. Ademas, los conjugados son adecuados para su uso como profilacticofrente a las hemorragias incontroladas, opcionalmente en p acientes que no p adecen h emofilia. D e est a m anera, por ejemplo, e l co njugado s e pu ede administrar un paciente con riesgo de hemorragia incontrolada antes de una intervencion quirurgica.
La dosisreal que se administra podravariardependiendo de la edad, peso, y elestadogeneral desalud delsujeto
asi como de la gravedad de la afeccion que se esta tratando, del juicio del profesional de cuidados sanitarios, y del conjugado que se va administrar. Los expertos en la materia conocen las cantidades terapeuticamente eficaces y/o estas se describen en los libros de texto y la literatura de referencia pertinentes. Generalmente, en base al peso, la cantidad terapeuticamente eficaz podra variar de aproximadamente 0,001 mg a 100 mg, preferentemente en dosis
5 de 0,01 mg/dia a 75 mg/dia, y mas preferentemente en dosis de 0,10 mg/dia a 50 mg/dia. En base a la actividad, el experto en la materia puede calcular las dosis correspondientes basadas en unidades internacionales de actividad.
La dosificacion unitaria de cualquier conjugado determinado (de nuevo, proporcionado preferentemente como parte de una composicion farmaceutica) se puede administrar con una diversidad de programas de dosificacion que
10 dependen del juicio del clinico, las necesidades del paciente, y demas. El programa de dosificacion especifico se conoce por los expertos habituales en la materia o se puede determinar experimentalmente utilizando metodos de rutina. Los ejemplos de programas de dosificacion incluyen la administracion cinco veces al dia, cuatro veces al dia, tres veces al dia, dos veces al dia, una vez al dia, tres veces a la semana, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, una vez al mes, y cualquier combinacion de los mismos. Una vez que se ha conseguido
15 el criterio de valoracion clinico, se interrumpe la dosificacion de la composicion.
Procedimiento experimental
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique otra cosa, tecnicas convencionales de
20 sintesis organica, que estan dentro de la experiencia de la tecnica. Tales tecnicas se explican completamente en la bibliografia. Los reactivos y los materiales estan disponibles comercialmente a menos que se indique especificamente lo contrario. Vease, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms y Structure, 4a Ed. (New York: Wiley-lnterscience, 1992), mencionado anteriormente.
25 En los siguientes ejemplos, se ha realizado un esfuerzo para asegurarsede la precision con respecto a los valores numericos utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero se deberian tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las temperaturas son en grados Celsius °C y la presion es la presion atmosferica a nivel del mar o cercana a ella.
30 Aunque se hara referencia a otras abreviaturas conocidas por los expertos habituales en la materia, se usaran otros reactivos y materiales, y se usaran otros metodos conocidos por los expertos en lamateria, se proporciona la siguiente lista y descripcion de metodos solo por conveniencia.
NaCNBH3 Cianoborohidruro sodico, 95% (Aldrich)
HCI Acido clorhidrico, glacial (Fisher)
K o kDa kilodaltons
Acetonitrilo (Fisher Optima)
TFA Acido trifluoroacetico, calidad de HPLC (JT Baker)
PBS Tampon fosfato salino (Sigma)
SEC Cromatografia de exclusion por tamano
HPLC Cromatografia liquida de alto rendimiento
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico
35 HEPES [acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfonico] certificado de rendimiento en biotecnologia, 99,5�% (Sigma)
Alcohol etilico, USP, Absolute-200 Proof (AAPER)
40 NuPAGE® MES [acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico] tampon de migracion en SDS (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA)
NuPAGE® 4 x LDS (docecilsulfato de litio) tampon de muestras (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA)
45 SigmaMarker, intervalo bajo (P.M. 6500-66000) (Sigma)
SigmaMarker, intervalo medio (P.M. 36000-205000) (Sigma)
50 NuPAGE® Novex Bis-Tris [Bis(2-hidroxietil)imino-tris(hidroximetil)metano-HCI] gel (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA)
Analisis por SEC-HPLC
La cromatografia de exclusion por tamano (SEC) se llevo a cabo en un sistema Agilent 1100 HPLC (Agilent). Para las muestras que se analizaron utilizando SEC-HPLC, cada muestra se analizo utilizando una columna KW-804 de
5 proteina SHODEX (Showa Denko KK, Tokio Japon), a pH 7,2. El caudal para la columna se ajusto a 0,5 ml/minuto. Las proteinas y los conjugados PEG-proteina eluidos se detectaron utilizando un enfoque basado en UV que tiene una longitud de onda establecida en 280 nm.
Analisis por SDS-PAGE
10 La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico (SDS-PAGE) se llevo a cabo usando un sistema de electroforesis XCELL SURELOCK Mini-Cell (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA). Para las muestras que se analizaron utilizando SDS-PAGE, cada mezcla se mezclo con 4 x tampon de muestras LDS (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA). A continuacion las muestras preparadas se cargaron sobre un gel NuPAGE Novex Bis-Tris al 4-12% y
15 migraron durante aproximadamente 30 minutos a 200 V usando tampon de migracion NuPAGE®MES (Invitrogen Corporation, Carlsbad CA).
Analisis por RP-HPLC
20 La cromatografia liquida de alto rendimiento de fase inversa se realizo utilizando una columna inversa C3 (Hamilton,
�orbax). Se utilizo un gradiente del 30-80% de acetonitrilo junto con una temperatura elevada durante 30 minutos a 0,5 ml/ minuto.
El Factor IX recombinante correspondiente a la secuencia de aminoacidos de la SEC. ID. N° 1 se utilizo en los
25 Ejemplos 1-16. Se obtuvo el Factor IX en un tampon que contiene tanto L-histidina como glicina. A causa de que los grupos amino asociados con la L-histidina y la glicina en el tampon podrian competir con los grupos amino asociados con el Factor IX, fue necesario intercambiar el tampon que contiene amina por un tampon libre de aminas para mejorar el rendimiento de la conjugacion del Factor IX cuando se utilizaron reactivos polimericos dirigidos a aminas para efectuar la conjugacion.
30 En resumen, el tampon que contiene amina se intercambio por un tampon libre de aminas en una de las dos aproximaciones, dependiendo del volumen de t ampon a intercambiar. Para volumenes de tamponrelativamente pequenos, se utilizo una columna centrifuga de 500 1l �eba Desalt (Pierce Biotechnology, Rockford IL) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Para volumenes de tampon relativamente grandes, se utilizo un
35 dispositivo de filtrado centrifugo de 2 ml CENTRICON® (Millipore Corporation, Billerica MA) con un punto de corte de un peso molecular de 10000 o 30000 dalton de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Todas las muestras utilizadas en los Ejemplos sin etanol se cambiaron a 1 x tampon PBS que tiene un pH de 7,5, mientras que todas las muestras utilizadas en los Ejemplos con etanol se intercambiaron con 1 x tampon PBS que tiene un pH de 7,5 con etanol anadido para formar una mezcla de reaccion de Factor IX que contiene etanol al 10%.
40 El tampon libre de aminas que contiene el Factor IX recombinante y que corresponde a la secuencia de aminoacidos de la SEC. ID. N° 1 (la "solucion patron de Factor IX") se utilizo en los Ejemplos 1-16. La solucion patron de Factor IX contenia aproximadamente de 0,2 mg/ml a 0,55 mg/ml de Factor IX.
45 Ejemplo 1
PEGilacion de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa
(Proporcion 1:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol) 50
Se templo a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG55 SMB (4,1 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solucion de mPEG-SMB. Se anadio la solucion de mPEG-SMB a una alicuota de la solucion patron de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta
que se alcanzo una pr oporcion molar 1:1 de m PEG-SMB con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG-SMB, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante tres horas a temperatura ambiente, despues de lo cual se migro la muestra con SDS PAGE, que confirmo la presencia de material m onoconjugado ( "1-mero"). V ease l a ban da m arcada co mo " SMB 30 K 1: 1" en e l ge l proporcionado en la Figura 1. Despues de esto, se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion durante 15 horas a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se ut ilizaron RP-HPLC (C 3) y una se gunda S DS P AGE par a l a c aracterizacion d e l a s olucion de co njugado resultante. Basandose en el resultado de la segunda SDS PAGE, se observo conjugacion. Vease la banda marcada como "SMB 30 K 1:1" en el gel proporcionado en la Figura 2. Se utilizo RP-HPLC (C3) para separar los componentes de l a so lucion de co njugado r esultante y el cr omatograma r esultante i ndico un r endimiento de l 0,54% ( que representa el 100% de especies monoPEGiladas o "1-mero"). Vease el cromatograma proporcionado en la Figura 5.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SMB que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo 2
PEGilacion de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa
(Proporcion 10:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol)
Se templo a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-SMB (4,1 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solucion de mPEG-SMB. Se anadio la solucion de mPEG-SMB a una alicuota de la solucion patron de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzo un exceso molar 10 veces superior de mPEG-SMB con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG-SMB, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante tres horas atemperatura ambiente, despues de lo cual se migro la muestra con SDS PAGE, que confirmo la presencia de material monoconjugado ("1-mero"). Vease la banda marcada como "SMB 30 K 10:1" en el gel proporcionado en la Figura 1. Despues de esto, se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion durante 15 horas a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se ut ilizaron RP-HPLC (C 3) y una se gunda S DS P AGE par a l a c aracterizacion d e l a s olucion de co njugado resultante. Basandose en el resultado de la segunda SDS PAGE, se observo conjugacion. Vease la banda marcada como " SMB 30 K 10: 1" e n el g el proporcionado en la F igura 2. S e ut ilizo R P-HPLC (C 3) p ara se parar l os componentes de la solucion de conjugado resultante y el cromatograma resultante indico un rendimiento del 6,4% (que representa el 100% de especies monoPEGiladas o "1-mero"). Vease el cromatograma proporcionado en la Figura 6.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. De esta manera, cuando se repitio el experimento con tiempos prolongados a temperatura ambiente antes de continuar la reaccion durantetoda la noche a 4 ° C, se consiguio un aumento en el rendimiento de conjugado que se evidencio mediante una banda mas oscura como se muestra en el gel de SDS PAGE. Vease la banda marcada como "SMB 30 K 10:1" en la Figura 4. Usando este mismo e nfoque, se pueden pr eparar ot ros conjugados utilizando m PEG-SMB que tenga ot ro peso m olecular promedio en peso.
Ejemplo 3
PEGilacion de Factor IX con mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa
(Proporcion 1:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol)
mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa
5 Se t emplo a t emperatura a mbiente mPEG2-N-hidroxisuccinimida r amificado, 40 kD a, al macenado a -20 ° C e n atmosfera de argon. El mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado (2,0 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM para f ormar u na so lucion d e m PEG2-N-hidroxisuccinimida r amificado. S e a nadio l a so lucion de m PEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado a una alicuota de la solucion patron de Factor IXque contiene 0,07 mg de FactorIX
10 hasta que se alcanzo una proporcion molar 1:1 de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado con respecto al Factor
IX. Despues de la adicion del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar u n valor d e p H de 7,2 a 7,5,y se m ezclo bi en. P ara permitir e l ac oplamiento d el m PEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante tres horas a temperatura ambiente, despues de lo cual se migro la muestra con SDS PAGE, que no mostro ninguna
15 conjugacion detectable. Vease la banda marcada como " NHS 40 K 1:1 " en el gel proporcionado en la Figura 1. Despues de esto, se proporciona un tiempo adicional para la conjugacion mediante la agitacion de la solucion de reaccion durante 15 horas a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se ut ilizaron RP-HPLC (C 3) y una se gunda S DS P AGE par a l a c aracterizacion d e l a s olucion de co njugado
20 resultante. Basandose en el resultado de la segunda SDS PAGE, se observo conjugacion. Vease la banda marcada como " NHS 40 K 1:1 " en el gel proporcionado en la Figura 2. Se utilizo RP-HPLC (C 3) para separar los componentes de la solucion de conjugado resultante y el cromatograma resultante indico un rendimiento del 0,1% (que representa el 100% de especies monoPEGiladas o "1-mero"). Vease el cromatograma proporcionado en la Figura 7.
25 Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.
30 Ejemplo 4
PEGilacion de Factor IX con mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa
(Proporcion 10:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol) 35
mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa
Se t emplo a t emperatura a mbiente mPEG2-N-hidroxisuccinimida r amificado, 40 kD a, al macenado a -20 ° C e n
40 atmosfera de argon. El mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado (2,0 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM para f ormar u na so lucion d e m PEG2-N-hidroxisuccinimida r amificado. S e a nadio l a so lucion de m PEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado a una alicuota de la solucion patron de Factor IXque contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzo un exceso molar 10 veces superior de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, se comprobo el pH de la reaccion
45 para as egurar un va lor de pH de 7,2 a 7,5,y se m ezclo bi en. P ara per mitir el ac oplamiento de l m PEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante tres horas a temperatura ambiente, despues de lo cual se migro la muestra con SDS PAGE, que no mostro ninguna conjugacion detectable. Vease la banda marcada como " NHS 40 K 10:1 " en el gel proporcionado en la Figura 1. Despues de esto, se permitio que continuara el acoplamientomediante laagitacion de la solucion de reaccion
50 durante 15 horas a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se ut ilizaron RP-HPLC (C 3) y una se gunda S DS P AGE par a l a c aracterizacion d e l a s olucion de co njugado resultante. Basandose en el resultado de la segunda SDS PAGE, la conjugacion aun no era detectable. Vease la banda marcada como " NHS 40 K 10:1 " en el gel proporcionado en la Figura 2. Se utilizo RP-HPLC (C3) para separar los componentes de la solucion de conjugado resultante y el cromatograma resultante no indico ningun rendimiento de conjugado detectable. Vease el cromatograma proporcionado en la Figura 8.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo 5
PEGilacion de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa
(Proporcion 10:1 de polimero con respecto al Factor IX; con etanol)
Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteinas, se introdujo etanol en el tampon y el sistema de reaccion. Se templo a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-SMB (10,0 mg) templado se disolvio en 0,5 ml de HCl 2 mM con etanol anadido para formar una solucion de mPEG-SMB que contiene etanol al 10%. Se anadio la solucion de mPEG-SMB que contiene etanol al 10% a la mezcla dereaccion de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzo un exceso molar 10 veces superior de mPEG-SMB con respecto al Factor IX. Despues de laadicion del mPEG-SMB, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante tres horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion durante toda la noche a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se utilizo SDS PAGE para la caracterizacion de la solucion de conjugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, no se detecto conjugacion. Vease la banda marcada como " SMB 30 K 10:1 � EtOH" en el gel proporcionado en la Figura 3. No se cree que la introduccion de etanol incremente la flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugacion de mPEG-SMB, 30 kDa.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SMB que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo 6
PEGilacion de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa
(Proporcion 20:1 de polimero con respecto al Factor IX; con etanol)
Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructuralde ciertas proteinas, se introdujo etanolen el
tampon y el sistema de reaccion. Se templo a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-SMB (10,0 mg) templado se disolvio en 0,5 ml de HCl 2 mM con etanol anadido para formar una solucion de mPEG-SMB que contiene etanol al 10%. Se anadio la solucion de mPEG-SMB que contiene etanol al 10% a la mezcla dereaccion de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzo un exceso
5 molar 20 veces superior de mPEG-SMB con respecto al Factor IX. Despues de laadicion del mPEG-SMB, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante tres horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion durante toda la noche a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
10 Se utilizo SDS PAGE para la caracterizacion de la solucion de conjugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, no se detecto conjugacion. Vease la banda marcada como " SMB 30 K 20:1 � EtOH" en el gel proporcionado en la Figura 3. No se cree que la introduccion de etanol incremente la flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugacion de mPEG-SMB, 30 kDa.
15 Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SMB que tenga otro peso molecular promedio en peso.
20 Ejemplo 7
PEGilacion de Factor IX con mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa
(Proporcion 10:1 de polimero con respecto al Factor IX; con etanol) 25
mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa
Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteinas, se introdujo etanol en el
30 tampon y el sistema de reaccion. Se templo a temperatura ambiente mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado (2,0 mg) templado se disolvio en 1,0ml de HCl 2mM con etanol anadido para formar una solucion de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado q ue co ntiene et anol al 10%. S e ana dio la so lucion de m PEG2-N-hidroxisuccinimida r amificado que contiene etanol al 10% a la mezcla de reaccion de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzo un
35 exceso molar 10 veces superior de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificadoal Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante tres horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion toda la noche a 4 °C,
40 obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se utilizo SDS PAGE para la caracterizacion de la solucion de conjugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, n o se det ecto conjugacion ( resultados no mostrados). No se cr ee q ue l a i ntroduccion de etanol incremente la flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugacion de mPEG2-N
45 hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.
50 Ejemplo 8
PEGilacion de Factor IX con mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa
55 (Proporcion 20:1 de polimero con respecto al Factor IX; con etanol)
mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa
Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteinas, se introdujo etanol en el tampon y el sistema de reaccion. Se templo a temperatura ambiente mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado (2,0 mg) templado se disolvio en 1,0ml de HCl 2mM con etanol anadido para formar una solucion de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado q ue co ntiene et anol al 10%. S e ana dio la so lucion d e mPE G2-N-hidroxisuccinimida r amificado que contiene etanol al 10% a la mezcla de reaccion de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzo un exceso molar 20 veces superior de mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificadoal Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante tres horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion toda la noche a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se utilizo SDS PAGE para la caracterizacion de la solucion de conjugado resultante. Basandose en los resultados de SDS P AGE, n o se det ecto conjugacion ( resultados no mostrados). No se cr ee q ue l a i ntroduccion de etanol incremente la flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugacion de mPEG2-Nhidroxisuccinimida ramificado, 40 kDa.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG2-N-hidroxisuccinimida ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo 9
PEGilacion de Factor IX con mPEG-SMB, 30 kDa
(Proporcion 20:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol)
Se templo a temperatura ambiente mPEG-SMB, 30 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-SMB (8,6 mg) templado se disolvio en 1,0 ml de HCl 2 mM para formar una solucion de mPEG-SMB. Se anadio la solucion de mPEG-SMB a una alicuota de la solucion patron de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzo un exceso molar 20 veces superior de mPEG-SMB con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG-SMB, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SMB al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante dos horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion toda la noche a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado. Despues de esto, se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion toda la noche a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se utilizo SDS PAGE para la caracterizacion de la solucion de conjugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, se observo conjugacion. Vease la banda marcada como " SMB 30 K 20:1 " en el gel proporcionado en la Figura 4.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de
reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SMB que tenga otro peso molecular promedio en peso. Ejemplo 10 PEGilacion de Factor IX con mPEG-SPA, 20 kDa (Proporcion 20:1 de polimero con respecto al Factor IX; con etanol)
Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteinas, se introdujo etanol en el tampon y el sistema de reaccion. Se templo a temperatura ambiente mPEG-SPA, 20 kDa, almacenado a -20 °C en 15 atmosfera de argon. El mPEG-SPA (10,0 mg) templado se disolvio en 0,5 ml de HCl 2 mM con etanol anadido para formar una solucion de mPEG-SPA que contiene etanol al 10%. Se anadio la solucion de mPEG-SPA que contiene etanol al 10% a la mezcla dereaccion de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzo un exceso molar 20 veces superior de mPEG-SPA con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG-SPA, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el
20 acoplamiento del mPEG-SPA al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante dos horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion.
Basandose en los resultados de SDS PAGE, no se detecto conjugacion. Vease la banda marcada como " SPA 20 K 25 20:1 � EtOH"en el gel proporcionado en la Figura 3. No se cree que laintroduccion de etanol incrementela flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugacion de mPEG-SPA, 20 kDa.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros 30 conjugados utilizando mPEG-SPA que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo 11
PEGilacion de Factor IX con mPEG-SPA, 20 kDa 35 (Proporcion 40:1 de polimero con respecto al Factor IX; con etanol)
40 Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteinas, se introdujo etanol en el tampon y el sistema de reaccion. Se templo a temperatura ambiente mPEG-SPA, 20 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-SPA (10,0 mg) templado se disolvio en 0,5 ml de HCl 2 mM con etanol anadido para formar una solucion de mPEG-SPA que contiene etanol al 10%. Se anadio la solucion de mPEG-SPA que contiene
45 etanol al 10% a la mezcla dereaccion de Factor IX que contiene etanol al 10% hasta que se alcanzo un exceso molar 40 veces superior de mPEG-SPA con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG-SPA, se comprobo el pH de la reaccion para asegurar un valor de pH de 7,2 a 7,5, y se mezclo bien. Para permitir el acoplamiento del mPEG-SPA al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante dos horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de
50 reaccion.
Basandose en los resultados de SDS PAGE, no se detecto conjugacion. Vease la banda marcada como " SPA 20 K
40:1 � EtOH"en el gel proporcionado en la Figura 3. No se cree que laintroduccion de etanol incremente la
flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugacion de mPEG-SPA, 20 kDa. 55
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SPA que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo comparativo: Ejemplo 12 PEGilacion de Factor IX con mPEG-butiraldehido ramificado, 20 kDa (Proporcion 10:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol)
mPEG-butiraldehido ramificado, 20 kDa
Se templo a temperatura ambiente mPEG-butiraldehido ramificado, 20 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-butiraldehido ramificado (10,9 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solucion de mPEG-butiraldehido ramificado. Se anadio la solucion de mPEG-butiraldehido ramificado a una alicuota de la solucion patron de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzo un exceso molar 10 veces superior de mPEG-butiraldehido ramificado con respecto al Factor IX. Despues de 30 minutos de mezcla, se anadio un agente reductor, NaCNBH3 (disuelto en 1 x PBS), en exceso en relacion al mPEG-butiraldehido ramificado (comprobando y aj ustando el pH s i f uera nec esario p ara ase gurar la r educcion a l a am ina s ecundaria). A continuacion se agito la solucion toda la noche a 4 °C para asegurar el acoplamiento a traves de un enlace amina.
Se utilizaron RP-HPLC (C3) y SDS PAGE para la caracterizacion de la solucion de conjugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, no se detecto conjugacion. Vease la banda marcada como " BYA 20 K 10:1 " en el gel proporcionado en la Figura 4. Se utilizo RP-HPLC ( C3) para separar los componentes de la solucion de conjugado r esultante y el cr omatograma r esultante no confirmo l a pr esencia de m aterial c onjugado. V ease e l cromatograma proporcionado en la Figura 9.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-butiraldehido ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo comparativo: Ejemplo 13
PEGilacion de Factor IX con mPEG-butiraldehido ramificado, 20 kDa
(Proporcion 20:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol)
mPEG-butiraldehido ramificado, 20 kDa
Se templo a temperatura ambiente mPEG-butiraldehido ramificado, 20 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-butiraldehido ramificado (10,9 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solucion de mPEG-butiraldehido ramificado. Se anadio la solucion de mPEG-butiraldehido ramificado a una alicuota de la solucion patron de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzo un exceso molar 20 veces superior de mPEG-butiraldehido ramificado con respecto al Factor IX. Despues de 30 minutos de mezcla, se anadio un agente reductor, NaCNBH3 (disuelto en 1 x PBS), en exceso en relacion al mPEG-butiraldehido ramificado (comprobando y aj ustando el pH s i f uera nec esario p ara ase gurar la r educcion a l a am ina s ecundaria). A continuacion se agito la solucion toda la noche a 4 °C para asegurar el acoplamiento a traves de un enlace amina.
Se utilizaron RP-HPLC (C3) y SDS PAGE para la caracterizacion de la solucion de conjugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, no se detecto conjugacion. Vease la banda marcada como " BYA 20 K 20:1 " en el
gel proporcionado en la Figura 4. Se utilizo RP-HPLC ( C3) para separar los componentes de la solucion de conjugado r esultante y el cr omatograma r esultante no c onfirmo l a pr esencia de m aterial c onjugado. V ease e l cromatograma proporcionado en la Figura 10.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-butiraldehido ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo 14
PEGilacion de Factor IX con mPEG-SPA, 20 kDa
(Proporcion 53:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol)
Se templo a temperatura ambiente mPEG-SPA, 20 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-SPA (5,4 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solucion de mPEG-SPA. Se anadio la solucion de mPEG-SPA a una alicuota de la solucion patron de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzo un exceso molar 53 veces superior de mPEG-SPA con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG-SPA, s e co mprobo e l pH de l a r eaccion par a asegurar un va lor de p H de 7,2 a 7, 5. P ara per mitir e l acoplamiento del mPEG-SPA al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante dos horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion toda la noche a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se ut ilizaron RP-HPLC (C3) y una se gunda S DS P AGE par a l a c aracterizacion d e l a s olucion de co njugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, se confirmo la conjugacion. Vease la banda marcada como " SPA 20 K 53:1 " en el gel proporcionado en la Figura 4. Se utilizo RP-HPLC (C3) para separar los componentes de la so lucion de co njugado r esultante y el cromatograma r esultante i ndico un r endimiento de c onjugacion de aproximadamente un 60% (que comprende un 51,9% de especies monoPEGiladas o "1-mero" y un 18% de especies diPEGiladas o "2-mero"). Vease el cromatograma proporcionado en la Figura 11. Se cree, sin embargo, que el rendimiento real puede ser algo inferior debido al exceso relativamente grande de reactivo polimerico.
Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SPA que t enga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo 15
PEGilacion de Factor IX con mPEG-SPA, 20 kDa
(Proporcion 110:1 de polimero con respecto al Factor IX; sin etanol)
Se templo a temperatura ambiente mPEG-SPA, 20 kDa, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-SPA (5,4 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM para formar una solucion de mPEG-SPA. Se anadio la solucion de mPEG-SPA a una alicuota de la solucion patron de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzo un exceso molar 110 veces superior de mPEG-SPA con respecto al Factor IX. Despues de la adicion del mPEG-SPA, s e co mprobo e l pH de l a r eaccion par a asegurar un va lor de p H de 7,2 a 7, 5. P ara per mitir el acoplamiento del mPEG-SPA al Factor IX a traves de un enlace amida, la solucion de reaccion se agito durante dos horas a temperatura ambiente. Se permitio que continuara el acoplamiento mediante la agitacion de la solucion de reaccion toda la noche a 4 °C, obteniendose de esta manera una solucion de conjugado.
Se ut ilizaron RP-HPLC (C 3) y una se gunda S DS P AGE par a l a c aracterizacion d e l a s olucion de co njugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, se confirmo la conjugacion. Vease la banda marcada como " SPA 20K 110:1 "en el gel proporcionado en laFigura 4. Se utilizo RP-HPLC (C3) para separar los componentes de la solucion de conjugado resultante y el cromatograma resultante indico un rendimiento de conjugacion de aproximadamente un 44% (representa aproximadamente el 100% de especies monoPEGiladas o "1-mero"). Vease el cromatograma proporcionado en la Figura 12. Se cree, sin embargo, que el rendimiento real puede ser algo inferior debido al exceso relativamente grande de reactivo polimerico.
Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-SPA que t enga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo comparativo: Ejemplo 16
PEGilacion de Factor IX con mPEG-butiraldehido ramificado, 20 kDa
(Proporcion 20:1 de polimero con respecto al Factor IX; con etanol)
mPEG-butiraldehido ramificado, 20 kDa
Dado que se cree que el etanol aumenta la flexibilidad estructural de ciertas proteinas, se introdujo etanol en el tampon y e l si stema de r eaccion. S e t emplo a t emperatura am biente mPEG-butiraldehido r amificado, 2 0 kD a, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-butiraldehido ramificado (10,9 mg) templado se disolvio en 1 ml de HCl 2 mM con etanol anadido para formar una solucion de mPEG-butiraldehido ramificado que contiene etanol al 10%. Se anadio la solucion de mPEG-butiraldehido ramificado que contiene etanol al 10% a una alicuota de la solucion patron de Factor IX que contiene 0,07 mg de Factor IX hasta que se alcanzo un exceso molar 20 veces superior de mPEG-butiraldehido ramificado con respecto al Factor IX. Despues de 30 minutos de mezcla, se anadio un agente reductor, NaCNBH3(disuelto en 1 x PBS), en exceso en relacion al mPEG-butiraldehido ramificado (comprobando y aj ustando el pH s i f uera nec esario p ara ase gurar la r educcion a l a am ina s ecundaria). A continuacion se agito la solucion toda la noche a 4 °C para asegurar el acoplamiento a traves de un enlace amina.
Se utilizaron RP-HPLC (C3) y SDS PAGE para la caracterizacion de la solucion de conjugado resultante. Basandose en los resultados de SDS PAGE, no se detecto conjugacion. Vease la banda marcada como " BYA 20 K 20:1 � EtOH" en el gel proporcionado en la Figura 4. Los datosde RP-HPLC (C3) confirmaron la ausencia de material conjugado detectable (resultados no mostrados). No se cree que la introduccion de etanol incremente la flexibilidad estructural del Factor IX que permita un aumento de la conjugacion de mPEG-butiraldehido ramificado.
Se espera que un aumento en los tiempos de reaccion, el aumento de la temperatura y/o las adiciones multiples de reactivo polimerico podrian incrementar el rendimiento. Usando este mismo enfoque, se pueden preparar otros conjugados utilizando mPEG-butiraldehido ramificado que tenga otro peso molecular promedio en peso.
Ejemplo 17
PEGilacion de Factor IXa con mPEG-SBA
Se obt iene mPEG-butanoato de su ccinimidilo q ue t iene un p eso m olecular d e 10 000 daltons de N ektar Therapeutics, (Huntsville, AL). La estructura basica del reactivo polimerico se proporciona a continuacion:
Si se encuentra liofilizado, el Factor IXa se disuelve en tampon libre de aminas tal como fosfato para obtener un pH final de 7,2-9. A continuacion se anade a esta solucion un exceso molar de 1,5 a 10 veces superior de mPEG-SBA. La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante varias horas.
La mezcla de reaccion se analiza mediante SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilacion de la proteina.
Ejemplo 18 PEGilacion de Factor IX con mPEG-PIP, 5 K
El reactivo polimerico anterior, mostrado tanto en l a forma de ce tona como en l a del correspondiente cetal, se
10 prepara como se describe en el documento de Publicacion de Solicitud de Patente de los Estados Unidos de America N° 2005/0031576.
Para preparar el reactivopolimerico anterior, aunasolucion demetoxi-polietilenglicol-propionato de succinimidilo que tiene un peso molecular promedio en peso de 5000 daltons (1,0 g, 0,002 moles) en cloruro de metileno (20 ml),
15 se anaden trietilamina (0,084 ml, 0,006 moles) e hidrocloruro de monohidrato de 4-piperidona (0,077 g, 0,005 moles). La m ezcla de r eaccion se agita a t emperatura am biente en at mosfera de n itrogeno dur ante u na noch e y a continuacion se purifica antes de la conjugacion. De forma alternativa, el reactivo polimerico se puede adquirir en Nektar Therapeutics.
20 Para efectuar la conjugacion, a una solucion de Factor IX en tampon acuoso se anade un exceso molar 20 veces superior de mPEG-PIP, 5 K. La solucion resultante se coloca en un agitador orbital Roto MixT (Thermolyne Corp., Dubuque, lA) ajustado a la velocidad lenta para facilitar la reaccion a temperatura ambiente. Despues de 15 minutos, se anade NaCNBH3 acuoso en una cantidad igual a un exceso molar 50 veces superior con relacion al Factor IX. Se recogen alicuotas en intervalos de tiempo de la mezcla de reaccion y se analizan mediante SDS-PAGE (utilizando
25 geles disponibles en Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
Los analisis por SDS-PAGE indican la presencia de derivados de PEG del Factor IX que tienen 1, 2, y 3 restos de PEG unidos.
30 Ejemplo 19
Conjugacion de Factor IX insertado con cisteina con mPEG-MAL, 20 K
Se insertan en el Factor IX uno o mas residuos de cisteina de acuerdo con el proceso descrito en el documento de 35 Patente WO 90/12874.
Antes de laconjugacion, serealizaun intercambio detampon en el Factor IX para reemplazar la histidina con HEPES.
40 Se templo a temperatura ambiente mPEG-MAL, 20 K, almacenado a -20 °C en atmosfera de argon. El mPEG-MAL (4,4 mg) templado se disuelve en 0,044 ml de tampon HEPES [HEPES 50 mM (u otro tampon adecuado) pH 7,0] para preparar una solucion de mPEG-MAL al 10%. La solucion de mPEG-MAL se anade rapidamente a 4 ml de solucion de Factor IX [0,4324 mg/ml en 50 HEPES mM (u otro tampon adecuado) pH 7,0] y se mezcla bien. Despues de 30 minutos de reaccion a temperatura ambiente, se transfiere el vial de reaccion a una camara fria (4 °C), y se
45 anaden otros0,044 mlde solucion de mPEG-MAL a la mezcla de reaccion, seguido de la adicion de tres alicuotas mas de 0,044 ml de solucion de mPEG-MAL en el transcurso de dos horas. Se determina el pH (pH 7,0 ± 0,2). La proporcion molar de mPEG-MAL con respecto a la proteina que es de 50:1. La concentracion final de mPEG-MAL es de 5,213 mg/ml, y la concentracion final de Factor IX es de 0,410 mg/ml. Se deja transcurrir la reaccion toda la noche a 4 °C en Rotomix (velocidad lenta, Thermolyne).
50 La mezcla de conjugado se purifico utilizando cromatografia por filtracion en gel. Se desarrolla un metodo de cromatografia de exclusion por tamano para analizar las mezclas de reaccion, y los productos finales.Tambien se usa el analisis mediante SDS-PAGE para la caracterizacion de las muestras.
55 Ejemplo 20
Actividad in vitro de los conjugados de Factor IX con PEG ejemplares
Se determina la actividad biologica de cada uno de los conjugados de Factor IX con PEG descritos en los Ejemplos 5 1, 2, 3, 9, 14 y 15. Se determino en todos los conjugados de Factor IX con PEG ensayados que tuvieran algun grado de actividad de Factor IX.
�istado de secuencias
10 SEC. ID. N° 1 (abreviatura de letra individual): Secuencia de aminoacidos del Factor IX humano

Claims (39)

  1. REIvINDICACIoNES
    1.
    Un conjugado que comprende un resto de Factor IX unido covalentemente a traves de un enlace amida, bien directamente o bien a traves de un resto espaciador que comprende uno o mas atomos, a un po limero soluble en agua, en el que el peso molecular promedio en peso del polimero soluble en agua esta en elintervalo de 6000 daltons a 100000 daltons, en el que el conjugado no incluye mas de 6 polimeros solubles en agua unidos covalentemente al resto de Factor IX y en el que el polimero soluble en agua que es polietilenglicol.
  2. 2.
    Un conjugado que comprende un resto de F actor IX unido covalentemente mediante un enlace amida, bien directamenteo bien a traves de un resto espaciador quecomprende uno o mas atomos, a un polimero no lineal soluble en agua en el que dicho polimero soluble en agua es polietilenglicol.
  3. 3.
    E l co njugado de l a r eivindicacion 1 o de l a r eivindicacion 2, en el qu e el poli(etilenglicol) esta pr otegido terminalmentecon un resto de proteccion terminal seleccionado del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.
  4. 4.
    El co njugado de l a r eivindicacion 1 o de l a r eivindicacion 2, en el qu e el poli(etilenglicol) esta pr otegido terminalmente con metoxi.
  5. 5.
    El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que el poli(etilenglicol)tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 10000 daltons a 85000 daltons.
  6. 6.
    El conjugado de la reivindicacion 5, en el que el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 20000 daltons a 85000 daltons.
  7. 7.
    El conjugado de la reivindicacion 1, en el que cada polimero soluble en agua es lineal.
  8. 8.
    El conjugado de la reivindicacion 1, en el que cada polimero soluble en agua es ramificado.
  9. 9.
    El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que el resto de Factor IX es Factor IX.
  10. 10.
    El conjugado de la reivindicacion 9, en el que el resto de Factor IX es Factor IXa.
  11. 11.
    El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que e l resto de Factor IX esta derivado recombinantemente.
  12. 12.
    El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que el resto de Factor IX es derivado de la sangre.
  13. 13.
    El conjugado de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que no mas de tres polimeros solubles en agua estan unidos al resto de Factor IX.
  14. 14.
    Una composicion que comprende una pluralidad de conjugados, en la que al menos el 80% de cada uno de todos los conjugados de la composicion esta compuesto por un resto de Factor IX unido covalentemente a uno, dos, tres o cuatro polimeros solubles en agua, cada polimero soluble en agua en el conjugado tiene un peso molecular promedio en peso en el intervalo de 6000 daltons a 90000 daltons, el resto de Factor IX esta unido al polimero soluble en agua a traves de un enlace amida directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos y en l a que di cho polimero soluble en agu a se selecciona entre un poli(oxido de alquileno), poli(vinilpirrolidona), pol i(alcohol vinilico), p olioxazolina, p oli(poliol o xietilado), alcohol poliolefinico, poli(hidroxialquilmetacrilamida, pol i(hidroxialquilmetacrilato), polisacaridos, pol i(a-hidroxiacido), pol ifosfazeno, polioxazolina, y poli(acriloilmorfolina).
  15. 15.
    Una composicion que comprende una pluralidad de conjugados, en la que al menos el 85% de cada uno de todos los conjugados de la composicion tiene de uno a tres polimeros solubles en agua unidos covalentemente a un resto de Factor IX;en la que cada polimero soluble en agua tiene un peso molecular promedio en peso enel intervalo de 6000 daltons a 90000 daltons, y en la que, para cada conjugado, el resto de Factor IX esta unido a de uno a tres polimeros solubles en agua a traves de un enlace amida directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos y en la que el polimero soluble en agua se selecciona del grupo poli(oxido de alquileno), p oli(vinilpirrolidona), pol i(alcohol vi nilico), p olioxazolina, po li(poliol o xietilado), alcohol pol iolefinico, poli(hidroxialquilmetacrilamida), poli(hidroxialquilmetacrilato), polisacaridos, poli(a-hidroxiacido), polifosfazeno, polioxazolina, y poli(acriloilmorfolina).
  16. 16.
    Una composicion que comprende una pluralidad de conjugados del resto de Factor IX monoPEGilado, en la que al menos el 85% de todos los conjugados en la composicion son conjugados del resto de Factor IX monoPEGilado, y en la que cada PEG en el conjugado del resto de Factor IX monoPEGilado tiene unpeso molecular promedioen peso en el intervalo de 6000 daltons a 1000000 daltons y el resto de Factor IX esta unido al PEG a traves de un
    enlace amida, directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos.
  17. 17.
    La composicionde la reivindicacion 14o 15, enla que el polimero soluble en agua en cada conjugado se selecciona d el gr upo que c onsiste en un pol i(oxido de al quileno), p oli(vinilpirrolidona), p oli(alcohol vi nilico), polioxazolina, y poli(acriloilmorfolina).
  18. 18.
    La composicion de la reivindicacion 17, en la que cada polimero soluble en agua es un poli(oxido de alquileno).
  19. 19.
    La composicion de la reivindicacion 18, en la que cada poli(oxido de alquileno) es un poli(etilenglicol).
  20. 20.
    La composicion de la reivindicacion 19, en la que el poli(etilenglicol) esta protegido terminalmente con un resto de proteccion terminal seleccionado del grupo que consiste en hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi y ariloxi sustituido.
  21. 21.
    La composicion de la reivindicacion 19, en la que el poli(etilenglicol) esta protegido terminalmente con metoxi.
  22. 22.
    La composicion de las reivindicaciones 14, 15 o16,en la que el poli(etilenglicol)tiene un peso molecular promedio en peso total en el intervalo de 10000 daltons a 85000 daltons.
  23. 23.
    La composicion de la reivindicacion 22, en la que el poli(etilenglicol) tiene un peso molecular promedio en peso total en el intervalo de 20000 daltons a 85000 daltons.
  24. 24.
    La composicion de las reivindicaciones 14, 15 o 16, en la que el resto de Factor IX es Factor IX.
  25. 25.
    La composicion de la reivindicacion 24, en la que el resto de Factor IX es Factor IXa.
  26. 26.
    La composicion de la reivindicacion 19, en la que el resto de Factor IX esta derivado recombinantemente.
  27. 27.
    La composicion de la reivindicacion 19, en la que el resto de Factor IX es derivado de la sangre.
  28. 28.
    La composicionde las reivindicaciones 14 o 15, en la que no mas de tres polimeros solubles en agua estan unidos al resto de Factor IX.
  29. 29.
    La composicion de la reivindicacion 19, en la que la composicion esta basicamente libre de albumina.
  30. 30.
    La composicion de la reivindicacion 19, en la que la composicion esta basicamentelibre de proteinas que no tienen actividad de Factor IX.
  31. 31.
    La composicion de la reivindicacion 19, en la que la composicion esta basicamente libre de polimeros solubles en agua no unidos covalentemente.
  32. 32.
    La composicion de la reivindicacion 19, en forma liofilizada.
  33. 33.
    La composicion de la reivindicacion 19, en la forma de un liquido.
  34. 34.
    La co mposicion d e l a r eivindicacion 19, que c omprende a dicionalmente u n excipiente f armaceuticamente aceptable.
  35. 35.
    Un metodo para la elaboracion de un conjugado que comprende el contacto, en condiciones de conjugacion, de un resto de Factor IX conun reactivo polimerico, en el que el conjugado comprende un restode Factor IX unido covalentemente a traves de un enlace amida, directamente o a traves de un resto espaciador compuesto de uno o mas atomos, a un polimero soluble en agua con un peso molecular promedio en peso de 6000 a 100000 daltons, en el que el conjugado no incluye mas de 6 polimeros solubles en agua unidos individualmente al resto de Factor IX y en el que dicho polimero soluble en agua es poli(etilenglicol).
  36. 36.
    El metodo de la reivindicacion 35, en la que no se anade alcohol adicional.
  37. 37.
    El metodo de la reivindicacion 35, en la que no se lleva a cabo una etapa de oxidacion.
  38. 38.
    La composicion de la reivindicacion 34 para su uso en un paciente que padece hemofilia B.
  39. 39.
    La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 38 para la administracion a un paciente dentro de los dos dias anteriores a someterse a cirugia.
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Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7083787B2 (en) * 2000-11-15 2006-08-01 Globeimmune, Inc. Yeast-dendritic cell vaccines and uses thereof
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US20070026485A1 (en) 2003-04-09 2007-02-01 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
KR101100059B1 (ko) * 2004-06-30 2011-12-29 넥타르 테라퓨틱스 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
AU2014280936B2 (en) * 2004-06-30 2016-12-15 Nektar Therapeutics Polymer-factor ix moiety conjugates
EP1771066A2 (en) 2004-07-13 2007-04-11 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 glp-1
ES2572779T3 (es) 2004-10-29 2016-06-02 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glucopegilación del Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF)
ES2449195T3 (es) 2005-01-10 2014-03-18 Ratiopharm Gmbh Factor estimulante de colonias de granulocitos glicopegilado
EP2386571B1 (en) 2005-04-08 2016-06-01 ratiopharm GmbH Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
JP5335422B2 (ja) 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
EP2213733A3 (en) 2006-05-24 2010-12-29 Novo Nordisk Health Care AG Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
US9187532B2 (en) 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
CA2659990C (en) 2006-08-04 2016-03-22 Prolong Pharmaceuticals, Inc. Polyethylene glycol erythropoietin conjugates
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
NZ577728A (en) * 2006-12-27 2012-01-12 Baxter Int Von willebrand factor- and factor viii-polymer conjugates having a releasable linkage
US8507653B2 (en) * 2006-12-27 2013-08-13 Nektar Therapeutics Factor IX moiety-polymer conjugates having a releasable linkage
WO2008119815A1 (en) * 2007-04-02 2008-10-09 Novo Nordisk A/S Subcutaneous administration of coagulation factor ix
CA2682897C (en) 2007-04-03 2016-11-22 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
CN101778859B (zh) 2007-06-12 2014-03-26 诺和诺德公司 改良的用于生产核苷酸糖的方法
EP2209487A4 (en) * 2007-10-15 2012-06-20 Univ North Carolina VARIANTS OF HUMAN FACTOR IX WITH EXTENDED HALF-TIME
US20130189239A1 (en) 2008-02-27 2013-07-25 Novo Nordisk A/S Conjugated Factor VIII Molecules
CA2721362A1 (en) * 2008-04-16 2009-11-19 Bayer Healthcare Llc Site-directed modification of factor ix
NZ588854A (en) * 2008-04-24 2011-12-22 Celtic Pharma Peg Ltd Factor ix-polyethylene conjugates with extended half-lives
WO2010045568A1 (en) * 2008-10-17 2010-04-22 Baxter International Inc. Modified blood factors comprising a low degree of water soluble polymer
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
EP3578205A1 (en) 2010-08-06 2019-12-11 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
US20120237975A1 (en) 2010-10-01 2012-09-20 Jason Schrum Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
WO2012167076A2 (en) * 2011-06-01 2012-12-06 The Regents Of The University Of Michigan Nanochannel-guided patterning for polymeric substrates
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2850624A1 (en) 2011-10-03 2013-04-11 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
CA2868398A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP2838566A2 (en) * 2012-04-16 2015-02-25 Cantab Biopharmaceuticals Patents Limited Optimised subcutaneous therapeutic agents
JP6144355B2 (ja) 2012-11-26 2017-06-07 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 化学修飾ｍＲＮＡ
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3052106A4 (en) 2013-09-30 2017-07-19 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
JP2016538829A (ja) 2013-10-03 2016-12-15 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド
AU2016324310B2 (en) 2015-09-17 2021-04-08 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
CA3007955A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of therapeutic agents
PL3394030T3 (pl) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Związki i kompozycje do wewnątrzkomórkowego dostarczania środków
WO2018089540A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
EP3596042B1 (en) 2017-03-15 2022-01-12 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
HUE060693T2 (hu) 2017-03-15 2023-04-28 Modernatx Inc Vegyület és készítmények terápiás szerek intracelluláris bejuttatására
US11874480B2 (en) 2017-12-20 2024-01-16 The Regents Of The University Of Michigan Plasmonic lithography for patterning high aspect-ratio nanostructures
JP2022548304A (ja) 2019-09-19 2022-11-17 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療薬の細胞内送達のための分岐状尾部脂質化合物及び組成物
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4361510A (en) * 1980-05-27 1982-11-30 Cutter Laboratories, Inc. Blood coagulation promoting product
US4470968A (en) * 1983-01-13 1984-09-11 Miles Laboratories, Inc. Pasteurized therapeutically active blood coagulation factor concentrates
US5614500A (en) * 1983-03-04 1997-03-25 The Scripps Research Institute Compositions containing highly purified factor IX proteins prepared by immunoaffinity chromatography
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US5171569A (en) * 1985-03-15 1992-12-15 National Research Development Corporation Factor IX preparations uncontaminated by plasma components or pox virus
AU5864086A (en) 1985-04-22 1986-11-18 Genetics Institute Inc. High yield production of active factor ix
US4786726A (en) * 1986-01-06 1988-11-22 Blood Systems, Inc. Factor IX therapeutic blood product, means and methods of preparing same
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
ATE158816T1 (de) 1990-11-26 1997-10-15 Genetics Inst Expression von pace in wirtszellen und verfahren zu dessen verwendung
AT402261B (de) * 1991-01-25 1997-03-25 Immuno Ag Komplex enthaltend den gerinnungsfaktor ix
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US6037452A (en) * 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5298643A (en) * 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6372716B1 (en) 1994-04-26 2002-04-16 Genetics Institute, Inc. Formulations for factor IX
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
US5714583A (en) 1995-06-07 1998-02-03 Genetics Institute, Inc. Factor IX purification methods
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
WO1997018833A1 (en) * 1995-11-22 1997-05-29 Amgen Inc. Methods of increasing lean tissue mass using ob protein compositions
US6320029B1 (en) 1996-11-29 2001-11-20 The American National Red Cross Methods of production and use of liquid formulations of plasma proteins
US5925738A (en) 1995-12-01 1999-07-20 The American National Red Cross Methods of production and use of liquid formulations of plasma proteins
US5770700A (en) 1996-01-25 1998-06-23 Genetics Institute, Inc. Liquid factor IX formulations
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US6159722A (en) * 1997-12-03 2000-12-12 Boehringer Mannheim Gmbh Chimeric serine proteases
KR100614212B1 (ko) * 1998-08-06 2006-08-21 마운틴 뷰 파마슈티컬즈 인크. 피이지-유레이트 옥시데이즈 접합체 및 그의 이용
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
CN1810832B (zh) * 1998-10-23 2012-12-12 麒麟-安姆根有限公司 与MPl受体结合并具有血小板生成活性的模拟二聚体血小板生成素肽
US6423626B1 (en) * 1998-11-02 2002-07-23 Micron Technology, Inc. Removal of metal cusp for improved contact fill
KR100619612B1 (ko) * 1999-10-04 2006-09-01 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 폴리머 안정화 신경펩타이드
US7355019B2 (en) * 2000-06-06 2008-04-08 Sibtech, Inc. Cysteine-containing peptide tag for site-specific conjugation of proteins
US6423826B1 (en) 2000-06-30 2002-07-23 Regents Of The University Of Minnesota High molecular weight derivatives of vitamin K-dependent polypeptides
RU2003109746A (ru) * 2000-09-08 2005-01-27 Грифон Терапьютикс, Инк. (Us) Синтетические белки, стимулирующие эритропоэз
JP2002112782A (ja) * 2000-10-04 2002-04-16 Ajinomoto Co Inc 抗血栓活性を有する蛋白質及びその製造法
DE10112825A1 (de) 2001-03-16 2002-10-02 Fresenius Kabi De Gmbh HESylierung von Wirkstoffen in wässriger Lösung
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
NZ532027A (en) * 2001-10-10 2008-09-26 Neose Technologies Inc Remodeling and glycoconjugation of peptides
US7125843B2 (en) * 2001-10-19 2006-10-24 Neose Technologies, Inc. Glycoconjugates including more than one peptide
US7179617B2 (en) 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7026440B2 (en) * 2001-11-07 2006-04-11 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
WO2003049760A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-19 Intermune, Inc. Compositions and method for treating hepatitis virus infection
US7459435B2 (en) * 2002-08-29 2008-12-02 Hoffmann-La Roche Inc. Treatment of disturbances of iron distribution
US20040106779A1 (en) 2002-12-03 2004-06-03 Bigler Douglas E. Modified factor IX preparation
CA2509260C (en) * 2002-12-31 2012-10-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates
US20040180054A1 (en) 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US7610156B2 (en) * 2003-03-31 2009-10-27 Xencor, Inc. Methods for rational pegylation of proteins
ES2725808T3 (es) * 2003-05-23 2019-09-27 Nektar Therapeutics Derivados de PEG que contienen dos cadenas de PEG
US7141544B2 (en) * 2003-10-10 2006-11-28 Baxter International, Inc. Stabilization of pharmaceutical protein formulations with small peptides
WO2005055950A2 (en) * 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor ix
AU2005224078B2 (en) * 2004-03-17 2011-01-27 Anticancer, Inc. Methods for increasing protein polyethylene glycol (PEG) conjugation
KR101100059B1 (ko) * 2004-06-30 2011-12-29 넥타르 테라퓨틱스 중합체­인자 ｉｘ 부분의 접합체
PL1824988T3 (pl) * 2004-11-12 2018-01-31 Bayer Healthcare Llc Ukierunkowana na miejsce modyfikacja czynnika VIII

Also Published As

Publication number Publication date
US20210023186A1 (en) 2021-01-28
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