JP2018510863A - Ｉｌ−７部分とポリマーとのコンジュゲート - Google Patents

Ｉｌ−７部分とポリマーとのコンジュゲート Download PDF

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Abstract

ＩＬ−７部分と１つ以上の非ペプチド水溶性ポリマーとのコンジュゲートが提供される。典型的には、非ペプチド水溶性ポリマーはポリ（エチレングリコール）又はその誘導体である。また、特に、コンジュゲートを含む組成物、コンジュゲートの作製方法、及び個体への組成物の投与方法も提供される。本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−７部分の残基は遊離可能な連結を介して水溶性ポリマーと共有結合している。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１５年３月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／１３１，６３４号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に全て援用される。
特に、本発明の１つ又は複数の実施形態は、概して、ＩＬ−７部分（即ち、少なくとも何らかのヒトＩＬ−７と同様の活性を有する部分）と水溶性非ペプチドポリマーとを含むコンジュゲートに関する。加えて、本発明は、（特に）コンジュゲートを含む組成物、コンジュゲートの合成方法、及び組成物の投与方法に関する。
サイトカインは免疫系の刺激物質であり、従って薬物として有用である。例えば、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、及び顆粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、いずれも承認薬である。このクラスの薬物は、ウイルス感染症、癌、及び自己免疫疾患などの免疫系調節不全の罹患者の治療、並びに癌化学療法後における免疫系の回復の促進に用いられている。残念ながら、これらのタンパク質はそれ自体に対する免疫応答を刺激し得るため、患者が治療用タンパク質に対する抗体を作り出すことが起こり得る。これらの抗体はまた、患者の体内で内因的に産生された同じタンパク質の機能を阻害し得る結果として、患者の健康に長期的影響を及ぼす可能性もある。
インターロイキン−７（「ＩＬ−７」）は、Ｔ細胞、長期記憶Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び他の免疫細胞の生存及び／又は増殖を促進するサイトカインである。このサイトカインは、細胞表面タンパク質であって２つの異なる小型タンパク質鎖（即ち、ＩＬ−７受容体α及び共通γ）で構成されているＩＬ−７受容体に結合する。Ｋｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１２）：１１３５−１１４２。ＩＬ−７は、Ｔ細胞レパートリーを拡大して、より多様な腫瘍抗原標的化を可能にするものと思われる。ＩＬ−７のこれら及び他の活性ゆえに、このサイトカインは、癌化学療法、ＨＩＶ感染、又は他の疾患、障害、又は化学物質への曝露によって免疫系が損傷を受けている患者を治療する治療用タンパク質として潜在的な候補となっている。しかしながら、その免疫刺激特性に基づけば、ＩＬ−７の治療的投与はそれ自体に対する抗体応答を誘発することが予想される。従って、当該技術分野においては、免疫原性が低く、しかし免疫系の刺激特性は保持している改良型のＩＬ−７が必要とされている。
加えて、ＩＬ−７の外因的投与後に起こり得る比較的高いレベルのＩＬ−７が、ＩＬ−７受容体の発現の深刻で持続的な低下を引き起こし得る。例えば、Ｇｈａｚａｗｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９１：１４９−１５８を参照のこと。従って、当該技術分野においては、作動薬のレベルが比較的高いことに伴うＩＬ−７受容体の発現の低下を回避する方法でＩＬ−７作動薬の持続的レベルを生じさせるＩＬ−７ベースの療法が更に必要とされている。
従って、特に、本発明の１つ又は複数の実施形態は、ＩＬ−７と比較して、以下、即ち、免疫原性の低下；排出の減少又は遅延；腫瘍環境に一層限局した免疫応答の活性化；及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を通じた持続的で耐久性のあるシグナル伝達のうちの１つ以上の特徴を有する形態のＩＬ−７、並びにこのようなコンジュゲートを含む組成物及び本明細書に記載されるとおりの関連する方法に関し、これらは新規であり、当該技術分野では全く提案されたことがないものと考えられる。
Ｋｒｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１２）：１１３５−１１４２ Ｇｈａｚａｗｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９１：１４９−１５８
従って、本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−７部分の残基は遊離可能な連結を介して水溶性ポリマーと共有結合している。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−７部分の残基は遊離不可能な連結を介して水溶性ポリマーと共有結合しており、好ましくは、水溶性ポリマーは５，０００ダルトンより高い重量平均分子量を有する。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−７部分は、ジスルフィド結合に関与しないシステイン残基を含まない。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−７部分はヒトＩＬ−７と比較して追加のシステイン残基を有し、水溶性ポリマーがその追加のシステイン残基に共有結合している。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、分枝鎖状水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−７部分のアミンがアミド連結以外の連結を介して水溶性ポリマーに共有結合している。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供され、ＩＬ−７部分のアミンがアミン連結を介して水溶性ポリマーに共有結合している。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、組成物であって、本明細書に記載されるとおりのコンジュゲートを薬学的に許容可能な賦形剤と共に含む組成物が提供される。
本発明の１つ又は複数の実施形態では、コンジュゲートの送達方法であって、ＩＬ−７の残基と水溶性ポリマーとのコンジュゲートを含む組成物を患者に皮下投与するステップを含む方法が提供される。
実施例１に記載されるとおり調製したｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、２０ｋＤａ−ＩＬ−７コンジュゲート溶液のＲＰ−ＨＰＬＣ分析のプロットである。 種々の量の実施例１に記載されるとおりのｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、２０ｋＤａとのＩＬ−７のコンジュゲーション反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。 実施例２に記載されるとおり調製したｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、４０ｋＤａ−ＩＬ−７コンジュゲート溶液のＲＰ−ＨＰＬＣ分析のプロットである。 種々の量の実施例２に記載されるとおりのｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、４０ｋＤａとのＩＬ−７のコンジュゲーション反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。 種々の量の実施例３に記載されるとおりのＣ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ、２０ｋＤａとのＩＬ−７のコンジュゲーション反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
本発明の１つ又は複数の実施形態を詳細に説明する前に、この発明は、特定のポリマー、合成方法、ＩＬ−７部分などに限定されず、従って異なり得ることが理解されるべきである。
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」が、文脈上特に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことは注記されるべきである。従って、例えば、「ポリマー（ａ ｐｏｌｙｍｅｒ）」と言うとき、それは単一のポリマー並びに２つ以上の同じ、又は異なるポリマーを含み、「任意選択の賦形剤（ａｎ ｏｐｔｉｏｎａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」と言うとき、それは単一の任意選択の賦形剤並びに２つ以上の同じ、又は異なる任意選択の賦形剤を指すなどする。
本発明の１つ又は複数の実施形態の説明及び特許請求においては、以下の専門用語を下記の定義に従い用いるものとする。
「ＰＥＧ」、「ポリエチレングリコール」、及び「ポリ（エチレングリコール）」は、本明細書で使用されるとき同義であり、任意の非ペプチド性水溶性ポリ（エチレンオキシド）を包含する。典型的には、本発明に従い使用されるＰＥＧは、以下の構造「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−」（式中、（ｎ）は２〜４０００である）を含む。本明細書で使用されるとき、ＰＥＧはまた、末端酸素が例えば合成変換中に置換されたかどうかに応じて、「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−」、及び「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−」も含む。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて、用語「ＰＥＧ」には、様々な末端基又は「エンドキャップ」基などを有する構造が含まれることに留意しなければならない。用語「ＰＥＧ」はまた、過半数の、すなわち５０％を超える−ＯＣＨ２ＣＨ２−の反復サブユニットを含むポリマーも意味する。具体的な形態に関して、ＰＥＧは、様々な分子量、並びに「分枝鎖状」、「直鎖状」、「フォーク型」、「多官能性」などの構造又は幾何形状のうちのいずれをとってもよく、これについては以下にさらに詳細に記載される。
用語「エンドキャップされた」及び「末端がキャップされた」は、本明細書では同義的に用いられ、ポリマーの末端又は終点がエンドキャップ部分を有することを指す。典型的には、必須ではないが、エンドキャップ部分はヒドロキシ基又はＣ１〜２０アルコキシ基、より好ましくはＣ１〜１０アルコキシ基、さらにより好ましくはＣ１〜５アルコキシ基を含む。従って、エンドキャップ部分の例としては、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ及びベンジルオキシ）、並びに、アリール、ヘテロアリール、シクロ、ヘテロシクロなどが挙げられる。エンドキャップ部分には、ポリマー中の末端単量体の１個又は複数の原子が含まれ得ることに留意しなければならない［例えば、ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−及びＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−におけるエンドキャップ部分「メトキシ」］。加えて、前述の各々の飽和型、不飽和型、置換型、及び非置換型が想定される。さらに、エンドキャップ基はシランであってもよい。エンドキャップ基はまた、有利には検出可能標識も含み得る。ポリマーが検出可能標識を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマー及び／又はそのポリマーが結合している部分（例えば、活性薬剤）の量又は位置を、好適な検出器を用いて決定することができる。かかる標識としては、限定なしに、蛍光剤、化学発光剤、酵素標識に用いられる部分、比色（例えば、色素）、金属イオン、放射性部分などが挙げられる。好適な検出器としては、光度計、フィルム、分光計などが挙げられる。エンドキャップ基はまた、有利にはリン脂質も含み得る。ポリマーがリン脂質を含むエンドキャップ基を有する場合、ポリマー及び得られるコンジュゲートに固有の特性が付与される。例示的なリン脂質としては、限定なしに、ホスファチジルコリンと称されるクラスのリン脂質から選択されるものが挙げられる。具体的なリン脂質としては、限定なしに、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、ベヘノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、及びレシチンからなる群から選択されるものが挙げられる。エンドキャップ基はまた、ポリマー（並びにそれに結合するあらゆるもの、例えばＩＬ−７部分）が目的の範囲に選択的に局在することができるように、標的部分も含み得る。
本明細書に記載されるとおりのポリマーに関して「天然に存在しない」とは、そのままの状態としては自然界に見ることのできないポリマーを意味する。しかしながら、天然に存在しないポリマーは、全体としてのポリマー構造が自然界に見られない限りにおいて、１つ又は複数の天然に存在する単量体又は単量体セグメントを含み得る。
「水溶性ポリマー」にあるような用語「水溶性の」ポリマーは、室温で水に対して可溶性の任意のポリマーである。典型的には、水溶性ポリマーは、ろ過後の同じ溶液により伝達される光（例えば波長６００ｎｍのもの）の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９５％を伝達する。水溶性ポリマーは、重量基準で、好ましくは水に対して少なくとも約３５％（重量）溶解することができ、より好ましくは水に対して少なくとも約５０％（重量）溶解することができ、さらにより好ましくは水に対して約７０％（重量）溶解することができ、さらにより好ましくは水に対して約８５％（重量）溶解することができる。しかしながら、最も好ましくは、水溶性ポリマーは水に対して約９５％（重量）溶解することができ、又は水に対して完全に溶解することができる。
水溶性ポリマー、例えばＰＥＧに関連した分子量は、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれとしても表すことができる。特に指示されない限り、本明細書で分子量と言うときは全て、重量平均分子量を指す。数平均及び重量平均のいずれの分子量の測定も、ゲル浸透クロマトグラフィー法又は他の液体クロマトグラフィー法を用いて計測することができる。また、分子量の値を計測するための他の方法を用いて、例えば、末端基分析を用いるか、若しくは束一的性質（例えば、凝固点降下、沸点上昇、若しくは浸透圧）を計測することにより数平均分子量を決定してもよく、又は、光散乱法、超遠心法若しくは粘度測定法を用いることにより重量平均分子量を決定してもよい。本発明のポリマーは、典型的には多分散系であり（すなわち、ポリマーの数平均分子量と重量平均分子量とが等しくない）、好ましくは約１．２未満、より好ましくは約１．１５未満、さらにより好ましくは約１．１０未満、なおさらにより好ましくは約１．０５未満、及び最も好ましくは約１．０３未満の低い多分散性値を有する。
用語「活性の」、「反応性の」、又は「活性化された」は、特定の官能基と併せて使用されるとき、別の分子上の求電子剤又は求核剤と容易に反応する反応性官能基を指す。これは、反応させるために強力な触媒又は極めて非現実的な反応条件が必要な基（すなわち、「非反応性の」、又は「不活性の」基）と対比される。
本明細書で使用されるとき、用語「官能基」又はその任意の同義語は、その保護型並びに無保護型を包含することが意図される。
用語「スペーサー部分」、「連結」、及び「リンカー」は、本明細書では、例えば高分子剤の末端とＩＬ−７部分又はＩＬ−７部分の求電子剤若しくは求核剤との相互接続部分を場合により連結するために用いられる結合又は原子若しくは原子集合を指して用いられる。スペーサー部分は、加水分解に対して安定であってもよく、又は生理的に加水分解可能か、若しくは酵素分解可能な連結を含んでもよい。文脈上特に明確に指示されない限り、スペーサー部分は化合物の任意の２つの要素間に場合により存在する（例えば、ＩＬ−７部分の残基と水溶性ポリマーとを含む提供のコンジュゲートは、直接的にも、又はスペーサー部分を介して間接的にも結合することができる）。
「アルキル」は炭化水素鎖を指し、典型的には約１〜１５個の範囲の原子長さである。かかる炭化水素鎖は、必須ではないが好ましくは飽和しており、分枝鎖状であっても、又は直鎖状であってもよく、但し典型的には直鎖状が好ましい。例示的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、３−メチルペンチルなどが挙げられる。
「低級アルキル」は、１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を指し、直鎖状であっても、又は分枝鎖状であってもよく、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、及びｔ−ブチルにより例示されるとおりである。
「シクロアルキル」は、飽和又は不飽和の環状炭化水素鎖を指し、架橋、縮合、又はスピロ環化された化合物を含み、好ましくは３〜約１２個の炭素原子、より好ましくは３〜約８個の炭素原子で構成される。「シクロアルキレン」は、環式環系における任意の２個の炭素で鎖を結合させることによりアルキル鎖に挿入されたシクロアルキル基を指す。
「アルコキシ」は、−ＯＲ基であって、式中、Ｒがアルキルか、又は置換アルキル、好ましくはＣ１〜６アルキル（例えば、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシなど）である−ＯＲ基を指す。
例えば「置換アルキル」にあるような用語「置換された」は、限定はされないが、アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、例えば、シクロプロピル、シクロブチルなど；ハロ、例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード；シアノ；アルコキシ、低級フェニル；置換フェニル；などの１つ又は複数の干渉しない置換基で置換された部分（例えば、アルキル基）を指す。「置換アリール」は、１つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するアリールである。フェニル環に対する置換について、置換基はいかなる配向（すなわち、オルト、メタ、又はパラ）であってもよい。
「干渉しない置換基」は、分子中に存在するとき、典型的にはその分子中に含まれる他の官能基との反応性を有しない基である。
「アリール」とは、１つ又は複数の芳香環であって、各々が５個又は６個の中心炭素原子であるものを意味する。アリールは、ナフチルにおけるように縮合していることも、又はビフェニルにおけるように縮合していないこともある複数のアリール環を含む。アリール環はまた、１つ又は複数の環状炭化水素、ヘテロアリール、又は複素環式環と縮合していても、又は縮合していなくともよい。本明細書で使用されるとき、「アリール」にはヘテロアリールが含まれる。
「ヘテロアリール」は、１〜４個のヘテロ原子、好ましくは硫黄、酸素、若しくは窒素、又はそれらの組み合わせを含むアリール基である。ヘテロアリール環はまた、１つ又は複数の環状炭化水素、複素環式環、アリール環、又はヘテロアリール環と縮合していてもよい。
「複素環」又は「複素環式」とは、５〜１２個の原子、好ましくは５〜７個の原子の１つ又は複数の環であって、不飽和特性又は芳香族特性を伴うことも、又は伴わないこともあり、且つ炭素以外の少なくとも１個の環原子を有する環を意味する。好ましいヘテロ原子としては、硫黄、酸素、及び窒素が挙げられる。
「置換ヘテロアリール」は、１つ又は複数の干渉しない基を置換基として有するヘテロアリールである。
「置換複素環」は、干渉しない置換基から形成された１つ又は複数の側鎖を有する複素環である。
「有機ラジカル」は、本明細書で使用されるとき、アキル（ａｋｙｌ）、置換アルキル、アリール、及び置換アリールを含む。
「求電子剤」及び「求電子基」は、求電子中心、すなわち電子を求引する中心を有し、求核剤と反応することが可能なイオン又はイオン化し得る原子若しくは原子集合を指す。
「求核剤」及び「求核基」は、求核中心、すなわち求電子中心を求引する中心を有するか、又は求電子剤を伴う、イオン又はイオン化し得る原子若しくは原子集合を指す。
「酵素分解性連結」は、１つ以上の酵素によって分解を受ける連結を意味する。
「加水分解性」結合は、生理的条件下で水と反応する（即ち加水分解される）結合である。結合が水中で加水分解し易いかどうかは、２つの中心原子をつなぐ連結の一般的なタイプのみならず、それらの中心原子に結合する置換基にも依存し得る。加水分解に対して不安定な、又は加水分解を受け易い適切な連結としては、限定はされないが、カルボン酸エステル、リン酸エステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。「遊離可能な結合」は、生理的条件下において臨床的に有用な速度で開裂する共有結合性の連結であり、例えば及び限定なしに、加水分解性結合及び酵素分解性連結が含まれる。
「加水分解に対して安定な」連結又は結合とは、水中で実質的に安定な、すなわち生理学的条件下で長期間にわたってもいかなる認め得る程度の加水分解も受けない化学結合、典型的には共有結合を指す。加水分解に対して安定な連結の例としては、限定はされないが、以下のもの：炭素−炭素結合（例えば、脂肪族鎖中）、エーテル、アミド、ウレタンなどが挙げられる。概して、加水分解に対して安定な連結とは、生理学的条件下で１日約１〜２％未満の加水分解率を呈するものである。代表的な化学結合の加水分解率については、多くの標準的な化学テキストを参照することができる。
「薬学的に許容可能な賦形剤又は担体」とは、場合により本発明の組成物中に含めることができ、患者に対して何ら有意な毒性の有害作用を引き起こすことのない賦形剤を指す。
「薬理学的な有効量」、「生理学的な有効量」、及び「治療上の有効量」は、本明細書では同義的に用いられ、血流中又は標的組織中に所望のレベルのコンジュゲート（又はそれに対応する非コンジュゲート化ＩＬ−７部分）をもたらすのに必要なポリマー−（ＩＬ−７）部分コンジュゲートの量を意味する。正確な量は、例えば、特定のＩＬ−７部分、治療組成物の成分及び物理的特性、目的とする患者集団、個々の患者の考慮事項など数多くの要因に依存し、当業者は、本明細書に提供される情報に基づきそれを容易に決定することができる。
「多官能性」は、３個以上の官能基がそこに含まれるポリマーを意味し、ここでそれらの官能基は同じであっても又は異なってもよい。本発明の多官能性ポリマー試薬は、典型的には約３〜１００個の官能基を含むことになり、例えば、以下の範囲の１つ以上を満たす個数を含有し得る：３〜５０個の官能基；３〜２５個の官能基；３〜１５個の官能基；３〜１０個の官能基。例えば、官能基の個数は、ポリマー骨格内の３、４、５、６、７、８、９及び１０個の官能基からなる群から選択することができる。
用語「ＩＬ−７部分」は、本明細書で使用されるとき、ヒトＩＬ−７活性を有するペプチド又はタンパク質部分を指す。ＩＬ−７部分はまた、ポリマー試薬との反応に好適な少なくとも１つの求電子基又は求核基も有し得る。加えて、用語「ＩＬ−７部分」は、コンジュゲート形成前のＩＬ−７部分並びにコンジュゲート形成後のＩＬ−７部分残基の双方を包含する。以下にさらに詳細に説明するとおり、当業者は、任意の所与の部分がＩＬ−７活性を有するかどうかを決定することができる。配列番号１〜８のいずれか１つに対応するアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにそれと実質的に相同な任意のタンパク質又はポリペプチドが、ＩＬ−７部分である。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−７部分」には、例えば部位特異的突然変異誘発によって意図的に修飾されたか、又は突然変異によって偶発的に修飾されたかかるペプチド及びタンパク質が含まれる。これらの用語にはまた、１〜６個のさらなるグリコシル化部位を有する類似体、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端側の終端部に、少なくとも１個のさらなるアミノ酸であって、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む１個又は複数のさらなるアミノ酸を有する類似体、及び少なくとも１つのグリコシル化部位を含むアミノ酸配列を有する類似体も含まれる。この用語には、天然の部分及び組換え及び合成的に産生された部分の双方が含まれる。
用語「実質的に相同な」とは、特定の対象配列、例えば突然変異配列が、１つ又は複数の置換、欠失、又は付加だけ基準配列と異なるが、その正味の効果としては、基準配列と対象配列との間に機能上の有害な相違は生じないことを意味する。本発明の目的上、９５パーセントより高い相同性、等価な生物活性（必須ではないが等価な生物活性強度）、及び等価な発現特性を有する配列が、実質的に相同であると見なされる。相同性を決定する目的では、成熟配列のトランケーションは無視するものとする。本明細書で用いられる例示的なＩＬ−７部分には、実質的に相同な配列番号１である配列が含まれる。
用語「断片」とは、ＩＬ−７部分の一部又は断片のアミノ酸配列を有する任意のタンパク質又はポリペプチドであって、ＩＬ−７の生物活性を有するものを意味する。断片には、ＩＬ−７部分のタンパク質分解によって産生されたタンパク質又はポリペプチド、並びに当該技術分野においてルーチンの方法による化学合成によって産生されたタンパク質又はポリペプチドが含まれる。
用語「患者」とは、活性薬剤（例えば、コンジュゲート）を投与することにより予防又は治療することのできる病態を患っている、又はそうした病態に罹りやすい生物体を指し、ヒト及び動物の双方を含む。
「任意選択の」、又は「場合により」とは、続いて記載される状況が起こることも、又は起こらないこともあり、従ってその記載は、その状況が起こる場合と、それが起こらない場合とを含むことを意味する。
「実質的に」とは、ほぼ全面的又は完全に、という意味であり、例えば、以下のうちの１つ又は複数を満足する：条件の５０％超、５１％以上、７５％以上、８０％以上、９０％以上、及び９５％以上。
ペプチド中のアミノ酸残基は、以下のとおり略記される：フェニルアラニンはＰｈｅ又はＦであり；ロイシンはＬｅｕ又はＬであり；イソロイシンはＩｌｅ又はＩであり；メチオニンはＭｅｔ又はＭであり；バリンはＶａｌ又はＶであり；セリンはＳｅｒ又はＳであり；プロリンはＰｒｏ又はＰであり；スレオニンはＴｈｒ又はＴであり；アラニンはＡｌａ又はＡであり；チロシンはＴｙｒ又はＹであり；ヒスチジンはＨｉｓ又はＨであり；グルタミンはＧｌｎ又はＱであり；アスパラギンはＡｓｎ又はＮであり；リジンはＬｙｓ又はＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐ又はＤであり；グルタミン酸はＧｌｕ又はＥであり；システインはＣｙｓ又はＣであり；トリプトファンはＴｒｐ又はＷであり；アルギニンはＡｒｇ又はＲであり；及びグリシンはＧｌｙ又はＧである。
本発明の１つ又は複数の実施形態について見ると、コンジュゲートであって、水溶性ポリマーと（直接、又はスペーサー部分を介して）共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートが提供される。本発明のコンジュゲートは、以下の特徴のうちの１つ又は複数を有する。
ＩＬ−７部分
先述のとおり、このコンジュゲートは、水溶性ポリマーと直接、又はスペーサー部分を介して共有結合したＩＬ−７部分の残基を含む。本明細書で使用されるとき、用語「ＩＬ−７部分」は、コンジュゲート形成前のＩＬ−７部分、並びに非ペプチド性水溶性ポリマーと結合した後のＩＬ−７部分を指すものとする。しかしながら、本来のＩＬ−７部分が非ペプチド性水溶性ポリマーと結合すると、ポリマーとの連結に伴い１つ又は複数の共有結合が存在するため、ＩＬ−７部分は僅かに変化することが理解されるであろう。多くの場合に、この別の分子と結合して僅かに変化した形態のＩＬ−７部分は、ＩＬ−７部分の「残基」と称される。
ＩＬ−７部分は、非組換え方法からも、及び組換え方法からも得ることができ、本発明はこの点について限定されない。加えて、ＩＬ−７部分は、ヒト供給源にも、動物供給源（昆虫を含む）にも、菌類供給源（イーストを含む）にも及び植物供給源にも由来し得る。
ＩＬ−７部分は、Ｎａｍｅｎらによって記載される手順に従い得ることができる。（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：９８８−１００２ｅｔ ａｌ．
ＩＬ−７部分は、組換え方法によって誘導することができる。例えば、Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ３０：１５６−１６６を参照のこと。
ＩＬ−７部分は、例えば、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．から市販品を購入することができる。
ＩＬ−７部分は、細菌［例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（３）：２９５−３１１を参照］、哺乳動物［例えば、Ｋｒｏｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｇｅｎｅ １２１：２９５−３０４を参照］、酵母［例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２８（１）：１２１−１２９を参照］、及び植物［例えば、Ｍｏｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（３）：２５９−２６６を参照］の発現系で発現させることができる。発現は、外因性発現によっても（宿主細胞が天然で所望の遺伝コードを含む場合）又は内因性発現によっても起こり得る。
組換えに基づくタンパク質の調製方法には違いがあり得るが、典型的には、組換え方法には、所望のポリペプチド又は断片をコードする核酸の構築、核酸の発現ベクターへのクローニング、宿主細胞（例えば、植物、細菌、酵母、トランスジェニック動物細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞若しくはベビーハムスター腎臓細胞などの哺乳動物細胞）の形質転換、及び核酸の発現による所望のポリペプチド又は断片の産生が関わる。組換えポリペプチドをインビトロで原核生物及び真核生物の宿主細胞において産生し、発現させる方法は、当業者に公知である。
組換えポリペプチドの同定及び精製を促進するため、エピトープタグ又は他の親和性結合配列をコードする核酸配列を、コード配列とインフレームで挿入又は付加し、それにより所望のポリペプチドと、結合に適したポリペプチドとを含む融合タンパク質を産生することができる。融合タンパク質の同定及び精製は、初めに融合タンパク質を含む混合物を、融合タンパク質中のエピトープタグ又は他の結合配列に対する結合部分（例えば、抗体）を有するアフィニティーカラムに通過させ、それによって融合タンパク質をカラム内に結合させることにより行うことができる。その後、カラムを適切な溶液（例えば、酸）で洗浄して結合した融合タンパク質を遊離させることにより、融合タンパク質を回収することができる。組換えポリペプチドはまた、宿主細胞の溶解、ポリペプチドの、例えばイオン交換クロマトグラフィーによる分離、親和性結合手法、疎水性相互作用手法により精製し、その後、ＭＡＬＤＩ又はウエスタンブロットにより同定し、及びポリペプチドを回収することもできる。組換えポリペプチドを同定及び精製するためのこれらの及び他の方法は、当業者に公知である。しかしながら、本発明の１つ又は複数の実施形態では、ＩＬ−７部分は融合タンパク質の形態ではない。
ＩＬ−７活性を有するタンパク質の発現に用いるシステムに応じて、ＩＬ−７部分はグリコシル化されていなくても、又はグリコシル化されていてもよく、いずれも用いられ得る。即ち、ＩＬ−７部分はグリコシル化されていなくてもよく、又はＩＬ−７部分はグリコシル化されていてもよい。本発明の１つ又は複数の実施形態において、ＩＬ−７部分はグリコシル化されていない。ＩＬ−７部分がグリコシル化されている実施形態では、コンジュゲーションは任意選択により（例えば米国特許第７，９５６，０３２号明細書に記載される方法で）炭水化物上に行うことができる。
ＩＬ−７部分は、有利には、１つ又は複数のアミノ酸残基、例えば、リジン、システイン及び／又はアルギニンを含む及び／又は置換するように修飾することができ、それによりポリマーがそのアミノ酸の側鎖内の原子と結合し易くなる。ＩＬ−７部分の置換の例は、米国特許第６，１７７，０７９号明細書に記載される。加えて、ＩＬ−７部分は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むように修飾することができる。アミノ酸残基及び天然に存在しないアミノ酸残基を付加する方法は、当業者に公知である。Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）を参照されたい。
加えて、ＩＬ−７部分は、有利には、官能基の結合（官能基を含むアミノ酸残基の付加によるものは除く）を含むように修飾することができる。例えば、ＩＬ−７部分は、チオール基を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−７部分は、Ｎ末端のα炭素を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−７部分は、１つ又は複数の炭水化物部分を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−７部分は、アルデヒド基を含むように修飾することができる。加えて、ＩＬ−７部分は、ケトン基を含むように修飾することができる。本発明の一部の実施形態では、ＩＬ−７部分は、チオール基、Ｎ末端のα炭素、炭水化物、アルデヒド基（ａｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ）及びケトン基のうちの１つ又は複数を含むようには修飾されないことが好ましい。
例示的ＩＬ−７部分は、本明細書、文献、並びに例えば米国特許第７５８９１７９号明細書、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２（１１），ｅ２６４４２：１−３、Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１（１）：３１−４０、およびＶｕｄａｔｔｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：１３２−１４０に記載される。好ましいＩＬ−７部分には、配列番号１〜８からなる群から選択される配列、及びそれと実質的に相同の配列を含むアミノ酸配列を有するものが含まれる。好ましいＩＬ−７部分は、配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する。
場合によっては、ＩＬ−７部分は、対応するペプチドの単一の発現が個別の単位として体系付けられる「単量体」形態であり得る。他の場合には、ＩＬ−７部分は、２つの単量体形態のタンパク質が互いに会合している「二量体」の形態（例えば、組換えＩＬ−７の二量体）であり得る。
前述の配列のいずれかのトランケート型、ハイブリッド変異体、及びペプチド模倣物もまた、ＩＬ−７部分として働き得る。少なくともある程度のＩＬ−７活性を維持する前述のいずれかの生物学的に活性な断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体もまた、ＩＬ−７部分として働き得る。
いずれの所与のペプチド又はタンパク質部分についても、当該部分がＩＬ−７活性を有するかどうかを決定することが可能である。当該技術分野においては、インビトロＩＬ−７活性を決定する様々な方法が記載されている。例えば、任意の提案されるＩＬ−７部分及びそれから形成されたコンジュゲートの生物活性は、ＩＬ−７依存性マウスプロＢ細胞株２Ｅ８を用いて評価することができ、ここではこの株由来の細胞が所定の濃度範囲の目的の被験物質に規定の時間にわたって曝露され、生物活性の定量的尺度としてシグナル伝達タンパク質ＳＴＡＴ５のリン酸化の程度が用いられる。このような試験では、以下の品質のうちの少なくとも１つを呈する被験物質が、ＩＬ−７活性を有すると理解される：（ａ）飽和用量のヒト天然ＩＬ−７によって誘発されるレベルの少なくとも１０％のＳＴＡＴ５リン酸化レベル；及び（ｂ）ヒト天然ＩＬ−７のＥＣ５０より１０００倍未満高いＥＣ５０。被験物質が本発明のポリマーコンジュゲートである場合、このコンジュゲートが、飽和用量のヒト天然ＩＬ−７によって誘発されるレベルの少なくとも５０％のＳＴＡＴ５リン酸化レベル及び／又はヒト天然ＩＬ−７のＥＣ５０より１０倍未満高いＥＣ５０を有することが好ましい。ポリマーコンジュゲートは最小限の量のＩＬ−７生物活性を呈し得るが、１つ以上の水溶性ポリマーの遊離が理由でなおも本発明の範囲内のコンジュゲートと理解されることが理解される（ここで「下流」バージョンのコンジュゲート、例えば、患者に投与されるバージョンと比べた水溶性ポリマーの１つ以上を欠いているバージョンは、実に以下の品質のうちの少なくとも１つを呈する：（ａ）飽和用量のヒト天然ＩＬ−７によって誘発されるレベルの少なくとも１０％のＳＴＡＴ５リン酸化レベル；及び（ｂ）ヒト天然ＩＬ−７のＥＣ５０より１０００倍未満高いＥＣ５０）。
電位測定法、分光測定法、クロマトグラフィー法、及び放射測定法を含めた当該技術分野において公知の他の方法もまた、ＩＬ−７機能の評価に用いることができる。
ＩＬ−７部分の活性の計測に関連して用いられるアッセイはまた、本明細書に記載されるコンジュゲートの活性の計測にも用いることができる。しかしながら、所与のコンジュゲートの特性（例えば、遊離可能な連結の取り込み、代謝耐性能力、高い半減期、選択的結合特性など）に起因して、必ずしもコンジュゲートが本明細書で定義されるＩＬ−７部分と同じ活性を呈しなければならないわけではない。
水溶性ポリマー
先に考察したとおり、各コンジュゲートは水溶性ポリマーと結合したＩＬ−７部分を含む。水溶性ポリマーに関して、水溶性ポリマーは非ペプチド性で、非毒性であり、天然には存在せず、且つ生体適合性である。生体適合性に関して、物質は、生体組織に関連して物質を単独で、又は別の物質（例えば、ＩＬ−７部分などの活性薬剤）と共に使用すること（例えば、患者への投与）に伴う有益な作用が、臨床医、例えば医師が評価するとき、いかなる有害な作用にも勝る場合に、生体適合性であると見なされる。非免疫原性に関して、物質は、生体内での物質の意図される使用によって望ましくない免疫反応（例えば、抗体の形成）が生じることがない場合か、又は、免疫反応が生じる場合にも、かかる反応が、臨床医の評価で臨床的に有意、又は重要とは見なされない場合に、非免疫原性であると見なされる。非ペプチド性水溶性ポリマーは、生体適合性且つ非免疫原性であることが特に好ましい。
さらに、このポリマーは、典型的には２〜約３００個の末端を有するものとして特徴付けられる。かかるポリマーの例としては、限定はされないが、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体などのポリ（アルキレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシアルキル）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（「ＰＯＺ」）（これについては、国際公開第２００８／１０６１８６号パンフレットに記載されている）、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、及び前述のいずれかの組み合わせが挙げられる。
水溶性ポリマーは特定の構造に限定されず、直鎖状（例えば、エンドキャップされた、例えばアルコキシＰＥＧ又は二官能性ＰＥＧ）、分枝鎖状又は多腕状（例えば、フォーク型ＰＥＧ又はポリオール核と結合したＰＥＧ）、樹木状（又は星型）の構造であってもよく、各々は、１つ又は複数の分解可能な連結を有することも、又は有しないこともある。さらに、水溶性ポリマーの内部構造は、種々の反復パターンのいずれとして体系付けられてもよく、ホモポリマー、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、交互トリコポリマー、ランダムトリコポリマー、及びブロックトリコポリマーからなる群から選択することができる。
典型的には、活性化ＰＥＧ及び他の活性化水溶性ポリマー（すなわち、ポリマー試薬）は、ＩＬ−７部分上の所望の部位とのカップリングに適した好適な活性化基により活性化される。従って、ポリマー試薬は、ＩＬ−７部分と反応するための反応基を有する。代表的なポリマー試薬及びこうしたポリマーを活性部分とコンジュゲート化するための方法は、当該技術分野において公知であり、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、“Ｕｓｅ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌｓ）ｆｏｒ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ”、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」所収、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ、Ｐｌｅｎｕｓ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２年）、及びＺａｌｉｐｓｋｙ（１９９５年）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：１５７−１８２頁にさらに記載されている。ＩＬ−７部分のカップリングに好適な例示的活性化基としては、特に、ヒドロキシル、マレイミド、エステル、アセタール、ケタール、アミン、カルボキシル、アルデヒド、アルデヒド水和物、ケトン、ビニルケトン、チオン、チオール、ビニルスルホン、ヒドラジンが挙げられる。
典型的には、コンジュゲート中の水溶性ポリマーの重量平均分子量は、約１００ダルトン〜約１５０，０００ダルトンである。しかしながら、例示的範囲としては、５，０００ダルトン超〜約１００，０００ダルトンの範囲、約６，０００ダルトン〜約９０，０００ダルトンの範囲、約１０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、１０，０００ダルトン超〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２０，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約５３，０００ダルトン〜約８５，０００ダルトンの範囲、約２５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約２９，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、約３５，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲、及び約４０，０００ダルトン〜約１２０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量が挙げられる。任意の所与の水溶性ポリマーについて、これらの範囲のうちの１つ又は複数の分子量を有するＰＥＧが好ましい。
水溶性ポリマーについての例示的な重量平均分子量としては、約１００ダルトン、約２００ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、約６００ダルトン、約７００ダルトン、約７５０ダルトン、約８００ダルトン、約９００ダルトン、約１，０００ダルトン、約１，５００ダルトン、約２，０００ダルトン、約２，２００ダルトン、約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン、約４，０００ダルトン、約４，４００ダルトン、約４，５００ダルトン、約５，０００ダルトン、約５，５００ダルトン、約６，０００ダルトン、約７，０００ダルトン、約７，５００ダルトン、約８，０００ダルトン、約９，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約１１，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン、約１３，０００ダルトン、約１４，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン、約２２，５００ダルトン、約２５，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン、約３５，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約４５，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン、約５５，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約６５，０００ダルトン、約７０，０００ダルトン、及び約７５，０００ダルトンが挙げられる。前述のいずれかの総分子量を有する分枝鎖型の水溶性ポリマー（例えば、２つの２０，０００ダルトンのポリマーを含む４０，０００ダルトンの分枝鎖状水溶性ポリマー）もまた、使用することができる。１つ又は複数の実施形態において、コンジュゲートは、直接的にも、又は間接的にも、約６，０００ダルトン未満の重量平均分子量を有するＰＥＧと結合したＰＥＧ部分は有しない。
ポリマーとして用いられるとき、ＰＥＧは、典型的には複数の（ＯＣＨ２ＣＨ２）単量体［又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単量体、ＰＥＧがどのように定義されるかによる］を含む。この説明全体を通じた使用について、反復単位の数は、「（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ」の添え字「ｎ」によって特定される。従って、（ｎ）の値は、典型的には以下の範囲の１つ又は複数のなかに含まれる：２〜約３４００、約１００〜約２３００、約１００〜約２２７０、約１３６〜約２０５０、約２２５〜約１９３０、約４５０〜約１９３０、約１２００〜約１９３０、約５６８〜約２７２７、約６６０〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約７９５〜約２７３０、約９０９〜約２７３０、及び約１，２００〜約１，９００。分子量が既知の任意の所与のポリマーについては、ポリマーの総重量平均分子量を反復単量体の分子量で除算することにより、反復単位の数（すなわち、「ｎ」）を決定することが可能である。
本発明での使用に特に好ましいポリマーの一つは、エンドキャップされたポリマー、すなわち、少なくとも１つの末端が下級Ｃ１〜６アルコキシ基などの比較的不活性な基で（但し、ヒドロキシル基も用いることができる）キャッピングされたポリマーである。例えば、ポリマーがＰＥＧであるとき、メトキシＰＥＧ（一般にｍＰＥＧと称される）を使用することが好ましく、このメトキシＰＥＧは、ポリマーの一方の末端がメトキシ（−ＯＣＨ３）基で、それに対し他の末端が、場合により化学修飾されていてもよいヒドロキシル又は他の官能基である直鎖型のＰＥＧである。
本発明の１つ又は複数の実施形態で有用な一形態において、遊離ＰＥＧ又は非結合ＰＥＧは、各末端がヒドロキシル基で終端している直鎖状ポリマー：
ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
であり、式中、（ｎ）は典型的には０〜約４，０００の範囲である。
上記のポリマー、α−、ω−ジヒドロキシルポリ（エチレングリコール）は、簡略な形ではＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨと表すことができ、ここでは−ＰＥＧ−記号が、以下の構造単位を表し得ることが理解される：
−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−
式中、（ｎ）は上記に定義されるとおりである。
本発明の１つ又は複数の実施形態で有用な別のタイプのＰＥＧは、メトキシＰＥＧ−ＯＨ、又は簡略にはｍＰＥＧであり、これは一方の末端が比較的不活性なメトキシ基で、それに対し他方の末端がヒドロキシル基である。ｍＰＥＧの構造は、以下に示すとおりである。
ＣＨ３Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
式中、（ｎ）は上記のとおりである。
米国特許第５，９３２，４６２号明細書に記載されるような多腕状又は分枝鎖状ＰＥＧ分子もまた、ＰＥＧポリマーとして使用することができる。例えば、ＰＥＧは以下の構造を有し得る：
式中：
ｐｏｌｙａ及びｐｏｌｙｂは、メトキシポリ（エチレングリコール）などのＰＥＧ骨格であり（いずれも同じか、又は異なる）；
Ｒ”は、Ｈ、メチル又はＰＥＧ骨格などの非反応性部分であり；及び
Ｐ及びＱは、非反応性の連結である。好ましい実施形態において、分枝鎖状ＰＥＧポリマーはメトキシポリ（エチレングリコール）二置換リジンである。使用される具体的なＩＬ−７部分によっては、二置換リジンの反応性エステル官能基がさらに修飾され、ＩＬ−７部分内の標的基との反応に好適な官能基を形成してもよい。
加えて、ＰＥＧはフォーク型ＰＥＧを含むことができる。フォーク型ＰＥＧの例は、以下の構造によって表される：
式中：Ｘは、１個又は複数の原子のスペーサー部分であり、各Ｚは、一定長の原子鎖によってＣＨと連結された活性化末端基である。国際公開第９９／４５９６４号パンフレットは、本発明の１つ又は複数の実施形態に用いることが可能な様々なフォーク型ＰＥＧ構造を開示している。Ｚ官能基を分枝鎖状炭素原子と連結する原子鎖はテザー基として働き、例えば、アルキル鎖、エーテル鎖、エステル鎖、アミド鎖及びそれらの組み合わせを含み得る。
ＰＥＧポリマーは、カルボキシルなどの反応基が、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧの長さに沿って共有結合するペンダント型ＰＥＧ分子を含み得る。ペンダント型の反応基はＰＥＧと直接、又はアルキレン基などのスペーサー部分を介して結合することができる。
上述した形態のＰＥＧに加え、ポリマーはまた、上述のポリマーのいずれかを含め、ポリマー中に１つ又は複数の弱い、又は分解可能な連結を含むように調製することもできる。例えば、ＰＥＧは、加水分解を受けやすいエステル連結をポリマー中に含むように調製することができる。以下に示されるとおり、この加水分解の結果として、ポリマーがより低い分子量の断片に切断される：
ポリマー骨格内の分解可能な連結として、及び／又はＩＬ−７部分との分解可能な連結として有用な、加水分解により分解可能な他の連結としては、カーボネート連結；例えばアミンとアルデヒドとの反応から得られるイミン連結（例えば、Ｏｕｃｈｉら（１９９７年）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ ３８（１）：５８２−３頁を参照）；例えばアルコールをリン酸基と反応させることによって形成されるリン酸エステル連結；典型的にはヒドラジドとアルデヒドとの反応によって形成されるヒドラゾン連結；典型的にはアルデヒドとアルコールとの間の反応によって形成されるアセタール連結；例えばギ酸塩とアルコールとの間の反応によって形成されるオルトエステル連結；例えばＰＥＧなどのポリマーの末端にあるアミン基と別のＰＥＧ鎖のカルボキシル基とによって形成されるアミド連結；例えば末端イソシアネート基を有するＰＥＧとＰＥＧアルコールとの反応から形成されるウレタン連結；ＰＥＧなどのポリマーの末端にあるアミン基とペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチド連結；及び、例えば、例えばポリマーの末端にあるホスホラミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。
コンジュゲートのかかる任意選択の特徴、すなわち、１つ又は複数の分解可能な連結を高分子鎖の中に、又はＩＬ−７部分に対して導入することは、コンジュゲートを投与したときの、その最終的な所望の薬理学的特性に対してさらなる制御をもたらし得る。例えば、大型で比較的不活性なコンジュゲート（すなわち、１つ又は複数の高分子量のＰＥＧ鎖、例えば約１０，０００より大きい分子量を有する１つ又は複数のＰＥＧ鎖がそこに結合しているもの、この場合、コンジュゲートは本質的に生物活性を有しない）が投与されてもよく、これは加水分解されて、元のＰＥＧ鎖の一部を有する生物活性コンジュゲートを生じる。このようにして、時間の経過に伴うコンジュゲートの生物活性が平衡するように、コンジュゲートの特性をより効果的に調整することができる。
コンジュゲートに関連する水溶性ポリマーはまた、「遊離可能」であってもよい。すなわち、水溶性ポリマーは放出され（加水分解、酵素過程、触媒過程又は他の方法のいずれかにより）、それによりコンジュゲート化されていないＩＬ−７部分がもたらされる。ある場合には、遊離可能ポリマーは、インビボで、水溶性ポリマーのいかなる断片も残さずＩＬ−７部分から離れる。別の場合には、遊離可能ポリマーは、インビボで、水溶性ポリマーからの比較的小さい断片（例えば、コハク酸タグ）を残してＩＬ−７部分から離れる。例示的な開裂可能ポリマーには、カーボネート連結を介してＩＬ−７部分に結合するものが含まれる。
当業者は、前述の非ペプチド性水溶性ポリマーに関する考察が、何ら網羅的なものではなく、単に例示に過ぎず、上記の質を有するあらゆるポリマー材料が企図されることを認識するであろう。本明細書で使用されるとき、用語「ポリマー試薬」は、概して、水溶性ポリマーセグメントと官能基とを含み得る分子全体を指す。
上記のとおり、本発明のコンジュゲートは、ＩＬ−７部分と共有結合した水溶性ポリマーを含む。典型的には、任意の所与のコンジュゲートについて、１〜３個の水溶性ポリマーが、ＩＬ−７活性を有する１つ又は複数の部分と共有結合している。しかしながら、ある場合には、コンジュゲートは、ＩＬ−７部分と個々に結合した１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上の水溶性ポリマーを有し得る。任意の所与の水溶性ポリマーは、ＩＬ−７部分のアミノ酸か、又はＩＬ−７部分が（例えば）糖タンパク質である場合には、ＩＬ−７部分の炭水化物と共有結合し得る。炭水化物との結合は、例えば、シアル酸−アジド化学反応を用いる代謝的官能化（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）［Ｌｕｃｈａｎｓｋｙら（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（３８）：１２３５８−１２３６６頁］、又はグリシドールの使用によりアルデヒド基の導入を促進する［Ｈｅｌｄｔら（２００７年）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２：５４２９−５４３３頁］などの他の好適な手法を利用して行ってもよい。
ＩＬ−７活性を有する部分とポリマーとの内部の特定の連結は、様々な要因に依存する。かかる要因としては、例えば、用いられる特定の連結の化学的特性、特定のＩＬ−７部分、ＩＬ−７部分内の利用可能な官能基（ポリマーと結合するためのものか、又は好適な結合部位に変換されるためのもの）、ＩＬ−７部分内における別の反応性官能基の存在などが挙げられる。
本発明のコンジュゲートは、必須ではないが、プロドラッグであってもよく、すなわちこれは、ポリマーとＩＬ−７部分との間の連結が加水分解的に遊離可能で、それにより親部分を放出できることを意味する。例示的な遊離可能な連結としては、カルボン酸エステル、リン酸エステル、チオールエステル、無水物、アセタール、ケタール、アシルオキシアルキルエーテル、イミン、オルトエステル、ペプチド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。かかる連結は、ＩＬ−７部分（例えば、タンパク質のカルボキシル基Ｃ末端、又はタンパク質中に含まれるセリン又はスレオニンなどのアミノ酸の側鎖ヒドロキシル基、又は炭水化物中の同様の官能基）及び／又はポリマー試薬のいずれかを、当該技術分野で一般的に用いられるカップリング方法を用いて適切に修飾することにより、容易に調製することができる。しかしながら、最も好ましくは、好適に活性化されたポリマーを、ＩＬ−７活性を有する部分中に含まれる修飾されていない官能基と反応させることにより容易に形成される加水分解性の連結である。
或いは、加水分解に対して安定な連結、例えば、アミド、ウレタン（カルバメートとしても知られる）、アミン、チオエーテル（スルフィドとしても知られる）、又は尿素（カルバミドとしても知られる）連結もまた、ＩＬ−７部分のカップリング用連結として用いることができる。さらに、加水分解に対して安定な連結としては、アミドが好ましい。一手法では、活性化エステルを有する水溶性ポリマーを、ＩＬ−７部分のアミン基と反応させて、それによりアミド連結を生じさせることができる。
コンジュゲートは（コンジュゲートされていないＩＬ−７部分と対比されるものとして）、測定可能な程度のＩＬ−７活性を有することも、又は有しないこともある。すなわち、本発明に係るポリマー−ＩＬ−７部分コンジュゲートは、修飾されていない親ＩＬ−７部分の約０．１％〜約１００％の範囲の生物活性を有し得る。ある場合には、ポリマー−ＩＬ−７部分コンジュゲートは、修飾されていない親ＩＬ−７部分の１００％より大きい生物活性を有し得る。好ましくは、ＩＬ−７活性をほとんど又は全く有しないコンジュゲートは、ポリマーを部分とつなぐ加水分解可能な連結を含み、そのためコンジュゲート中に活性が欠如している（又は比較的欠如している）こととは関係なしに、加水分解可能な連結が水により誘発されて切断されると、活性な親分子（又はその誘導体）が放出される。かかる活性は、用いられるＩＬ−７活性を有する特定の部分についての既知の活性に応じて、好適なインビボ又はインビトロモデルを用いて測定し得る。
加水分解に対して安定な連結を有し、それがＩＬ−７活性を有する部分をポリマーとカップリングするコンジュゲートについて、このコンジュゲートは、典型的には測定可能な程度の生物活性を有する。例えば、かかるコンジュゲートは、典型的には、コンジュゲートされないＩＬ−７部分の生物活性と比べた以下の割合のうちの１つ又は複数を満足する生物活性を有するものとして特徴付けられる：少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約１００％、及び１０５％超（当該技術分野において周知のものなど、好適なモデルでの測定時）。好ましくは、加水分解に対して安定な連結（例えば、アミド連結）を有するコンジュゲートは、修飾されていない親のＩＬ−７活性を有する部分の生物活性の少なくともある程度を有する。
ここで、本発明に係る例示的なコンジュゲートを説明する。典型的には、かかるＩＬ−７部分は、配列番号１〜７の少なくとも１つに提供される配列と同様のアミノ酸配列を（少なくとも一部において）共有するものと予想される。従って、配列番号１〜７内の特定の位置又は原子が参照されるものの、そうした参照は便宜上に過ぎず、当業者は、ＩＬ−７活性を有する他の部分における対応する位置又は原子を容易に決定し得る。特に、天然ヒトＩＬ−７に関して本明細書に提供される説明は、多くの場合に、前述のいずれかの断片、欠失変異体、置換変異体又は付加変異体に適用することができる。
ＩＬ−７部分のアミノ基は、ＩＬ−７部分と水溶性ポリマーとの間の結合点を提供する。配列番号１〜７に提供されるアミノ酸配列を使用すると、コンジュゲートに利用し得るε−アミノ酸を有する数個のリジン残基が各々にあることは明らかである。さらに、いずれのタンパク質のＮ末端アミンもまた、結合点として機能することができる。
ＩＬ−７部分の利用可能なアミンとの共有結合性の連結を形成するのに有用な好適なポリマー試薬の例は、数多くある。具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表１に提供する。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−ＮＨ−（ＩＬ−７）」は、ポリマー試薬とのコンジュゲート形成後のＩＬ−７部分の残基を表す。表１に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は末端が「ＣＨ３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。
ＩＬ−７部分のアミノ基とのポリマー試薬のコンジュゲート形成は、様々な方法で達成することができる。一手法では、ＩＬ−７部分が、スクシンイミジル誘導体（又は他の活性化エステル基、この場合、そうした代替的な活性化エステル基を含有するポリマー試薬について記載されるものと同様の手法を用いることができる）により官能化されたポリマー試薬とコンジュゲート化され得る。この手法では、スクシンイミジル誘導体を有するポリマーは、ｐＨ７〜９．０の水性媒体中でＩＬ−７部分と結合し得るが、異なる反応条件を用いると（例えば、６〜７などのより低いｐＨ、又は異なる温度及び／又は１５℃未満）、結果としてポリマーは、ＩＬ−７部分の異なる位置に結合し得る。加えて、アミン末端を有する非ペプチド性水溶性ポリマーを、活性なカルボン酸基を有するＩＬ−７部分と反応させることにより、アミド連結を形成することができる。
例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される
式中：
（ｎ）は、２〜４０００の値を有する整数であり；
Ｘは、スペーサー部分であり；
Ｒ１は、有機ラジカルであり；及び
ＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
式中、（ｎ）は２〜４０００の値を有する整数であり、及びＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
ＩＬ−７部分のポリマー試薬とのコンジュゲート化に有用な別の手法としては、還元的アミノ化を用いることによるＩＬ−７部分の第一級アミンの、ケトン、アルデヒド又はその水和物形態（例えば、ケトン水和物、アルデヒド水和物）で官能化されたポリマー試薬とのコンジュゲート化が典型的である。この手法では、ＩＬ−７部分の第一級アミンがアルデヒド又はケトンのカルボニル基（又はそれに対応する水和アルデヒド又はケトンのヒドロキシル含有基）と反応し、それによりシッフ塩基が形成される。ひいては、次にシッフ塩基が、水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を使用することにより安定なコンジュゲートに還元的に変換され得る。特に、ケトン又はα−メチル分枝鎖アルデヒドで官能化されたポリマーを用いると、及び／又は特定の反応条件下（例えば、低いｐＨ）では、選択的な反応（例えば、Ｎ末端における）が可能である。
水溶性ポリマーが分枝鎖型である本発明の例示的コンジュゲートには、水溶性ポリマーが以下の構造に包含されるものが含まれる：
式中、各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数である。
本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；
Ｘはスペーサー部分であり；
（ｂ）は、２〜６の値を有する整数であり；
（ｃ）は、２〜６の値を有する整数であり；
Ｒ２は、存在するごとに、独立してＨ又は低級アルキルであり；及び
ＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
本発明の他の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｘは、存在するとき、１つ又は複数の原子を含むスペーサー部分であり；
（ｂ’）は、０又は１〜１０の値を有する整数であり；
（ｃ）は、１〜１０の値を有する整数であり；
Ｒ２は、存在するごとに、独立してＨ又は有機ラジカルであり；
Ｒ３は、存在するごとに、独立してＨ又は有機ラジカルであり；及び
ＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
本発明のさらに別の例示的コンジュゲートは、以下の構造に包含される：
式中：
各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
遊離可能な連結を含む例示的コンジュゲートには、ＩＬ−７部分が、以下の式に包含されるポリマー試薬とコンジュゲート化されるものが含まれる：
式中：
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり；
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり；
Ｘ１は、第１のスペーサー部分であり；
Ｘ２は、第２のスペーサー部分であり；
Ｈαは、イオン化水素原子であり；
Ｒ１は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
Ｒ２は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｒｅ１は、存在するとき、第１の電子改変基であり；
Ｒｅ２は、存在するとき、第２の電子改変基であり；及び
（ＦＧ）は、活性薬剤のアミノ基と反応してカルバメート連結などの遊離可能な連結を形成することが可能な官能基である。この式中、さらに確定的な構造を有するポリマー試薬が企図される：
式中、ＰＯＬＹ１、ＰＯＬＹ２、Ｘ１、Ｘ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｈα及び（ＦＧ）の各々は、先に定義したとおりであり、及びＲｅ１は第１の電子改変基であり；及びＲｅ２は第２の電子改変基である。
さらに別の例示的ポリマー試薬は、以下の式に含まれる：
式中、各構造について、かつ各例において、（ｎ）は、独立して４〜１５００の整数である。
これらの遊離可能な連結を提供するポリマー試薬は、米国特許出願公開第２００６／０２９３４９９号明細書に記載される手順に従い調製することができる。
遊離可能な連結を提供するポリマー試薬を使用して形成される例示的コンジュゲートには、以下の式のものが含まれる：
式中：
ＰＯＬＹ１は、第１の水溶性ポリマーであり；
ＰＯＬＹ２は、第２の水溶性ポリマーであり；
Ｘ１は、第１のスペーサー部分であり；
Ｘ２は、第２のスペーサー部分であり；
Ｈαは、イオン化水素原子であり；
Ｒ１は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
Ｒ２は、Ｈ又は有機ラジカルであり；
（ａ）は、０又は１のいずれかであり；
（ｂ）は、０又は１のいずれかであり；
Ｒｅ１は、存在するとき、第１の電子改変基であり；
Ｒｅ２は、存在するとき、第２の電子改変基であり；
Ｙ１は、Ｏ又はＳであり；
Ｙ２は、Ｏ又はＳであり；及び
（ＩＬ−７）は、ＩＬ−７部分の残基である。
例示的コンジュゲートは、以下の構造を有する：
式中、各構造について、かつ各例において、（ｎ）は、独立して４〜１５００の整数であり、及びＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
カルボキシル基は、ＩＬ−７部分における結合点として機能し得る別の官能基を表す。構造上、コンジュゲートは以下を含み得る：
式中、（ＩＬ−７）及び隣接するカルボニル基は、カルボキシル含有ＩＬ−７部分に対応し、Ｘは連結鎖、好ましくはＯ、Ｎ（Ｈ）、及びＳから選択されるヘテロ原子であり、ＰＯＬＹは、場合により末端にエンドキャップ部分を有する、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーである。
Ｃ（Ｏ）−Ｘ連結は、末端官能基を有するポリマー誘導体とカルボキシル含有ＩＬ−７部分との間の反応から得られる。上記に考察されるとおり、具体的な連結は、利用される官能基のタイプに依存し得る。ポリマーがヒドロキシル基で末端官能化又は「活性化」される場合、結果として得られる連結はカルボン酸エステルとなり、ＸはＯとなる。ポリマー骨格がチオール基で官能化される場合、結果として得られる連結はチオエステルとなり、ＸはＳとなる。特定の多腕状、分枝鎖状又はフォーク型ポリマーが用いられると、Ｃ（Ｏ）Ｘ部分、特にＸ部分は比較的複雑となり得るとともに、より長い連結構造を含み得る。
ヒドラジド部分を含む水溶性誘導体もまた、カルボニル及びカルボン酸におけるコンジュゲート形成に有用である。ＩＬ−７部分がカルボニル部分又はカルボン酸を含まない限りでは、当業者に公知の手法を用いて付加することができる。例えば、カルボニル部分は、カルボン酸（例えば、Ｃ末端カルボン酸）を還元することにより、及び／又はグリコシル化若しくは糖化された（この場合、付加される糖がカルボニル部分を有する）形のＩＬ−７部分を提供することにより、導入することができる。カルボン酸を含有するＩＬ−７部分に関して、ＰＥＧ−ヒドラジン試薬は、カップリング剤（例えば、ＤＣＣ）の存在下に、ＩＬ−７部分と共有結合させることができる［例えば、ｍＰＥＧ−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ２＋ＨＯＣ（Ｏ）−（ＩＬ−７）の結果、ｍＰＥＧ−ＯＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨＣ（Ｏ）−ＩＬ−７が得られる］。ヒドラジド部分を含有する水溶性誘導体の具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表２に提供する。加えて、活性化エステルを含有する水溶性ポリマー誘導体をヒドラジン（ＮＨ２−ＮＨ２）又はｔｅｒｔ−カルバジン酸ブチル［ＮＨ２ＮＨＣＯ２Ｃ（ＣＨ３）３］と反応させることにより、活性化エステル（例えば、スクシンイミジル基）を含有する任意の水溶性誘導体を、ヒドラジド部分を含むように変換することができる。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−Ｃ（Ｏ）−（ＩＬ−７）」は、ポリマー試薬とのコンジュゲート形成後のＩＬ−７部分の残基を表す。場合により、ヒドラゾン連結は、好適な還元剤を用いて還元してもよい。表２に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は末端が「ＣＨ３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。
ＩＬ−７部分中に含まれるチオール基は、水溶性ポリマーが結合する有効な部位として機能することができる。特に、システイン残基は、ＩＬ−７部分がタンパク質であるとき、チオール基を提供する。次に、かかるシステイン残基のチオール基が、チオール基との反応に特異的な活性化ＰＥＧ、例えば、Ｎ−マレイミジルポリマー又は米国特許第５，７３９，２０８号明細書及び国際公開第０１／６２８２７号パンフレットに記載されるとおりの他の誘導体と反応し得る。加えて、保護基を有するチオールを活性化糖タンパク質のオリゴ糖側鎖に導入し、続いてチオール反応性水溶性ポリマーで脱保護してもよい。
試薬の具体例について、対応するコンジュゲートと共に以下の表３に提供する。表中、変数（ｎ）は反復単量体単位の数を表し、「−Ｓ−（ＩＬ−７）」は、水溶性ポリマーとのコンジュゲート形成後のＩＬ−７部分残基を表す。表３に示される各ポリマー部分［例えば、（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ又は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ］は末端が「ＣＨ３」基であるが、これは他の基（Ｈ及びベンジルなど）に置換されてもよい。
例示的ＩＬ−７部分に対応する配列番号１に関して、３、３５、４８、９３、１３０および１４２位にシステイン残基があることが分かる。従って、例示的チオール結合部位は、３、３５、４８、９３、１３０および１４２位を含む。加えて、従来の合成技法を用いてシステイン残基をＩＬ−７部分に付加することが可能である。例えば、システイン残基の付加については、国際公開第９０／１２８７４号パンフレットに記載される手順を参照されたく、かかる手順をＩＬ−７部分に適合させ得る。加えて、従来の遺伝子工学方法を用いてシステイン残基をＩＬ−７部分に導入することもできる。しかしながら一部の実施形態では、追加のシステイン残基及び／又はチオール基を導入しないことが好ましい。
１つ又は複数のマレイミド官能基を有する水溶性ポリマーから形成されたコンジュゲートに関して（マレイミドがＩＬ−７部分のアミン基と反応するか、又はチオール基と反応するかにかかわらず）、対応する１つ又は複数のマレアミド酸型の水溶性ポリマーもまたＩＬ−７部分と反応することができる。一定の条件下（例えば、ｐＨ約７〜９且つ水の存在下）では、マレイミド環が「開環」することにより対応するマレアミド酸が形成される。ひいては、マレアミド酸が、ＩＬ−７部分のアミン基又はチオール基と反応し得る。例示的なマレアミド酸ベースの反応が、以下に概略的に示される。ＰＯＬＹは水溶性ポリマーを表し、（ＩＬ−７）はＩＬ−７部分を表す。
本発明に係る代表的なコンジュゲートは、以下の構造を有し得る：
ＰＯＬＹ−Ｌ０，１−Ｃ（Ｏ）Ｚ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−（ＩＬ−７）
式中、ＰＯＬＹは水溶性ポリマーであり、Ｌは任意選択のリンカーであり、Ｚは、Ｏ、ＮＨ、及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Ｙは、Ｃ２〜１０アルキル、Ｃ２〜１０置換アルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から選択され、（ＩＬ−７）はＩＬ−７部分である。ＩＬ−７部分と反応することができ、結果としてこのタイプのコンジュゲートをもたらすポリマー試薬は、米国特許出願公開第２００５／００１４９０３号明細書に記載されている。
先に指摘したとおり、水溶性ポリマーが分枝鎖型である本発明の例示的コンジュゲートは、以下の構造を含む分枝鎖型の水溶性ポリマーを有し得る：
式中、各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数である。
分枝鎖型の水溶性ポリマーを有する例示的コンジュゲートは、以下の試薬を用いて調製することができ：
これにより、以下の構造を有するコンジュゲートが形成される：
式中：
（各構造について）各（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
さらなる例示的コンジュゲートは、以下の試薬を用いて形成することができ：
これにより、以下の構造を有するコンジュゲートが形成される：
式中：
（各構造について）（ｎ）は、独立して２〜４０００の値を有する整数であり；及び
ＩＬ−７は、ＩＬ−７部分の残基である。
コンジュゲートは、チオール選択的ポリマー試薬を使用して様々な方法で形成することができ、本発明はこの点について限定されない。例えば、ＩＬ−７部分−場合により好適な緩衝液（必要であれば、アミンを含有する緩衝液を含む）中にあるもの−がｐＨ約７〜８の水性媒体に入れられ、チオール選択的ポリマー試薬がモル過剰で添加される。そのまま反応を約０．５〜２時間にわたり進め、但し、ペグ化の収率が比較的低いと判断される場合、２時間より長い（例えば、５時間、１０時間、１２時間、及び２４時間の）反応時間が有用であり得る。この手法で使用することのできる例示的なポリマー試薬は、マレイミド、スルホン（例えば、ビニルスルホン）、及びチオール（例えば、オルトピリジニル又は「ＯＰＳＳ」などの官能性チオール）からなる群から選択される反応基を有するポリマー試薬である。
ポリマー試薬に関して、本明細書及びその他に記載されるものは、商業的な供給業者から購入するか、又は市販の出発物質から調製することができる。加えて、ポリマー試薬の調製方法は、文献中に記載がある。
ＩＬ−７部分と非ペプチド性水溶性ポリマーとの結合は直接であってもよく、この場合、ＩＬ−７部分とポリマーとの間に介在する原子は存在せず、又は結合は間接的であってもよく、この場合、ＩＬ−７部分とポリマーとの間に１個又は複数の原子が位置する。間接的な結合に関して、「スペーサー部分」が、ＩＬ−７部分の残基と水溶性ポリマーとの間のリンカーとして機能する。スペーサー部分を構成する１個又は複数の原子としては、炭素原子、窒素原子、硫黄原子、酸素原子、及びそれらの組み合わせのうちの１つ又は複数を挙げることができる。スペーサー部分は、アミド、第二級アミン、カルバメート、チオエーテル、及び／又はジスルフィド基を含むことができる。具体的なスペーサー部分の非限定的な例としては、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｓ）−、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［ＣＨ２］ｈ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｊ−、二価シクロアルキル基、−Ｏ−、−Ｓ−、アミノ酸、−Ｎ（Ｒ６）−、及び前述のいずれかの２つ以上の組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられ、式中、Ｒ６は、Ｈか、又は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール及び置換アリールからなる群から選択される有機ラジカルであり、（ｈ）は０〜６であり、（ｊ）は０〜２０である。他の具体的なスペーサー部分は以下の構造を有する：−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）１〜６−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、式中、各メチレンの後ろの添え字の値は構造中に含まれるメチレンの数を示し、例えば、（ＣＨ２）１〜６は、その構造が、１、２、３、４、５又は６個のメチレンを含み得ることを意味する。加えて、上記のスペーサー部分のいずれも、１〜２０個のエチレンオキシド単量体単位［すなわち、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１〜２０］を含むエチレンオキシドオリゴマー鎖をさらに含み得る。すなわち、エチレンオキシドオリゴマー鎖は、スペーサー部分の前にも、又は後ろにも、及び場合によっては２個以上の原子を含むスペーサー部分の任意の２個の原子間に、存在することができる。また、オリゴマー鎖は、オリゴマーがポリマーセグメントに隣接し、単にポリマーセグメントの延長部に相当するに過ぎないならば、スペーサー部分の一部とは見なされない。
組成物
コンジュゲートは、典型的には組成物の一部である。概して、組成物は複数のコンジュゲートを含み、必須ではないが、好ましくは、各コンジュゲートは同じＩＬ−７部分を含む（すなわち、組成物全体のなかに、ただ１つのタイプのＩＬ−７部分が存在する）。加えて、組成物は、任意の所与のコンジュゲートが２つ以上の異なるＩＬ−７部分からなる群から選択されるある部分を含む複数のコンジュゲートを含み得る（すなわち、組成物全体のなかに、２つ以上の異なるＩＬ−７部分が存在する）。しかしながら、最適には、組成物中の実質的に全てのコンジュゲート（例えば、組成物中の複数のコンジュゲートのうちの８５％以上）が、各々、同じＩＬ−７部分を含む。
組成物は、単一のコンジュゲート種（例えば、単一のポリマーが、組成物中の実質的に全てのコンジュゲートについて同じ位置で結合するモノペグ化コンジュゲート）か、又はコンジュゲート種の混合物（例えば、ポリマーの結合が異なる部位で起こるモノペグ化コンジュゲートの混合物、及び／又は、モノペグ化、ジペグ化及びトリペグ化コンジュゲートの混合物）を含み得る。組成物はまた、４、５、６、７、８個又はそれ以上のポリマーが、ＩＬ−７活性を有する任意の所与の部分と結合している他のコンジュゲートも含み得る。加えて、本発明は、組成物が複数のコンジュゲートを含み、各コンジュゲートが、１個のＩＬ−７部分と共有結合した１個の水溶性ポリマーを含む場合、並びに１個のＩＬ−７部分と共有結合した２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上の水溶性ポリマーを含む組成物も含む。
組成物中のコンジュゲートに関して、本組成物は以下の特徴の１つ以上を満たすことになり、即ち、組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜８個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜７個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜５個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約８５％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜３個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜２個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−７部分に結合した３〜８個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−７部分に結合した２〜５、７個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−７部分に結合した３〜６個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９５％が、ＩＬ−７部分に結合した１個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜６個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜４個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜３個のポリマーを有し得る；組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−７部分に結合した１〜２個のポリマーを有し得る；及び組成物中のコンジュゲートの少なくとも約９９％が、ＩＬ−７部分に結合した１個のポリマーを有し得る。ポリマーの範囲に関する表現、例えば「ｘ〜ｙ個のポリマー」は、複数のポリマーｘ〜ｙ個（端点を含む）を企図すること（即ち、例えば、「１〜３個のポリマー」は１個のポリマー、２個のポリマー及び３個のポリマーを企図し、「１〜２個のポリマー」は１個のポリマー及び２個のポリマーを企図する等）が理解される。加えて、ＩＬ−７部分に結合した２個以上のポリマーを有する所与のコンジュゲートが、安定に且つ遊離可能に結合したポリマーの混合物（ここでは少なくとも１個のポリマーがＩＬ−７部分に安定に結合し、且つ少なくとも１個のポリマーがＩＬ−７部分に遊離可能に結合している）を有し得ることもまた企図される。
１つ又は複数の実施形態において、コンジュゲート含有組成物はアルブミンを含まないか又は実質的に含まないことが好ましい。また、組成物が、ＩＬ−７活性を有しないタンパク質を含まないか又は実質的に含まないことも好ましい。従って、組成物は８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは９９％アルブミン不含であることが好ましい。加えて、組成物は、ＩＬ−７活性を有しないタンパク質を８５％、より好ましくは９５％、及び最も好ましくは９９％不含であることが好ましい。組成物中にアルブミンが存在する限りにおいて、本発明の例示的組成物は、ＩＬ−７部分の残基をアルブミンに連結するポリ（エチレングリコール）ポリマーを含むコンジュゲートを実質的に含まない。
任意の所与の部分に対するポリマーの所望の数の制御は、適切なポリマー試薬、ポリマー試薬のＩＬ−７部分に対する比、温度、ｐＨ条件、及びコンジュゲート形成反応の他の側面を選択することにより実現することができる。加えて、精製手段により、望ましくないコンジュゲート（例えば、４個以上のポリマーが結合したコンジュゲート）の低減又は除去を実現することができる。
例えば、ポリマー−ＩＬ−７部分コンジュゲートを精製して、異なるコンジュゲート化種を得る／単離することができる。具体的には、生成混合物を精製して、各ＩＬ−７部分につき平均１、２、３、４、５個又はそれ以上の範囲のＰＥＧ、典型的には、各ＩＬ−７部分につき１、２又は３個のＰＥＧを得ることができる。最終的なコンジュゲート反応混合物の精製方針は、例えば、用いられるポリマー試薬の分子量、特定のＩＬ−７部分、所望の投薬レジメン、１つ又は複数のコンジュゲートの個々の残基活性及びインビボ特性を含め、様々な要因に依存し得る。
必要であれば、ゲルろ過クロマトグラフィー及び／又はイオン交換クロマトグラフィーを用いて分子量が異なるコンジュゲートを単離することができる。すなわち、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いると、その分子量の違いに基づき（この違いは、本質的に水溶性ポリマー分の平均分子量に対応する）、ポリマー−対−ＩＬ−７部分の比の大きさが異なるもの（例えば、１ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなど、ここで「１ｍｅｒ」は、１ポリマー対ＩＬ−７部分を示し、「２ｍｅｒ」は、２ポリマー対ＩＬ−７部分を示す等）が分画される。例えば、３５，０００ダルトンのタンパク質が、約２０，０００ダルトンの分子量のポリマー試薬に対してランダムにコンジュゲート化される例示的反応では、結果として得られる反応混合物は、非修飾タンパク質（分子量約３５，０００ダルトン）、モノペグ化タンパク質（分子量約５５，０００ダルトン）、ジペグ化タンパク質（分子量約７５，０００ダルトン）などを含み得る。
この手法を用いることで、異なる分子量を有するＰＥＧと他のポリマー−ＩＬ−７部分コンジュゲートとを分離することはできるが、概してこの手法は、ＩＬ−７部分中のポリマー結合部位が異なる位置アイソフォームの分離には役立たない。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いると、ＰＥＧ １ｍｅｒ、２ｍｅｒ、３ｍｅｒなどの混合物を互いに分離することはできるが、回収したコンジュゲート組成物の各々は、ＩＬ−７部分中の異なる反応基（例えば、リジン残基）に結合した１つ又は複数のＰＥＧを含み得る。
このタイプの分離を行うのに好適なゲルろ過カラムとしては、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から入手可能なＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）カラム及びＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）カラムが挙げられる。特定のカラムの選択は、望ましい所望の分画範囲に依存し得る。溶出は、概して、リン酸、酢酸などの好適な緩衝液を使用して行われる。収集された画分は、例えば、（ｉ）タンパク質含量についての２８０ｎｍの吸光度、（ｉｉ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準として使用する色素ベースのタンパク質分析、（ｉｉｉ）ＰＥＧ含量についてのヨウ素試験（Ｓｉｍｓら（１９８０年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０７：６０−６３頁）、（ｉｖ）ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）と、続くヨウ化バリウムによる染色、及び（ｖ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）など、様々な異なる方法により分析され得る。
位置アイソフォームの分離は、好適なカラム（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ又はＶｙｄａｃなどの企業から市販されているＣ１８カラム又はＣ３カラム）を使用した逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いる逆相クロマトグラフィーによるか、又はイオン交換カラム、例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）イオン交換カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより行われる。いずれの手法を用いても、同じ分子量を有するポリマー−活性薬剤の異性体（すなわち、位置アイソフォーム）を分離することができる。
組成物は、好ましくはＩＬ−７活性を有しないタンパク質を実質的に含まない。加えて、組成物は、好ましくは他のいかなる非共有結合性の水溶性ポリマーも実質的に含まない。しかしながら、ある状況下では、組成物は、ポリマー−ＩＬ−７部分コンジュゲートと非コンジュゲート化ＩＬ−７部分との混合物を含み得る。
場合により、本発明の組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。必要であれば、薬学的に許容可能な賦形剤はコンジュゲートに添加され、組成物を形成することができる。
例示的な賦形剤としては、限定なしに、炭水化物、無機塩類、抗菌剤、抗酸化剤、界面活性剤、緩衝剤、酸、塩基、アミノ酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。
糖、誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖、及び／又は糖ポリマーなどの炭水化物が、賦形剤として存在し得る。具体的な炭水化物賦形剤としては、例えば：フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖類；及びマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリンなどのアルジトールが挙げられる。
賦形剤としてはまた、クエン酸、酢酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硝酸カリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせなどの無機塩又は緩衝剤も挙げることができる。
組成物はまた、微生物の繁殖を防止又は抑止するための抗菌剤も含むことができる。本発明の１つ又は複数の実施形態に好適な抗菌剤の非限定的な例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメルソール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
抗酸化剤も同様に組成物中に存在し得る。抗酸化剤を使用すると酸化が防止され、それによりコンジュゲート又は調製物の他の構成成分の劣化が防止される。本発明の１つ又は複数の実施形態での使用に好適な抗酸化剤としては、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、次亜リン酸、モノチオグリセロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、スルホキシル酸ナトリウムホルムアルデヒド、メタ重亜硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
賦形剤として界面活性剤が存在してもよい。例示的な界面活性剤としては、「Ｔｗｅｅｎ ２０」及び「Ｔｗｅｅｎ ８０」などのポリソルベート、並びにＦ６８及びＦ８８（双方とも、ＢＡＳＦ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪから入手可能）などのプルロニック；ソルビタンエステル；レシチン及び他のホスファチジルコリンなどのリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン（但し、リポソーム形態ではないことが好ましい）、脂肪酸、並びに脂肪酸エステルなどの脂質；コレステロールなどのステロイド；並びにＥＤＴＡ、亜鉛及び他のかかる好適な陽イオンなどのＩＬ−７レーティング（ＩＬ−７ｌａｔｉｎｇ）剤が挙げられる。
酸又は塩基が組成物中に賦形剤として存在してもよい。使用することのできる酸の非限定的な例としては、塩酸、酢酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、ギ酸、トリクロロ酢酸、硝酸、過塩素酸、リン酸、硫酸、フマル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される酸が挙げられる。好適な塩基の例としては、限定なしに、水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、フマル酸カリウム、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される塩基が挙げられる。
１つ又は複数のアミノ酸は、本明細書に記載される組成物中に賦形剤として存在することができる。この関連における例示的なアミノ酸としては、アルギニン、リジン及びグリシンが挙げられる。
組成物中のコンジュゲート（すなわち、活性薬剤とポリマー試薬との間で形成されるコンジュゲート）の量は、様々な要因によって異なり得るが、最適には、組成物が単位用量容器（例えば、バイアル）に保存されるとき、治療上有効な用量であり得る。加えて、医薬調製物はシリンジに収容されてもよい。治療上有効な用量は、どの量が臨床的に望ましいエンドポイントを生じるかを判断するために、コンジュゲートの量を漸増させながら反復投与することにより実験的に決定することができる。
組成物中の任意の個別の賦形剤の量は、賦形剤の活性及び組成物の特定の必要性によって異なり得る。典型的には、任意の個別の賦形剤についての最適量の決定は、ルーチンの実験を通じて、すなわち、様々な量の賦形剤（低量から高量までの範囲にわたる）を含む組成物を調製して安定性及び他のパラメータを調べ、次にどの時点で有意な副作用なしに最適な効果が得られるかを決定することにより行われる。
しかしながら、概して賦形剤は組成物中に約１％〜約９９重量％、好ましくは約５％〜約９８重量％、より好ましくは約１５〜約９５重量％の賦形剤の量で存在し、濃度は３０重量％未満が最も好ましい。
これらの前述の医薬賦形剤は、他の賦形剤と共に、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第１９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、（１９９５年）、「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ（１９９８年）、及びＫｉｂｂｅ，Ａ．Ｈ．、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、２０００年に記載されている。
組成物は、あらゆるタイプの製剤、特に注射に適したもの、例えば、再構成することのできる粉末又は親液体並びに液体を包含する。固形組成物の注射前の再構成に好適な希釈剤の例としては、注射用静菌水、水中のデキストロース５％、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、生理食塩水、滅菌水、脱イオン水、及びそれらの組み合わせが挙げられる。液状の医薬組成物に関しては、溶液及び懸濁液が想定される。
１つ又は複数の実施形態において、本組成物はまたハイドロゲルであってもよい。例示的ハイドロゲルとしては、Ｚｕｓｔｉａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １１（５）：１３４８−１３５７に記載されるものなど、ポリ（エチレングリコール）（非コンジュゲート形態）を含むものが挙げられる。
１つ又は複数の実施形態の組成物は、必須ではないが、典型的には注射により投与され、従って投与直前には概してハイドロゲル、液状の溶液又は懸濁液である。医薬調製物はまた、シロップ、クリーム、軟膏、錠剤、粉末などの他の形態をとることもできる。他の投与方法には、肺内、直腸、経皮、経粘膜、経口、髄腔内、腫瘍内、腫瘍周囲、腹腔内、皮下、動脈内なども含まれる。
本発明はまた、本明細書に提供されるとおりのコンジュゲートを、コンジュゲートによる治療に反応性を有する病態を患う患者に対して投与する方法も提供する。この方法は、患者に対し、概して注射により、治療上有効量のコンジュゲート（好ましくは医薬組成物の一部として提供されるもの）を投与することを含む。先述のとおり、コンジュゲートは、注射（例えば、筋肉内、皮下及び非経口）することができる。非経口投与に好適な製剤タイプとしては、特に、即時注射用溶液、使用前に溶媒と混和する乾燥粉末、即時注射用懸濁液、使用前に媒剤と混和する不溶性の乾燥組成物、並びに投与前に希釈する乳剤及び液状濃縮物が挙げられる。
コンジュゲートを投与する方法は（好ましくは医薬組成物の一部として提供する）、場合により、コンジュゲートを特定の範囲に局在させるように実施することができる。例えば、コンジュゲートを含む液体、ゲル及び固形製剤を、罹患範囲（腫瘍内、腫瘍の近傍、炎症範囲内、及び炎症範囲の近傍など）に外科的に植え込んでもよい。好都合には、臓器及び組織はまた、所望の位置がコンジュゲートに対してより良好に曝露されることを確実にするため、画像化され得る。
この投与方法を用いて、本コンジュゲートの投与によって治癒又は予防することのできる任意の病態を治療し得る。当業者は、具体的なコンジュゲートがどの病態を有効に治療し得るかを理解する。例えば、免疫不全に罹患している患者を治療するため、及び例えば本質的に免疫抑制性の疾患又は治療後に起こる免疫系の自然の再構築を促進することにおいて、本コンジュゲートを単独で、或いは他の薬物療法と併用して使用することができる。例えば、ウイルス感染症、免疫障害を治療するため、及び特定の細胞型の成長（増殖を含む）を増進させるため、本コンジュゲートを使用することができる。更に、膀胱癌、肺癌、脳癌、乳癌、皮膚癌、及び前立腺癌などの癌に罹患している患者の治療においてコンジュゲートを使用することができる。有利には、本コンジュゲートは別の活性薬剤の投与より前、それと同時、或いはその後に患者に投与され得る。例えば、本コンジュゲートは、癌に罹患している患者を治療するための免疫療法が関わる手法の一環として用いられてもよく、ここでコンジュゲートは、癌罹患者の治療に用いられる別の免疫療法薬の投与より前、それと同時、或いはその後に患者に投与される。
実際の投与用量は、対象の年齢、体重、及び全身状態並びに治療下の病態の重症度、医療専門家の判断、及び投与されるコンジュゲートに応じて異なり得る。治療有効量は当業者に公知であり、及び／又は関連する参考書及び文献に記載されている。概して、治療有効量は、約０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／日〜７５ｍｇ／日の用量、及びより好ましくは０．１０ｍｇ／日〜５０ｍｇ／日の用量の範囲であり得る。所与の用量が、例えば臨床医が適切なエンドポイント（例えば、治癒、退縮、部分退縮など）に達したことを決定するまで、定期的に投与されてもよい。
単位投薬量の任意の所与のコンジュゲート（ここでも、好ましくは医薬調製物の一部として提供されるもの）は、臨床医の判断、患者の必要性などに応じて様々な投薬スケジュールで投与することができる。具体的な投薬スケジュールは、当業者には周知であるか、又はルーチンの方法を用いて実験的に決定することができる。例示的な投薬スケジュールとしては、限定なしに、１日１回、週３回、週２回、週１回、月２回、月１回、及びそれらの任意の組み合わせの投与が挙げられる。臨床的なエンドポイントが達成されると、組成物の投薬は中止される。
本発明は、その好ましい具体的な実施形態に関連して説明されているが、前述の説明並びに以下の実施例は例示を目的としており、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されるべきである。本発明の範囲内における他の態様、利点及び変更は、本発明の係る当該技術分野の当業者には明らかであろう。
本明細書で参照される論文、著作、特許及び他の刊行物は全て、全体として参照により本明細書に援用される。
本発明の実施には、特に指示されない限り、有機合成、生化学、タンパク質精製などの従来技術が用いられ、それらは当該技術分野の範囲内である。かかる方法は文献中に詳しく説明されている。例えば、Ｊ．Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、第４版（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９２年）、上記を参照のこと。
以下の実施例では、使用される数（例えば、量、温度等）に関する正確性を確保するように努めたが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮しなければならない。特に指示がない限り、温度は摂氏温度であり、圧力は海上気圧又はその近傍におけるものである。以下の例の各々は、当業者が本明細書に記載される実施形態の１つ又は複数を実行するための教示と見なされる。
本実施例で使用するために配列番号１のアミノ酸配列に対応する組換えＩＬ−７（「ｒｈＩＬ−７」）を含む水溶液（「ストック溶液」）が用意された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 試料はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎゲル電気泳動システム（ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ）を使用してドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。試料を試料緩衝液と混合した。次に、調製した試料をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４−１２％ポリアクリルアミド プレキャストゲルにロードし、約３０分間泳動した。
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析
Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）で逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析を実施した。試料は６０℃でＰｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ−Ｃ３カラム（２．１×７５ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して分析した。移動相は０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（Ａ）及び０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ（Ｂ）である。カラム流量は０．５ｍｌ／分であった。溶出したタンパク質及びＰＥＧタンパク質コンジュゲートは２８０ｎｍのＵＶを使用して検出した。
実施例１
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、２０ｋＤａによるＩＬ−７のペグ化
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、２０ｋＤａ、（「ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、２０ｋＤａを周囲温度に加温した。１０倍〜５０倍過剰（ストックＩＬ−７溶液の一定量のアリコート中におけるＩＬ−７の量に対して）の加温したｍＰＥＧ２−ＮＨＳを２ｍＭ ＨＣｌ中に溶解して１０％試薬溶液を形成した。この１０％試薬溶液をストックＩＬ−７溶液（２０ｍＭトリス中０．５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）のアリコートに素早く加え、十分に混合した。ｍＰＥＧ２−ＮＨＳをアミド連結によってＩＬ−７にカップリングさせるため、反応液を低速実験室用ローテータに室温で２時間、次に４℃で一晩置いた。反応を２５ｍＭグリシン溶液でクエンチした。このコンジュゲートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＲＰ−ＨＰＬＣの両方によって特徴付けた。
図１は、１０倍過剰のＰＥＧを使用することによるコンジュゲート溶液のＲＰ−ＨＰＬＣ分析に伴うクロマトグラムを示す。このペグ化反応により、４４％のモノコンジュゲート種（１個のＰＥＧがＩＬ−７に結合している）、３５％のジコンジュゲート種（２個のＰＥＧがＩＬ−７に結合している）及び１４％のトリコンジュゲート種（３個のＰＥＧがＩＬ−７に結合している）が生じた。溶液中に残る未反応のＩＬ−７は僅か７％であった。
図２は、種々のｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、２０ｋＤａ濃度（即ち、１０倍、２０倍、及び５０倍過剰）でのペグ化のＳＤＳゲル結果を示す。
実施例２
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、４０ｋＤａによるＩＬ−７のペグ化
分枝鎖状ｍＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、４０ｋＤａ、（「ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、４０ｋＤａを周囲温度に加温した。１０倍〜５０倍過剰（ストックＩＬ−７溶液の一定量のアリコート中におけるＩＬ−７の量に対して）の加温したｍＰＥＧ２−ＮＨＳを２ｍＭ ＨＣｌ中に溶解して１０％試薬溶液を形成した。この１０％試薬溶液をストックＩＬ−７溶液（２０ｍＭトリス中０．５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）に素早く加え、十分に混合した。ｍＰＥＧ２−ＮＨＳをアミド連結によってＩＬ−７にカップリングさせるため、反応液を低速実験室用ローテータに室温で２時間、次に４℃で一晩置いた。反応を２５ｍＭグリシン溶液でクエンチした。このコンジュゲートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＲＰ−ＨＰＬＣの両方によって特徴付けた。
図３は、１０倍過剰のＰＥＧを使用することによるコンジュゲート溶液のＲＰ−ＨＰＬＣ分析に伴うクロマトグラムを示す。このペグ化反応により、３６％のモノコンジュゲート種、４４％のジコンジュゲート種及び１７％のトリコンジュゲート種が生じた。溶液中に残る未反応のＩＬ−７は僅か３％であった。
図４は、種々のｍＰＥＧ２−ＮＨＳ、４０ｋＤａ濃度（即ち、１０倍、２０倍、及び５０倍過剰）でのペグ化のＳＤＳゲル結果を示す。
実施例３
９−ヒドロキシメチル−２，７−ジ［ｍＰＥＧ（１０，０００）−カルボキサミド］フルオレン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、２０ｋＤａによるＩＬ−７のペグ化
分枝鎖状ｍＰＥＧ−ＦＭＯＣ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、２０ｋＤａ、（「Ｃ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−２０℃で保存したＣ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ、２０ｋＤａを周囲温度に加温した。１０倍〜５０倍過剰（ストックＩＬ−７溶液の一定量のアリコート中におけるＩＬ−７の量に対して）の加温したＣ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳを２ｍＭ ＨＣｌ中に溶解して１０％試薬溶液を形成した。この１０％試薬溶液をストックＩＬ−７溶液（２０ｍＭトリス中０．５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）のアリコートに素早く加え、十分に混合した。Ｃ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳをカルバメート連結によってＩＬ−７にカップリングさせるため、反応液を低速実験室用ローテータに室温で２時間、次に４℃で一晩置いた。反応を２５ｍＭグリシン溶液でクエンチした。このコンジュゲートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＲＰ−ＨＰＬＣの両方によって特徴付けた。
図５は、ペグ化スカウティング（ｓｃｏｕｔｉｎｇ）のＳＤＳゲル結果を示す。以下のゲルに示されるとおり、１０倍過剰の試薬による優勢種はモノコンジュゲート（４３％）であった一方、２０倍過剰の試薬による優勢種はジコンジュゲート（４０％）であり、５０倍過剰の試薬による優勢種はトリコンジュゲート（４７％）であった。
この同じ手法を用いることにより、他の重量平均分子量を有するＣ２−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳを使用して他のコンジュゲートを調製することができる。
実施例４
直鎖状ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノエート誘導体、３０ｋＤａによるＩＬ−７のペグ化
直鎖状ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノエート誘導体、３０ｋＤａ （「ｍＰＥＧ−ＳＭＢ」）
アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ−ＳＭＢ、３０ｋＤａを周囲温度に加温する。２０倍過剰（ストックＩＬ−７溶液の一定量のアリコート中におけるＩＬ−７の量に対して）の加温したｍＰＥＧ−ＳＭＢを２ｍＭ ＨＣｌ中に溶解して１０％試薬溶液を形成する。この１０％試薬溶液をストックＩＬ−７溶液（リン酸ナトリウム緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５）のアリコートに素早く加え、十分に混合した。ｍＰＥＧ−ＳＭＢを加えた後、反応混合物のｐＨを決定し、従来技術を用いて７．５に調整する。ｍＰＥＧ−ＳＭＢをアミド連結によってＩＬ−７にカップリングさせるため、反応液を低速実験室用ローテータに一晩置いて、室温でコンジュゲーションを促進する。反応をグリシン溶液でクエンチする。このコンジュゲート溶液をＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付ける。
この同じ手法を用いることにより、他の重量平均分子量を有するｍＰＥＧ−ＳＭＢを使用して他のコンジュゲートを調製することができる。
実施例５
直鎖状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、２０ｋＤａによるＩＬ−７のペグ化
直鎖状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、２０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ」）
アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、２０ｋＤａを周囲温度に加温する。３０倍過剰（ストックＩＬ−７の一定量のアリコート中におけるＩＬ−７の量に対して）の加温したｍＰＥＧ−ＢｕｔｒｙＡＬＤをＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏ中に溶解して１０％試薬溶液を形成する。この１０％試薬溶液をストックＩＬ−７溶液（酢酸ナトリウム緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５．５）のアリコートに素早く加え、十分に混合する。ｍＰＥＧ−ＢｕｔｒｙＡＬＤを３０分間加えた後、次に還元剤のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えて１０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を作製した。反応液を低速実験室用ローテータに一晩置いて、室温でコンジュゲーションを促進する。反応を酢酸でｐＨ４にクエンチする。このコンジュゲート溶液をＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付ける。
ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤのアルデヒド基は、ＩＬ−７に関連する第一級アミンと反応することができ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬によって還元すると、ＩＬ−７に第二級アミンを介して共有結合的に結合し得る。ペグ化反応はｐＨ５．５で行われるため、ＩＬ−７に対するＰＥＧ誘導体の結合はＮ末端に選択的である。
この同じ手法を用いることにより、他の重量平均分子量を有する直鎖状ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤを使用して他のコンジュゲートを調製することができる。
実施例６
分枝鎖状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、４０ｋＤａによるＩＬ−７のペグ化
分枝鎖状ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド誘導体、４０ｋＤａ（「ｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤ」）
アルゴン下に−２０℃で保存したｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤ、４０ｋＤａを周囲温度に加温する。３０倍過剰（ストックＩＬ−７の一定量のアリコート中におけるＩＬ−７の量に対して）の加温したｍＰＥＧ２−ＢｕｔｒｙＡＬＤをＭｉｌｌｉ−Ｑ Ｈ２Ｏ中に溶解して１０％試薬溶液を形成する。この１０％試薬溶液をストックＩＬ−７溶液（リン酸ナトリウム緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０）のアリコートに素早く加え、十分に混合する。ｍＰＥＧ２−ＢｕｔｒｙＡＬＤを３０分間加えた後、次に還元剤のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを加えて１０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ３を作製する。反応液を低速実験室用ローテータに一晩置いて、室温でコンジュゲーションを促進する。反応を酢酸でｐＨ４にクエンチする。このコンジュゲート溶液をＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって特徴付ける。
ｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤのアルデヒド基は、ＩＬ−７に関連する第一級アミンと反応することができ、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元試薬によって還元すると、ＩＬ−７に第二級アミンを介して共有結合的に結合し得る。ペグ化反応はｐＨ６．０で行われるため、ＩＬ−７に対するＰＥＧ誘導体の結合はＮ末端に選択的である。
この同じ手法を用いることにより、他の重量平均分子量を有する分枝鎖状ｍＰＥＧ２−ＢｕｔｙｒＡＬＤを使用して他のコンジュゲートを調製することができる。
実施例７
９−ヒドロキシメチル−４−（ｍＰＥＧ（２０，０００）−カルボキシアミド）−７−（３−（ｍＰＥＧ（２０，０００））カルバモイル−プロピル）−フルオレン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネート、４０ｋＤａによるＩＬ−７のペグ化
分枝鎖状ｍＰＥＧ−ＦＭＯＣ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、４０ｋＤａ、（「ＣＡＣ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−２０℃で保存したＣＡＣ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ、４０ｋＤａを周囲温度に加温する。１０倍〜５０倍過剰（ストックＩＬ−７溶液の一定量のアリコート中におけるＩＬ−７の量に対して）の加温したＣＡＣ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳを２ｍＭ ＨＣｌ中に溶解して１０％試薬溶液を形成する。この１０％試薬溶液をストックＩＬ−７溶液（リン酸ナトリウム緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５）のアリコートに素早く加え、十分に混合する。反応液を低速実験室用ローテータ（ＲｏｔｏＭｉｘ）に初めは室温で２時間、次に４℃で一晩置く。１Ｍ酢酸を加えてｐＨを５に低下させることにより、反応をクエンチする。このコンジュゲート溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによって特徴付ける。
ＰＥＧ構造の遊離可能な連結により、これらのＰＥＧは生理的条件下でＰＥＧ−ＩＬ−７コンジュゲートから遊離可能である。
この同じ手法を用いることにより、他の重量平均分子量を有するＣＡＣ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳを使用して他のコンジュゲートを調製することができる。
実施例８
９−ヒドロキシメチル−［４−カルボキサミドＭ−ＰＥＧ（２０，０００）−７−アミドグルタルアミドＭ−ＰＥＧ（２０，０００）］フルオレン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、４０ｋＤａによるＩＬ−７のペグ化
分枝鎖状ｍＰＥＧ−ＦＭＯＣ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、４０ｋＤａ、（「ＣＧ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ」）
アルゴン下に−２０℃で保存したＣＧ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳ、４０ｋＤａを周囲温度に加温する。１０倍〜５０倍過剰（ストックＩＬ−７溶液の一定量のアリコート中におけるＩＬ−７の量に対して）の加温したＣＧ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳを２ｍＭ ＨＣｌ中に溶解して１０％試薬溶液を形成する。この１０％試薬溶液をストックＩＬ−７溶液（リン酸ナトリウム緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５）のアリコートに素早く加え、十分に混合する。反応液を低速実験室用ローテータ（ＲｏｔｏＭｉｘ）に初めは室温で２時間、次に４℃で一晩置く。１Ｍ酢酸を加えてｐＨを５に低下させることにより、反応をクエンチする。このコンジュゲート溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによって特徴付ける。
ＰＥＧ構造の分解性の連結により、これらのＰＥＧは生理的条件下でＰＥＧ−ＩＬ−７コンジュゲートから遊離可能である。
この同じ手法を用いることにより、他の重量平均分子量を有するＣＧ−ＰＥＧ２−ＦＭＯＣ−ＮＨＳを使用して他のコンジュゲートを調製することができる。

Claims (19)

  1. 水溶性ポリマーと共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲート。
  2. 前記水溶性ポリマーと共有結合した前記ＩＬ−７部分が遊離可能な連結を介して共有結合している、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 前記水溶性ポリマーに共有結合した前記ＩＬ−７部分が、安定な連結を介して共有結合している、請求項１に記載のコンジュゲート。
  4. 前記水溶性ポリマーが分枝鎖状水溶性ポリマーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  5. 前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、及びポリ（アクリロイルモルホリン）からなる群から選択されるポリマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  6. 前記水溶性ポリマーがポリ（アルキレンオキシド）である、請求項５に記載のコンジュゲート。
  7. 前記ポリ（アルキレンオキシド）がポリ（エチレングリコール）である、請求項６に記載のコンジュゲート。
  8. 前記ポリ（エチレングリコール）が、ヒドロキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、アルケノキシ、置換アルケノキシ、アルキノキシ、置換アルキノキシ、アリールオキシ及び置換アリールオキシからなる群から選択されるエンドキャップ部分で末端がキャップされている、請求項７に記載のコンジュゲート。
  9. 前記水溶性ポリマーが、約５００ダルトン〜約１００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  10. 前記コンジュゲートが、前記ＩＬ−７部分の残基のアミン基に共有結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  11. １個、２個、３個又は４個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−７部分の残基に結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  12. １個、２個又は３個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−７部分の残基に結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  13. １個又は２個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−７部分の残基に結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  14. １個の水溶性ポリマーが前記ＩＬ−７部分の残基に結合している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  15. 前記ＩＬ−７部分が、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号６；配列番号７；及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  16. 水溶性ポリマーに共有結合したＩＬ−７部分の残基を含むコンジュゲートであって、前記水溶性ポリマーが、共有結合する前には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル基を有するポリマー試薬である、コンジュゲート。
  17. 請求項１〜１６のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
  18. 請求項１７に記載の医薬組成物を個人に投与するステップを含む方法。
  19. コンジュゲート形成条件下で、ＩＬ−７部分をポリマー試薬と接触させるステップを含むコンジュゲートの作製方法。
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